JP6928618B2 - 生物学的環境において改善された性能を有するパラジウム触媒 - Google Patents
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Description
関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年５月１０日に出願された米国仮出願第６２／３３４，０４３号の優先権を主張するものであり、その全体が参考として組み込まれる。
本出願は、２０１６年５月１０日に出願された米国仮出願第６２／３３４，０４３号の優先権を主張するものであり、その全体が参考として組み込まれる。
本明細書では、生物学的環境において改善された性能を有するパラジウム（Ｐｄ）触媒を提供する。特に、タンパク質リッチ条件下で、Ｐｄ触媒の改善された性能をもたらす配合物、調製方法及び保存条件を提供する。
パラジウム化合物は、様々な異なる反応において有用な触媒である。例としては、有機ハライドと有機亜鉛化合物間の根岸カップリング、アルケンとアリールハライド間のＨｅｃｋ反応、アリールハライドとボロン酸間の鈴木反応、有機ハライドと有機スズ化合物間のＳｔｉｌｌｅ反応、有機ハライドと有機ケイ素化合物間の檜山カップリング、アリールハライドとアルキン間の薗頭カップリング（助触媒としてヨウ化銅（Ｉ）を用いる）、アリールハライドとアミンのＢｕｃｈｗａｌｄ−Ｈａｒｔｗｉｇアミノ化、グリニャール試薬と、アリール又はビニルハライドの熊田カップリング、アリル化合物と種々の求核剤間の辻−トロスト反応（トロストアリル化）及びアレーンジアゾニウム塩とアルケンのＨｅｃｋ・マツダ反応が含まれる。これらの反応はすべて、０酸化状態のパラジウム（Ｐｄ（０））に依存する。
有機化学における様々な用途のために多数のＰｄ触媒及びプレ触媒が存在するが、それらの大部分は有機溶媒中で反応を実施するために使用され、通常、ｉｎ ｓｉｔｕで調製される。具体的に言えば、生物学的又はタンパク性環境において機能的であるパラジウム触媒を事前に調製する方法及び保管する方法について、これまで記載したものはなかった。
本明細書では、生物学的環境において改善された性能を有するパラジウム（Ｐｄ）触媒を提供する。特に、生物学的環境において存在するようなタンパク質リッチ条件下で、Ｐｄ触媒の改善された性能をもたらす配合物、調製方法及び保存条件を提供する。
ある実施形態では、ホスフィン配位パラジウムイオンを含むＰｄ触媒組成物について提供し、ホスフィン配位子は、前記組成物中のパラジウムより６〜１２倍過剰に存在する。ある実施形態では、前記ホスフィン配位子は、強いπ受容体アリールホスフィンである。ある実施形態では、前記ホスフィン配位子は、ＤＡＮＰＨＯＳファミリー化合物である。ある実施形態では、前記ホスフィン配位子は、ＤＡＮＰＨＯＳ、ｏ−ＤＡＮＰＨＯＳ、ｐ−ＤＡＮＰＨＯＳ、ＤＡＮ２ＰＨＯＳ、ｏ−ＤＡＮ２ＰＨＯＳ、ｐ−ＤＡＮ２ＰＨＯＳ及びＤＡＮＰＨＯＳ／ＤＡＮ２ＰＨＯＳ誘導体と代替可溶化基（例えば、１つ以上のＳＯ3 -置換基の代わりにＣＯＯＨ及び／又はＳＯ2ＮＨ2）からなる群から選択される。
ある実施形態では、前記ホスフィン配位子は、ｏ−ＤＡＮＰＨＯＳである。ある実施形態では、前記パラジウムは、酢酸パラジウム（Ｐｄ（ＯＡｃ）2）、トリフルオロ酢酸パラジウム（Ｐｄ（ＴＦＡ）2）、硝酸パラジウム（Ｐｄ（ＮＯ3）2）、塩化パラジウム（ＰｄＣｌ2）、臭化パラジウム（ＰｄＢｒ2）、テトラクロロパラジウム酸ナトリウム（Ｎａ2ＰｄＣｌ4）、テトラクロロパラジウム酸カリウム（Ｋ2ＰｄＣｌ4）、テトラクロロパラジウム酸リチウム（Ｌｉ2ＰｄＣｌ4）、テトラブロモパラジウム酸ナトリウム（Ｎａ2ＰｄＢｒ4）、テトラブロモパラジウム酸カリウム（Ｋ2ＰｄＢｒ4）、Ｐｄ2（ジベンジリデンアセトン）3、Ｐｄ（ジベンジリデンアセトン）2及びＢｕｃｈｗａｌｄプレ触媒からなる群から選択されるパラジウム（ＩＩ）塩として提供される。ある実施形態では、前記ホスフィン配位パラジウムイオンは、水溶液中にある。ある実施形態では、前記ホスフィン配位パラジウム種（Ｐｄ（０））は、凍結乾燥状態（例えば、フリーズドライした、粉末など）にある。
ある実施形態では、非緩衝水中でパラジウム（ＩＩ）塩をホスフィン配位子と結合することを含むＰｄ触媒の調製方法が提供される。ある実施形態では、パラジウム（ＩＩ）塩を、緩衝水（例えば、非配位性緩衝液中で緩衝された）中でホスフィン配位子と結合することを含むＰｄ触媒の調製方法が提供される。ある実施形態では、前記ホスフィンは水溶性である。ある実施形態では、前記ホスフィン配位子は、強いπ受容体アリールホスフィンである。ある実施形態では、前記ホスフィン配位子は、ＤＡＮＰＨＯＳファミリー化合物である。ある実施形態では、前記ホスフィン配位子は、ＤＡＮＰＨＯＳ、ｏ−ＤＡＮＰＨＯＳ、ｐ−ＤＡＮＰＨＯＳ、ＤＡＮ２ＰＨＯＳ、ｏ−ＤＡＮ２ＰＨＯＳ ｐ−ＤＡＮ２ＰＨＯＳからなる群から選択される。ある実施形態では、前記ホスフィン配位子は、ｏ−ＤＡＮＰＨＯＳである。ある実施形態では、前記パラジウムは、酢酸パラジウム（Ｐｄ（ＯＡｃ）2）、トリフルオロ酢酸パラジウム（Ｐｄ（ＴＦＡ）2）、硝酸パラジウム（Ｐｄ（ＮＯ3）2）、塩化パラジウム（ＰｄＣｌ2）、臭化パラジウム（ＰｄＢｒ2）、テトラクロロパラジウム酸ナトリウム（Ｎａ2ＰｄＣｌ4）、テトラクロロパラジウム酸カリウム（Ｋ2ＰｄＣｌ4）、テトラクロロパラジウム酸リチウム（Ｌｉ2ＰｄＣｌ4）、テトラブロモパラジウム酸ナトリウム（Ｎａ2ＰｄＢｒ4）及びテトラブロモパラジウム酸カリウム（Ｋ2ＰｄＢｒ4）からなる群から選択されるパラジウム（ＩＩ）塩として提供される。ある実施形態では、前記非緩衝水は、酸素が除去された水である。ある実施形態では、方法は、前記結合ステップの前に、前記水の脱気ステップを更に含む。ある実施形態では、前記パラジウム（ＩＩ）塩及び前記ホスフィン配位子が、撹拌又はかき混ぜによって結合する。ある実施形態では、方法は、前記結合ステップの前に、前記パラジウム（ＩＩ）塩を水中に溶解させること及び前記ホスフィン配位子を水中に溶解させることを更に含む。ある実施形態では、方法は、前記結合ステップの後に、前記Ｐｄ触媒を緩衝するステップを更に含む。ある実施形態では、前記Ｐｄ触媒は、ｐＨ ６．５〜８．０の間（例えば、ｐＨ ６．５、ｐＨ ６．６、ｐＨ ６．７、ｐＨ ６．８、ｐＨ ６．９、ｐＨ ７．０、ｐＨ ７．１、ｐＨ ７．２、ｐＨ ７．３、ｐＨ ７．４、ｐＨ ７．５、ｐＨ ７．６、ｐＨ ７．７、ｐＨ ７．８、ｐＨ ７．９、ｐＨ ８．０又はこれらの間の任意の範囲）で緩衝される。ある実施形態では、方法は、前記Ｐｄ触媒を凍結乾燥させるステップを更に含む。ある実施形態では、方法は、前記Ｐｄ触媒を緩衝液中で再溶解させるステップを更に含む。ある実施形態では、前記緩衝液は、ＨＥＰＥＳ又はＭＯＰＳである。ある実施形態では、前記結合ステップは、不活性雰囲気下（例えば、アルゴン又は窒素ガス）にて実施される。
