JP6940852B2 - ポリイオンコンプレックス、及びポリイオンコンプレックスの成形体 - Google Patents

Description

本発明は、ポリイオンコンプレックス、及びポリイオンコンプレックスの成形体に関する。

バイオマテリアルは、生体分子及び細胞等の生体を構成する要素に対して適応する、又は生体に直接接触させて利用する材料である。バイオマテリアルには、生体適合性が求められるため、ヒドロキシアパタイト及び多糖類等の生体中に存在する材料が利用されることが多い。

多糖類を利用したバイオマテリアルとして、例えば、特許文献１には、酸性又は塩基性の水溶性多糖類及び当該多糖類の電荷と反対の電荷を持つ水溶性生体高分子を主成分として含み、前記水溶性多糖類と前記水溶性生体高分子とがイオン結合していることを特徴とする非多孔質体が開示されている。

国際公開第２０１０／１０１２４２号

ところで、生体に直接接触させて利用するバイオマテリアルは、体液等の液体に接触した場合でも寸法変化が小さい寸法安定性を有することが望ましい。

そこで、本発明は、液体と接触した場合の寸法安定性が改善された成形体を形成可能なポリイオンコンプレックスを提供することを目的とする。本発明はまた、当該ポリイオンコンプレックスから形成された成形体を提供することも目的とする。

本発明者らは、カルボキシメチル基を導入した修飾ヒアルロン酸（カルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸）と、キトサンとを含むポリイオンコンプレックスが、上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、例えば、以下の各発明に関する。
［１］ カルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸及びその塩からなる群より選択される少なくとも１種の修飾ヒアルロン酸類と、キトサン及びその塩からなる群より選択される少なくとも１種のキトサン類とを含む、ポリイオンコンプレックス。
［２］ 上記修飾ヒアルロン酸類に含まれるアニオン性官能基のモル数と、上記キトサン類に含まれるカチオン性官能基のモル数との比が、０．８：１〜１．２：１の範囲内にある、［１］に記載のポリイオンコンプレックス。
［３］ 上記カルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸における構成ヒアルロン酸に対するカルボキシメチル基の修飾率が、５％以上２００％以下である、［１］又は［２］に記載のポリイオンコンプレックス。
［４］ 上記カルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸の分子量が、４，０００以上２００万以下である、［１］〜［３］のいずれかに記載のポリイオンコンプレックス。
［５］ 上記キトサンの分子量が、５，０００以上５０万以下である、［１］〜［４］のいずれかに記載のポリイオンコンプレックス。
［６］ ［１］〜［５］のいずれかに記載のポリイオンコンプレックスから形成された成形体。
［７］ フィルム、糸若しくは当該糸を含む編布、又はマイクロニードルである、［６］に記載の成形体。
［８］ 最大応力が７０ＭＰａ以上である、［６］又は［７］に記載の成形体。

本発明によれば、液体と接触した場合の寸法安定性が改善された成形体を形成可能なポリイオンコンプレックスの提供が可能となる。本発明によればまた、当該ポリイオンコンプレックスから形成された寸法安定性が改善された成形体の提供が可能となる。

本発明に係る成形体は、体液等の液体と接触した場合でも膨潤速度が緩やかなうえ、最大に膨潤したときの膨潤率が低く抑えられているため、成形体の急激な膨潤による組織損傷、組織からの脱落、強度の低下等を抑制できるので、生体に適用するバイオマテリアルとして優れた特性を有している。

カルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸（ＨＹＡ誘導体）とキトサン（Ｈ−ＣＨＩ）とのポリイオンコンプレックスのゲルを示す写真である。 ＨＹＡ誘導体とＨ−ＣＨＩとのポリイオンコンプレックスから作製したフィルム（ＨＹＡ誘導体／Ｈ−ＣＨＩフィルム）を示す写真である。 ＨＹＡ誘導体／Ｈ−ＣＨＩフィルムの超純水（ＵＰＷ）及びリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の膨潤性を評価した結果を示すグラフである。 ＨＹＡ誘導体／Ｈ−ＣＨＩフィルムの超純水（ＵＰＷ）及びリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の重量損失を評価した結果を示すグラフである。 ＨＹＡ誘導体／Ｈ−ＣＨＩフィルムの引張強度を評価した結果を示すグラフである。 未修飾ヒアルロン酸（ＨＹＡ−ＬＱ又はＨＹＡ−ＬＱＨ）とキトサン（Ｈ−ＣＨＩ）とのポリイオンコンプレックスから作製したフィルム（ＨＹＡ−ＬＱ／Ｈ−ＣＨＩフィルム（図６（Ａ））又はＨＹＡ−ＬＱＨ／Ｈ−ＣＨＩフィルム（図６（Ｂ）））の超純水（ＵＰＷ）中の膨潤性を評価した結果を示すグラフである。 ＨＹＡ−ＬＱ／Ｈ−ＣＨＩフィルム又はＨＹＡ−ＬＱＨ／Ｈ−ＣＨＩフィルムのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の膨潤性（図７（Ａ））及び重量損失（図７（Ｂ））を評価した結果を示すグラフである。 ＨＹＡ−ＬＱ／Ｈ−ＣＨＩフィルム（図８（Ａ））又はＨＹＡ−ＬＱＨ／Ｈ−ＣＨＩフィルム（図８（Ｂ））の引張強度を評価した結果を示すグラフである。

以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。

＜本発明の特徴＞
（ポリイオンコンプレックス）
本発明は、カルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸及びその塩からなる群より選択される少なくとも１種と、キトサン及びその塩からなる群より選択される少なくとも１種とを含む、ポリイオンコンプレックスを提供することに特徴を有する。

