ES2894844T3 - Tratamiento de la calcificación vascular - Google Patents

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Abstract

Un inhibidor de poli(ADP ribosa)polimerasa (PARP), o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo, para el uso en el tratamiento, prevención o mejora de la calcificación vascular de la media o calcificación aterosclerótica de la íntima, en donde el que el inhibidor de PARP es olaparib; rucaparib; niraparib; veliparib; talazoparib; minociclina; cilostazol o clorhidrato de N-(6-oxo-5,6-dihidrofenantridin-2-il)-(N,N- dimetilamino)acetamida (PJ34).

Description

d e s c r ip c ió n
Tratamiento de la calcificación vascular
La presente invención se refiere a la calcificación vascular y, en particular, a compuestos útiles para el tratamiento de enfermedades asociadas con una calcificación vascular excesiva y/o inapropiada. La invención se refiere especialmente al tratamiento de la calcificación vascular de la media o la calcificación aterosclerótica de la íntima. La invención se extiende a composiciones farmacéuticas y métodos para tratar la calcificación vascular excesiva y/o inapropiada (es decir, de la media).
La calcificación vascular está asociada con una variedad de enfermedades y se puede separar ampliamente en tres tipos distintos, específicamente (1) calcificación aterosclerótica de la íntima, que es la calcificación de la túnica íntima, e incluye la aterosclerosis y la inflamación asociada; (2) estenosis aórtica calcificada valvular, que es la calcificación de la válvula aórtica; y (3) calcificación arterial de la media, que es la calcificación de la túnica media, ver Demer y Tintut "Vascular Clacification", Circulation, 2008; 117, 2938-2948.
La túnica media es la capa intermedia de una arteria o vena y está formada por células de músculo liso y tejido elástico.
Como se muestra en la Figura 28A, la calcificación aterosclerótica es excéntrica y conduce a la deformación del lumen. La deformación del lumen se debe a un depósito de lipoproteínas 3, debido a glóbulos blancos cargados de colesterol (células espumosas), cubiertos por un casquete fibroso de la íntima 4. La calcificación 1 se produce en toda la lesión aterosclerótica, incluso en el casquete 4, y la elastinólisis focal 2 se produce en la túnica media adyacente al depósito de lipoproteínas 3. El endurecimiento de los vasos se debe a una calcificación aterosclerótica.
Por el contrario, como se muestra en la Figura 28B, la calcificación de la media es concéntrica. En consecuencia, la calcificación 1 y la elastinólisis se producen en toda la túnica media. El endurecimiento de los vasos también se debe a la calcificación de la media.
A nivel molecular, la calcificación es la formación y unión de partículas minerales a la matriz extracelular. El trabajo realizado durante los últimos 20 años demostró que la calcificación vascular es un proceso mediado por células con similitudes con la osteocondrogénesis del desarrollo. La calcificación da como resultado el endurecimiento de la matriz, que es esencial para el hueso, pero con consecuencias perjudiciales para las propiedades mecánicas del tejido vascular.
La arteriosclerosis de Monckeberg, conocida de cualquier otra manera como esclerosis calcificada de la media, es la variedad más común de calcificación de la media. Además, la arteriolopatía urémica calcificante (CUA), conocida de cualquier otra manera como calcifilaxis, es una forma gravemente mórbida y potencialmente mortal de calcificación vascular de la media que conduce a necrosis cutánea y paniculitis.
La reducción de la elastancia aórtica y arterial, a causa de la calcificación vascular, altera la hemodinámica cardiovascular. Esto puede resultar en hipertensión, estenosis aórtica, hipertrofia cardíaca, isquemia miocárdica y de extremidades inferiores e insuficiencia cardíaca congestiva. En particular, la calcificación vascular es un factor de riesgo principal de enfermedad cardiovascular.
La calcificación vascular también se asocia comúnmente con diabetes mellitus I, diabetes mellitus II, enfermedad renal crónica, envejecimiento, hiperpatiroidismo, trastornos de la vitamina D, deficiencia de vitamina K, osteoporosis, enfermedad de Kawasaki, calcificación arterial por deficiencia de CD73 (ACDC), calcificación arterial generalizada de la infancia (GACI), calcificación idiopática de los ganglios basales (IBGC), pseudoxantoma elástico (PXE), artritis reumatoide, síndrome de Singleton-Merten, p-talasemia y uso de warfarina.
En consecuencia, existe la necesidad de compuestos que puedan usarse para tratar, prevenir o mejorar enfermedades asociadas con la calcificación vascular excesiva y/o inapropiada, y en particular la calcificación vascular de la media o la calcificación aterosclerótica de la íntima.
Como se describió en los Ejemplos, los inventores demostraron que puede usarse una variedad de compuestos que actúan como inhibidores de la poli (ADP ribosa) polimerasa (PARP) para reducir la calcificación vascular medial.
La invención se define en las reivindicaciones adjuntas. Por tanto, de acuerdo con un primer aspecto de la invención, se proporciona un inhibidor de poli(ADP ribosa) polimerasa (PARP) o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo, para el uso en el tratamiento, prevención o mejora de la calcificación vascular de la media o la calcificación aterosclerótica de la íntima.
De acuerdo con un segundo aspecto de la invención, se proporciona un método para tratar, prevenir o mejorar la calcificación vascular de la media o la calcificación aterosclerótica de la íntima en un sujeto, que comprende el método para administrar a un sujeto que necesite dicho tratamiento, una cantidad terapéuticamente efectiva de un inhibidor de la poli (ADP ribosa) polimerasa (PARP) o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo.
Ventajosamente, Ios Ejemplos muestran que el Inhibidor de PARP Inhibe la calcificación de una manera dependiente de la dosis. Además, Ios Ejemplos muestran que el inhibidor de PARP inhibe la calcificación de las células del músculo liso, que están presentes en la túnica media. Preferentemente, por lo tanto, el inhibidor de PARP inhibe la calcificación de las células del músculo liso presentes en la túnica media. Preferentemente, el inhibidor de PARP se usa para tratar, prevenir o mejorar la calcificación arterial de la media.
Preferentemente, el inhibidor de PARP se usa para tratar, prevenir o mejorar la calcificación vascular de la media.
Preferentemente, el inhibidor de PARP se usa para tratar, prevenir o mejorar una enfermedad seleccionada de un grupo que consiste de: Arteriosclerosis de Monckeberg; y arteriolopatía urémica calcificante (CUA).
Preferentemente, el inhibidor de PARP se usa para tratar, prevenir o mejorar la calcificación vascular de la media en un sujeto que padece enfermedad renal crónica, diabetes, envejecimiento, hiperpatiroidismo, hiperfosfatemia, un trastorno de vitamina D, un trastorno de vitamina K, osteoporosis, enfermedad de Kawasaki, calcificación arterial por deficiencia de CD73 (ACDC), calcificación arterial generalizada de la infancia (GACI), calcificación idiopática de Ios ganglios basales (IBGC), pseudoxantoma elástico (PXE), artritis reumatoide, síndrome de Singleton-Merten y/o ptalasemia. Preferentemente, la enfermedad renal crónica es una enfermedad renal en etapa terminal. La diabetes puede ser diabetes mellitus I. Preferentemente, la diabetes es diabetes mellitus II. Preferentemente, el trastorno de vitamina D es la toxicidad por vitamina D. Preferentemente, el trastorno de vitamina K es la deficiencia de vitamina K.
Preferentemente, el inhibidor de PARP se usa para tratar, prevenir o mejorar la calcificación vascular de la media en un sujeto al que se le prescribe warfarina.
Preferentemente, el inhibidor de PARP no se usa para tratar, prevenir o mejorar la estenosis aórtica calcificada valvular, tal como la calcificación de la válvula aórtica. Alternativamente, el inhibidor de PARP puede usarse para tratar, prevenir o mejorar la calcificación aterosclerótica de la íntima.
Los inventores señalan que la calcificación aterosclerótica requiere la diferenciación osteogénica de las células del músculo liso vascular, en otras palabras una transformación específica de las células de Ios vasos sanguíneos antes de que suceda. Por este motivo, existen placas ateroscleróticas que nunca se calcifican, por muy malas que sean, e igualmente otras que se calcifican en una etapa temprana del daño vascular. En consecuencia, la calcificación no es una parte inevitable de la aterosclerosis y solo la padecerá un grupo selecto de pacientes. No se conoce específicamente qué desencadena la transformación celular que causa la calcificación aterosclerótica, aunque se especula que el mecanismo de control que previene la calcificación en la aterosclerosis en general puede fallar en algunos pacientes y conducir a la calcificación aterosclerótica.
Un paciente que padece de calcificación aterosclerótica puede identificarse mediante el uso de una tomografía computarizada (t C). La tomografía computarizada puede usarse para calcular una puntuación de Agatston, una variable pseudo-continua que se deriva de las densidades de placa y sus áreas en todas las arterias coronarias, para un paciente. En consecuencia, un paciente con una puntuación de Agatston de o no tendría calcificación de la arteria coronaria. Preferentemente, el inhibidor de PARP se usa para tratar la calcificación aterosclerótica en un paciente con una puntuación de Agatston de al menos 20, con mayor preferencia al menos 40, al menos 60 o al menos 80 y con la máxima preferencia al menos 100.
El estrés estructural de la placa aumenta inicialmente con la calcificación temprana de la placa y puede conducir a la ruptura de la placa lo que a su vez puede causar un ataque cardíaco. En consecuencia, el inhibidor de PARP se usa para tratar la calcificación aterosclerótica en un paciente que muestra una calcificación temprana en la aterosclerosis. Podrían obtenerse imágenes del sistema vascular de un paciente mediante el uso de la histología virtual por ecografía intravascular (VH-IVUS), y a partir de ahí se podría identificar Ios pacientes que presentan una calcificación temprana.
En consecuencia, Ios inventores identificaron un nuevo grupo de pacientes, específicamente pacientes que padecen calcificación aterosclerótica, que pueden tratarse con éxito mediante el uso de inhibidores de PARP. Los inventores señalan que las estatinas se usan normalmente para tratar la aterosclerosis. Sin embargo, como se muestra en el Ejemplo 9, las estatinas no tratan la calcificación per se, por lo que la calcificación aterosclerótica no se trataría mediante el uso de estatinas. De hecho, existe alguna evidencia de que la calcificación de la íntima aumenta con el uso de estatinas. En consecuencia, la presente invención permite que el nuevo grupo de pacientes sea tratado específica y deliberadamente mediante el uso de inhibidores de PARP.