ある実施形態では、本明細書記載の方法（例えば、前項に記載の方法）により作製されたＰｄ触媒を含む組成物が提供される。
ある実施形態では、１つ以上の以下のステップを含むＰｄ触媒の保存方法が提供される：（ｉ）前記Ｐｄ触媒の水溶液を乾燥状態まで凍結乾燥すること、（ｉｉ）前記Ｐｄ触媒を非緩衝状態（又は非配位性緩衝液中で緩衝された）で保存すること、（ｉｉｉ）前記Ｐｄ触媒から分子酸素を除去すること、（ｉｖ）低温で保存すること、（ｖ）密封容器中で保存すること。ある実施形態では、前記容器の材料は、分子酸素に対して低透過性を示す。ある実施形態では、前記容器は、分子酸素に対して不透過性である（例えば、ガラス）。ある実施形態では、方法は、２，３，４，５又はそれ以上のステップを含む。
定義
本明細書に記載された実施形態の実施又は試験において、本明細書に記載のものと類似又は同等の任意の方法及び材料を使用することができるが、いくつかの好ましい方法、組成物、デバイス及び材料が本明細書に記載される。しかしながら、本発明の材料及び方法を記載する前に、本発明は、本明細書に記載される特定の分子、組成物、方法論又はプロトコルに限定されず、これらは、日常的な実験及び最適化に従って変化し得ることが理解されるべきである。本明細書で使用する用語は、特定のバージョン又は実施形態のみを説明するためのものであり、本明細書に記載された実施形態の範囲を限定するものではないことも理解されたい。
本明細書に記載された実施形態の実施又は試験において、本明細書に記載のものと類似又は同等の任意の方法及び材料を使用することができるが、いくつかの好ましい方法、組成物、デバイス及び材料が本明細書に記載される。しかしながら、本発明の材料及び方法を記載する前に、本発明は、本明細書に記載される特定の分子、組成物、方法論又はプロトコルに限定されず、これらは、日常的な実験及び最適化に従って変化し得ることが理解されるべきである。本明細書で使用する用語は、特定のバージョン又は実施形態のみを説明するためのものであり、本明細書に記載された実施形態の範囲を限定するものではないことも理解されたい。
別途定義されていない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。しかしながら、矛盾する場合には、定義を含む本明細書が優先する。したがって、本明細書に記載の実施形態の文脈において、以下の定義が適用される。
本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈で別段明確に指示されない限り、複数形の言及を含む。したがって、例えば「Ｐｄ触媒」とは、当業者などに知られている１つ以上のＰｄ触媒及びその等価物への言及である。
本明細書で使用する場合、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」及びその言語的変形は、列挙した特徴（複数可）、要素（複数可）、方法ステップ（複数可）などの存在を示し、追加の特徴（複数可）、要素（複数可）、方法ステップ（複数可）などの存在を除外しない。逆に、用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」及びその言語的変形は、列挙した特徴（複数可）、要素（複数可）、方法ステップ（複数可）などの存在を示し、列挙していないあらゆる特徴（複数可）、要素（複数可）、方法ステップ（複数可）などは、一般的に付随する不純物を除いて除外する。「本質的に〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という語句は、列挙した特徴（複数可）、要素（複数可）、方法ステップ（複数可）など、及び、組成物、システム又は方法の基本的な性質に実質的に影響を与えない任意の追加の特徴（複数可）、要素（複数可）、方法ステップ（複数可）などを意味する。本明細書の多くの実施形態は、オープンな「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語を用いて説明される。かかる実施形態は、複数のクローズドな「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」及び／又は「本質的に〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」を包含し、このような用語を使用して代替的に請求又は記載され得る。
本明細書で使用する場合、「タンパク性環境」又は「タンパク質リッチ環境」という用語は、０．１ｍｇ／ｍｌを超えるタンパク質濃度を有する局所的条件（ｌｏｃａｌ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）を指す。「高タンパク性環境」は、１０ｍｇ／ｍｌを超えるタンパク質濃度を有する局所的条件を指す。
本明細書で使用する場合、用語「配位」は、電子供与性リガンド（例えば、ホスフィン）と電子吸引性金属（例えば、パラジウム）との間の相互作用及びそれらの間の配位共有結合（双極子結合）の形成を指す。
本明細書で使用する場合、用語「非緩衝」は、ｐＨの変化の影響を受けにくい緩衝液を添加しない溶液（又は水）を指す。
本明細書では、生物学的環境において改善された性能を有するパラジウム（Ｐｄ）触媒を提供する。特に、タンパク質リッチ条件下で、Ｐｄ触媒の改善された性能をもたらす配合物、調製方法及び保存条件を提供する。
１．触媒配合物
１．触媒配合物
ある実施形態では、Ｐｄ触媒が提供される。ある実施形態では、前記Ｐｄ触媒は、水溶性Ｐｄ錯体を含む。ある実施形態では、前記Ｐｄは、１つ以上の水溶性有機ホスフィン配位子によって錯体化する。ある実施形態では、前記Ｐｄは、Ｐｄ（０）状態で配位子によって配位される。ある実施形態では、前記Ｐｄ触媒は、Ｐｄ塩と好適な配位子（例えば、ＤＡＮＰＨＯＳ配位子）の相互作用によって生成される。ある実施形態では、パラジウム（ＩＩ）塩は、パラジウムの供給源として使用される。ある実施形態では、好適なパラジウム（ＩＩ）塩は、以下を含む群から選択されるが、これらに限定されるわけではない：酢酸パラジウム（Ｐｄ（ＯＡｃ）2）、トリフルオロ酢酸パラジウム（Ｐｄ（ＴＦＡ）2）、硝酸パラジウム（Ｐｄ（ＮＯ3）2）、塩化パラジウム（ＰｄＣｌ2）、臭化パラジウム（ＰｄＢｒ2）、テトラクロロパラジウム酸ナトリウム（Ｎａ2ＰｄＣｌ4）、テトラクロロパラジウム酸カリウム（Ｋ2ＰｄＣｌ4）、テトラクロロパラジウム酸リチウム（Ｌｉ2ＰｄＣｌ4）、テトラブロモパラジウム酸ナトリウム（Ｎａ2ＰｄＢｒ4）及びテトラブロモパラジウム酸カリウム（Ｋ2ＰｄＢｒ4）。
