JP6960487B2 - 顕微鏡装置を用いた観察方法 - Google Patents

Description

本開示は、蛍光顕微鏡やライトシート顕微鏡装置に最適な液浸対物レンズ、液浸対物レンズを備えた顕微鏡装置及び、顕微鏡装置を用いた観察方法に関する。

生体試料（物体）の深部の３次元情報を取得するための装置として、例えば蛍光顕微鏡やライトシート顕微鏡（非特許文献１）が公知である。

これらの顕微鏡による観察法では、照明光（励起光）の照射された領域からのみ生体試料の蛍光画像情報が得られるため、３次元情報を取得するためには、試料ないし光学系をスキャンする必要がある。それゆえ、３次元情報が取得可能な範囲は、コンデンサレンズ及び対物レンズから試料面までの距離、いわゆる作動距離（Ｗｏｒｋｉｎｇ Ｄｉｓｔａｎｃｅ；ＷＤ）により制限を受ける。

これまでは、生体を透明化するための試薬の能力に限界があり、必然的に小さな試料を観察できれば十分であった。それゆえ、コンデンサレンズ、対物レンズは共にＷＤが小さい市販の液浸対物レンズで実用上十分であった。

近年、生体組織透明化技術に進展により、大きな生体試料、具体的には臓器の３次元画像情報を得るための研究が進んでいる（非特許文献２）。このような要望から従来の蛍光顕微鏡の構成を踏襲し、対物レンズとしての作動距離を伸ばした液浸対物レンズの構成として、特許文献１〜３に示されるものが公知である。

一方で、かかる液浸対物レンズを用いた生体観察においては、対物レンズと試料との間に満たされた浸液が複数種類あることが普通である。このことは、特に大きな開口数と大きな作動距離とを両立させる場合に問題となる。具体的には主に異なる種類の浸液の分散（すなわち、アッベ数）の違いにより、対物レンズ全体としての色収差が変化することにより解像力が劣化するため、何等かの方法で分散の違いを補正する必要がある。

高い開口数を持つ生物顕微鏡用対物レンズには、カバーガラスの厚みの誤差などに伴う収差変化を吸収するため、補正環が設けられている（例えば、特許文献４）。この生物顕微鏡用対物レンズでは、補正環の回転によって一部の補正レンズ群が光軸方向に移動することで、カバーガラスの厚みや試料の観察部位の深さによる球面収差の変化が打ち消される。特許文献１〜３には、浸液の屈折率の違いによる球面収差変化を一部のレンズの移動により打ち消す例が示されている。

特開２０１５−７９１４４号公報 特開２０１５−７９２２２号公報 特許第６５５２４３６号公報 特開２００８−１１１９８１号公報

Ｊ Ｍ Ｇｉｒｋｉｎ ａｎｄ Ｍ Ｔ Ｃａｒｖａｌｈｏ、"Ｔｈｅ ｌｉｇｈｔ−ｓｈｅｅｔ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ｒｅｖｏｌｕｔｉｏｎ"、Ｊ．Ｏｐｔ． ２０、（２０１８）０５３００２（２０ｐｐ） 国立研究開発法人 科学技術振興機構 研究開発戦略センター、「研究開発の俯瞰報告書 ライフサイエンス・臨床医学分野（２０１９年）」

しかしながら、補正環により一部のレンズを移動させる方式では、球面収差は変化させることができても、光学系の近軸量である色収差を大きく変化させることはできない。そのため、液浸対物レンズにこの方式をそのまま適用したとしても、長作動距離を実現しつつ様々な浸液に対応させて色収差を補正することはできない。

本発明が解決しようとする課題は、異なる浸液による色収差を補正でき、かつ様々な浸液に対応させて色収差を補正できるようにすることである。

このような課題を解決するために、本発明のある実施形態は、液浸対物レンズ（１）であって、屈折力を持つ対物レンズ（３）と、前記屈折力を持たない厚みが異なる同一硝種からなる複数の平行平面板（５）とを備え、複数の前記平行平面板が、前記対物レンズに対して物体（Ｓ）の側に配置される浸液（２）の種類に応じ、前記対物レンズと前記浸液との間に選択的に配置される。

この構成によれば、対物レンズと浸液との間に配置される平行平面板の厚みを変化させることにより、異なる浸液による色収差を補正することができ、様々な浸液の屈折率に対応させて色収差を補正することができる。