Preferentemente, el inhibidor de PARP se usa para tratar, prevenir o mejorar la calcificación aterosclerótica en un sujeto que padece hipertensión, estenosis aórtica, hipertrofia cardíaca, isquemia miocárdica y de extremidades inferiores e insuficiencia cardíaca congestiva.
El inhibidor de PARP se puede seleccionar de un grupo que consiste de: olaparib; rucaparib; niraparib; veliparib; talazoparib; minociclina; cilostazol; clorhidrato de N-(6-oxo-5,6-dihidrofenantridin-2-il)-(N,N-dimetilamino)acetamida (PJ34); 3-aminobenzamida (3-AB); y 3,4-dihidro-5-[4-(1-piperidinil)butoxil]-1(2H)-isoquinolinona (DPQ), o un derivado de la misma.
Preferentemente, el inhibidor de PARP es capaz de inhibir la PARP que se produce por una célula de mamífero. Preferentemente, el inhibidor de PARP comprende olaparib; rucaparib; niraparib; veliparib; talazoparib; minociclina; o cilostazol; o un derivado del mismo. Alternativamente, el inhibidor de PARP comprende PJ34; minociclina; 3-AB; o d p q .
El derivado de la minociclina puede tener la fórmula general [II]:
Figure imgf000004_0001
en donde, cada R3 es una C1-3 alquilo.
El derivado de veliparib puede tener la fórmula general [III]:
Figure imgf000004_0002
[Fórmula III]
en donde, R4 es una C1.3 alquilo; y
R5 y Rejunto con el átomo de carbono al que están unidos forman un grupo heterocicilo de cinco o seis miembros. Preferentemente, R4 es metilo. Preferentemente, R5 y Rejunto con el átomo de carbono al que están unidos forman un grupo heterocicilo de cinco miembros. Con mayor preferencia, el grupo heterocicilo es pirrolidina o tetrahidrofurano. El derivado de niraparib puede tener la fórmula general [IV]:
Figure imgf000004_0003
en donde, L1 es un grupo arilo o heteroarilo de seis miembros; y
R7 y R8 junto con el átomo de carbono al que están unidos forman un grupo heterocicilo de cinco o seis miembros. Preferentemente, L1 es un grupo fenilo. Preferentemente, L1 se sustituye en las posiciones para. Preferentemente, R7 y R8 junto con el átomo de carbono al que están unidos forman un grupo heterocicilo de seis miembros. Con mayor preferencia, el grupo heterocicilo es piperidina, tetrahidropirano o tiano.
El derivado de rucaparib puede tener la fórmula general [V]:
Figure imgf000005_0001
L2 es un grupo arilo o heteroarilo de seis miembros; y
Rg es una C1-3 alquilo.
Preferentemente, X6 es flúor, cloro o bromo, con mayor preferencia flúor o cloro, con la máxima preferencia flúor. Preferentemente, L2 es un grupo fenilo. Preferentemente, L2 se sustituye en las posiciones para. Preferentemente, Rg es metilo.
El derivado de olaparib puede tener la fórmula general [VI]:
Figure imgf000005_0002
en donde, X7 es un halógeno;
L3 es un grupo cicloalquilo o heterociclilo de seis miembros; y
R10 y R11 Junto con el átomo de carbono al que están unidos forman un grupo cicloalquilo de 3 a 6 miembros.
Preferentemente, X7 es flúor, cloro o bromo, con mayor preferencia flúor o cloro, con la máxima preferencia flúor. Preferentemente, L3 es un grupo heterociclilo de seis miembros. Con mayor preferencia, L3 es piperazina, morfolina, tiomorfolina, dioxano o ditiano. Con mayor preferencia, L3 es
Figure imgf000005_0003
Preferentemente, R10 y R11 Junto con el átomo de carbono al que están unidos forman ciclopropilo, ciclobutilo o ciclopentilo, con mayor preferencia ciclopropilo o ciclobutilo, y con la máxima preferencia cicloproprilo.
El derivado
Figure imgf000005_0004
en donde, X8 es un halógeno;
Xg es halógeno; y
R12 es una C1-3 alquilo.
Preferentemente, X8 es flúor, cloro o bromo, con mayor preferencia flúor o cloro, con la máxima preferencia flúor. Preferentemente, Xg es flúor, cloro o bromo, con mayor preferencia flúor o cloro, con la máxima preferencia flúor. Preferentemente, R12 es metilo.
Como se muestra en las Figuras 9B, 13 y 16, la minociclina inhibe la calcificación de una manera dependiente de la dosis.
Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen cualquier sal de un inhibidor de PARP que se proporciona en la presente descripción que conserve sus propiedades biológicas y que no sea tóxica o indeseable de cualquier otra manera para uso farmacéutico. La sal farmacéuticamente aceptable puede derivarse de una variedad de contraiones orgánicos e inorgánicos bien conocidos en la técnica.
La sal farmacéuticamente aceptable puede comprender una sal de adición de ácido que se forma con ácidos orgánicos o inorgánicos tales como clorhídrico, bromhídrico, sulfúrico, nítrico, fosfórico, sulfámico, acético, trifluoroacético, tricloroacético, propiónico, hexanoico, ciclopentilpropiónico, glicólico, glutárico, pirúvico, láctico, malónico, succínico, sórbico, ascórbico, málico, maleico, fumárico, tartárico, cítrico, benzoico, 3-(4-hidroxibenzoi!)benzoico, pícrico, cinámico, mandélico, ftálico, láurico, metanosulfónico, etanosulfónico, 1,2-etano-disulfónico, 2-hidroxietanosulfónico, bencenosulfónico, 4-clorobencenosulfónico, 2-naftalenosulfónico, 4-toluenosulfónico, alcanfórico, alcanforsulfónico, 4-metilbiciclo[2.2.2]-oct-2-eno-1-carboxílico, glucoheptónico, 3-fenilpropiónico, trimetilacético, ácidos terc-butilacético, lauriisulfúrico, glucónico, benzoico, glutámico, hidroxinaftoico, salicílico, esteárico, ciciohexilsulfámico, quínico, mucónico y similares. Alternativamente, la sal farmacéuticamente aceptable puede comprender una sal de adición de base que se forma cuando un protón del ácido presente en el compuesto original se reemplaza por un ion metálico, por ejemplo, un ion de metal alcalino, un ion alcalinotérreo, un ion de aluminio, un metal alcalino o hidróxidos de metales alcalinotérreo, como sodio, potasio, calcio, magnesio, aluminio, litio, zinc e hidróxido de bario, o coordinados con una base orgánica, como aminas orgánicas alifáticas, alicíclicas o aromáticas, como amoniaco, metilamina, dimetilamina, dietilamina, picolina, etanolamina, dietanolamina, trietanolamina, etilendiamina, lisina, arginina, ornitina, colina, N,N'-dibenciletilen-diamina, cloroprocaína, dietanolamina, procaína, N-bencilfenetilamina, N-metilglucamina, piperazina, hidróxido de tetrametilamonio y similares.
Por ejemplo, una sal farmacéuticamente aceptable de pipaciclina puede ser penimepiciclina.
Un solvato farmacéuticamente aceptable se refiere a un inhibidor de PARP que se proporciona en la presente descripción, o una sal del mismo, que incluye además una cantidad estequiométrica o no estequiométrica de solvente unido por fuerzas intermoleculares no covalentes. Cuando el solvente es agua, el solvato es un hidrato.
Se apreciará que el inhibidor de PARP que se describe en la presente descripción, o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo, puede usarse en un medicamento que puede usarse en una monoterapia (es decir, uso del inhibidor de PARP soIo), para tratar, mejorar o prevenir la calcificación vascular de la media o la calcificación aterosclerótica de la íntima. Alternativamente, el inhibidor de PARP o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo puede usarse como complemento de, o en combinación con, terapias conocidas para tratar, mejorar o prevenir la calcificación vascular de la media o la calcificación aterosclerótica de la íntima.
El inhibidor de PARP se puede combinar en composiciones que tienen un número de formas diferentes que depende, en particular, de la manera en que se va a usar la composición. Por lo tanto, por ejemplo, la composición puede estar en forma de polvo, comprimido, cápsula, líquido, pomada, crema, gel, hidrogel, aerosol, atomizador, solución micelar, parche transdérmico, suspensión de liposomas o cualquier otra forma adecuada que se pueda administrar a una persona o animal que necesite tratamiento. Se apreciará que el vehículo de medicamentos de acuerdo con la invención debe ser uno que sea bien tolerado por el sujeto al que se administra.
Los medicamentos que comprenden el inhibidor de PARP que se describen en la presente descripción pueden usarse de varias formas. Las composiciones que comprenden el inhibidor de PARP de la invención se pueden administrar por inhalación (por ejemplo, intranasalmente). Las composiciones también se pueden formular para uso tópico. Por ejemplo, se pueden aplicar cremas o pomadas sobre la piel.
El inhibidor de PARP de acuerdo con la invención también puede incorporarse dentro de un dispositivo de liberación lenta o retardada. Tales dispositivos se pueden, por ejemplo, insertar sobre o debajo de la piel y el medicamento puede liberarse durante semanas o incluso meses. El dispositivo se puede ubicar al menos en una región adyacente al sitio de tratamiento. Tales dispositivos pueden ser particularmente ventajosos cuando se requiere un tratamiento a largo plazo con el inhibidor de PARP que se usa de acuerdo con la invención y que normalmente requeriría una administración frecuente (por ejemplo, al menos una inyección diaria).
El inhibidor de PARP y las composiciones de acuerdo con la invención pueden administrarse a un sujeto mediante inyección en el torrente sanguíneo o directamente en un sitio que requiera tratamiento, por ejemplo, un vaso sanguíneo específico (vena o arteria) que sufre calcificación. Las inyecciones pueden ser intravenosas (bolo o infusión) o subcutáneas (bolo o infusión) o intradérmicas (bolo o infusión).
En una modalidad preferida, el inhibidor de PARP se administra por vía oral. En consecuencia, el inhibidor de PARP puede estar contenido dentro de una composición que, por ejemplo, puede ingerirse por vía oral en forma de comprimido, cápsula o líquido.