（ポリイオンコンプレックスから形成された成形体）
本発明はまた、本発明に係るポリイオンコンプレックスから形成された成形体を提供することに特徴を有する。

＜カルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸及びその塩＞
本明細書において、「カルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸及びその塩」（以下、まとめて「修飾ヒアルロン酸類」と記載することもある。）とは、少なくとも一部にカルボキシメチル基が導入されているヒアルロン酸及びその塩のことをいう。ここで、「カルボキシメチル基」とは、「−ＣＨ_２−ＣＯ_２Ｈ」または「−ＣＨ_２−ＣＯ_２ ⁻」で表される基のことをいう。

本実施形態に係る修飾ヒアルロン酸類は、例えば、ヒアルロン酸（下記式（１）参照）を構成する水酸基（下記式（１）において、ヒアルロン酸を構成するＮ−アセチルグルコサミンのＣ−４位及びＣ−６位、並びにヒアルロン酸を構成するグルクロン酸のＣ−２位及びＣ−３位）のうち、少なくとも一部の水酸基の水素原子が−ＣＨ_２−ＣＯ_２Ｈ及び／又は−ＣＨ_２−ＣＯ_２ ⁻で表される基に置換されている化合物又はその塩であってよい。

式（１）中、ｎは１以上７，５００以下の数を示す。

本実施形態に係る修飾ヒアルロン酸類は、例えば、下記式（２）で表される化合物又はその塩であってよい。

式（２）中、Ｒ^１〜Ｒ^５は独立して、水素原子、−ＣＨ_２−ＣＯ_２Ｈで表される基、又は−ＣＨ_２−ＣＯ_２ ⁻で表される基を示し（ただし、Ｒ^１〜Ｒ^５がいずれも水素原子を表す場合を除く。）、ｎは１以上７，５００以下の数を示す。

カルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸の塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩及びアンモニウム塩等の形態が挙げられる。

（修飾ヒアルロン酸類の分子量）
本実施形態に係る修飾ヒアルロン酸類の分子量は、例えば、４，０００以上２００万以下であってもよい。液体と接触した場合の寸法安定性に優れると共に、機械的強度（例えば、引張強度）にも優れる成形体が得られるという観点から、本実施形態に係る修飾ヒアルロン酸類の分子量は、１０万以上１８０万以下であることが好ましく、４０万以上１６０万以下であることがより好ましく、６０万以上１４０万以下であることが更に好ましく、８０万以上１２０万以下であることが更により好ましい。

修飾ヒアルロン酸類の分子量は、以下の方法にて測定することができる。
まず、ゲル濾過カラムを用いて、分子量が既知である複数の（精製）ヒアルロン酸（基準物質）を液体クロマトグラフィー分析することで、それらの保持時間より検量線を作成する。同様に、測定対象である修飾ヒアルロン酸類を液体クロマトグラフィー分析し、作製した検量線を用いて分子量を求めることで、修飾ヒアルロン酸類の分子量を求めることができる。

液体クロマトグラフィー分析に使用することができる液体クロマトグラフィー分析装置としては、例えば、Ｗａｔｅｒｓ Ａｌｌｉａｎｃｅ ２６９０ ＨＰＬＣ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ Ｍｏｄｕｌｅ（Ｗａｔｅｒｓ社製）、Ｗａｔｅｒｓ Ａｌｌｉａｎｃｅ ２６９５ ＨＰＬＣ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ Ｍｏｄｕｌｅ（Ｗａｔｅｒｓ社製）、１２００ Ｓｅｒｉｅｓ（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）が挙げられる。また、液体クロマトグラフィー分析に使用することができるカラムとしては、例えば、ｓｈｏｄｅｘ社製配位子交換クロマトグラフィー用カラム（配位子交換モード＋サイズ排除モード）、型名「ＳＵＧＡＲ ＫＳ−８０１」、「ＳＵＧＡＲ ＫＳ−８０２」、「ＳＵＧＡＲ ＫＳ−８０３」、「ＳＵＧＡＲ ＫＳ−８０４」、「ＳＵＧＡＲ ＫＳ−８０５」、「ＳＵＧＡＲ ＫＳ−８０６」、「ＳＵＧＡＲＫＳ−８０７」や、ＴＯＳＯＨ製サイズ排除クロマトグラフィーカラム、型名「ＴＳＫｇｅｌ ＧＭＰＷ」が挙げられる。

（修飾ヒアルロン酸類の修飾率）
本実施形態に係る修飾ヒアルロン酸類の修飾率（カルボキシメチル化率）は、ヒアルロン酸を構成する２糖単位を１単位とし、当該１単位あたりに含まれるカルボキシメチル基の数を意味し、具体的には、当該１単位を１００％とした場合の、該１単位に対する、該１単位あたりに含まれるカルボキシメチル基の数の割合（％）をいう。ここで、ヒアルロン酸を構成する２糖単位とは、ヒアルロン酸を構成する、隣り合って結合する２糖（グルクロン酸及びＮ−アセチルグルコサミン）で構成される１単位をいう。

修飾ヒアルロン酸類の修飾率は、例えば、修飾ヒアルロン酸類の^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルにおいて、ヒアルロン酸骨格中のＣ−２位に結合するＮ−アセチル基のメチル基（−ＣＨ_３）のプロトンを示すピーク（２ｐｐｍ付近に発現）の積算値に対する、−ＣＨ_２−ＣＯ_２Ｈ及び／又は−ＣＨ_２−ＣＯ_２ ⁻で表される基中のメチレン基（−ＣＨ_２−）のプロトンを示すピーク（３．８ｐｐｍ以上４．２ｐｐｍ以下の範囲に発現）の積算値の割合（％）で表される。

本実施形態に係る修飾ヒアルロン酸類の修飾率は、例えば、５％以上２００％以下であってもよい。液体と接触した場合の寸法安定性に優れると共に、機械的強度（例えば、引張強度）にも優れる成形体が得られるという観点から、本実施形態に係る修飾ヒアルロン酸類の修飾率は、２０％以上１８０％以下であることが好ましく、３５％以上１５０％以下であることがより好ましく、５０％以上１２０％以下であることが更に好ましく、６５％以上９５％以下であることが更により好ましい。