また上記課題を解決するために、本発明のある実施形態は、顕微鏡装置（１０）であって、上記構成の液浸対物レンズ（１）と、前記液浸対物レンズから出射した光束を収斂する結像レンズ（１４）とを備え、複数の前記平行平面板が、前記浸液のアッベ数（ν_２）に応じ、前記対物レンズと前記浸液との間に選択的に配置可能に構成されている。

この構成によれば、異なる分散を持つ複数種の浸液に対し、対物レンズと物体との間に配置される平行平面板を変更することによって色収差を補正して物体を観察することができる。

また上記課題を解決するために、本発明のある実施形態は、上記構成の顕微鏡装置（１０）を用いた観察方法であって、前記浸液のアッベ数（ν_２）に応じ、複数の前記平行平面板の中から少なくとも１つを選択し、選択した前記平行平面板を前記浸液中の前記対物レンズと前記浸液との間に挿入する。

この構成によれば、対物レンズと浸液との間に挿入した平行平面板によって浸液の分散に応じた色収差の補正を行うことができる。

好ましくは、前記平行平面板のアッベ数（ν_１）は前記浸液のアッベ数（ν_２）より小さく、ν_２ａのアッベ数（ν_２）の前記浸液に対して選択される前記平行平面板の厚みをｔ_ａ、ν_２ｂのアッベ数（ν_２）の前記浸液に対して選択される前記平行平面板の厚みをｔ_ｂとするとき、ν_２ａ≦ν_２ｂならばｔ_ａ≦ｔ_ｂであるとよい。

ただしアッベ数は式（１）により定義される材料固有の値である。

ここで、ｎ_０は色収差の補正範囲の中央となる波長での屈折率、ｎ_Ｓ及びｎ_Ｌはそれぞれ、短波長側の屈折率と、長波長側の屈折率である。一般に、アッベ数の定義において、ｎ_０はｄ線（λ＝５８７．５６ｎｍ）、ｎ_ＳはＦ線（λ＝４８６．１３ｎｍ）、ｎ_ＬはＣ線（λ＝６５６．２７ｎｍ）に対する屈折率とされる。ただし、光学系の用途に応じて、近赤外域ないし近紫外域を含む任意の波長の屈折率を用いてアッベ数を定義してもよい。

この構成によれば、浸液のアッベ数の値に応じて適切に色収差を補正することができる。

好ましくは、前記平行平面板のアッベ数（ν_１）は前記浸液のアッベ数（ν_２）より大きく、ν_２ａのアッベ数（ν_２）の前記浸液に対して選択される前記平行平面板の厚みをｔ_ａ、ν_２ｂのアッベ数の前記浸液に対して選択される前記平行平面板の厚みをｔ_ｂとするとき、ν_２ａ≧ν_２ｂならばｔ_ａ≦ｔ_ｂであるとよい。

この構成によれば、浸液のアッベ数の値に応じて適切に色収差を補正することができる。

このように本発明によれば、異なる浸液による色収差を補正でき、かつ様々な浸液に対応させて色収差を補正可能な液浸対物レンズ、顕微鏡装置及び、観察方法を提供することができる。

空気中に置かれた平行平面板に光線が入射し、像点位置が変化することを示す模式図 複数の連続した異なる媒質Ｍに光線が入射することを示す模式図 式（１４）における係数（ｎ−１）／ｎ^２の変化を示すグラフ 実施形態に係る液浸対物レンズの概略構成図 実施形態に係る液浸対物レンズの使用態様の説明図 実施例１の光路図を示す図 実施例１において浸液２−１に対する縦収差図 実施例１において浸液２−２に対する縦収差図 実施例１において浸液２−３に対する縦収差図 実施例１において浸液２−１に対するＭＴＦ 実施例１において浸液２−２に対するＭＴＦ 実施例１において浸液２−３に対するＭＴＦ 実施例２の光路図を示す図 実施例２において浸液２−４に対する縦収差図 実施例２において浸液２−５に対する縦収差図 実施例２において浸液２−６に対する縦収差図 実施例２において浸液２−４に対するＭＴＦ 実施例２において浸液２−５に対するＭＴＦ 実施例２において浸液２−６に対するＭＴＦ 実施形態に係る液浸対物レンズが適用された顕微鏡装置の構成図