Se apreciará que la cantidad de inhibidor de PARP que se requiere está determinada por su actividad biológica y biodisponibilidad, que a su vez depende del modo de administración, las propiedades fisicoquímicas del inhibidor de PARP y si se usará como monoterapia o en una terapia combinada. La frecuencia de administración también estará influenciada por la vida media del inhibidor de PARP dentro del sujeto que se trata. Los expertos en la técnica pueden determinar las dosis óptimas a administrar, y variarán con el inhibidor de PARP particular en uso, la potencia de la composición farmacéutica, el modo de administración y el avance de la calcificación vascular de la media. Los factores adicionales en dependencia del sujeto particular que se trata, que incluyen la edad del sujeto, el peso, el género, la dieta, y el tiempo de administración, resultarán en una necesidad de ajustar las dosis.
El inhibidor de PARP puede administrarse antes, durante o después del inicio de la calcificación vascular de la media a tratar. Las dosis diarias se pueden dar como una sola administración. Sin embargo, preferentemente, el inhibidor de PARP se administra dos o más veces durante un día, y con la máxima preferencia dos veces al día.
La dosis diaria del inhibidor de PARP a administrar puede estar entre 1 mg y 10000 mg o entre 2 mg y 2000 mg, con mayor preferencia entre 5 mg y 1000 mg o entre 10 mg y 200 mg, y con la máxima preferencia entre 15 mg y 100 mg o entre 20 mg y 50 mg.
En una modalidad más preferida, el inhibidor de PARP de acuerdo con la invención se puede administrar en dos dosis diarias, cada dosis estará entre 1 mg y 5000 mg o entre 2 mg y 1000 mg, con mayor preferencia entre 3 mg y 500 mg o entre 4 mg y 100 mg, y con la máxima preferencia entre 5 mg y 50 mg o entre 10 mg y 25 mg. Una dosis más preferida incluye dos dosis de 10 a 25 mg.
Un paciente que recibe tratamiento puede tomar una primera dosis al despertar y luego una segunda dosis por la noche (si está en un régimen de dos dosis) o en intervalos de 3 o 4 horas a partir de entonces. Alternativamente, puede usarse un dispositivo de liberación lenta para proporcionar dosis óptimas del inhibidor de PARP y/o tetraciclina de acuerdo con la invención a un paciente sin la necesidad de administrar dosis repetidas.
Los procedimientos conocidos, como los que se emplean convencionalmente por la industria farmacéutica (por ejemplo experimentación in vivo, ensayos clínicos, etc.), pueden usarse para formar formulaciones específicas que comprenden el inhibidor de PARP de acuerdo con la invención y regímenes terapéuticos precisos (tales como dosis diarias del inhibidor de PARP y la frecuencia de administración). Los inventores creen que son los primeros en describir una composición farmacéutica para tratar la calcificación vascular de la media, basándose en el uso del inhibidor de PARP de la invención.
Por tanto, en un tercer aspecto, se proporciona una composición farmacéutica para tratar la calcificación vascular de la media o la calcificación aterosclerótica de la íntima que comprende un inhibidor de PARP, o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
La composición farmacéutica puede usarse en la mejora, prevención o tratamiento terapéutico en un sujeto de calcificación vascular de la media o calcificación aterosclerótica de la íntima.
También se proporciona un proceso para preparar la composición según el tercer aspecto, el proceso que comprende poner en contacto una cantidad terapéuticamente efectiva de un inhibidor de PARp del primer aspecto, o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Un "sujeto" puede ser un vertebrado, un mamífero o un animal doméstico. Por tanto, el inhibidor de PARP, las composiciones y los medicamentos de acuerdo con la invención pueden usarse para tratar cualquier mamífero, por ejemplo ganado (por ejemplo, un caballo), mascotas, o pueden usarse en otras aplicaciones veterinarias. Sin embargo, con la máxima preferencia, el sujeto es un ser humano.
Una "cantidad terapéuticamente efectiva" del inhibidor de PARP es cualquier cantidad que, cuando se administra a un sujeto, es la cantidad de fármaco que se necesita para tratar la calcificación vascular de la media.
Por ejemplo, la cantidad diaria terapéuticamente efectiva del inhibidor de PARP que se usa puede estar entre 1 mg y 10 000 mg o entre 2 mg y 2000 mg, con mayor preferencia entre 5 mg y 1000 mg o entre 10 mg y 200 mg, y con la máxima preferencia entre 15 mg y 100 mg o entre 20 mg y 50 mg. Se prefieren dos dosis diarias de 10-25 mg. Un "vehículo farmacéuticamente aceptable" como se referencia en la presente descripción, es cualquier compuesto conocido o combinación de compuestos conocidos que los expertos en la técnica conocen por ser útil en la formulación de composiciones farmacéuticas.
En una modalidad, el vehículo farmacéuticamente aceptable puede ser un sólido y la composición puede estar en forma de polvo o comprimido. Un vehículo sólido farmacéuticamente aceptable puede incluir una o más sustancias que también pueden actuar como agentes saborizantes, lubricantes, solubilizantes, agentes de suspensión, colorantes, rellenos, deslizantes, auxiliares de compresión, aglutinantes inertes, edulcorantes, conservantes, tintes, revestimientos o agentes de desintegración de comprimidos. El vehículo también puede ser un material encapsulante. En los polvos, el vehículo es un sólido finamente dividido que se mezcla con los agentes activos finamente divididos (es decir, el inhibidor de PARP) de acuerdo con la invención. En los comprimidos, el inhibidor de PARP activo puede mezclarse con un vehículo que tenga las propiedades de compresión necesarias en proporciones adecuadas y compactarse en la forma y tamaño deseados. Los polvos y comprimidos contienen preferentemente hasta un 99 % del inhibidor de PARP activo.
Los vehículos sólidos adecuados incluyen, por ejemplo, fosfato de calcio, estearato de magnesio, talco, azúcares, lactosa, dextrina, almidón, gelatina, celulosa, polivinilpirrolidona, ceras de bajo punto de fusión y resinas de intercambio iónico. En otra modalidad, el vehículo farmacéutico puede ser un gel y la composición puede estar en forma de crema o similar.
Sin embargo, el vehículo farmacéutico puede ser un líquido, y la composición farmacéutica tiene forma de una solución. Los vehículos líquidos son usados para preparar soluciones, suspensiones, emulsiones, jarabes, elixires y composiciones presurizadas. El inhibidor de Pa Rp de acuerdo con la invención puede disolverse o suspenderse en un vehículo líquido farmacéuticamente aceptable tal como agua, un solvente orgánico, una mezcla de ambos o aceites o grasas farmacéuticamente aceptables. El vehículo líquido puede contener otros aditivos farmacéuticos adecuados tales como solubilizantes, emulsionantes, tampones, conservantes, edulcorantes, agentes saborizantes, agentes de suspensión, agentes espesantes, colorantes, reguladores de viscosidad, estabilizadores u osmorreguladores. Los ejemplos de vehículos líquidos adecuados para administración oral y parenteral incluyen agua (que contiene parcialmente aditivos como los mencionados anteriormente, por ejemplo, derivados de celulosa, preferentemente solución de carboximetilcelulosa de sodio), alcoholes (incluidos alcoholes monohídricos y alcoholes polihídricos, por ejemplo, glicoles) y sus derivados, y aceites (por ejemplo, aceite de coco fraccionado y aceite de cacahuete). Para la administración parenteral, el vehículo puede ser un éster oleoso tal como oleato de etilo y miristato de isopropilo. Los vehículos líquidos estériles se usan en las composiciones en forma líquida estériles para administración parenteral. El vehículo líquido para las composiciones presurizadas puede ser un hidrocarburo halogenado u otro propelente farmacéuticamente aceptable.
Las composiciones farmacéuticas líquidas, que son soluciones o suspensiones estériles, se pueden utilizar, por ejemplo, mediante inyección intramuscular, intratecal, epidural, intraperitoneal, intravenosa y particularmente subcutánea. El inhibidor de PARP se puede preparar como una composición sólida estéril que se puede disolver o suspender en el momento de la administración mediante el uso de agua estéril, solución salina u otro medio inyectable estéril apropiado.
El inhibidor de PARP y las composiciones de la invención se pueden administrar en forma de una solución o suspensión estéril que contiene otros solutos o agentes de suspensión (por ejemplo, suficiente solución salina o glucosa para hacer que la solución sea isotónica), sales biliares, goma arábiga, gelatina, monoleato de sorbitán, polisorbato 80 (ésteres oleato de sorbitol y sus anhídridos copolimerizados con óxido de etileno) y similares. El inhibidor de PARP que se usa de acuerdo con la invención también se puede administrar por vía oral en forma de composición líquida o sólida. Las composiciones adecuadas para la administración oral incluyen formas sólidas, tales como píldoras, cápsulas, grageas, comprimidos y polvos, y formas líquidas, tales como soluciones, jarabes, elixires y suspensiones. Las formas útiles para la administración parenteral incluyen soluciones, emulsiones y suspensiones estériles.
De acuerdo con un aspecto adicional de la invención, se proporciona un inhibidor de poli(ADP ribosa) polimerasa (PARP), o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo, para el uso en el tratamiento, prevención o mejora de una enfermedad caracterizada por una calcificación vascular inapropiada.
De acuerdo con otro aspecto más de la invención, se proporciona un método para tratar, prevenir o mejorar una enfermedad caracterizada por una calcificación vascular inapropiada en un sujeto, que comprende el método a administrar a un sujeto que necesita tal tratamiento, una cantidad terapéuticamente efectiva de un inhibidor de la poli(ADP ribosa) polimerasa (PARP), o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo.
De acuerdo con otro aspecto más, se proporciona un método para reducir la calcificación vascular en un sujeto, que comprende el método a administrar a un sujeto que necesite dicho tratamiento, una cantidad terapéuticamente efectiva de un inhibidor de poli(ADP ribosa) polimerasa (PARP), o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo.
La calcificación vascular puede comprender calcificación aterosclerótica. Alternativamente, la calcificación vascular puede comprender una calcificación de la media.
Todas las características que se describen en la presente descripción (que incluyen cualquier reivindicación, resumen y figuras adjuntos), y/o todas las etapas de cualquier método o proceso que se describe, se pueden combinar con cualquiera de los aspectos anteriores en cualquier combinación, excepto las combinaciones donde al menos algunas de tales características y/o etapas son mutuamente excluyentes.