ある実施形態では、パラジウムは、ホスフィン配位子（例えば、水溶性配位子）によって配位される。本明細書中の触媒の形成のためにＰｄ配位に使用されるホスフィンの例としては以下が含まれるが、これらに限定されるわけではない：ｍ−ＴＰＰＴＳ、ｍ−ＴＰＰＤＳ、ｍ−ＴＰＰＭＳ、ＴＸＰＴＳ、ＴＸＰＤＳ、ＴＭＡＰＴＳ、ｍ−ＴＰＰＴＣ、ｍ−ＴＰＰＤＣ、ｐ−ＴＰＰＴＣ、ｐ−ＴＰＰＤＣ、ｏ−ＴＰＰＤＣ、ｏ−ＴＰＰＴＣ、ｍ−ＴＰＰＴＧ、ｍ−ＴＰＰＤＧ、ｍ−ＴＰＰＭＧ、Ｃｙ−Ａｍｐｈｏｓ、ｔ−Ｂｕ−Ａｍｐｈｏｓ、ＢＤＳＰＰＢ、Ｘａｎｔｐｈｏｓ−Ｓ、ＤＡＮＰＨＯＳ、ｏ−ＤＡＮＰＨＯＳ、ｐ−ＤＡＮＰＨＯＳ、ＤＡＮ２ＰＨＯＳ ｏ−ＤＡＮ２ＰＨＯＳ ｐ−ＤＡＮ２ＰＨＯＳなど（例えば、図２参照）。特定の実施形態では、本明細書のＰｄ触媒は、ＤＡＮＰＨＯＳファミリー化合物（例えば、図６Ｂ；ＤＡＮＰＨＯＳ、ｏ−ＤＡＮＰＨＯＳ、ｐ−ＤＡＮＰＨＯＳ、ＤＡＮ２ＰＨＯＳ ｏ−ＤＡＮ２ＰＨＯＳ ｐ−ＤＡＮ２ＰＨＯＳなど）によって配位されたＰｄを含む。特定の実施形態では、本明細書のＰｄ触媒は、ｏ−ＤＡＮＰＨＯＳによって配位されたＰｄ（例えば、Ｐｄ（０））を含む。
本明細書の実施形態の展開中に実施された実験では、他の水溶性ホスフィンと比較した場合、ＤＡＮＰＨＯＳ化合物（例えば、ｏ−ＤＡＮＰＨＯＳ）のホスフィンから誘導されたＰｄ触媒が、優れた触媒活性（例えば、アリル―カルバマート結合の切断）を提供し、生物学的環境（例えばタンパク性環境）において特に優れた性能をもたらすことを示した。具体的には、ＤＡＮＰＨＯＳ化合物（例えば、ｏ−ＤＡＮＰＨＯＳ）は、一般に使用されるホスフィンＴＰＰＴＳより性能が優れている。
２．Ｐｄ：ホスフィン比
２．Ｐｄ：ホスフィン比
本明細書の実施形態の展開中に実施された実験では、Ｐｄに対して過剰のホスフィンが存在する場合、ホスフィン（例えば、ＤＡＮＰＨＯＳファミリー（例えば、ｏ−ＤＡＮＰＨＯＳ））配位Ｐｄ触媒による触媒性能が改善されることを示した。例えば、本明細書の実施形態の展開中に実施された実験では、Ｐｄ対ホスフィン（例えば、ＤＡＮＰＨＯＳ化合物（例えば、ｏ−ＤＡＮＰＨＯＳなど）など）との最適比は、１：６と１：１２の間（例えば、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１１、１：１２及びそれらの間の範囲（例えば、１：８〜１：１０）であることを示した。多くの触媒金属錯体では、活性触媒種は、１つ又は２つの配位する配位子（例えば、ホスフィン）によって配位された金属中心であることが知られているため、このような知見は予想外であった。ホスフィンの量が多すぎると金属配位圏が完全に飽和し、結果として活性触媒が存在するとしてもごくわずかとなり、反応性が低下し、反応速度が遅くなることが予想された。したがって、過剰なホスフィンが、特に生物学的環境、例えばタンパク質リッチ環境において、触媒性能を改善することは予想外であった。
３．調製
３．調製
一般的に、触媒活性Ｐｄ（０）触媒は、不安定である。有機化学用途では、それらは通常、ｉｎ ｓｉｔｕで調製される。注目すべき例外の１つは、Ｐｄ（ＰＰｈ3）4−テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）である。活性Ｐｄ（ＰＰｈ3）4触媒の形成は、典型的には、Ｐｄ（ＩＩ）塩を過剰な配位子（例えば、ホスフィン）と反応させることによって達成される。ホスフィンは、配位子と還元剤の両方として作用する。還元速度は、配位子（例えば、ホスフィン）の性質及び他の反応パラメーターに依存する（例えば、米国特許第８，９８１，０８６号を参照；その全体が参照により組み込まれる）。
本明細書の実施形態の展開中に実施された実験では、ｉｎ ｓｉｔｕ還元によって生成される触媒は、生物学的環境、特に、タンパク質リッチ環境において、効率的な触媒作用（例えば、アリル―カルバマート結合の切断）をもたらさないことを示した。この結果は、タンパク質官能基によるＰｄ（ＩＩ）のキレート化によるものであり得、２＋酸化状態でＰｄの安定化がもたらされる可能性があり、非効率的な還元プロセス、活性Ｐｄ（０）触媒の量の減少及び切断の減少につながる可能性がある。本明細書に記載の実施形態は、いかなる特定の作用のメカニズムにも限定されず、そのような実施形態を実施するためには、作用のメカニズムの理解は必要ではない。しかしながら、ある実施形態では、タンパク質環境の阻害効果は、Ｐｄ（ＩＩ）塩を過剰のホスフィン（例えば、６倍〜１２倍、８倍〜１０倍など）と水溶液中で十分な時間反応させ、確実に十分な還元をすることによって克服される。例えば、水中のＴＰＰＴＳによるＰｄ（ＩＩ）の還元速度は、パラジウムでは１次、配位子では０次であり、１．０×１０-3ｓ-1の速度で起こる；約８分の還元の半減期に相当（Ａｍａｔｏｒｅ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９９５， ６０， ６８２９−６８３９；その全体が参照により組み込まれる。）。強塩基（例えば、ＮａＯＨ）が添加される場合、還元は定量的かつ瞬間的である（例えば、Ｋｕｎｔｚ＆Ｖｉｔｔｏｒｉ．Ｍｏｌ．ｃａｔ．Ａ：Ｃｈｅｍ．１９９８，１２９，１５９−１７１；その全体が参照により組み込まれる）。
４．保存
４．保存
本明細書の実験では、予め活性化されたＰｄ触媒が、特に生物学的環境、例えばタンパク質リッチ環境において、ｉｎ ｓｉｔｕ生成触媒と比較して優れた性能をもたらすが、ある実施形態では、分子酸素（例えば、周囲環境（例えば、空気、水溶液内の溶存酸素、緩衝液などから）からの）を含む種々の酸化剤によるＰｄ（０）からＰｄ（ＩＩ）への活性触媒の酸化の可能性が存在することを示す。特定の実施形態では、酸化剤（例えば、大気中の酸素、溶存酸素など）への感受性は、Ｐｄ触媒の長期保存（例えば、次の保存：１日、２日、３日、４日、５日、１週間、２週間、１ヶ月、２ヶ月、６ヶ月、１年、２年、５年、もしくはそれ以上又はそれらの間の範囲（例えば、１〜２日、１〜３日、１〜５日、１〜２週間、１〜２ヶ月、１〜６ヶ月、１〜２年、１〜５年など））にとって大きな課題となる。
ある実施形態では、調製され、密封容器（例えば、密封ガラスアンプル）に保存された触媒は、その活性を長期間（１日、２日、３日、４日、５日、１週間、２週間、１ヶ月、２ヶ月、６ヶ月、１年、２年、５年、もしくはそれ以上又はそれらの間の範囲（例えば、１〜２日、１〜３日、１〜５日、１〜２週間、１〜２ヶ月、１〜６ヶ月、１〜２年、１〜５年など））保持する。