図面を参照して、本発明に係る液浸対物レンズ１について説明する。

本発明は、複数種の浸液２に対して色収差の発生を防止するものであり、液浸対物レンズ１（図３及び図４参照）により具現化される。液浸対物レンズ１は、試料Ｓ（物体）に対峙するように配置される対物レンズ３を備えており、対物レンズ３に対して試料Ｓの側には浸液２が配置される。対物レンズ３は正の屈折力を持つものであり、単一のレンズ（単レンズ又は接合レンズ）によって構成されてもよく、複数のレンズによって構成されてもよい。また液浸対物レンズ１は、屈折力を持たない厚みが異なる同一硝種からなる複数の平行平面板５を含むように構成される。浸液２のアッベ数（ν_２）に応じて選択された平行平面板５が対物レンズ３と浸液２との間に浸液２に接するように挿入されることにより、異なる浸液２による色収差が補正される。

以下に、ある厚みを持つ平行平面板５の選択方法について、その背景となる理論を説明する。

最初に、図１のように空気中に置かれたｔの厚み及びｎの屈折率を持つ平行平面板５に、光線が光軸に対する入射角度θ_０をもって入射することを考えると、スネルの法則により、入射角度θ_０と射出角θの間には式（２）の関係が成り立つ。

光線の平行平面板５への入射点Ｒにおいて、入射光線と屈折後の光線の高さが等しいことから、図１においてＬとＬ'及び平行平面板５の厚みの間には、式（３）で示される関係が成り立つ。

式（２）及び式（３）を、近軸領域（ｓｉｎθ≒θ、ｔａｎθ≒θ）において近似することにより、平行平面板５の有無による像点位置の変化（Ｌ'−Ｌ）は式（４）で与えられる。

ここで、平行平面板５の屈折率（ｎ）は波長により異なるので、平行平面板５の有無による像面位置の変化もまた波長により異なる。すなわち、Ｌ'−Ｌの波長による差異が補正板として機能する平行平面板５による色収差である。

以上により平行平面板５による色収差（ΔＬ）は、式（５）で与えられる。

なお差分Δは、対象とする波長域の短い側と長い側での差を意味し、具体的にΔ（１／ｎ）は式（６）で与えられる。

ここで、ｎ_Ｓ及びｎ_Ｌはそれぞれ、短波長側の屈折率と、長波長側の屈折率である。

一般に複数の媒質Ｍからなる平行平面板５から発生する色収差は、式（５）で与えられる色収差を各媒質Ｍについて足し合わせることで求めることができる。すなわち、全体より発生する色収差は式（７）で与えられる。

式（７）は一般的な場合であるが、平行平面板５と浸液２よりなる系（図２においてｋ＝２の場合）を考える。すなわち、媒質Ｍ_１が平行平面板５に、媒質Ｍ_２が浸液２に対応する。複数種の浸液２に対応する理論式を得るため、仮想的に補正板の厚みがゼロになる浸液２（媒質Ｍ_０）を考え、その屈折率をｎ_０、厚みをＬとする。

異なる浸液２に対しても、平行平面板５と浸液２の長さの和がほぼ一定になること、すなわち、液浸対物レンズ１の最も試料面に近い面から試料面までの距離が一定になることが実運用上望ましい。

以上を踏まえ、媒質Ｍ_０に対する色収差が媒質Ｍ_２に対しても変化せず、かつ媒質Ｍ_１からなる平行平面板５と媒質Ｍ_２からなる浸液２の長さの和が一定となる条件を立てると、媒質Ｍ_１の厚み（すなわち平行平面板５の厚み）及び媒質Ｍ_２の厚み（すなわち浸液２の厚み）は以下の連立方程式（８）により決定される。ただし、ｔ_１：媒質Ｍ_１の厚み、ｔ_２：媒質Ｍ_２の厚み、である。

ここで、ａ＝Δ（１／ｎ_１）、ｂ＝Δ（１／ｎ_２）、ｃ＝Δ（１／ｎ_０）とすると式（８）は以下の一次方程式（９）に他ならない。

この一次方程式の解は式（１０）で与えられる。

媒質Ｍ_１（平行平面板５）及び媒質Ｍ_２（浸液２）の厚みが正となるためには、ａ＝Δ（１／ｎ_１）、ｂ＝Δ（１／ｎ_２）、ｃ＝Δ（１／ｎ_０）の間に式（１１）で示される条件が成り立たなければならない。