（修飾ヒアルロン酸類の入手方法）
本実施形態に係る修飾ヒアルロン酸類は、例えば、温度が３０℃以下の含水溶媒（例えば、水、又はエタノール等の水溶性有機溶媒と水との混合液）中で、溶解したヒアルロン酸及び／又はその塩をハロ酢酸及び／又はその塩と反応させることにより得ることができる。また、本実施形態に係る修飾ヒアルロン酸類は、例えば、特開２０１５−１４７９４５号公報に記載された製造方法により得ることができる。

本実施形態に係る修飾ヒアルロン酸類は、市販されているものを使用してもよい。市販されている修飾ヒアルロン酸類としては、例えば、ヒアロキャッチ（登録商標）（キユーピー株式会社製）を挙げることができる。

＜キトサン及びその塩＞
本実施形態に係るキトサン及びその塩（以下、まとめて「キトサン類」と記載することもある。）としては、特に制限されるものではなく、例えば、カニ、エビ等の甲殻類の外骨格から得られるキチンを脱アセチル化して得たものを利用することができる。キトサンの塩としては、例えば、塩酸塩、酢酸塩、ギ酸塩等の形態が挙げられる。

（キトサン類の分子量）
本実施形態に係るキトサン類の分子量は、例えば、５，０００以上５０万以下であってもよい。液体と接触した場合の寸法安定性に優れると共に、機械的強度（例えば、引張強度）にも優れる成形体が得られるという観点から、本実施形態に係るキトサン類の分子量は、１万以上４０万以下であることが好ましく、５万以上３０万以下であることがより好ましく、１０万以上２０万以下であることが更に好ましい。キトサン類の分子量は、例えば、サイズ排除クロマトグラフィーにより測定することができる。

（キトサン類の脱アセチル化度）
本実施形態に係るキトサン類の脱アセチル化度は、例えば、６０％以上１００％以下であってもよい。液体と接触した場合の寸法安定性に優れると共に、機械的強度（例えば、引張強度）にも優れる成形体が得られるという観点から、本実施形態に係るキトサン類の脱アセチル化度は、７５％以上１００％以下であることが好ましく、８０％以上９８％以下であることがより好ましく、８５％以上９５％以下であることが更に好ましい。キトサン類の脱アセチル化度は、例えば、ＮＭＲ測定、赤外吸収スペクトル測定により、−ＮＨ_２基と−ＮＨＣＯＣＨ_３基の比率を算出することにより、求めることができる。

（キトサン類の入手方法）
本実施形態に係るキトサン類は、市販されているものを使用してもよい。市販されているキトサン類としては、例えば、キトサン（フレーク状，分子量１０万以上，脱アセチル化度９０．２％，ナカライテスク株式会社製）、ＣＨＩＴＯＳＡＮ ＰＯＷＤＥＲ ＰＵＲＩＦＩＥＤ（分子量１万５千以下，脱アセチル化度８５％以上，ＰＯＬＹＳＣＩＥＮＣＥＳ社製）を挙げることができる。

＜ポリイオンコンプレックス＞
ポリイオンコンプレックスは、例えば、アニオン性ポリマーとカチオン性ポリマーとを水溶液中で混合することで静電相互作用により形成される複合体である。本発明に係るポリイオンコンプレックスは、アニオン性ポリマーとして修飾ヒアルロン酸類を、カチオン性ポリマーとしてキトサン類を使用して得られるものである。

（修飾ヒアルロン酸類とキトサン類との含有比）
本実施形態に係るポリイオンコンプレックスに含まれる修飾ヒアルロン酸類とキトサン類との比は、特に限定されるものではないが、例えば、修飾ヒアルロン酸類に含まれるアニオン性官能基（−ＣＨ_２−ＣＯ_２ ⁻及び−ＣＨ_２−ＣＯ_２Ｈ）のモル数と、キトサン類に含まれるカチオン性官能基（−ＮＨ_２）のモル数との比が、０．８：１〜１．２：１となる範囲であることが好ましく、０．９：１〜１．１：１となる範囲であることがより好ましく、０．９５：１〜１．０５：１となる範囲であることが更に好ましく、１：１となる範囲であることが更により好ましい。

（ポリイオンコンプレックスに含まれる成分）
本実施形態に係るポリイオンコンプレックスは、修飾ヒアルロン酸類からなる群より選択される少なくとも１種と、キトサン類からなる群より選択される少なくとも１種とを含むものであればよく、修飾ヒアルロン酸類を２種以上含むものであってもよく、キトサン類を２種以上含むものであってもよく、修飾ヒアルロン酸類及びキトサン類をそれぞれ２種以上含むものであってもよい。本実施形態に係るポリイオンコンプレックスは実質的に修飾ヒアルロン酸類からなる群より選択される少なくとも１種、及びキトサン類からなる群より選択される少なくとも１種とからなるものであるのが好ましく、修飾ヒアルロン酸類からなる群より選択される少なくとも１種、及びキトサン類からなる群より選択される少なくとも１種のみからなるものであるのがより好ましい。なお、いずれの態様においても、ポリイオンコンプレックスの調製に伴い不可避的に含まれる不純物を含むことを排除するものではない。

＜ポリイオンコンプレックスの製造方法＞
本実施形態に係るポリイオンコンプレックスは、修飾ヒアルロン酸類からなる群より選択される少なくとも１種と、キトサン類からなる群より選択される少なくとも１種とを混合すること（以下、「混合工程」ともいう。）により製造することができる。

（混合工程）
混合工程において、修飾ヒアルロン酸類とキトサン類を混合する方法は、特に限定されるものではないが、均質なポリイオンコンプレックスが得られるという観点から、それぞれの溶液を調製し、両溶液を混合する方法が好ましい。溶液を調製する際に用いる溶媒としては、水が好ましく、蒸留水又は超純水がより好ましい。溶媒としては、必要に応じて、緩衝液を用いてもよく、酢酸、アルコール等の有機溶媒を添加してもよい。