ある実施形態では、Ｐｄ触媒の調製及び／又は保存に使用される液体は、溶存酸素を除去するために脱気される（例えば、減圧下で、凍結脱気（ｆｒｅｅｚｅ−ｐｕｍｐ−ｔｈａｗ）技術などを用いて）。ある実施形態では、液体試薬（例えば、水、緩衝液など）の脱気により、酸化剤への暴露が低減し、活性保存寿命が延長され、並びに／又は触媒活性が維持及び／もしくは増加する（例えば、経時的に）。
ある実施形態では、Ｐｄ触媒は、酸化剤種への触媒の暴露を防ぐために、不活性ガス（例えば、窒素ガス、アルゴンガスなど）及び／又は減圧下で、調製及び／又は保存される。
ある実施形態では、Ｐｄ触媒は低温で調製及び保存される（例えば、１６℃、１２℃、８℃、４℃、０℃、−４℃、−８℃、−１２℃、−１６℃、−２０℃、−３０℃、−４０℃、−５０℃、−６０℃、−７０℃、−８０℃以下又はそれらの間の範囲（例えば、１６〜１２℃、１６〜８℃、８〜４℃、４〜０℃、０〜−４℃、０〜−８℃、−４〜−１２℃、０〜−８０℃））。ある実施形態では、調製され、低温で保存された触媒は、その活性を長期間（１日、２日、３日、４日、５日、１週間、２週間、１ヶ月、２ヶ月、６ヶ月、１年、２年、５年、もしくはそれ以上又はそれらの間の範囲（例えば（例えば、１〜２日、１〜３日、１〜５日、１〜２週間、１〜２ヶ月、１〜６ヶ月、１〜２年、１〜５年など））保持する。
ある実施形態では、Ｐｄ触媒は保存のために凍結乾燥される。ある実施形態では、凍結乾燥されたＰｄ触媒は、低温で保存される。ある実施形態では、触媒は調製され、凍結乾燥され、保存される（例えば、１６℃、１２℃、８℃、４℃、０℃、−４℃、−８℃、−１２℃、−１６℃、−２０℃、−３０℃、−４０℃、−５０℃、−６０℃、−７０℃、−８０℃以下又はそれらの間の範囲（例えば、１６〜１２℃、１６〜８℃、８〜４℃、４〜０℃、０〜−４℃、０〜−８℃、−４〜−１２℃、０〜−８０℃）の低温で）。かかる実施形態において、水溶性生物学的緩衝液中に再溶解した触媒は、有意な活性損失なく使用される（例えば、＜０．１％活性損失、＜０．２％活性損失、＜０．５％活性損失、＜１％活性損失、＜５％活性損失、＜１０％活性損失）。本明細書の実施形態の展開中に実施された実験では、凍結乾燥された触媒の安定性が数ヶ月にわたって示された。
５．他の実施形態
５．他の実施形態
ホスフィン自体によるＰｄ（ＩＩ）のＰｄ（０）への還元により、１当量のホスフィンの損失及び１当量のホスフィンオキシドの生成がもたらされる。ある実施形態では、１当量のホスフィンオキシドを生成することなく、活性触媒を生成する方法が提供される。
ある実施形態では、Ｐｄ（０）としてＰｄ2（ジベンジリデンアセトン）3及び／又はＰｄ（ジベンジリデンアセトン）2を用いる。かかる方法は、有機溶媒中で活性Ｐｄ（０）種を生成するのに用いられてきたが、この方法は、有機溶媒中で、ジベンジリデンアセトン（ｄｂａ）配位子自体がＰｄに結合する傾向があるという欠点がある。これは、効率性の低下につながる（米国特許第８，９８１，０８６号を参照；その全体が参照により組み込まれる。）。しかしながら、ｄｂａは水に溶解せず、前記触媒は１当量のホスフィンオキシドを生成することなく、且つｐＨを低下させることなく生成されるので（本明細書の実施例では、２当量のＨＣｌ又は酢酸のいずれかが生成される）、有機溶媒において存在する問題は、本明細書に記載される実施形態で克服される。
ある実施形態では、Ｂｕｃｈｗａｌｄ型のプレ触媒がＰｄ供給源として使用される（例えば、米国特許第８，９８１，０８６号を参照；その全体が参照により組み込まれる）。
ある実施形態では、Ｂｕｃｈｗａｌｄ型のプレ触媒が、Ｐｄ（０）の生成のために使用される。
ある実施形態では、Ｐｄ（０）の他の供給源又は還元方法は、本明細書の実施形態の範囲内である。
ある実施形態では、非キレート緩衝液を使用して、ｐＨが低下（例えば、生理的ｐＨ未満、中性ｐＨ未満など）するのを防ぐ。緩衝（例えば、塩基性の）反応により、Ｐｄ（ＩＩ）のＰｄ（０）へのより速い還元が生じる。次いで、ｐＨをより生理的レベルに調整する（例えば、生物学的環境における使用のために）。ある実施形態では、緩衝液を使用し、ｐＨ７．０からｐＨ１０．０（例えば、７．０、７．２、７．４、７．６、７．８、８．０、８．２、８．４、８．６、８．８、９．０、９．２、９．４、９．６、９．８、１０．０又はそれらの間の範囲（例えば、７．６〜８．６など））でのＰｄの還元の間、ｐＨレベルを維持する。
実験
実験
実施例１
以下の実施例（例えば、図１参照）では、ホスフィン及び求核剤の性質が、タンパク性環境におけるアリル―カルバマート結合のパラジウム触媒切断に影響し得ることを示す。これらの実験（図１Ｂ）において、ＨＡＬＯＴＡＧ被覆磁気ビーズ（固定化ＨＡＬＯＴＡＧタンパク質を４００μｇ含有）は、６０μＭのＳＬ＿０２８８と共に３０分間インキュベートした。対照色素ＳＬ＿０２８８は、いかなる固定化されたＨＡＬＯＴＡＧタンパク質も含有しないビーズとともにインキュベートした。固定化されたＨＡＬＯＴＡＧタンパク質へのＳＬ＿０２８８の共有結合の後、ビーズをＨＥＰＥＳ緩衝液中で３０分間、１：８のモル比で２ｍＭ、０．６６ｍＭ又は０．２２ｍＭのいずれかのＰｄ（ホスフィン）錯体で処理した。アリル―カルバマート基の切断によって、前記ビーズからの前記色素の放出がもたらされる。放出された色素のサンプルは、対照色素とともに、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離され、Ｔｙｐｈｏｏｎ ９４００蛍光イメージャーでスキャンされ、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔを用いてバンドが定量された。切断効率は、対照色素に対する放出された色素のパーセントとして測定された。図１Ｂの結果は、ホスフィン及び求核剤の性質が、パラジウム触媒切断効率に重要な役割を果たすことを示す。ＤＡＮＰＨＯＳファミリー、特にＤＡＮＰＨＯＳ及びｏ−ＤＡＮＰＨＯＳの電子不足のホスフィンは、一般的に使用されるホスフィンであるＴＰＰＴＳより優れていた。図１Ｃに示す実験では、固定化されたＨａｌｏＴａｇタンパク質へのＳＬ＿０２８８の共有結合の後、ビーズを、異なる求核剤を含有する複数のアミン緩衝液又は非アミン緩衝液中、Ｐｄ対ホスフィン１：８のモル比で２ｍＭ、０．６６ｍＭ又は０．２２ｍＭのＰｄ（ＤＡＮＰＨＯＳ）ｘ又はＰｄ（ｏ−ＤＡＮＰＨＯＳ）ｘ錯体で３０分間処理した。結果は、求核剤の性質が、パラジウム触媒切断効率に重要な役割を果たすことを示す。加えて、ホスフィンと求核剤の組み合わせは非常に重要である。Ｐｄ−ＤＡＮＰＨＯＳ錯体の場合、最も高い切断効率は、５ｍＭのジメチルバルビツル酸を補充したＰＢＳ緩衝液を用いて達成された。ｏ−ＤＡＮＰＨＯＳの場合、最も高い切断効率は、ＭＯＰＳ緩衝液を用いて達成された。更に、ｏ−ＤＡＮＰＨＯＳは、特に０．２２ｍＭの濃度でＤＡＮＰＨＯＳより優れていた。