条件１、条件２の不等式を整理することにより、式（１１）をさらに以下に示す式（１２）に書き換えることができる。

ここで、ａ＝Δ（１／ｎ_１）、ｂ＝Δ（１／ｎ_２）、ｃ＝Δ（１／ｎ_０）を、アッベ数を用いて表現することを考える。定義より

であるが、アッベ数の定義（式（１））からｎ_Ｓ−ｎ_Ｌ＝（ｎ_０−１）／νが成り立つので、結局、Δ（１／ｎ）は式（１４）となる。

図３によれば係数（ｎ_０−１）／ｎ_０ ^２は、ほぼｎによらず、０．２２〜０．２５の値を取るので、Δ（１／ｎ）はほぼアッベ数に反比例する。このことを踏まえると、式（１２）は媒質Ｍ_０のアッベ数（ν_０）、媒質Ｍ_１のアッベ数（ν_１）、媒質Ｍ_２のアッベ数（ν_２）を用いて近似的に以下の条件と等価になる。

以下で式（１５）条件１の場合の条件式を具体的に吟味する。

この条件下では、平行平面板５のアッベ数（ν_１）は、対応できるすべての浸液２のアッベ数（ν_２）より小さく、ν_０のアッベ数の浸液２に対して、ｂ＝ｃの場合に相当するため式（１０）で与えられる平行平面板５の解がゼロとなる。さらに、式（１０）において平行平面板５の厚みはｂ−ａに反比例するため、平行平面板５と浸液２のアッベ数の差が大きければ大きいほど、平行平面板５の厚みが厚くなることを意味する。すなわち、より大きなアッベ数に対して、色収差を補正する平行平面板５の厚み（ｔ）はより厚いものとなる。

式（１５）条件２の場合については、以上の考察は逆の条件を与え、平行平面板５のアッベ数（ν_１）は、対応できるすべての浸液２のアッベ数（ν_２）より大きく、より小さなアッベ数の浸液２に対して色収差を補正する平行平面板５の厚み（ｔ）はより厚いものとなる。

さらに、式（１５）条件１の場合について、数値例を挙げて説明する。

表１において、媒質Ｍ_１は平行平面板５、媒質Ｍ_２及び媒質Ｍ_２'は浸液２の特性が示されている。また、Δ（１／ｎ）は、式（１４）に物質のアッベ数と屈折率を代入して求めた値である。平行平面板５に対応する媒質Ｍ_１は、オハラ社の重フリント系光学ガラスであるＳ−ＮＰＨ２に対応する。

平行平面板５と浸液２よりなる系の厚みの和をＬ＝３５ｍｍとし、平行平面板５の厚みがゼロとなる媒質Ｍ_０を媒質Ｍ_２及び媒質Ｍ_２'に選択すると、式（１０）による解は以下のようになる。ここで、媒質Ｍ_１の厚み（ｔ_１）は平行平面板５の厚み（ｔ）に対応し、媒質Ｍ_２及び媒質Ｍ_２'の厚み（ｔ_２）は浸液２の厚み（ｔ'）に対応する。

表２に示すように、媒質Ｍ_２及び媒質Ｍ_２'について、平行平面板５の厚み（ｔ）はそれぞれ約５．１２ｍｍ及び９．９７ｍｍ、作動距離、すなわち浸液２の厚み（ｔ'）はそれぞれ２９．８７ｍｍ、２５．０２ｍｍという実用に供することのできる解が得られる。

さらに、対物レンズ３と浸液２との間に平行平面板５を介することにより、平行平面板５がいわゆるウインドウの役割も果たすことが可能であり、浸液２がレンズそのもの（レンズ表面、鏡筒、レンズ接着剤等）に及ぼすダメージを低減する効果が期待できる。

本発明によると、長い作動距離と大きな開口数を持ち、様々な浸液２の屈折率に対応させて色収差を補正できる液浸対物レンズ１を、なんらレンズを駆動させる機構を含むことなく構成することができる。

実施形態に係る液浸対物レンズ１の概略構成図を図４に示す。図４に示すように、液浸対物レンズ１は、屈折力を持つ対物レンズ３と、屈折力を持たない同一硝種からなる厚みが異なる複数の交換可能な平行平面板５（５−１、５−２・・・５−ｋ）とを備えている。

実施形態に係る液浸対物レンズ１の使用態様の説明図を図５に示す。液浸対物レンズ１は、対物レンズ３と複数の異なる厚みを持つ平行平面板５の組の内、ある浸液２に対してはある厚みの、また異なる浸液２に対してはそれとは異なる厚みの平行平面板５を選択し、対物レンズ３と浸液２との間に挿入して浸液２に接触させて使用される。