（修飾ヒアルロン酸類溶液）
修飾ヒアルロン酸類溶液における、修飾ヒアルロン酸類の濃度は特に限定されるものではないが、例えば、０．０１重量％以上２０重量％以下の範囲とすることができる。混合工程の操作性を向上させる観点からは、修飾ヒアルロン酸類の濃度は、０．１重量％以上５重量％以下の範囲であることが好ましい。

（キトサン類溶液）
キトサン類溶液における、キトサン類の濃度は特に限定されるものではないが、例えば、０．０１重量％以上２０重量％以下の範囲とすることができる。混合工程の操作性を向上させる観点からは、キトサン類の濃度は、０．１重量％以上５重量％以下の範囲であることが好ましい。

（修飾ヒアルロン酸類溶液及びキトサン類溶液の粘度）
修飾ヒアルロン酸類溶液及びキトサン類溶液を混合した後、均質なポリイオンコンプレックスを得るために、修飾ヒアルロン酸類溶液及びキトサン類溶液の粘度を調整することが好ましい。修飾ヒアルロン酸類溶液及びキトサン類溶液の粘度は、例えば、５Ｐａ・ｓ以下であることが好ましく、０．５Ｐａ・ｓ以下であることがより好ましい。修飾ヒアルロン酸類溶液及びキトサン類溶液の粘度は、例えば、修飾ヒアルロン酸類及びキトサン類の濃度を調整することにより調整することができる。

（混合工程の諸条件）
混合工程では、必要に応じて、撹拌をしながら修飾ヒアルロン酸類溶液及びキトサン類溶液を混合してもよい。また、混合時の各溶液の温度は、特に制限されるものではないが、例えば、０〜１００℃であることが好ましく、４〜８０℃であることがより好ましい。

混合工程では、ポリイオンコンプレックス中の修飾ヒアルロン酸類とキトサン類との含有比が、上述した範囲内となるように、使用する修飾ヒアルロン酸類溶液及びキトサン類溶液の割合を決定することが好ましい。また、例えば、修飾ヒアルロン酸類溶液及びキトサン類溶液のいずれか一方の溶液に対し、他方の溶液をゲル形成が飽和するまで滴下することで、修飾ヒアルロン酸類に含まれるアニオン性官能基のモル数と、キトサン類に含まれるカチオン性官能基のモル数との比が、約１：１となるようにすることもできる。

（超音波処理）
本実施形態に係るポリイオンコンプレックスの製造方法では、混合工程で修飾ヒアルロン酸類とキトサン類を混合した後、超音波処理を行うことが好ましい。これにより、ポリイオンコンプレックスの収率を向上させることができる。超音波処理の条件としては、これに限られるものではないが、例えば、バス型超音波照射器を用い、出力２４０ｋＷで２５分間超音波照射することで行うことができる。

＜ポリイオンコンプレックスの成形体＞
本発明に係る成形体は、上述した本発明のポリイオンコンプレックスから形成されたものである。

（成形体の形状）
本実施形態に係る成形体の形状は、本発明のポリイオンコンプレックスが任意の形状に成形できるため、特に制限されるものではないが、生体に好ましく適用できるという観点から、例えば、フィルム、糸及び当該糸を含む編布、マイクロニードルの形状であることが好ましい。本実施形態に係る成形体は、体液等の液体と接触した場合の膨潤率が低く抑えられ、寸法安定性に優れること、及び引張強度等の機械的特性に優れることから、フィルム、糸及び当該糸を含む編布、マイクロニードル等の形状にして、生体に好ましく適用できる。

（成形体の膨潤率）
本実施形態に係る成形体は、体液等の液体と接触した場合の膨潤率が低く抑えられ、寸法安定性に優れている。したがって、本実施形態に係る成形体は、例えば、超純水に３０分間浸漬したときの膨潤率が１６０％以下であってよく、１５０％以下であるのが好ましく、１４０％以下であることがより好ましい。膨潤率は、浸漬前の成形体の重量をＷ_Ｄ、浸漬後の成形体の重量をＷ_Ｓとしたときに下記式Ａで表される値である。

また、本実施形態に係る成形体は、例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に９０分間浸漬したときの膨潤率が５００％以下であってよく、４５０％以下であるのが好ましく、４００％以下であることがより好ましく、３５０％以下であるのが更に好ましい。更に、本実施形態に係る成形体は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に浸漬したときに膨潤率が飽和するまでの浸漬時間が、４０分間以上であってよく、５０分間以上であることが好ましく、６０分間以上であることがより好ましく、７０分間以上であることが更に好ましく、８０分間以上であることが更により好ましく、９０分間以上であることが更によりまた好ましい。

（成形体の重量損失）
本実施形態に係る成形体は、体液等の液体と接触した場合の重量損失が低く抑えられており、ポリイオンコンプレックスの構成成分が安定に保持されている。したがって、本実施形態に係る成形体は、例えば、超純水に６０分間浸漬したときの重量損失が５％以下であってよく、４％以下であるのが好ましく、３％以下であることがより好ましい。また、本実施形態に係る成形体は、例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に９０分間浸漬したときの重量損失が１５％以下であってよく、１０％以下であることが好ましく、７．５％以下であることがより好ましい。重量損失は、浸漬前の成形体の重量をＷ_Ｄ、浸漬後の成形体の乾燥重量をＷ_Ｓとしたときに下記式Ｂで表される値である。