以下の実施例（例えば、図１参照）では、ホスフィン及び求核剤の性質が、タンパク性環境におけるアリル―カルバマート結合のパラジウム触媒切断に影響し得ることを示す。これらの実験（図１Ｂ）において、ＨＡＬＯＴＡＧ被覆磁気ビーズ（固定化ＨＡＬＯＴＡＧタンパク質を４００μｇ含有）は、６０μＭのＳＬ＿０２８８と共に３０分間インキュベートした。対照色素ＳＬ＿０２８８は、いかなる固定化されたＨＡＬＯＴＡＧタンパク質も含有しないビーズとともにインキュベートした。固定化されたＨＡＬＯＴＡＧタンパク質へのＳＬ＿０２８８の共有結合の後、ビーズをＨＥＰＥＳ緩衝液中で３０分間、１：８のモル比で２ｍＭ、０．６６ｍＭ又は０．２２ｍＭのいずれかのＰｄ（ホスフィン）錯体で処理した。アリル―カルバマート基の切断によって、前記ビーズからの前記色素の放出がもたらされる。放出された色素のサンプルは、対照色素とともに、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離され、Ｔｙｐｈｏｏｎ ９４００蛍光イメージャーでスキャンされ、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔを用いてバンドが定量された。切断効率は、対照色素に対する放出された色素のパーセントとして測定された。図１Ｂの結果は、ホスフィン及び求核剤の性質が、パラジウム触媒切断効率に重要な役割を果たすことを示す。ＤＡＮＰＨＯＳファミリー、特にＤＡＮＰＨＯＳ及びｏ−ＤＡＮＰＨＯＳの電子不足のホスフィンは、一般的に使用されるホスフィンであるＴＰＰＴＳより優れていた。図１Ｃに示す実験では、固定化されたＨａｌｏＴａｇタンパク質へのＳＬ＿０２８８の共有結合の後、ビーズを、異なる求核剤を含有する複数のアミン緩衝液又は非アミン緩衝液中、Ｐｄ対ホスフィン１：８のモル比で２ｍＭ、０．６６ｍＭ又は０．２２ｍＭのＰｄ（ＤＡＮＰＨＯＳ）ｘ又はＰｄ（ｏ−ＤＡＮＰＨＯＳ）ｘ錯体で３０分間処理した。結果は、求核剤の性質が、パラジウム触媒切断効率に重要な役割を果たすことを示す。加えて、ホスフィンと求核剤の組み合わせは非常に重要である。Ｐｄ−ＤＡＮＰＨＯＳ錯体の場合、最も高い切断効率は、５ｍＭのジメチルバルビツル酸を補充したＰＢＳ緩衝液を用いて達成された。ｏ−ＤＡＮＰＨＯＳの場合、最も高い切断効率は、ＭＯＰＳ緩衝液を用いて達成された。更に、ｏ−ＤＡＮＰＨＯＳは、特に０．２２ｍＭの濃度でＤＡＮＰＨＯＳより優れていた。
実施例２
以下の実施例（例えば、図２参照）では、ホスフィン及び求核剤の性質が、タンパク性環境におけるアリル―カルバマート結合のパラジウム触媒切断に影響し得ることを示す。これらの実験において、ＨＡＬＯＴＡＧ被覆磁気ビーズ（固定化ＨＡＬＯＴＡＧタンパク質を４００μｇ含有）は、６０μＭのＳＬ＿０２８８と共に３０分間インキュベートした。対照色素ＳＬ＿０２８８は、いかなる固定化されたＨＡＬＯＴＡＧタンパク質も含有しないビーズとともにインキュベートした。固定化されたＨＡＬＯＴＡＧタンパク質へのＳＬ＿０２８８の共有結合の後、ビーズをＨＥＰＥＳ又はＭＯＰＳ緩衝液中で３０分間、１：８のモル比で２ｍＭ、０．６６ｍＭ又は０．２２ｍＭのいずれかの予め作られたＰｄ（ホスフィン）錯体で処理した。アリル―カルバマート基の切断によって、前記ビーズからの前記色素の放出がもたらされる。放出された色素のサンプルは、対照色素とともに、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離され、Ｔｙｐｈｏｏｎ ９４００蛍光イメージャーでスキャンされ、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔを用いてバンドが定量された。切断効率は、対照色素に対する放出された色素のパーセントとして測定された。結果は、ホスフィン及び求核剤の性質が、パラジウム触媒切断効率に重要な役割を果たすことを示す。ＤＡＮＰＨＯＳファミリー、特にＤＡＮＰＨＯＳ及びｏ−ＤＡＮＰＨＯＳの電子不足のホスフィンは、一般的に使用されるホスフィンであるＴＰＰＴＳより優れていた。
以下の実施例（例えば、図２参照）では、ホスフィン及び求核剤の性質が、タンパク性環境におけるアリル―カルバマート結合のパラジウム触媒切断に影響し得ることを示す。これらの実験において、ＨＡＬＯＴＡＧ被覆磁気ビーズ（固定化ＨＡＬＯＴＡＧタンパク質を４００μｇ含有）は、６０μＭのＳＬ＿０２８８と共に３０分間インキュベートした。対照色素ＳＬ＿０２８８は、いかなる固定化されたＨＡＬＯＴＡＧタンパク質も含有しないビーズとともにインキュベートした。固定化されたＨＡＬＯＴＡＧタンパク質へのＳＬ＿０２８８の共有結合の後、ビーズをＨＥＰＥＳ又はＭＯＰＳ緩衝液中で３０分間、１：８のモル比で２ｍＭ、０．６６ｍＭ又は０．２２ｍＭのいずれかの予め作られたＰｄ（ホスフィン）錯体で処理した。アリル―カルバマート基の切断によって、前記ビーズからの前記色素の放出がもたらされる。放出された色素のサンプルは、対照色素とともに、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離され、Ｔｙｐｈｏｏｎ ９４００蛍光イメージャーでスキャンされ、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔを用いてバンドが定量された。切断効率は、対照色素に対する放出された色素のパーセントとして測定された。結果は、ホスフィン及び求核剤の性質が、パラジウム触媒切断効率に重要な役割を果たすことを示す。ＤＡＮＰＨＯＳファミリー、特にＤＡＮＰＨＯＳ及びｏ−ＤＡＮＰＨＯＳの電子不足のホスフィンは、一般的に使用されるホスフィンであるＴＰＰＴＳより優れていた。
実施例３
本明細書に記載の実施形態の展開中に実施された実験では、パラジウム触媒切断の効率は、Ｐｄ−ホスフィン溶液のモル比に依存することを示した（例えば、図３参照）。これらの実験において、ＨＡＬＯＴＡＧ被覆ビーズ（固定化ＨＡＬＯＴＡＧタンパク質を４００μｇ含有）は、６０μＭのＳＬ＿０２８８と共に３０分間インキュベートした一方、対照色素ＳＬ＿０２８８は、固定化されたＨＡＬＯＴＡＧタンパク質を含有しないビーズとともにインキュベートした。固定化されたＨＡＬＯＴＡＧタンパク質へのＳＬ＿０２８８の共有結合の後、ビーズを、Ｐｄ対ｏ−ＤＡＮＰＨＯＳ１：４、１：６、１：８、１：１０、１：１２及び１：１５のモル比で、２ｍＭ、０．６ｍＭ又は０．２２ｍＭのいずれかのＰｄ−ｏ−ＤＡＮＰＨＯＳ錯体で３０分間処理した。アリル―カルバマート結合の切断によって、前記ビーズからの前記色素の放出がもたらされる。放出された色素は、対照色素とともに、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離され、Ｔｙｐｈｏｏｎ ９４００蛍光イメージャーでスキャンされ、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔを用いてバンドが定量された。切断効率は、対照色素に対する放出された色素のパーセントとして測定された。Ｐｄ対ｏ−ＤＡＮＰＨＯＳ１：８〜１：１０のモル比でのＰｄ−ｏ−ＤＡＮＰＨＯＳの溶液について、より高い切断効率が観察された。