Para un mejor entendimiento de la invención, y para mostrar cómo se pueden llevar a cabo las modalidades de la misma, se hará referencia ahora, a manera de ejemplo, a las Figuras adjuntas en las que:
La Figura 1A muestra un espectro de RMN de correlación 13C-13C bidireccional de una matriz extracelular humana de VSMC in vitro después de la lisis celular y el lavado de la matriz. Los componentes del azúcar biosintetizados a partir de la glucosa están marcados con 13C, al igual que la glicina y la prolina/hidroxiprolina (presentes predominantemente en las proteínas de colágeno). Además de las señales esperadas de los aminoácidos glicina, prolina e hidroxiprolina del colágeno y de la glicosilación del colágeno (principalmente a-glucosil-p-galactosilo y p-galactosilo ligados a O), hay señales claras de poli(ADP ribosa). Las asignaciones en cursiva indican que hay señales de otras especies moleculares que solapan a las señales de poli(ADP ribosa); y la Figura IB ilustra el esquema de numeración de átomos de poli(ADP ribosa) usado en la Figura 1A;
La Figura 2 muestra la expresión de poli(ADP ribosa) (PAR)/daños en el ADN en lesiones de la arteria carótida humana. Fase: contraste (A) e imagen fluorescente (B) de lesiones de la carótida humana a bajo aumento (la barra de escala es de 150 pm). En la parte superior izquierda de la imagen está el núcleo acelular (AC) de la lesión, rodeado por un área de engrasamiento de la íntima (IT) con calcificación (CaP) junto a la media (parte inferior derecha). La calcificación de la lesión es claramente visible como un depósito oscuro en (A) y como una fluorescencia verde después de la tinción con calceína en (B). Los núcleos celulares se tiñen con colorante Hoechst y aparecen de color azul. La inmunotinción para el daños en el ADN (anticuerpo yH2AX, rojo) y PAR (anticuerpo clon 10H, verde) en la media (C y D, las barras de escala son 18 pm) revela una tinción que se localiza predominantemente cerca del núcleo; por el contrario, en el área de engrosamiento/calcificación de la íntima (E y F, las barras de escala son de 16 pm) la tinción es más extensa y se localiza en asociación con el núcleo así como también con áreas citoplasmáticas y/o extracelulares;
La Figura 3 muestra la expresión de poli(ADP ribosa) (PAR)/daños en el ADN en la placa de crecimiento óseo fetal de oveja. Fase: contraste (A) e imagen fluorescente (B) de la placa de crecimiento fetal de oveja a bajo aumento (la barra de escala es de 150 pm). En la parte superior izquierda de la imagen está la zona del cartílago hipertrófico (HC) de la placa de crecimiento, que rodea la zona de calcificación (CF), donde comienza a formarse el mineral (parte inferior derecha). El mineral es claramente visible por la fluorescencia verde después de la tinción con calceína en (B). Los núcleos celulares se tiñen con colorante Hoechst y aparecen de color azul. La inmunotinción para PAR (anticuerpo clon 10H, verde) y daños en el ADN (anticuerpo H2A.X, rojo) en la zona HC cerca del borde donde se produce la mineralización (C y D, las barras de escala son 10 pm) revela una tinción predominantemente localizada cerca del núcleo (flecha), pero es visible una tinción débil lejos del ADN nuclear (asterisco). En la zona de CF que rodea las trabéculas óseas (E y F, las barras de escala son 10 um) PAR y las tinciones de daños en el ADN se localizan en asociación con el núcleo (flecha), así como también con áreas citoplasmáticas y/o extracelulares (asterisco);
La Figura 4A y B son gráficos que muestran la toxicidad del clorhidrato de N-(6-oxo-5,6-dihidrofenantridin-2-il)-(N,N-dimetilamino) acetamida (PJ34), minociclina (MC), cilostazol (CS), bosentan MH (Bos MH), pentoxifilina (PF), diltiazem (DZ), dipiridamol (DP), 3-aminobenzamida (3-AB) y 3,4-dihidro-5-[4-(1-piperidinil)butoxil]-1(2H )-isoquinolinona (DPQ) a concentraciones de 0 a 100 pM, y el vehículo de DMSO en las diluciones correspondientes, durante siete días para células de músculo liso vascular bovino (bVSMC);
La Figura 5Ay B son gráficos que muestran la toxicidad de PJ34, minociclina (MC), cilostazol (CS), bosentan MH (Bos MH), pentoxifilina (PF), diltiazem (DZ), dipiridamol (DP), 3-AB y DPQ en concentraciones de 0 a 100 pM, y el vehículo DMSO en las diluciones correspondientes, durante siete días para monocitos-macrófagos humanos (h MM);
La Figura 6 muestra los resultados obtenidos mediante el uso de la tinción con Rojo de Alizarina S donde los bVSMC se cultivaron solo con medio (NA) o en un medio GAD y no se agregaron inhibidores o se añadieron PJ34, minociclina (MC), cilostazol (CS), bosentan MH (Bos MH), pentoxifilina (PF), diltiazem (DZ), dipiridamol (DP) o 3-AB a una concentración de 10 pM;
La Figura 7A es un gráfico que muestra la masa de calcio que se obtiene de las placas en las que los bVSMC se cultivaron solo con medio (NA) y no se agregaron inhibidores o se añadieron J34, minociclina (m C), cilostazol (CS), bosentan MH (Bos MH), pentoxifilina (PF), diltiazem (DZ), dipiridamol (DP) o 3-AB a una concentración de 10 pM; y La Figura 7B es un gráfico que muestra la masa de calcio que se obtiene de las placas donde se cultivaron bvsM c en un medio GAD y no se agregaron inhibidores o se añadieron PJ34, minociclina (MC), cilostazol (CS), bosentan MH (Bos MH), pentoxifilina (PF), diltiazem (DZ), dipiridamol (DP) o 3-AB a una concentración de 10 pM;
La Figura 8 es un gráfico que muestra el contenido de proteína para cada una de las placas donde se dio el contenido de calcio en la Figura 7;
La Figura 9A y B son gráficos que normalizan los resultados que se muestran en las Figuras 7A y B respectivamente para dar la masa de calcio por masa de proteína;
La Figura 10 es un gráfico que muestra los resultados de viabilidad celular de bVSMC que se incubaron durante 7 días con medio de control (sin GAD) o con medio de p-GAD (con GAD) en presencia de inhibidores potenciales (NA) o en presencia de PJ34 (PJ) o minociclina (MC) a concentraciones de 10 pM, 1 pM o 0,1 pM;
La Figura 11 es un gráfico que muestra los resultados de viabilidad celular de bVSMC que se incubaron durante 9 días con medio de control (sin GAD) o con medio de p-GAD (con GAD) en presencia de inhibidores potenciales (NA) o en presencia de PJ34 (PJ) o minociclina (MC) a concentraciones de 10 pM, 1 pM o 0,1 pM;
La Figura 12 es un gráfico que muestra la concentración de Ca2+ en una muestra de bVSMC que se incubaron durante 7 días con medio de control (sin GAD) o con medio de p-GAD (con GAD) en presencia de inhibidores potenciales (NA) o en presencia de PJ34 o minociclina (MC) a concentraciones de 10 |jM, 1 j M o 0,1 |jM;
La Figura 13 es un gráfico que muestra la concentración de Ca2+ en una muestra de bVSMC que se incubaron durante 9 días con medio de control (sin GAD) o con medio de p-GAD (con GAD) en presencia de inhibidores potenciales (NA) o en presencia de PJ34 o minociclina (MC) a concentraciones de 10 j M, 1 j M o 0,1 jm ;
La Figura 14 es un gráfico que muestra la masa total de proteína en una muestra de bVSMC que se incubaron durante 7 días solo en medio de control (-) o con medio de p-GAD (+) en presencia de inhibidores potenciales (NA) o en presencia de PJ34 o minociclina (MC) a concentraciones de 10 j M, 1 j M o 0,1 j M;
La Figura 15 es un gráfico que muestra la masa total de proteína en una muestra de bVSMC que se incubaron durante 9 días solo en medio de control (-) o con medio de p-GAD (+) en presencia de inhibidores potenciales (NA) o en presencia de PJ34 o minociclina (MC) a concentraciones de 10 j M, 1 j M o 0,1 j M;
La Figura 16 es un gráfico que muestra la concentración de Ca2+ en una muestra de bVSMC cultivadas en medio GAD durante nueve días con o sin un inhibidor potencial que se expresa como un porcentaje en comparación con las bVSMC cultivadas en medio GAD durante nueve días sin un inhibidor potencial (Na );
La Figura 17 es un gráfico que muestra la masa de calcio que se obtiene de las placas donde se cultivaron células de músculo liso vascular humano (hVSMC) en presencia de d Ms O solo (control negativo), DMSO Ca/P (control positivo para la mineralización) o en condiciones de mineralización en la presencia de un inhibidor de PARP (PJ-34, minociclina o cilostazol) a diversas concentraciones;
La Figura 18 es un gráfico que muestra el contenido de proteína para cada una de las placas donde se dio el contenido de calcio en la Figura 17;
La Figura 19 es un gráfico que normaliza los resultados que se muestran en la Figura 17 para dar la masa de calcio por masa de proteína;
La Figura 20 es un gráfico que muestra la masa de calcio que se obtiene de las placas donde se cultivaron células de músculo liso vascular humano (hVSMC) en presencia de d Ms O solo (control negativo), DMSO Ca/P (control positivo para la mineralización) o en condiciones de mineralización en la presencia de un inhibidor de PARP (minociclina, cilostazol, Olaparib, Talazoparib, Rucaparib, Niraparib, Veliparib o Pj-34) a una concentración de 3 j M;
La Figura 21 es un gráfico que muestra el contenido de proteína para cada una de las placas donde se dio el contenido de calcio en la Figura 20;
La Figura 22 es un gráfico que normaliza los resultados que se muestran en la Figura 20 para dar la masa de calcio por masa de proteína;
La Figura 23 muestra los resultados que se obtienen mediante el uso de la tinción con Rojo de Alizarina S para cada una de las placas donde se dio el contenido de calcio en la Figura 20;
La Figura 24 muestra una fotografía de cerca para cada una de las placas donde se dio el contenido de calcio en la Figura 20;
La Figura 25 es un gráfico que muestra la masa de calcio que se obtiene de las placas donde se cultivaron células de músculo liso vascular humano (hVSMC) en presencia de d Ms O solo (control negativo), DMSO Ca/P (control positivo para la mineralización) o en condiciones de mineralización en la presencia de un inhibidor de PARP (veliparib, minociclina o cilostazol) u otro fármaco (bosentan, pentoxifilina, losartán, amlodipino o atorvastatina) en varias concentraciones, como se indica en el gráfico;
La Figura 26 es un gráfico que muestra el contenido de proteína para cada una de las placas donde se dio el contenido de calcio en la Figura 25;
La Figura 27 es un gráfico que normaliza los resultados que se muestran en la Figura 25 para dar la masa de calcio por masa de proteína; y
La Figura 28A muestra calcificación aterosclerótica; y la Figura 28B muestra calcificación de la media.