実施例１は、本発明に係る液浸対物レンズ１（焦点距離ｆ＝１８ｍｍ、ＮＡ０．３、視野φ２．５ｍｍ）の一例である。そのレンズデータを表３に、光路図を図６に示す。なお、Ｓ−ＴＩＭ２、Ｓ−ＦＰＬ５５、Ｓ−ＦＰＬ５１、Ｓ−ＢＳＬ７及びＳ−ＢＳＭ２５はそれぞれオハラ社のガラス名称である。

ここで、２０面と２１面はそれぞれ平行平面板５と浸液２に対応する。媒質Ｍ_２として、その特性を以下に示す浸液２−１、２−２、２−３とした場合の２０面、２１面のデータを表４に示す。

ここで、平行平面板５の材質をＳ−ＮＰＨ２としたが、この硝材のｄ線に対する屈折率は１．９２２８６、アッベ数は１８．９であり、媒質Ｍ_２として選択された浸液２−１、２−２、２−３のどのアッベ数よりも小さい。なおかつ表４によると、より大きなアッベ数を持つ浸液２に対しては、平行平面板５の厚みが厚くなっている。つまり、平行平面板５のアッベ数は浸液２のアッベ数より小さく、ν_２ａのアッベ数の浸液２に対して選択される平行平面板５の厚みをｔ_ａ、ν_２ｂのアッベ数の浸液２に対して選択される平行平面板５の厚みをｔ_ｂとするとき、ν_２ａ≦ν_２ｂならばｔ_ａ≦ｔ_ｂのように選択される。これにより、浸液２のアッベ数の値に応じて適切に色収差が補正される。

さらに、表４によると平行平面板５の厚み（ｔ）と浸液２の厚み（ｔ'）の和は３３．２１〜３３．５３の範囲でほぼ一定であり、運用上望ましい条件を満たしている。

図７、図８及び図９は、この設計に対するλ＝６５６．２７ｎｍ（Ｃ線）、５８７．５６ｎｍ（ｄ線）、４８６．１３ｎｍ（Ｆ線）での球面収差（縦収差）を示した図である。これらの図によれば、この設計が色消し条件を満たしており、媒質Ｍ_２の選択によらずほぼ一定の色収差を保っていることが分かる。

また、図１０、図１１及び図１２は、上記波長におけるＭｏｄｕｌａｔｉｏｎ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ（ＭＴＦ；光学伝達関数）であるが、これらの図によると、すべての媒質Ｍに対して、実施例１の設計が十分な解像度を有することを示している。

実施例２は、本発明に係る液浸対物レンズ１（焦点距離ｆ＝１８ｍｍ、ＮＡ０．３、視野φ２．５ｍｍ）の他の例である。そのレンズデータを表５に、光路図を図１３に示す。なお、Ｓ−ＮＢＭ５１、Ｓ−ＢＳＬ７、Ｓ−ＬＡＬ１８及びＳ−ＦＰＬ５５はそれぞれオハラ社のガラス名称であり、ＣＡＦ２は蛍石である。

ここで、２０面と２１面はそれぞれ平行平面板５と浸液２に対応する。媒質Ｍ_２として、その特性を以下に示す浸液２−４、２−５、２−６とした場合の２０面、２１面のデータを表６に示す。

ここで、平行平面板５の材質をＳ−ＦＰＬ５５としたが、この硝材のｄ線に対する屈折率は１．４３９９４８、アッベ数は９４．６であり、媒質Ｍ_２として選択された浸液２−４、２−５、２−６のどのアッベ数よりも大きい。なおかつ表６によると、より小さなアッベ数を持つ浸液２に対しては、平行平面板５の厚みが厚くなっている。つまり、平行平面板５のアッベ数は浸液２のアッベ数より大きく、ν_２ａのアッベ数の浸液２に対して選択される平行平面板５の厚みをｔ_ａ、ν_２ｂのアッベ数の浸液２に対して選択される平行平面板５の厚みをｔ_ｂとするとき、ν_２ａ≧ν_２ｂならばｔ_ａ≦ｔ_ｂのように選択される。これにより、浸液２のアッベ数の値に応じて適切に色収差が補正される。