本明細書に記載の実施形態の展開中に実施された実験では、パラジウム触媒切断の効率は、Ｐｄ−ホスフィン溶液のモル比に依存することを示した（例えば、図３参照）。これらの実験において、ＨＡＬＯＴＡＧ被覆ビーズ（固定化ＨＡＬＯＴＡＧタンパク質を４００μｇ含有）は、６０μＭのＳＬ＿０２８８と共に３０分間インキュベートした一方、対照色素ＳＬ＿０２８８は、固定化されたＨＡＬＯＴＡＧタンパク質を含有しないビーズとともにインキュベートした。固定化されたＨＡＬＯＴＡＧタンパク質へのＳＬ＿０２８８の共有結合の後、ビーズを、Ｐｄ対ｏ−ＤＡＮＰＨＯＳ１：４、１：６、１：８、１：１０、１：１２及び１：１５のモル比で、２ｍＭ、０．６ｍＭ又は０．２２ｍＭのいずれかのＰｄ−ｏ−ＤＡＮＰＨＯＳ錯体で３０分間処理した。アリル―カルバマート結合の切断によって、前記ビーズからの前記色素の放出がもたらされる。放出された色素は、対照色素とともに、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離され、Ｔｙｐｈｏｏｎ ９４００蛍光イメージャーでスキャンされ、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔを用いてバンドが定量された。切断効率は、対照色素に対する放出された色素のパーセントとして測定された。Ｐｄ対ｏ−ＤＡＮＰＨＯＳ１：８〜１：１０のモル比でのＰｄ−ｏ−ＤＡＮＰＨＯＳの溶液について、より高い切断効率が観察された。
実施例４
以下の実施例では、パラジウム：ホスフィン錯体の調製方法が、タンパク性環境における切断効率に影響を与え得ることについて説明する（例えば、図４参照）。水中で予め作られ、酸素が除去された状態で保存された触媒錯体は、ｉｎ ｓｉｔｕで調製されて直ちに使用される錯体よりも活性がある。これらの実験において、ＨＡＬＯＴＡＧ被覆ビーズ（固定化ＨＡＬＯＴＡＧタンパク質を４００μｇ含有）は、６０μＭのＳＬ＿０２８８と共に３０分間インキュベートした一方、対照色素ＳＬ＿０２８８は、固定化されたＨＡＬＯＴＡＧタンパク質を含有しないビーズとともにインキュベートした。固定化されたＨＡＬＯＴＡＧタンパク質へのＳＬ＿０２８８の共有結合の後、前記ビーズを２ｍＭのＰｄ／ＤＡＮＰＨＯＳ錯体で３０分間処理した。前記Ｐｄ／ＤＡＮＰＨＯＳ錯体は、ＨＥＰＥＳもしくはＭＯＰＳ緩衝液のいずれかで調製されて直ちに使用されるか、又は４ｍＭ溶液として水中で予め作られて酸素が除去された条件下で保存された。前記予め作られた溶液は、同じ緩衝液へと希釈され、２ｍＭ溶液を作製し、次いですぐに使用した。アリル―カルバマート基の切断によって、前記ビーズからの前記色素の放出がもたらされる。放出された色素は、対照色素とともに、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離され、Ｔｙｐｈｏｏｎ ９４００蛍光イメージャーでスキャンされ、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔを用いてバンドが定量された。切断効率は、対照色素に対する放出された色素のパーセントとして測定された。両方の緩衝液中の予め作られたＰｄ／ＤＡＮＰＨＯＳ錯体で、アリル―カルバマート基のより高い切断効率が観察された。これらの結果は、予め作られたＰｄ−ホスフィン錯体が、より高い切断効率をもたらす高濃度の活性触媒を含有していたことを示す。
以下の実施例では、パラジウム：ホスフィン錯体の調製方法が、タンパク性環境における切断効率に影響を与え得ることについて説明する（例えば、図４参照）。水中で予め作られ、酸素が除去された状態で保存された触媒錯体は、ｉｎ ｓｉｔｕで調製されて直ちに使用される錯体よりも活性がある。これらの実験において、ＨＡＬＯＴＡＧ被覆ビーズ（固定化ＨＡＬＯＴＡＧタンパク質を４００μｇ含有）は、６０μＭのＳＬ＿０２８８と共に３０分間インキュベートした一方、対照色素ＳＬ＿０２８８は、固定化されたＨＡＬＯＴＡＧタンパク質を含有しないビーズとともにインキュベートした。固定化されたＨＡＬＯＴＡＧタンパク質へのＳＬ＿０２８８の共有結合の後、前記ビーズを２ｍＭのＰｄ／ＤＡＮＰＨＯＳ錯体で３０分間処理した。前記Ｐｄ／ＤＡＮＰＨＯＳ錯体は、ＨＥＰＥＳもしくはＭＯＰＳ緩衝液のいずれかで調製されて直ちに使用されるか、又は４ｍＭ溶液として水中で予め作られて酸素が除去された条件下で保存された。前記予め作られた溶液は、同じ緩衝液へと希釈され、２ｍＭ溶液を作製し、次いですぐに使用した。アリル―カルバマート基の切断によって、前記ビーズからの前記色素の放出がもたらされる。放出された色素は、対照色素とともに、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離され、Ｔｙｐｈｏｏｎ ９４００蛍光イメージャーでスキャンされ、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔを用いてバンドが定量された。切断効率は、対照色素に対する放出された色素のパーセントとして測定された。両方の緩衝液中の予め作られたＰｄ／ＤＡＮＰＨＯＳ錯体で、アリル―カルバマート基のより高い切断効率が観察された。これらの結果は、予め作られたＰｄ−ホスフィン錯体が、より高い切断効率をもたらす高濃度の活性触媒を含有していたことを示す。
実施例５
本実施例では、前記活性触媒が、密封ガラスアンプル中の溶液として、又は凍結乾燥形態のいずれかで保存できることを示す（例えば、図５参照）。凍結乾燥する場合には、凍結乾燥前にパラジウムを十分に還元することが重要である。これらの実験において、ＨＡＬＯＴＡＧ被覆磁気ビーズ（固定化ＨＡＬＯＴＡＧタンパク質を４００μｇ含有）は、６０μＭのＳＬ＿０２８８と共に３０分間インキュベートした一方、コントロール色素ＳＬ＿０２８８は、固定化されたＨＡＬＯＴＡＧタンパク質を含有しないビーズとともにインキュベートした。固定化されたＨＡＬＯＴＡＧタンパク質へのＳＬ＿０２８８の共有結合の後、前記ビーズを、溶液として又は凍結乾燥形態（調製直後又は１、３、６、２２及び５２時間後に凍結乾燥した）のいずれかで保存された触媒から調製される０．６６ｍＭのＰｄ／ｏ−ＤＡＮＰＨＯＳで３０分間処理した。アリル―カルバマート結合の切断によって、前記ビーズからの前記色素の放出がもたらされる。放出された色素のサンプルは、コントロール色素とともに、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離され、Ｔｙｐｈｏｏｎ ９４００蛍光イメージャーでスキャンされ、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔを用いてバンドが定量された。切断効率は、コントロール色素に対する放出された色素のパーセントとして測定された。結果は、溶液中に保存された、又は調製後６時間以上凍結乾燥された触媒が、それらの活性を保持したことを示す。