Los inventores llevaron a cabo diversos experimentos que se pueden resumir así:
Ejemplo 1: Demostrar la conexión fisiológica entre poli(ADP ribosa) (PAR) y la calcificación vascular;
Ejemplo 2: Examinar la toxicidad de los inhibidores de PARP/tetraciclinas para las células del músculo liso vascular bovino;
Ejemplo 3: Examinar la toxicidad de los inhibidores de PARP/tetraciclinas para los monocitos macrófagos humanos; Ejemplo 4: Pruebas iniciales de inhibidores de PARP/tetraciclinas en un modelo de calcificación vascular de células de músculo liso vascular bovino in vitro;
Ejemplo 5: Dependencia de la dosis de los inhibidores del ensayo sobre los niveles de calcificación en el modelo de calcificación vascular de células de músculo liso vascular bovino in vitro;
Ejemplo 6: Sugerencia de dosis de ejemplo para inhibidores de prueba mediante el uso de una correlación de concentración pk;
Ejemplo 7: Pruebas iniciales de inhibidores de PARP/tetraciclinas en un modelo de calcificación vascular de células de músculo liso vascular humano in vitro;
Ejemplo 8: Pruebas adicionales de inhibidores de PARP/tetraciclinas en un modelo de calcificación vascular de células de músculo liso vascular humano in vitro, que incluye olaparib, rucaparib, niraparib, veliparib y talazoparib en la lista de compuestos que se probaron; y Ejemplo 9: Pruebas adicionales de inhibidores de PARP/tetraciclinas y otros fármacos cardiovasculares comunes en un modelo de calcificación vascular de células de músculo liso vascular humano in vitro, que incluye losartán, amlodipino y atorvastatina en la lista de compuestos que se probaron.
Ejemplo 1: Demostrar la conexión fisiológica entre poll(ADP rlbosa) (PAR) y la calcificación vascular
Las células de músculo liso vascular (VSMC) calcifican su matriz extracelular circundante cuando están sometidas a estrés. Se usó un modelo de tejido de VSMC in vitro para determinar si las VSMC que se someten a estrés producen poli(ADP ribosa) (PAR) en alguna cantidad apreciable.
En este modelo, las VSMC se cultivaron en altas concentraciones de glucosa, lo que induce estrés oxidativo en las células. Las células sintetizan la matriz extracelular y mineralizan la matriz, luego la lisis celular que imita la necrosis celular elimina las células de la matriz. Las matrices se lavaron al menos seis veces con tampón fosfato después de la lisis celular de modo que se eliminó cualquier componente molecular que no estuviera fuertemente unido a la matriz.
El medio de cultivo celular en estos experimentos contenía U-13C -glucosa y U-13C, 15N-glicina y prolina, de modo que todas las especies de azúcar que las células sintetizan a partir de la glucosa fueron marcadas con 13C así como el colágeno (que en su composición contiene ~33 % de glicina y 22 % de prolina/hidroxiprolina). A continuación, el contenido de colágeno y azúcar de las matrices resultantes podría examinarse mediante una correlación de espectros 13C-13C bidimensionales, que permiten la caracterización detallada de la composición de azúcares de la matriz con respecto al colágeno.
La Figura 1 muestra una correlación de espectros 13C-13 C bidimensional típico que se obtuvo de este experimento. Todos los espectros mostraron claramente las señales esperadas para PAR. El hecho de que se observan señales de RMN 13C de PAR después que se lavó la matriz indica una fuerte unión o retención de PAR en la matriz.
Los inventores luego fotografiaron ex vivo lesiones de la arteria carótida humana por depósitos de calcificación y la presencia de PAR y daños en el ADN (el rojo es el anticuerpo H2A.X). Se fotografiaron los depósitos minerales mediante el uso de imágenes de contraste de fase y tinción con calceína. En las secciones adyacentes, se usó tinción inmunohistoquímica indirecta para fotografiar imágenes de PAR (mediante el uso del clon 10H de anticuerpo monoclonal anti poli(ADP ribosa), fluorescencia verde) y daños en el ADN (mediante el uso de un anticuerpo monoclonal contra H2A.X, fluorescencia roja).
La Figura 2 muestra una imagen de contraste de fase y una imagen fluorescente de secciones adyacentes de una lesión. Tanto la imagen de contraste de fase como la imagen de fluorescencia de la tinción con calceína muestran claramente la presencia de depósitos minerales en la región de engrasamiento de la íntima en la lesión, adyacente al núcleo acelular necrótico de la lesión. En la sección adyacente (grosor de sección 5 |jm), hay una tinción significativa para poli(ADP ribosa), tanto en la región de los núcleos celulares como en las áreas de la matriz citoplasmática y/o extracelular. Patrones similares de tinción de poli(ADP ribosa) se ven en lesiones ateroscleróticas de la arteria coronaria ex vivo.
Una pregunta clave fue qué conduce a la síntesis de poli(ADP ribosa) en el desarrollo del hueso y en el tejido vascular sometido a estrés oxidativo. La poli(ADP ribosa) tiene funciones bien documentadas en la muerte celular (apoptosis a través de la liberación mitocondrial de AIF o parthanatos cuando el daño del ADN conduce a una expresión excesiva de PARP que causa deficiencia de la glucólisis) y en la reparación del ADN. En términos de muerte celular asociada con la calcificación de la matriz, entre el 60 - 80 % de los osteoblastos mueren durante la calcificación ósea. De manera similar, la muerte celular (apoptosis y necrosis) siempre precede a la calcificación vascular, ya sea que la calcificación esté asociada con aterosclerosis o a la calcificación de la media. La posibilidad de que el daño del ADN se asocie con la calcificación vascular es fuerte: El daño del ADN en las células del músculo liso vascular sometidas a estrés oxidativo de especies reactivas de oxígeno/nitrógeno es un escenario probable. Quizás de manera menos intuitiva y por lo tanto aún más interesante, las células SAOS-2, una línea celular osteoblástica, liberan peróxido de hidrógeno cuando expresan marcadores osteogénicos y la liberación de peróxido de hidrógeno va de la mano con la síntesis de poli(ADP ribosa), lo que sugiere un posible mecanismo dependiente del daño del ADN de la síntesis de poli(ADP ribosa) también en el desarrollo óseo.
Por lo tanto, los inventores plantearon la hipótesis de que la aparición de poli(ADP ribosa) en la matriz extracelular puede deberse a la muerte celular dependiente del daño del ADN y, por lo tanto, examinaron los depósitos de calcificación ósea en desarrollo como los de calcificación vascular humana para detectar la presencia de daño en el ADN en las células asociadas espacialmente dentro de regiones calcificantes. La Figura 2 (columna de la derecha) muestra que en la calcificación vascular, la tinción de poli(ADP ribosa) tanto nuclear como extracelular se localiza conjuntamente con la histona fosforilada, H2A.X, un marcador de daño en el ADN.
La Figura 3 muestra una relación muy similar entre la poli(ADP ribosa) y H2A.X en la placa de crecimiento óseo fetallocalización conjunta de poli(ADP ribosa) y H2A.X en núcleos celulares y en la matriz extracelular.
La asociación directa de poli(ADP ribosa) con depósitos minerales óseos y vasculares sugiere un vínculo mecanístico entre la deposición extracelular de poli(ADP ribosa) y la inducción de la formación de minerales.
Ejemplo 2: Toxicidad de los inhibidores de la poli(ADP ribosa) polimerasa (PARP) durante siete días para las células del músculo liso vascular bovino (bVSMC)
Dado el vínculo mecanístlco entre la deposición extracelular de PAR y la Inducción de la formación de minerales, se decidió probar los inhibidores de PARP para ver si inhibirían la calcificación vascular.
Se demostró que PJ34, minociclina (MC) y 3-AB inhiben la PARP producida por una célula de mamífero. En consecuencia, estos compuestos se identificaron para su ensayo.
Adicionalmente, se demostró que el cilostazol (CS), bosentan MH (Bos MH), pentoxifilina (PF), diltiazem (DZ) y dipiridamol (DP) inhiben la PARP recombinante. En consecuencia, aunque no se sabe con certeza si estos compuestos son verdaderos inhibidores de PARP, se decidió que también deberían probarse.
La toxicidad de los compuestos identificados para las VSMC bovinas se midió mediante el uso del ensayo MTT, que mide la actividad de las enzimas deshidrogenasa de las células vivas. Este ensayo puede detectar tanto la muerte como la proliferación celular.
Metodología
Las VSMC bovinas se sembraron en placas de 96 pocilios y se cultivaron en M199/FCS al 20 % durante 1 día. Luego, las células se incubaron con concentraciones de inhibidor de 0,5 a 100 |jM (en medio M199 FBS al 5 %). Las células se incubaron con los inhibidores durante 7 días; se intercambió el medio -/+ inhibidores cada 2-3 días. Luego, se realizó el ensayo MTT. El vehículo de reserva DMSO se probó a concentraciones correspondientes a los inhibidores al 0,1 % de DMSO o menos.
Resultados
Los resultados se dan en la Tabla 1, más abajo, y se muestran gráficamente en la Figura 4. Los valores dados representan la media de tres experimentos, cada uno por duplicado. En la Figura 4, las barras de error representan el error estándar (SE) de los tres experimentos. Los valores sombreados en la tabla más abajo se consideran estadísticamente significativos en comparación con el control NA (sin inhibidor); p < 0,01 (ANOVA prueba LSD posthoc).
Tabla 1: Toxicidad de Ios inhibidores potenciales durante siete días para las bVSMCs
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Los resultados del ensayo MTT muestran que la Pentoxifilina (PF), 3AB, DPQ y el vehículo DMSO son prácticamente no tóxicos a las concentraciones ensayadas; el monohidrato de Bosentan (Bos) también muestra poca toxicidad. El PJ34, Dipiridamol (DP) y el Cilostazol (CS) son tóxicos a 50 y 100 |jM. La Minociclina (MC) y el Diltiazem no son tóxicos y, además, muestran un efecto estimulante sobre las células a 20 j M y más. Por lo tanto, todos Ios inhibidores son bien tolerados por las bVSMC a concentraciones similares a las que se usarán en un modelo de calcificación. Ejemplo 3: Toxicidad de Ios posibles inhibidores de Ios monocitos-macrófagos humanos (HMM)
Se realizó un conjunto similar de experimentos de toxicidad con monocitos-macrófagos humanos (HMM). Como Ios HMM no proliferan en cultivo, algunas veces puede ayudar una comparación entre las células en división (bVSMC) y las células que no se dividen (HMM) para distinguir entre Ios efectos que se deben a la toxicidad y Ios efectos que se deben a la proliferación. Además, para el uso previsto de Ios compuestos, es importante establecer que no son tóxicos para Ios macrófagos humanos.