さらに、表６によると平行平面板５の厚み（ｔ）と浸液２の厚み（ｔ'）との和は２８．６４〜２８．８４の範囲でほぼ一定であり、運用上望ましい条件を満たしている。

図１４、図１５及び図１６は、この設計に対するλ＝６５６．２７ｎｍ（Ｃ線）、５８７．５６ｎｍ（ｄ線）、４８６．１３ｎｍ（Ｆ線）での球面収差（縦収差）を示した図である。これらの図によれば、この設計が色消し条件を満たしており、媒質Ｍ_２の選択によらずほぼ一定の色収差を保っていることが分かる。また、図１７、図１８及び図１９は、上記波長におけるＭＴＦであるが、これらの図によると、すべての媒質Ｍに対して、実施例２の設計が十分な解像度を有することを示している。

次に、本発明に係る液浸対物レンズ１が適用された顕微鏡装置１０について、図２０を参照して説明する。図２０に示すように、顕微鏡装置１０は、試料Ｓの顕微鏡画像を取得する撮像光学系１１と、顕微鏡画像を撮像する撮像装置１２とを備えている。撮像装置１２はデジタルカメラであり、入射した光を電気信号に変換して画像データを生成し、生成した画像データを出力する。撮像装置１２から出力される画像データは図示しないコンピュータへ送られ、コンピュータによって試料Ｓの画像としてディスプレイに表示される。

撮像光学系１１は、試料Ｓ側から順に、浸液チャンバ１３と、上記構成の対物レンズ３と、結像レンズ１４とを含んでいる。浸液チャンバ１３には、対物レンズ３の物体側の面に接するように浸液２が満たされている。対物レンズ３は、結像レンズ１４と組み合わせて使用される無限遠補正型の顕微鏡対物レンズである。結像レンズ１４は、正の屈折力を持つものであり、対物レンズ３から出射した無限遠光線束を収斂し、撮像装置１２の撮像面に試料Ｓの光学像を形成する。結像レンズ１４は単一のレンズ（単レンズ又は接合レンズ）によって構成されてもよく、複数のレンズによって構成されてもよい。

平行平面板５は、浸液チャンバ１３に満たされた浸液２に接するように対物レンズ３と浸液２との間に選択的に配置可能に構成されている。対物レンズ３及び平行平面板５により液浸対物レンズ１が構成される。これにより、異なる分散を持つ複数種の浸液２に対し、対物レンズ３と浸液２との間に配置される平行平面板５を変更することができる。

顕微鏡装置１０は、さらに、試料Ｓを載置するＸＹＺステージ１５と、第１照明装置１６と、第２照明装置１７とを備えている。ＸＹＺステージ１５は、撮像光学系１１の光軸及びこれに直交する互いに直角をなす２軸を含む３軸方向に移動可能に構成されている。ＸＹＺステージ１５は電動ステージであってもよく、手動ステージであってもよい。試料Ｓは浸液チャンバ１３に満たされた浸液２の内部に浸漬されており、さらに試料ＳはＸＹＺステージ１５に乗っていることにより、３次元内の任意の位置に移動可能である。

本実施形態においては、試料Ｓは２通りの方法により照明され得る。１つは浸液チャンバ１３の外部からの第１照明装置１６による照明であり、もう１つは第２照明装置１７により対物レンズ３を介して照明するいわゆる落射照明である。当然ながら、例えばＸＹＺステージ１５の中央に穴をあけ、その穴を介して試料Ｓを照明するいわゆる透過照明の方法も可能である。

これらの照明光によって試料Ｓから散乱された光、ないしは照明光により励起された蛍光を対物レンズ３により取り込み、さらに結像レンズ１４により撮像装置１２により画像を取得することで、試料Ｓの顕微鏡画像を得ることができる。さらには、試料ＳをＸＹＺステージ１５により移動させることにより、大きな試料Ｓの広い範囲の３次元情報も取得が可能となる。

なお、以上の構成では、顕微鏡装置１０を固定し、試料Ｓを移動する構成を示したが、それとは逆に、試料Ｓを固定し、顕微鏡装置１０を移動する構成をとることもできる。

ここで、浸液２には複数の種類の浸液２が使用される可能性がある。その場合、前述のように、浸液２の分散の相違により、対物レンズ３のもとから持つ色収差が変化してしまう。そこで、具体的には上記の実施例１又は実施例２で述べた方法により、浸液２のアッベ数（ν_２）及び平行平面板５のアッベ数（ν_１）に応じて、厚みが異なる平行平面板５を対物レンズ３と浸液２との間に挿入する。これにより、浸液２の分散に応じて色収差を補正して、試料Ｓを観察することができる。また、そのように複数種の浸液２に対応させて色収差を補正できる顕微鏡装置１０を簡易な構成で実現することができる。