（成形体の最大応力）
本実施形態に係る成形体は、引張強度等の機械的特性に優れている。したがって、本実施形態に係る成形体は、例えば、最大応力が７０ＭＰａ以上であってよく、７５ＭＰａ以上であることが好ましく、８０ＭＰａ以上であることがより好ましい。最大応力は、例えば、卓上精密万能試験機（ＡＧＳ−Ｊ，島津製作所製）に垂直になるように試料（フィルム）を挟み、ロードセル定格５００Ｎ、クロスヘッド１ｍｍ／ｍｉｎ、標点距離２０ｍｍで引張試験を行ったとき、試験力を断面積で除した応力が最大となるときの値である。

（フィルム）
本実施形態に係る成形体がフィルムの形状である場合、フィルムの厚みは、特に制限されず用途に応じて適宜選定可能であるが、例えば、０．０２μｍ〜５００μｍであることが好ましく、０．２μｍ〜２００μｍであることがより好ましい。フィルムの大きさは、特に制限されず用途に応じて適宜選定可能であるが、例えば、０．０１ｃｍ^２以上であることが好ましく、０．５ｃｍ^２以上であることがより好ましい。

＜ポリイオンコンプレックスの成形体の製造方法＞
本発明に係る成形体は、例えば、本発明に係るポリイオンコンプレックスを成形すること（以下、「成形工程」）で得ることができる。また、本発明に係るポリイオンコンプレックスがゲル状の析出物である場合、ゲル状の析出物を、凍結乾燥、自然乾燥等の手法により乾燥して固形体とし、固形体を成形工程に用いてもよい。

（成形工程）
成形工程は、本発明に係るポリイオンコンプレックスを加圧成形する工程であってもよい。加圧成形は、加熱しながら行なうこともできる（加熱加圧成形）。加熱する場合には、加熱と加圧を同時に行ってもよい。加熱加圧成形は、例えば、熱プレス機、加熱延伸機を用いて行ってもよい。加熱加圧成形を行うことで、均一で緻密な成形体を得ることができる。

成形工程は、本発明に係るポリイオンコンプレックスを射出成形する工程であってもよい。射出成形は、例えば、加熱射出成形機を用いて行ってもよい。射出成形機の金型の形状を選択することで、例えば、糸の形状の成形体など、金型の形状に対応した成形体を製造することができる。また、糸の形状の成形体を得た後、当該糸を編み込んで編布の形状の成形体を得ることもできる。

成形工程は、本発明に係るポリイオンコンプレックスを鋳型に充填し乾燥する工程であってもよく、ステンレス線又はシリコン線を直立配列させ、これらの線を本発明に係るポリイオンコンプレックス溶液の表面に接触させゆっくり引き上げる又は引き下げることにより成形する工程であってもよい。

（加熱加圧成形）
成形工程で加熱加圧成形を行う場合、成形工程を繰り返し行ってもよい。成形工程を繰り返し行う場合、繰り返しの回数は、例えば、２回以上２０回以下であってよく、２回以上６回以下であることが好ましい。また、必要に応じて、本発明に係るポリイオンコンプレックスを追加しながら加熱加圧成形を繰り返してもよい。

成形工程を繰り返し行う場合、成形工程の初期の段階、例えば、一回目の成形工程と二回目の成形工程との間に、対象物の表面を水で濡らすことが好ましい。これにより、均質で徹密な成形体が得られやすくなる。これは、加圧加熱対象物が多少ゲル状態に戻って流動性を発現し、塊が動きやすくなって、全体として均質になるものと推察される。

加熱加圧成形の際の加熱温度は、例えば、２５℃以上２５０℃以下とすることができ、５０℃以上１５０℃以下としてもよい。加熱加圧成形の際の加熱温度は、修飾ヒアルロン酸類及びキトサン類の少なくとも一方のガラス転移温度以上の温度であることが好ましい。

加圧成形の際の加圧は、任意の圧力で行えばよく、加圧力が大きいほどより徹密な成形体が得られる。加圧成形の際の加圧力は、例えば、１ＭＰａ以上１００ＭＰａ以下であってよく、５ＭＰａ以上２５ＭＰａ以下であってもよい。また、加圧時に少量の水及び／又はエタノール、グリセロール等の低級アルコールで対象物の表面を濡らしてもよい。これにより、均質で緻密な成形体が得られやすくなる。

また、加熱加圧成形の際に、厚さの決まったスペーサーを用いることによって、得られる成形体の厚みを制御することができる。スペーサーは、加熱加圧成形によってもその形態が変化しない材質からなり、通常は薄板状であり、その中心に目的とする成形体の面積に相当する穴を空けたものである。熱プレス機のプレス部にこのスペーサーを置き、スペーサー穴の部分に本発明に係るポリイオンコンプレックスを充分な量置いた後、加熱加圧操作を行うと、このスペーサーの厚みに相当する厚さをもった成形体が得られる。

＜成形体の用途＞
本実施形態に係る成形体の用途としては、例えば、医療分野の医用材料、特に生体材料（人工弁、人工臓器、人工血管、創傷被覆材等）の一部として生体組織の皮膚や臓器などの修復、再生、治療等が挙げられる。また、マイクロニードル、再生医療分野における生体組織培養の足場としても好ましく用いることができる。

生体材料の中でも医療器具用コーティング剤として利用することができる。具体的には、機械的人工心臓弁、生体人工心臓弁、人工血管、血管修復用材料、個人用透析装置、人工心肺装置、気泡型人工肺、膜型人工肺、植込型ペースメーカ、体外型ペースメーカ、心臓ペースメーカの部品及び付属品、人工腎臓用血液回路、血液ろ過器、血液ろ過用装置、吸着型血液浄化器、吸着型血液浄化装置、膜型血漿分離器、膜型血漿成分分離器、遠心型血液成分分離装置、膜型血漿分離装置、腹膜潅流システム、透析用監視装置、多人数用透析液供給装置、中空糸型透析器、コイル型透析器、積層型透析器、人工肝臓、人工すい臓、腹水ろ過濃縮器、補助循環装置などの内蔵機能代用器が挙げられる。