La metodología fue como se describió en el Ejemplo 2, excepto que Ios HMM se cultivaron en medio M0-SFM (medio sin suero) para el cultivo de rutina así como también para el ensayo de toxicidad.
Resultados
Los resultados se dan en la Tabla 2, más abajo, y se muestran gráficamente en la Figura 5. Como antes, Ios valores dados representan la media de tres experimentos, cada uno por duplicado. En la Figura 5, las barras de error representan el error estándar (SE) de Ios tres experimentos. Los valores sombreados en la tabla más abajo se consideran estadísticamente significativos en comparación con el control NA (sin inhibidor); p < 0,01 (ANOVA prueba LSD post-hoc).
Tabla 2: Toxicidad de Ios inhibidores potenciales durante siete días para las HMMs
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El resultado del ensayo de toxicidad muestra que a una concentración de 100 |jM de MC, PJ34, DZ y BOS son Ios inhibidores más tóxicos para Ios HMM, mientras que CS, DP, PF, DPQ y 3AB son relativamente inocuos.
Los resultados de Ios Ejemplos 2 y 3 nos permiten Juzgar la toxicidad de las concentraciones de Ios compuestos que se requieren para inhibir la calcificación vascular en Ios siguientes ejemplos.
Ejemplo 4: Prueba inicial de calcificación vascular por PJ34, minociclina (MC), cilostazol (CS), bosentan MH (Bos), 3-AB, pentoxifilina (PF), diltiazem (DZ) y dipiridamol (d P)
Metodología
Para las bVSMC se usó un modelo de medio GAD (p-glicerofosfato 10 mM/ácido L-ascórbico-2-fosfato 0,1 mM/dexametasona 10 nM) para inducir la mineralización en bVSMC. En consecuencia, las células se sembraron en placas de cultivo de tejidos mediante el uso de medio de cultivo M199/FCS al 20 % y se cultivaron durante la noche. Al día siguiente, las células se trataron con medio solo (M199/FBS al 5 %) /- inhibidores o con el medio GAD (pglicerofosfato 10 mM/ácido L-ascórbico-2-fosfato 0,1 mM/dexametasona 10 nM) /inhibidores.
Todos Ios inhibidores se usaron a una concentración de 10 j M, como muestran Ios ejemplos 2 y 3 que todos Ios compuestos no fueron tóxicos a esta concentración y además, no parecían inducir otros efectos tales como una proliferación significativa que podría complicar la evaluación de cualquier efecto inhibidor de la calcificación que ellos puedan mostrar. Los medios /inhibidores se intercambiaron cada 2-3 días. Las VSMC bovinas se incubaron durante 7 días antes de la evaluación.
Tinción con Rojo de Alizarina S
La tinción con Rojo de Alizarina S es una mancha visual/histológica para Ios depósitos de calcio en Ios tejidos. Las células se fijan brevemente en paraformaldehído al 4 %/tampón PIPES pH 7,2 y subsecuentemente se tiñen durante 5 minutos con Rojo de Alizarina S (Rojo de Alizarina S al 2 %/DIW pH 4,2). El exceso de la mancha se elimina lavando en DIW. Los depósitos de minerales de calcio se tiñen de un rojo anaranjado brillante.
Ensayo de o-Cresolftaleína
El ensayo de o-Cresolftaleína es un método espectrofotométrico para medir concentraciones de Ca2+ en lisados de células/tejidos. Después de los experimentos de calcificación, las células se lavan brevemente para eliminar el medio y se añaden 100 l de HCl 0,1 N a cada pocilio para disolver los depósitos minerales. Luego, la concentración de Ca2+ de las muestras se mide espectrofotométricamente (a 570 nm) en el ensayo de o-cresolftaleína con la ayuda de una curva estándar de CaCÍ2 en un intervalo de concentración de ~ 0,02 - 270 g de Ca2+/ml.
Ensayo de proteínas de BioRad
El ensayo comercial de BioRad DC para proteínas se basa en el método de Lowry, también se conoce como la reacción de proteínas con un complejo de tartrato de cobre y posterior reacción con el reactivo de Folin. Después del experimento de calcificación, las células se lavan brevemente para eliminar el medio y se añaden 100 i de solución de soiubilización (NaOH 0,1 M/SDS al i %o/DIW) a cada pocilio para lisar las células. Las concentraciones de proteína de los lisados se determinan subsecuentemente en el ensayo de BioRad DC según las instrucciones del proveedor mediante el uso de BSA (albúmina de suero bovino) como estándar.
Resultados
En la Figura 6 se muestra una fotografía de las placas tratadas con tinción con Rojo de Alizarina S. Está claro que para las células tratadas solo con medio (NA) no fue visible ninguna tinción roja que se deba a Alizarina. Esto indica que se produjo poca o ninguna calcificación de los cultivos.
Por el contrario, las células tratadas con GAD se tiñeron positivamente con Alizarina lo que muestra una calcificación de los cultivos. A juzgar por el ojo, el grado de mineralización fue ligeramente menor en la muestra de minociclina (MC) y ligeramente peor en las muestras de PJ34 y Dipiridamol (DP).
El ensayo de o-Cresolftaleína permitió a los inventores cuantificar la deposición de Ca2+, como se muestra en las Figuras 7A y B.
Como se muestra en la Figura 7A, el ensayo de cresolftaleína mostró que el contenido de calcio en el grupo de tratamiento con NA fue muy bajo (básicamente en el límite de detección del ensayo). En el grupo de tratamiento con GAD, que se muestra en la Figura 7B, Ios niveles de calcio se elevan a aproximadamente 50 a 60 veces los de las células no tratadas.
Como se muestra en la Figura 7B, CS, Bos, 3AB y PF parecían no tener efecto sobre Ios niveles de calcio, mientras que PJ34 y DP parecían elevar Ios niveles de calcio. Sin embargo, DZ y particularmente MC parecieron reducir Ios niveles de calcio en comparación con las muestras en las que no se agregaron inhibidores.
Los resultados del ensayo de proteínas de BioRad se muestran en la Figura 8. Cuando se evalúa el grado en que un compuesto inhibe la calcificación, es habitual cuantificar el grado de inhibición como la masa de calcio en la muestra (determinada por el ensayo de cresolftaleína) por masa de proteína en la muestra (determinada por el ensayo de proteínas de BioRad). Esto se debe a que la masa total de proteína en la muestra puede aumentar durante el período de tiempo durante el cual se realiza el experimento, en este caso 7 días, debido al crecimiento celular, la proliferación o la síntesis celular de la matriz inducida por el compuesto que se añadió. Los resultados normalizados se muestran en la Figura 9.
Como se muestra en la Figura 9B, cuando Ios resultados se normalizan, CS todavía no parece tener un efecto sobre Ios niveles de calcio y que PJ34 y DP parece elevar Ios niveles de calcio. Sin embargo, Bos, 3AB, PF y DZ parecen tener niveles de calcio ligeramente más bajos, y MC parece reducir significativamente Ios niveles de calcio.
Ejemplo 5: Dependencia de la dosis de Ios inhibidores del ensayo sobre la calcificación en el modelo in vitro de calcificación vascular
Metodología
El modelo in vitro es el mismo modelo que se usó en el ejemplo 4; células de músculo liso vascular bovino (bVSMC) cultivadas para que produzcan matriz extracelular, con la adición del medio GAD (p-glicerofosfato 10 mM/ácido L-ascórbico-2-fosfato 0,1 mM/dexametasona 10 nM).
Como anteriormente, las células se trataron con medio solamente ("sin adiciones"; NA) /inhibidores, o con el medio GAD /- inhibidores. Los inhibidores usados fueron PJ34 y minociclina (MC) a 10 |jM, 1 |jM y 0,1 |jM. Se inspeccionó visualmente la mineralización de Ios cultivos celulares y se evaluó el grado de calcificación a Ios 7 días de tratamiento con GAD, ya que se planificó previamente como el primer punto de datos. El segundo punto de tiempo en el que se evaluó el grado de calcificación se tomó como 9 días, ya que la mineralización en las células tratadas con GAD pareció progresar con bastante rapidez. Se consideró arriesgado una mayor duración del tratamiento, ya que las células tienden a desprenderse de Ios pocilios y luego pueden perderse por completo.
De manera similar al ejemplo 4, se llevaron a cabo un ensayo de o-Cresolftaleína para la cuantificación de la deposición de Ca2+ y un ensayo de proteínas de BioRad para determinar el contenido de proteína. La metodología fue la misma que la que se describió en el ejemplo 4.
Adicionalmente, se realizó un ensayo de MTT como medida de la viabilidad/proliferación celular. Las VSMC bovinas se sembraron en placas de 96 pocilios y se cultivaron en M199/FCS al 20 % durante 1 día. Luego, las células se incubaron con concentraciones de inhibidor de 10 |jM, 1 |jM y 0,1 |jM (en medio M199 FBS al 5 %). Las células se incubaron con los inhibidores durante 7 o 9 días; se intercambió el medio -/+ inhibidores cada 2-3 días. Luego, se realizó el ensayo MTT.
Resultados
Ensayo de viabilidad celular MTT
Los resultados de viabilidad celular para las bVSMC que se incubaron durante 7 días se dan en la Tabla 3, más abajo, y se muestran gráficamente en la Figura 10. De manera similar, los resultados de viabilidad celular para las bVSMc que se incubaron durante 9 días se dan en la Tabla 4, más abajo, y se muestran gráficamente en la Figura 11. En cada caso, los valores dados representan la media de tres experimentos. En las Figuras 10 y 11, las barras de error representan la desviación estándar (SD) de los tres experimentos.