以上、本発明を、その好適な実施形態について説明したが、本発明はこのような実施形態により限定されるものではなく、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で適宜変更可能である。また、上記実施形態に示した構成要素は必ずしも全てが必須なものではなく、本発明の趣旨を逸脱しない限りにおいて適宜取捨選択することが可能である。

本構成からなる対物レンズ３により、生体試料の深部まで観察する必要のある装置において、レンズ性能を悪化させることなく、良好な解像力を得られる浸液２の選択肢を広げることができる。

１ 液浸対物レンズ
２（２−１、２−２、２−３、２−４、２−５、２−６） 浸液
３ 対物レンズ
５（５−１、５−２、５−３） 平行平面板
１０ 顕微鏡装置
１１ 撮像光学系
１２ 撮像装置
１３ 浸液チャンバ
１４ 結像レンズ
１５ ＸＹＺステージ
１６ 第１照明装置
１７ 第２照明装置
Ｍ（Ｍ_０、Ｍ_１、Ｍ_２、Ｍ_２'） 媒質
Ｓ 試料（物体）
ｔ 平行平面板５の厚み
ｔ' 浸液２の厚み
ｔ_１ 媒質Ｍ_１の厚み
ｔ_２ 媒質Ｍ_２の厚み
ｔ_ａ 平行平面板５の厚みの値
ｔ_ｂ 平行平面板５の厚みの値
ν_１ 媒質Ｍ_１のアッベ数（平行平面板５のアッベ数）
ν_２ 媒質Ｍ_２のアッベ数（浸液２のアッベ数）
ν_２ａ 浸液２のアッベ数の値
ν_２ｂ 浸液２のアッベ数の値

Claims (2)

1. 屈折力を持つ対物レンズと、前記屈折力を持たない厚みが異なる同一硝種からなる複数の平行平面板とを備え、複数の前記平行平面板が、前記対物レンズに対して物体の側に配置される浸液の種類に応じ、前記対物レンズと前記浸液との間に選択的に配置される液浸対物レンズと、
   前記液浸対物レンズから出射した光束を収斂する結像レンズとを備え、
   複数の前記平行平面板が、前記浸液のアッベ数に応じ、前記対物レンズと前記浸液との間に選択的に配置可能に構成されている顕微鏡装置を用いた観察方法であって、
   前記浸液のアッベ数に応じ、複数の前記平行平面板の中から少なくとも１つを選択し、選択した前記平行平面板を前記浸液中の前記対物レンズと前記浸液との間に挿入し、
   前記平行平面板のアッベ数は前記浸液のアッベ数より小さく、
   ν２ａのアッベ数の前記浸液に対して選択される前記平行平面板の厚みをｔａ、ν２ｂのアッベ数の前記浸液に対して選択される前記平行平面板の厚みをｔｂとするとき、ν２ａ≦ν２ｂならばｔａ≦ｔｂであることを特徴とする観察方法。
2. 屈折力を持つ対物レンズと、前記屈折力を持たない厚みが異なる同一硝種からなる複数の平行平面板とを備え、複数の前記平行平面板が、前記対物レンズに対して物体の側に配置される浸液の種類に応じ、前記対物レンズと前記浸液との間に選択的に配置される液浸対物レンズと、
   前記液浸対物レンズから出射した光束を収斂する結像レンズとを備え、
   複数の前記平行平面板が、前記浸液のアッベ数に応じ、前記対物レンズと前記浸液との間に選択的に配置可能に構成されている顕微鏡装置を用いた観察方法であって、
   前記浸液のアッベ数に応じ、複数の前記平行平面板の中から少なくとも１つを選択し、選択した前記平行平面板を前記浸液中の前記対物レンズと前記浸液との間に挿入し、
   前記平行平面板のアッベ数は前記浸液のアッベ数より大きく、
   ν２ａのアッベ数の前記浸液に対して選択される前記平行平面板の厚みをｔａ、ν２ｂのアッベ数の前記浸液に対して選択される前記平行平面板の厚みをｔｂとするとき、ν２ａ≧ν２ｂならばｔａ≦ｔｂであることを特徴とする観察方法。

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