本実施形態に係る成形体はまた、衛生材料、化粧品材料、食品産業材料として好ましく使用することができる。さらに、創傷パッド、経皮吸収剤担持膜、皮膚の保湿シート、可食性食品保護フィルム、食品包装フィルム等への応用も可能である。

以下、実施例等に基づいて、本発明をより具体的に説明する。ただし、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

〔実施例１：ＨＹＡ誘導体／Ｈ−ＣＨＩフィルムの作製と物性評価（１）〕
（１−１）ＨＹＡ誘導体／Ｈ−ＣＨＩフィルムの作製
カルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸（ヒアロキャッチ（登録商標），平均分子量８０万〜１２０万，修飾率６５．０〜９５．０％，キユーピー株式会社製）とキトサン（キトサン（フレーク状），平均分子量１００，０００以上，脱アセチル化度９０．２％，ナカライテスク株式会社製）を用いてフィルム（ＨＹＡ誘導体／Ｈ−ＣＨＩフィルム）を作製した。

（１−１−１）乾燥ゲルの調製
５００ｍＬビーカーにキトサン（Ｈ−ＣＨＩ）１．０ｇと１．０重量％酢酸水溶液１００ｍＬを加え、マグネチックスターラで約１日撹拌し、１．０重量％Ｈ−ＣＨＩ溶液を調製した。同様に、５００ｍＬビーカーにカルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸（ＨＹＡ誘導体）１．０ｇと超純水１００ｍＬを加え、マグネチックスターラで約１日攪拌し、１．０重量％ＨＹＡ誘導体溶液を調製した。

１．０重量％Ｈ−ＣＨＩ溶液７．５ｍＬを５０ｍＬ遠沈管に入れ、そこに１．０重量％ＨＹＡ誘導体溶液をシリンジで滴下し（約１１ｍＬ）、ボルテックスミキサーで激しく撹拌して、ＨＹＡ誘導体とＨ−ＣＨＩとのポリイオンコンプレックス（ＰＩＣ）ゲルを形成させた（図１（ａ））。

遠心分離機（ＣＮ−２０６０，ＡＳ ＯＮＥ製）で遠心分離（６０００ｒｐｍ，５分間）し、上清を廃棄した後、超純水を約１５ｍＬ加え、よく振り混ぜＰＩＣゲルを洗浄した。遠心分離（６０００ｒｐｍ，３分間）し、上清を廃棄して、ＨＹＡ誘導体／Ｈ−ＣＨＩ ＰＩＣゲルを得た（図１（ｂ））。

液体窒素で予備凍結した後、凍結乾燥機（ＦＤＵ−１２００，東京理化器械株式会社製）で約１日凍結乾燥を行い、乾燥ゲルを得た（図１（ｃ））。乾燥ゲルの収率は、６３．９８±５．２７％（ｎ＝５）であった。得られた乾燥ゲルは、参考例に示した従来のＨＹＡ／ＣＨＩゲルと巨視像では違いが見られなかった。

（１−１−２）ＨＹＡ誘導体／Ｈ−ＣＨＩフィルムの作製
（１−１−１）で調製した乾燥ゲル、ポリエチレンテレフタラート（ＰＥＴ）シート、及びポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）シートを、ＰＥＴシート−ＰＴＥＦシート−乾燥ゲル−ＰＴＦＥシート−ＰＥＴシートの順に重ねたものを、熱プレス機（ＡＨ−２００３，ＡＳ ＯＮＥ製）を使用して熱プレス（１２０℃，２０ＭＰａ）し、すぐに取り出した（図２（ａ））。

熱プレス後の乾燥ゲルに対し、表面覆う程度の量の超純水を滴下し、その状態で５分間程度放置した。キムワイプで余分な水分をふき取った後、ＰＥＴシート、ＰＴＦＥシート、ＰＥＴシート、ＰＴＦＥシートの順に挟みこみ、熱プレス機で熱プレス（１２０℃，０ＭＰａ）し、ゲル中の水分が蒸発する音が聞こえなくなる前に取り出した（図２（ｂ））。

水分を飛ばした後のゲルをピンセットで四角形になるように折りたたんだ（図２（ｃ））。ＰＴＦＥシートにスペーサー（ＰＥＴシートの中央部を３×３ｃｍ^２に切り抜いたもの）を重ね、スペーサーの中央部の切り抜き部に折りたたんだゲルを配置した後、更にＰＴＦＥシートを重ねた（ＰＴＦＥシート−スペーサー−ＰＴＦＥシートの順）。これを熱プレス機で３分間熱プレス（１２０℃，２０ＭＰａ）した。熱プレス後、室温で放冷し、ＨＹＡ誘導体／Ｈ−ＣＨＩフィルムを得た（図２（ｄ））。得られたＨＹＡ誘導体／Ｈ−ＣＨＩフィルムは、平滑で緻密な構造であり、参考例に示した従来のＨＹＡ／ＣＨＩフィルムと巨視像では違いが見られなかった。

（１−２）ＨＹＡ誘導体／Ｈ−ＣＨＩフィルムの物性評価
作製したＨＹＡ誘導体／Ｈ−ＣＨＩフィルムについて、以下の手順で超純水（ＵＰＷ）膨潤性、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）膨潤性、及び重量損失を評価した。

（１−２−１）超純水（ＵＰＷ）膨潤性評価
ＨＹＡ誘導体／Ｈ−ＣＨＩフィルムを１×１ｃｍ^２に切り出し、その重量（浸漬前の重量）を測定した。次に、サンプルケースに超純水を４ｍＬ入れ、そこにフィルムを浸漬させた。浸漬の開始から１，３，５，１０，２０，３０，４０，５０及び６０分後にフィルムを取り出し、キムワイプで余分な水分をふき取った後、重量（浸漬後の重量）を測定した。６０分間浸漬させたフィルムをシリカゲルの入ったサンプルケースに入れ、約１日乾燥させた後、再度重量（乾燥後の重量）を測定した。