Tabla 3: Toxicidad del medio solo y del medio GAD en combinación con inhibidores potenciales durante siete días para las bVSMC
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Tabla 4: Toxicidad del medio solo y del medio GAD en combinación con inhibidores potenciales durante nueve días para las bVSMC
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Después de 9 días, la matriz/células que se trataron con el medio GAD comenzaron a enrollarse ligeramente dentro de los pocilios. El ensayo MTT mostró una caída en la producción de formazán de aproximadamente un 27 % en el grupo de tratamiento con GAD en comparación con el grupo de tratamiento con NA. Lo más probable es que esto se deba al enrollamiento de las células en los pocilios y al menor acceso/exposición de las células al MTT en lugar de representar una caída en la viabilidad celular. Esta noción está soportada por el hecho de que en el MC 10 |jM, las células de muestra se enrollaron considerablemente menos y no se observó una caída en la producción de formazán en este grupo de tratamiento.
Ensayo de cresolftaleína
Los resultados de la concentración de Ca2+ para las bVSMC que se incubaron durante 7 días se dan en la Tabla 5, más abajo, y se muestran gráficamente en la Figura 12. De manera similar, los resultados de la concentración de Ca2+ de las bVsMc que se incubaron durante 9 días se dan en
la Tabla 6, más abajo, y se muestra gráficamente en la Figura 13. En cada caso, los valores dados representan la media de triplicados. En las Figuras 12 y 13, las barras de error representan la desviación estándar (SD) de los triplicados.
Tabla 5: Concentración de Ca2+ que se encontró en las bVSMC cultivadas en medio solo y medio GAD en presencia de inhibidores potenciales durante siete días
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Tabla 6: Concentración de Ca2+ que se encontró en las bVSMC cultivadas en medio solo y medio GAD en presencia de inhibidores potenciales durante nueve días
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En las placas que no se trataron con el medio GAD (identificado como "tratamiento NA" en las Figuras 12 y 13) el contenido de Ca2+ fue muy bajo después de 7 y 9 días, como era de esperar.
Donde las placas se trataron con el medio GAD la concentración de Ca2+ fue sólo aproximadamente tres veces mayor que la concentración de Ca2+ de las placas que no trataron con el medio GAD después de 7 días de tratamiento cuando no había inhibidores presentes, ver las dos primeras barras en la Figura 12. Sin embargo, después de 9 días, se observó un aumento más dramático en la concentración de Ca2+ a aproximadamente veinticinco veces más que la que se observó para las placas que no se trataron con el medio GAD cuando no había inhibidores presentes, ver las dos primeras barras en la Figura 13.
Como se discutió en el ejemplo 4, al evaluar el grado en que un compuesto inhibe la calcificación, es habitual en la literatura cuantificar el grado de inhibición de la calcificación como la masa de calcio en la muestra por masa de proteína en la muestra. La masa total de proteína en la muestra se determinó mediante el ensayo de BioRad y se muestra en las Figuras 14 y 15. En estas Figuras, las muestras marcadas con un "+" se trataron con el medio g A d y las muestras marcadas con "-" no se trataron con el medio GAD.
En consecuencia, está claro que la masa total de proteína es mayor para los cultivos celulares tratados con el medio GAD en comparación con los que no se trataron con el medio g Ad . Sin embargo, el tratamiento con GAD no causa ningún cambio obvio en el número de células de la muestra, según se determinó por el ensayo MTT. Lo más probable es que el aumento de proteínas bajo el tratamiento con GAD en comparación con ningún tratamiento con GAD se deba a la estimulación de la matriz extracelular u otra producción de proteínas.
En consecuencia, los inventores creen que expresar el grado de calcificación por miligramo de proteína sobrestima cualquier efecto inhibidor de los inhibidores de prueba. Para superar este problema, se calculó el grado de calcificación de las placas que se trataron con el medio GAD y un inhibidor potencial como un porcentaje en comparación con las placas que se trataron con el medio GAD y sin inhibidor. Estos valores se dan en la tabla 7 y se muestran gráficamente en la Figura 16.
Tabla 7: Concentración de Ca2+ de las bVSMC cultivadas en medio GAD durante nueve días con o sin un inhibidor potencial que se expresa como un porcentaje en comparación con las placas cultivadas en medio GAD durante nueve días sin un inhibidor potencial
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La Minociclina redujo la deposición de Ca2+ a ~ 19 %, en comparación cuando no estuvo presente ningún inhibidor potencial, a concentraciones de 10 j M es decir una reducción de aproximadamente el 81 %. De manera similar, la minociclina redujo la deposición de Ca2+ a ~ 62 % en comparación cuando no estuvo presente ningún inhibidor potencial, a concentraciones de 1 j M, es decir una reducción de aproximadamente el 38 %. Sin embargo, la minociclina no pareció tener ningún efecto sobre la concentración de Ca2+ a concentraciones de 0,1 j M.
Discusión
La minociclina muestra un efecto dosis-dependiente sobre la calcificación, consistente con este fármaco que tiene un efecto directo sobre el proceso de calcificación vascular. En consecuencia, la minociclina se muestra prometedora como inhibidor de la calcificación vascular.
Ventajosamente, se cree que la minociclina podría usarse como inhibidor de la calcificación vascular a una concentración relativamente baja que está dentro de los niveles aceptados de seguridad.
Mientras tanto, PJ-34 parece incentivar la calcificación. Sin embargo, también parece inducir algo de muerte celular en las bVSMC, ver Figura 4A y ejemplo 2. En consecuencia, podría ser la muerte celular la que provoque la calcificación que se observa.
Una célula muerta puede (y generalmente lo hará) actuar como un nido para la precipitación de un mineral/calcificación. No está claro si un proceso similar puede ocurrir alrededor de las células muertas in vivo. Sin embargo, en experimentos in vitro, como el que se discutió anteriormente, las células muertas significan que ves calcificación. En consecuencia, es posible que PJ-34 inhiba todavía la calcificación de las células vivas restantes.
Ejemplo 6: Ejemplo de sugerencia de dosis
Los experimentos que se llevaron a cabo en el Ejemplo 5 mostraron que la minociclina puede inhibir la calcificación a concentraciones tan bajas como 1 |jM, y posiblemente también podría ser efectiva a concentraciones más bajas. La masa molecular de la minociclina es de 457 g/mol, por lo que una concentración de 1 j M es equivalente a 0,46 microgramos/ml.
La concentración máxima (Cmáx) de una dosis oral de 50 mg de minociclina en el torrente sanguíneo de un paciente es de 0,65 microgramos/ml que se alcanza 2 horas después de la dosificación (Tmáx).
Típicamente la minociclina se toma dos veces al día y la vida media de la minociclina en el cuerpo es de aproximadamente 12 horas. La concentración en estado estacionario de una dosis continua de 50 mg cada 12 horas es, por tanto, de 1,3 microgramos/ml.
En consecuencia, la dosis necesaria para alcanzar la concentración de 0,46 microgramos/ml sería de aproximadamente 20 mg de minociclina dos veces al día.
Los efectos secundarios de la minociclina parecen depender de la dosis y, por lo tanto, deben superarse a estas dosis bajas.
Se debe señalar que la dosis para adultos de minociclina para tratar el acné (su uso principal) es de 50-100 mg dos veces al día y luego pasar a una dosis de mantenimiento de 50-100 mg al día. En consecuencia, la dosis sugerida está dentro de los niveles seguros aceptados.
Ejemplo 7: Prueba inicial de calcificación vascular por PJ14, minociclina y cilostazol mediante el uso de células de músculo liso vascular humano (hVSMC)
Metodología
Dados los resultados positivos y las conclusiones con respecto a la inhibición de la calcificación vascular en un modelo in vitro de células de músculo liso vascular bovino, los inventores continuaron sus experimentos en un modelo in vitro de células de músculo liso vascular humano.
Las hVSMC primarias se cultivaron en medio M199 que contiene FBS (M199/FBS al 5 %). Se colocaron en placas a una densidad celular conocida, se dejaron crecer durante 24 horas y luego se trataron con control (solo DMSO) o medio de calcificación (DMSO que contiene Calcio 2,7 mM fosfato 2,5 mM) /- inhibidores. Después de 6 días, se evaluó la calcificación mediante el uso del ensayo de o-Cresolftaleína para la cuantificación de la deposición de Ca2+ y un ensayo de proteínas de BioRad para determinar el contenido de proteína.
Se usó PJ34 a una concentración de 10 j M, mientras que tanto la minociclina como el cilostazol se usaron a concentraciones de 0,5 j M, 1 j M y 2 j M. Los medios /- inhibidores se intercambiaron cada 2-3 días.
Cada experimento se realizó por triplicado, y las Figuras 17 a 19 muestran la media el error estándar de la media (SEM).
Resultados
El ensayo de o-Cresolftaleína permitió a los inventores cuantificar la deposición de Ca2+, como se muestra en la Figura 17. Esto mostró que el contenido de calcio en el grupo DMSO (control negativo) fue muy bajo. Por el contrario, en el grupo DMSO Ca+P (control positivo), los niveles de calcio estaban sustancialmente elevados. El PJ34, la minociclina y el cilostazol parecieron reducir los niveles de calcio.
Los resultados del ensayo de proteínas de BioRad se muestran en la Figura 18. Los datos que se obtuvieron a partir de esto permitieron normalizar los resultados con el ensayo de o-Cresolftaleína, dando la masa de calcio por masa de proteína. Los resultados normalizados se muestran en la Figura 19.
Como se muestra en la Figura 19, cuando los resultados se normalizan, cada uno de PJ34, minociclina y cilostazol reducen significativamente los niveles de calcio. Adicionalmente, la minociclina parece reducir los niveles de calcio de una manera dependiente de la dosis.
Ejemplo 8: Pruebas adicionales sobre la calcificación vascular por inhibidores de PARP mediante el uso de células de músculo liso vascular humano (hVSMC)
Metodología
Las hVSMC primarias se cultivaron en medio M199 que contiene FBS (M199/FBS al 5 %o). Se colocaron en placas a una densidad celular conocida, se dejaron crecer durante 24 horas y luego se trataron con control (solo DMSO) o medio de calcificación (DMSO que contiene calcio 2,7 mM fosfato 2,5 mM) /- inhibidores. Después de 8 días, la calcificación se evaluó mediante el uso del ensayo de o-Cresolftaleína para la cuantificación de la deposición de Ca2+ y un ensayo de proteínas de BioRad para determinar el contenido de proteína.
Los inhibidores de PARP que se probaron incluyeron olaparib (2 fuentes analizadas por separado), talazoparib, niraparib, rucaparib y veliparib, junto con minociclina y cilostazol. Todos los compuestos que se probaron se usaron a una concentración de 3 |jM. Los medios /- inhibidores se intercambiaron cada 2-3 días.