本実施例では、前記活性触媒が、密封ガラスアンプル中の溶液として、又は凍結乾燥形態のいずれかで保存できることを示す（例えば、図５参照）。凍結乾燥する場合には、凍結乾燥前にパラジウムを十分に還元することが重要である。これらの実験において、ＨＡＬＯＴＡＧ被覆磁気ビーズ（固定化ＨＡＬＯＴＡＧタンパク質を４００μｇ含有）は、６０μＭのＳＬ＿０２８８と共に３０分間インキュベートした一方、コントロール色素ＳＬ＿０２８８は、固定化されたＨＡＬＯＴＡＧタンパク質を含有しないビーズとともにインキュベートした。固定化されたＨＡＬＯＴＡＧタンパク質へのＳＬ＿０２８８の共有結合の後、前記ビーズを、溶液として又は凍結乾燥形態（調製直後又は１、３、６、２２及び５２時間後に凍結乾燥した）のいずれかで保存された触媒から調製される０．６６ｍＭのＰｄ／ｏ−ＤＡＮＰＨＯＳで３０分間処理した。アリル―カルバマート結合の切断によって、前記ビーズからの前記色素の放出がもたらされる。放出された色素のサンプルは、コントロール色素とともに、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離され、Ｔｙｐｈｏｏｎ ９４００蛍光イメージャーでスキャンされ、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔを用いてバンドが定量された。切断効率は、コントロール色素に対する放出された色素のパーセントとして測定された。結果は、溶液中に保存された、又は調製後６時間以上凍結乾燥された触媒が、それらの活性を保持したことを示す。
実施例６
スキーム１：活性触媒の調製：
スキーム１：活性触媒の調製：
操作は、アルゴン雰囲気下で実施された（シュレンク法）。水は、３回の凍結脱気サイクルによって脱気された。
ｏ−ＤＡＮＰＨＯＳ（１８８ｍｇ、０．３２ｍｍｏｌ、純度９７％）を密封バイアルに入れ、撹拌棒を取り付けた。空気を除去し、該バイアルをアルゴンで充填した（３回繰り返し）。脱気した水（９ｍｌ）をカニューレによって加え、透明溶液が形成された。異なる密封バイアルに、Ｎａ2ＰｄＣｌ4（１１．８ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ）を入れ、空気を除去し、該バイアルをアルゴンで充填した（３回繰り返し）。脱気した水（１ｍｌ）を固体Ｎａ2ＰｄＣｌ4に加え、褐色溶液が形成された。該Ｎａ2ＰｄＣｌ4の褐色水溶液（１ｍＬ、１１．８ｍｇ／ｍＬ）の溶液を、前記攪拌したホスフィン溶液に加え、透明な黄色溶液が形成された。Ｐｄ−ｏ−ＤＡＮＰＨＯＳ錯体の透明な黄色溶液をアルゴン下で適当な時間混合した。十分な時間が経過した時点で、該黄色の溶液を
ａ）アルゴン下又は減圧下のいずれかにて熱密封されたガラスアンプル中の１ｍＬアリコート（溶液は４℃で保存され、光から保護した）；
ｂ）ガラスアンプル中の１ｍＬアリコート（アンプルはセプタムで密封し、溶液は液体窒素で慎重に凍結し、凍結乾燥後、ガラスアンプルを熱密封し、光から保護して−８０℃で保存した）；及び
ｃ）セプタム密封されたガラスバイアル中の１ｍＬアリコート（溶液は液体窒素又はドライアイスで凍結し、凍結乾燥した。凍結乾燥した残留物を密封ガラスバイアルに−８０℃で保存した）
に移した。
スキーム２：Ｐｄ（ＯＡｃ）2からの活性触媒の調製：
ａ）アルゴン下又は減圧下のいずれかにて熱密封されたガラスアンプル中の１ｍＬアリコート（溶液は４℃で保存され、光から保護した）；
ｂ）ガラスアンプル中の１ｍＬアリコート（アンプルはセプタムで密封し、溶液は液体窒素で慎重に凍結し、凍結乾燥後、ガラスアンプルを熱密封し、光から保護して−８０℃で保存した）；及び
ｃ）セプタム密封されたガラスバイアル中の１ｍＬアリコート（溶液は液体窒素又はドライアイスで凍結し、凍結乾燥した。凍結乾燥した残留物を密封ガラスバイアルに−８０℃で保存した）
に移した。
スキーム２：Ｐｄ（ＯＡｃ）2からの活性触媒の調製：
４ｍＭのＰｄ−ＤＡＮＰＨＯＳ１：８溶液の例
ＤＡＮＰＨＯＳ（９６ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ、純度９７％）及びＰｄ（ＯＡｃ）2（４．５ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌ）を、撹拌棒を取り付けた密封バイアルに入れた。空気を除去し、該バイアルをアルゴンで充填した（３回繰り返し）。脱気した水（５ｍｌ）をカニューレによって加え、撹拌後、透明溶液が形成された。（Ｐｄ（ＯＡｃ）2はゆっくり反応し溶解する）。前記Ｐｄ−ＤＡＮＰＨＯＳ錯体の透明な黄色溶液を、バイアル包装する前にアルゴン下で２０時間混合した。
前記触媒の効率は、Ｐｄ供給源に依存しない。Ｎａ2ＰｄＣｌ4及びＰｄ（ＯＡｃ）2の両方は、同じ条件下では、実験的に、両方とも非常に類似の効率を示すことが示された。
実施例７
以下の実施例では、２つの異なるパラジウム塩の供給源から調製された触媒が同様の反応性を有することを示す（例えば、図６参照）。ＨＡＬＯＴＡＧ被覆ビーズ（固定化ＨＡＬＯＴＡＧタンパク質を４００μｇ含有）は、６０μＭのＳＬ＿０２８８と共に３０分間インキュベートした一方、対照色素ＳＬ＿０２８８は、固定化されたＨＡＬＯＴＡＧタンパク質を含有しないビーズとともにインキュベートした。固定化されたＨＡＬＯＴＡＧタンパク質へのＳＬ＿０２８８の共有結合の後、前記ビーズを、Ｐｄ対ホスフィン１：８のモル比で２つのパラジウム塩の供給源Ｐｄ（ＯＡＣ）2又はＮａ2ＰｄＣｌ4から調製された２ｍＭのＰｄ／ＤＡＮＰＨＯＳ触媒で３０分間処理した。該Ｐｄ／ＤＡＮＰＨＯＳ錯体を、ＨＥＰＥＳ緩衝液又はＭＯＰＳ緩衝液のいずれかに再溶解させた。アリル―カルバマート基の切断によって、前記ビーズからの前記色素の放出がもたらされる。放出された色素は、対照色素とともに、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離され、Ｔｙｐｈｏｏｎ ９４００蛍光イメージャーでスキャンされ、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔを用いてバンドが定量された。切断効率は、対照色素に対する放出された色素のパーセントとして測定された。パラジウム塩の両方の供給源から調製された触媒について、アリル―カルバマート基の類似の切断効率が観察された。