下記式Ａに従って、膨潤率を算出した。

Ｗ_Ｄ：浸漬前の重量，Ｗ_Ｓ：浸漬後の重量

（１−２−２）リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）膨潤性
サンプルケース中の超純水をＰＢＳに代えたこと、及びＰＢＳへの浸漬を浸漬開始から９０分後まで行ったこと以外は、（１−２−１）超純水（ＵＰＷ）膨潤性評価と同じ手順で測定を行い、式Ａに従って膨潤率を算出した。

（１−２−３）重量損失評価
（１−２−１）及び（１−２−２）と同じ手順で測定を行い、下記式Ｂに従って、重量損失を算出した。

Ｗ_Ｄ：浸漬前の重量，Ｗ_Ａ：乾燥後の重量

超純水（ＵＰＷ）膨潤性、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）膨潤性、及び重量損失は、それぞれ２サンプルに対して測定を行い、その平均値を求めた。評価結果を図３及び図４、並びに表１に示す。

超純水に浸漬したＨＹＡ誘導体／Ｈ−ＣＨＩフィルムの膨潤率は、参考例に示した従来のＨＹＡ／ＣＨＩフィルムと比べ、低いものであった。また、ＰＢＳに浸漬したＨＹＡ誘導体／Ｈ−ＣＨＩフィルムの膨潤率は、参考例に示した従来のＨＹＡ／ＣＨＩフィルムと比べ、ゆっくり膨潤率が増加し、また定常値に達した後の膨潤率も低いものであった。これらの結果は、ＨＹＡ誘導体／Ｈ−ＣＨＩフィルムの寸法安定性が優れていることを示している。さらに、ＨＹＡ誘導体／Ｈ−ＣＨＩフィルムは、参考例に示した従来のＨＹＡ／ＣＨＩフィルムと比べ、重量損失が小さく、フィルムからのＨＹＡ誘導体又はＨ−ＣＨＩの放出が抑えられていることが示唆された。

〔実施例２：ＨＹＡ誘導体／Ｈ−ＣＨＩフィルムの作製と物性評価（２）〕
（２−１）ＨＹＡ誘導体／Ｈ−ＣＨＩフィルムの作製
カルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸（ヒアロキャッチ（登録商標），平均分子量８０万〜１２０万，修飾率６５．０〜９５．０％，キユーピー株式会社製）とキトサン（キトサン（フレーク状），平均分子量１００，０００以上，脱アセチル化度９０．２％，ナカライテスク株式会社製）を用いてフィルム（ＨＹＡ誘導体／Ｈ−ＣＨＩフィルム）を作製した。

（２−１−１）乾燥ゲルの調製
５００ｍＬビーカーにキトサン（Ｈ−ＣＨＩ）１．０ｇと１．０重量％酢酸水溶液１００ｍＬを加え、マグネチックスターラで約１日撹拌し、１．０重量％Ｈ−ＣＨＩ溶液を調製した。同様に、５００ｍＬビーカーにカルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸（ＨＹＡ誘導体）１．０ｇと超純水１００ｍＬを加え、マグネチックスターラで約１日攪拌し、１．０重量％ＨＹＡ誘導体溶液を調製した。

１．０重量％Ｈ−ＣＨＩ溶液１５ｍＬを５０ｍＬ遠沈管に入れ、そこに１．０重量％ＨＹＡ誘導体溶液をシリンジで滴下し（約２２ｍＬ）、ボルテックスミキサーで激しく撹拌して、ＨＹＡ誘導体とＨ−ＣＨＩとのポリイオンコンプレックス（ＰＩＣ）ゲルを形成させた。次いで、超音波洗浄機（ＡＳＵ−１０，ＡＳ ＯＮＥ製）を使用し、２５分間超音波処理をした。

遠心分離機（ＣＮ−２０６０，ＡＳ ＯＮＥ製）で遠心分離（６０００ｒｐｍ，５分間）し、上清を廃棄した後、超純水を約１５ｍＬ加え、よく振り混ぜＰＩＣゲルを洗浄した。遠心分離（６０００ｒｐｍ，３分間）し、上清を廃棄して、ＨＹＡ誘導体／Ｈ−ＣＨＩ ＰＩＣゲルを得た。

液体窒素で予備凍結した後、凍結乾燥機（ＦＤＵ−１２００，東京理化器械株式会社製）で約１日凍結乾燥を行い、乾燥ゲルを得た。乾燥ゲルの収率は、７１．９６±３．４１％（ｎ＝２）であった。得られた乾燥ゲルは、参考例に示した従来のＨＹＡ／ＣＨＩゲルと巨視像では違いが見られなかった。

（２−１−２）ＨＹＡ誘導体／Ｈ−ＣＨＩフィルムの作製
スペーサーとして、ＰＥＴシートの中央部を４×４ｃｍ^２切り抜いたものを使用したこと以外は、（１−１−２）と同じ手順で、（２−１−１）で調製した乾燥ゲルからＨＹＡ誘導体／Ｈ−ＣＨＩフィルムを作製した。

（２−２）ＨＹＡ誘導体／Ｈ−ＣＨＩフィルムの物性評価
作製したＨＹＡ誘導体／Ｈ−ＣＨＩフィルムについて、以下の手順で引張強度を評価した。

（２−２−１）引張強度評価
卓上精密万能試験機（ＡＧＳ−Ｊ，島津製作所製）に垂直になるように試料（フィルム）を挟み、ロードセル定格５００Ｎ、クロスヘッド１ｍｍ／ｍｉｎ、標点距離２０ｍｍで引張試験を行った。

引張強度は、５サンプルに対して測定を行い、その平均値を求めた。評価結果を図５及び表２に示す。図５は、測定結果の試験力を断面積で除した応力（Ｓｔｒｅｓｓ，単位ＭＰａ）を縦軸とし、ストロークを元の長さで除した歪み（Ｓｔｒａｉｎ）を横軸にプロットしたグラフである。また、測定日の湿度は２５％であった。