Cada experimento se realizó seis veces, y las Figuras 20 y 22 muestran la media el error estándar de la media (SEM).
Resultados
En la Figura 24 se muestran fotografías de cerca de las placas, y en la Figura 23 se muestran fotografías de las placas que se trataron con tinción de rojo de alizarina S. Está claro que para las células del grupo DMSO (control negativo) hay una calcificación mínima y es visible en la Figura 23 una tinción roja mínima que se debe a la Alizarina. Esto indica que se produjo poca o ninguna calcificación del cultivo.
Por el contrario, las imágenes muestran que se produjo una gran cantidad de calcificación en las células del grupo DMSO Ca+P (control positivo). Mientras se produjo un grado de calcificación para todos los cultivos celulares que se trataron con inhibidores de PARP, está claro que esto es significativamente menor que para las células del grupo DMSO Ca+P.
El ensayo de o-Cresolftaleína permitió a los inventores cuantificar la deposición de Ca2+, como se muestra en la Figura 20. Como en el ejemplo 7, el contenido de calcio en el grupo DMSO (control negativo) fue muy bajo y el contenido de calcio en el grupo Dm SO Ca+P (control positivo) fue sustancialmente elevado. Todos los inhibidores de PARP parecieron reducir los niveles de calcio.
Los resultados del ensayo de proteínas de BioRad se muestran en la Figura 21. Los datos que se obtuvieron a partir de esto permitieron normalizar los resultados con el ensayo de o-Cresolftaleína, dando la masa de calcio por masa de proteína. Los resultados normalizados se muestran en la Figura 22.
Como se muestra en la Figura 22, cuando los resultados se normalizan, todos los inhibidores de PARP reducen significativamente los niveles de calcio. La minociclina, el cilostazol, el rucaparib, el niraparib y el veliparib fueron particularmente efectivos para reducir los niveles de calcio.
Ejemplo 9: Pruebas adicionales sobre la calcificación vascular por inhibidores de PARP mediante el uso de células de músculo liso vascular humano (hVSMC)
Metodología
Las hVSMC primarias se cultivaron en medio M199 que contiene FBS (M199/FBS al 5 %). Se colocaron en placas a una densidad celular conocida, se dejaron crecer durante 24 horas y luego se trataron con control (solo DMSO) o medio de calcificación (DMSO que contiene calcio 2,7 mM fosfato 2,5 mM) /- compuestos. Después de 8 días, la calcificación se evaluó mediante el uso del ensayo de o-Cresolftaleína para la cuantificación de la deposición de Ca2+ y un ensayo de proteínas de BioRad para determinar el contenido de proteína.
Junto con el control negativo DMSO y el control positivo DMSO Ca+P, se probaron los siguientes compuestos en este experimento: Monohidrato de bosentan, pentoxifilina, losartán, amlodipino, atorvastatina, veliparib, minociclina y cilostazol.
Se incluyeron el monohidrato de bosentan y la pentoxifilina como ejemplos de fármacos existentes examinados originalmente para comprobar las características del inhibidor de PARP en el modelo de VSMC bovino con resultados negativos (Ejemplo 4). El losartán, el amlodipino y la atorvastatina se incluyeron como ejemplos de fármacos cardiovasculares comunes (antagonista de la angiotensina II, bloqueador de los canales de calcio y estatina, respectivamente) para comprobar si inhibían la calcificación vascular de la media. El veliparib se incluyó como un ejemplo de un inhibidor de PARP conocido que se mostró en el Ejemplo 8 para inhibir la calcificación. Se incluyó la minociclina dados los resultados experimentales positivos en todo el trabajo del modelo de VSMC bovino y del modelo de VSMC humano (que se muestra en los Ejemplos 4-8). Se incluyó el cilostazol dados los resultados experimentales positivos en el trabajo de VSMC humano (que se muestra en los Ejemplos 7 y 8).
Los compuestos se usaron a concentraciones de entre 0,05 j M y 3 j M, como se indica en las Figuras. Estas concentraciones se eligieron para imitar las concentraciones sistémicas de estos medicamentos después de la dosificación del paciente de acuerdo con el programa de dosis en la información de prescripción de cada medicamento. Los medios /- inhibidores se intercambiaron cada 2-3 días.
Cada experimento se realizó tres veces, y las Figuras 25 a 27 muestran la media el error estándar de la media (SEM).
Resultados
El ensayo de o-Cresolftaleína permitió a los inventores cuantificar la deposición de Ca2+, como se muestra en la Figura 25. Esto mostró que el contenido de calcio en el grupo DMSO (control negativo) fue muy bajo. Por el contrario, en el grupo DMSO Ca+P (control positivo), los niveles de calcio estaban sustancialmente elevados.
Los resultados del ensayo de proteínas de BioRad se muestran en la Figura 26. Los datos que se obtuvieron a partir de esto permitieron normalizar los resultados con el ensayo de o-Cresolftaleína, dando la masa de calcio por masa de proteína. Los resultados normalizados se muestran en la Figura 27.
La Figura 27 muestra los resultados normalizados. El veliparib, la minociclina y el cilostazol inhiben cada uno la calcificación de forma significativa y repetida (barras de error estrechas). Los resultados confirman que el monohidrato de bosentan y la pentoxifilina no inhiben la calcificación. Es importante destacar que los resultados también confirman que, por ejemplo, los fármacos cardiovasculares comunes (losartán, amlodipino y atorvastatina) tampoco inhiben la calcificación vascular de la media. Las barras de error muestran la amplia variación de resultados que se observaron con el monohidrato de bosentan, la pentoxifilina, el losartán, el amlodipino y la atorvastatina.
Resumen
Los resultados muestran una fuerte correlación espacial entre la poli(ADP ribosa) extracelular y las regiones calcificadas de la matriz extracelular tanto en el hueso en desarrollo como en la calcificación vascular patológica, lo que sugiere que es probable que exista una relación mecanicista directa entre la poli(ADP ribosa) y la construcción de depósitos de calcificación dentro de la matriz extracelular.
Las células del músculo liso vascular expresan muchas proteínas osteogénicas cuando calcifican su matriz, que incluyen la sialoproteína ósea, la osteopontina y la osteocalcina, por lo que también podría producirse un proceso de construcción similar mediado por poli(ADP ribosa) en la calcificación vascular.
Los inventores demostraron que todos los inhibidores de PARP conocidos que se probaron (olaparib, rucaparib, niraparib, veliparib y talazoparib) junto con minociclina y cilostazol reducen significativamente la calcificación de la matriz extracelular en células bovinas y humanas en un modelo de calcificación vascular in vitro. Esto sugiere una ruta potencial para reducir la calcificación vascular de la media in vivo. A través de los resultados negativos que se obtuvieron al probar ejemplos de otros fármacos cardiovasculares (incluye notablemente una estatina), los inventores descartaron que los pacientes ya estén recibiendo un efecto inhibidor de la calcificación vascular de la media de otros medicamentos cardiovasculares que comúnmente se prescriben.
Dado que los compuestos anteriores pudieron inhibir la calcificación a bajas concentraciones in vitro esto indica que un fármaco para inhibir la calcificación vascular de la media podría ser útil a dosis bajas, lo que asegura que los efectos secundarios sean superables.

Claims (11)

r e iv in d ic a c io n e s
1. Un inhibidor de poli(ADP ribosa)polimerasa (PARP), o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo, para el uso en el tratamiento, prevención o mejora de la calcificación vascular de la media o calcificación aterosclerótica de la íntima, en donde el que el inhibidor de PARP es olaparib; rucaparib; niraparib; veliparib; talazoparib; minociclina; cilostazol o clorhidrato de N-(6-oxo-5,6-dihidrofenantridin-2-il)-(N,N-dimetilamino)acetamida (PJ34).
2. Un inhibidor de PARP para el uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el inhibidor de PARP se usa para tratar, prevenir o mejorar la calcificación vascular de la media.
3. Un inhibidor de PARP para el uso de acuerdo con la reivindicación 2, en donde el inhibidor de PARP se usa para tratar, prevenir o mejorar la arteriosclerosis de Monckeberg o la arteriolopatía urémica calcificada (CUA).
4. Un inhibidor de PARP para el uso de acuerdo con la reivindicación 2 o la reivindicación 3, en donde el inhibidor de PARP se usa para tratar, prevenir o mejorar la calcificación vascular de la media en un sujeto que padece enfermedad renal crónica, diabetes, envejecimiento, hiperpatiroidismo, hiperfosfatemia, un trastorno de vitamina D, un trastorno de vitamina K, osteoporosis, enfermedad de Kawasaki, calcificación arterial por deficiencia de CD73 (ACDC), calcificación arterial generalizada de la infancia (GACI), calcificación idiopática de los ganglios basales (IBGC), pseudoxantoma elástico (PXE), artritis reumatoide, síndrome de Singleton-Merten y/o p-talasemia.
5. Un inhibidor de PARP para el uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el inhibidor de PARP se usa para tratar, prevenir o mejorar la calcificación aterosclerótica de la íntima.
6. Un inhibidor de PARP para el uso de acuerdo con la reivindicación 5, en donde el inhibidor de PARP se usa para tratar la calcificación aterosclerótica en un paciente con una puntuación de Agatston de al menos 20, al menos 40, al menos 60, al menos 80 o al menos 100.
7. Un inhibidor de PARP para el uso de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en donde el inhibidor de PARP se selecciona de un grupo que consiste de olaparib; rucaparib; niraparib; veliparib; talazoparib; minociclina; y cilostazol.
8. Un inhibidor de PARP para el uso de acuerdo con la reivindicación 7, en donde el inhibidor de PARP es minociclina.
9. Un inhibidor de PARP para el uso de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en donde el inhibidor de PARP se administra como una dosis diaria de entre 1 mg y 10000 mg o entre 2 mg y 2000 mg, entre 5 mg y 1000 mg, entre 10 mg y 200 mg, entre 15 mg y 100 mg o entre 20 mg y 50 mg.
10. Un inhibidor de PARP para el uso de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en donde el inhibidor de PARP se administra en dos dosis diarias, en donde cada dosis está entre 1 mg y 5000 mg, entre 2 mg y 1000 mg, entre 3 mg y 500 mg, entre 4 mg y 100 mg, entre 5 mg y 50 mg o entre 10 mg y 25 mg.
11. Un inhibidor de PARP para el uso de acuerdo con la reivindicación 10, en donde cada dosis está entre 10 mg y 25 mg.
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