ＨＹＡ誘導体／Ｈ−ＣＨＩフィルムは、参考例に示した従来のＨＹＡ／ＣＨＩフィルムと比べ、最大応力が高く、歪みが小さかった。これらの結果は、ＨＹＡ誘導体／Ｈ−ＣＨＩフィルムは、機械的強度にも優れていることを示している。

〔参考例：未修飾ヒアルロン酸／Ｈ−ＣＨＩフィルムの作製と物性評価〕
（Ｓ−１）未修飾ヒアルロン酸／Ｈ−ＣＨＩフィルムの作製
未修飾のヒアルロン酸ＨＹＡ−ＬＱ（平均分子量８５万〜１６０万，キユーピー株式会社製）又はＨＹＡ−ＬＱＨ（平均分子量１２０万〜２２０万，キユーピー株式会社製）とキトサン（キトサン（フレーク状），平均分子量１００，０００以上，脱アセチル化度９０．２％，ナカライテスク株式会社製）を用いてフィルムを作製した。

（Ｓ−１−１）乾燥ゲルの調製
５００ｍＬビーカーにキトサン（Ｈ−ＣＨＩ）５．０ｇと１．０重量％酢酸水溶液５００ｍＬを加え、マグネチックスターラで約１日撹拌し、１．０重量％Ｈ−ＣＨＩ溶液を調製した。同様に、５００ｍＬビーカーに未修飾ヒアルロン酸（ＨＹＡ−ＬＱ又はＨＹＡ−ＬＱＨ）１．０ｇと超純水ｌ００ｍＬを加え、マグネチックスターラで約１日撹拌し、１．０重量％ヒアルロン酸溶液を調製した。

１．０重量％Ｈ−ＣＨＩ溶液７．５ｍＬを５０ｍＬ遠沈管に入れ、そこに１．０重量％ヒアルロン酸溶液をシリンジで滴下し（約１６ｍＬ）、ボルテックスミキサーで激しく撹拌して、ヒアルロン酸とＨ−ＣＨＩとのポリイオンコンプレックス（ＰＩＣ）ゲルを形成させた。

遠心分離機（ＣＮ−２０６０，ＡＳ ＯＮＥ製）で遠心分離（６０００ｒｐｍ，５分間）し、上清を廃棄した後、超純水を約１５ｍＬ加え、よく振り混ぜＰＩＣゲルを洗浄した。遠心分離（６０００ｒｐｍ，３分間）し、上清を廃棄して、未修飾ヒアルロン酸／Ｈ−ＣＨＩ ＰＩＣゲルを得た。

液体窒素で予備凍結した後、凍結乾燥機（ＦＤＵ−１２００，東京理化器械株式会社製）で約１日凍結乾燥を行い、乾燥ゲルを得た。

（Ｓ−１−２）未修飾ヒアルロン酸／Ｈ−ＣＨＩフィルムの作製
（１−１−２）と同じ手順で、（Ｓ−１−１）で調製した乾燥ゲルから未修飾ヒアルロン酸／Ｈ−ＣＨＩフィルムを作製した。

（Ｓ−２）未修飾ヒアルロン酸／Ｈ−ＣＨＩフィルムの物性評価
未修飾ヒアルロン酸としてＨＹＡ−ＬＱを使用した未修飾ヒアルロン酸／Ｈ−ＣＨＩフィルム（ＨＹＡ−ＬＱ／Ｈ−ＣＨＩフィルム）、及びＨＹＡ−ＬＱＨを使用した未修飾ヒアルロン酸／Ｈ−ＣＨＩフィルム（ＨＹＡ−ＬＱＨ／Ｈ−ＣＨＩフィルム）について、（１−２−１）〜（１−２−３）及び（２−２−１）と同じ手順で、超純水（ＵＰＷ）膨潤性、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）膨潤性、重量損失、及び引張強度を評価した。

超純水（ＵＰＷ）膨潤性、及び超純水での重量損失の評価結果を図６及び表３に示す。なお、表３には、最終的な膨潤率のみを示す。

リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）膨潤性、及びＰＢＳでの重量損失の評価結果を図７に示す。

引張強度の評価結果を図８及び表４に示す。

Claims (8)

1. ポリイオンコンプレックスであって、
   カルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸及びその塩からなる群より選択される少なくとも１種の修飾ヒアルロン酸類と、キトサン及びその塩からなる群より選択される少なくとも１種のキトサン類とを含む、ポリイオンコンプレックス。
2. 請求項１に記載のポリイオンコンプレックスにおいて、
   前記修飾ヒアルロン酸類に含まれるアニオン性官能基のモル数と、前記キトサン類に含まれるカチオン性官能基のモル数との比が、０．８：１〜１．２：１の範囲内にある、
   ポリイオンコンプレックス。
3. 請求項１又は２に記載のポリイオンコンプレックスにおいて、
   前記カルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸における構成ヒアルロン酸に対するカルボキシメチル基の修飾率が、５％以上２００％以下である、
   ポリイオンコンプレックス。
4. 請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリイオンコンプレックスにおいて、
   前記カルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸の分子量が、４，０００以上２００万以下である、
   ポリイオンコンプレックス。
5. 請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリイオンコンプレックスにおいて、
   前記キトサンの分子量が、５，０００以上５０万以下である、
   ポリイオンコンプレックス。
6. ポリイオンコンプレックスから形成された成形体であって、
   請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリイオンコンプレックスから形成された成形体。
7. 請求項６に記載の成形体において、
   フィルム、糸若しくは当該糸を含む編布、又はマイクロニードルである、
   成形体。
8. 請求項６又は７に記載の成形体において、
   最大応力が７０ＭＰａ以上である、
   成形体。

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