以下の実施例では、２つの異なるパラジウム塩の供給源から調製された触媒が同様の反応性を有することを示す（例えば、図６参照）。ＨＡＬＯＴＡＧ被覆ビーズ（固定化ＨＡＬＯＴＡＧタンパク質を４００μｇ含有）は、６０μＭのＳＬ＿０２８８と共に３０分間インキュベートした一方、対照色素ＳＬ＿０２８８は、固定化されたＨＡＬＯＴＡＧタンパク質を含有しないビーズとともにインキュベートした。固定化されたＨＡＬＯＴＡＧタンパク質へのＳＬ＿０２８８の共有結合の後、前記ビーズを、Ｐｄ対ホスフィン１：８のモル比で２つのパラジウム塩の供給源Ｐｄ（ＯＡＣ）2又はＮａ2ＰｄＣｌ4から調製された２ｍＭのＰｄ／ＤＡＮＰＨＯＳ触媒で３０分間処理した。該Ｐｄ／ＤＡＮＰＨＯＳ錯体を、ＨＥＰＥＳ緩衝液又はＭＯＰＳ緩衝液のいずれかに再溶解させた。アリル―カルバマート基の切断によって、前記ビーズからの前記色素の放出がもたらされる。放出された色素は、対照色素とともに、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離され、Ｔｙｐｈｏｏｎ ９４００蛍光イメージャーでスキャンされ、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔを用いてバンドが定量された。切断効率は、対照色素に対する放出された色素のパーセントとして測定された。パラジウム塩の両方の供給源から調製された触媒について、アリル―カルバマート基の類似の切断効率が観察された。
実施例８
以下は、Ｐｄ触媒溶液の調製のための例示的な手順である：
以下は、Ｐｄ触媒溶液の調製のための例示的な手順である：
ある実施形態では、ステップは、不活性雰囲気下（例えば、アルゴン）にて実施される。水は、液体窒素で３回の凍結脱気サイクルによって脱気される。ある実施形態では、本明細書に記載の調製／配合／保存ステップもしくは技術、又は本明細書に記載の他の任意の試薬／成分のいずれかを、この手順に組み込んでもよい。同様に、本明細書の範囲内又は当分野の技術の範囲内のいずれかであるこの手順の変形形態が考えられる。
実施例９
凍結乾燥形態のＰｄ触媒の安定性
凍結乾燥形態のＰｄ触媒の安定性
以下の実施例では、−８０℃で９ヶ月間凍結乾燥形態で保存された実施例６（ｃ）で調製されたＰｄ触媒の安定性に関する31Ｐ ＮＭＲ分析について示す。機能上、９ヶ月目の触媒は、新しく調製されたものと区別ができない、タンパク性環境での切断効率を示した。適切に保存された場合、31Ｐ ＮＭＲ及び切断効率の両方によって、Ｐｄ触媒がその効率を保持することが証明された（図８Ａ〜８Ｄ参照）。
触媒の不適切な保存（例えば、周囲温度付近の溶液中及び空気が完全に取り除かれない場合）により、ｏ−ＤＡＮＰＨＯＳはｏ−ＤＡＮＰＨＯＳ−オキシドへ完全に酸化され、活性Ｐｄ触媒は失活した。図９は、１ヶ月間の不適切な保存後、実施例６（ｃ）で調製した前記触媒が完全に分解され、31Ｐ ＮＭＲによりｏ−ＤＡＮＰＨＯＳオキシドのみが検出されたことを示す。
当業者には、本発明の範囲及び趣旨から逸脱することなく、本発明に記載された方法及び組成物の様々な改変及び変形が明らかであろう。実際、関連分野の当業者に明らかである本発明を実施するために記載された態様の様々な改変は、添付の特許請求の範囲内にあることが意図される。
Claims (14)
- ホスフィン配位パラジウムイオンを含むＰｄ触媒組成物であって、前記組成物中において、ホスフィン配位子が、パラジウムより６〜１２倍モル過剰に存在し、前記ホスフィン配位子が、以下の化合物、
からなる群から選択されるDANPHOSファミリーの化合物であり、前記ホスフィン配位パラジウムイオンが、水溶液中にあるか、該ホスフィン配位パラジウムイオンが、凍結乾燥されていることを特徴とする、Ｐｄ触媒組成物。 - Ｐｄ触媒の調製方法であって、
非緩衝水中で、パラジウム（ＩＩ）塩をホスフィン配位子と結合させる工程を含むか、又は緩衝水中で、パラジウム（ＩＩ）塩をホスフィン配位子と結合させる工程を含み、
前記ホスフィン配位子が、以下の化合物、
からなる群から選択されるDANPHOSファミリーの化合物であり、かつパラジウムより６〜１２倍モル過剰に存在し、任意に、その結合工程が、不活性雰囲気下で実施されることを特徴とする、Ｐｄ触媒の調製方法。 - 前記ホスフィン配位子が、ｏ−ＤＡＮＰＨＯＳである、請求項１に記載のＰｄ触媒組成物。
- 前記ホスフィン配位子が、ｏ−ＤＡＮＰＨＯＳである、請求項２に記載の方法。
- 前記パラジウムが、酢酸パラジウム（Ｐｄ（ＯＡｃ）2）、トリフルオロ酢酸パラジウム（Ｐｄ（ＴＦＡ）2）、硝酸パラジウム（Ｐｄ（ＮＯ3）2）、塩化パラジウム（ＰｄＣｌ2）、臭化パラジウム（ＰｄＢｒ2）、テトラクロロパラジウム酸ナトリウム（Ｎａ2ＰｄＣｌ4）、テトラクロロパラジウム酸カリウム（Ｋ2ＰｄＣｌ4）、テトラクロロパラジウム酸リチウム（Ｌｉ2ＰｄＣｌ4）、テトラブロモパラジウム酸ナトリウム（Ｎａ2ＰｄＢｒ4）、テトラブロモパラジウム酸カリウム（Ｋ2ＰｄＢｒ4）、Ｐｄ2（ジベンジリデンアセトン）3、Ｐｄ（ジベンジリデンアセトン）2、及びＢｕｃｈｗａｌｄプレ触媒からなる群から選択されるパラジウム（ＩＩ）塩として提供される、請求項１に記載のＰｄ触媒組成物。
- 前記パラジウムが、酢酸パラジウム（Ｐｄ（ＯＡｃ） 2 ）、トリフルオロ酢酸パラジウム（Ｐｄ（ＴＦＡ） 2 ）、硝酸パラジウム（Ｐｄ（ＮＯ 3 ） 2 ）、塩化パラジウム（ＰｄＣｌ 2 ）、臭化パラジウム（ＰｄＢｒ 2 ）、テトラクロロパラジウム酸ナトリウム（Ｎａ 2 ＰｄＣｌ 4 ）、テトラクロロパラジウム酸カリウム（Ｋ 2 ＰｄＣｌ 4 ）、テトラクロロパラジウム酸リチウム（Ｌｉ 2 ＰｄＣｌ 4 ）、テトラブロモパラジウム酸ナトリウム（Ｎａ 2 ＰｄＢｒ 4 ）、テトラブロモパラジウム酸カリウム（Ｋ 2 ＰｄＢｒ 4 ）、Ｐｄ 2 （ジベンジリデンアセトン） 3 、Ｐｄ（ジベンジリデンアセトン） 2 、及びＢｕｃｈｗａｌｄプレ触媒からなる群から選択されるパラジウム（ＩＩ）塩として提供される、請求項２に記載の方法。
- タンパク質リッチな環境又はタンパク性環境で使用される、請求項１に記載のＰｄ触媒組成物。
- 前記水が、酸素を除去されたものであり、任意に前記結合工程の前に、前記水の脱気工程を更に含む、請求項２記載の方法。
- 前記パラジウム（ＩＩ）塩及び前記ホスフィン配位子が、撹拌又はかき混ぜによって結合される、請求項２に記載の方法。
- 前記結合工程の前に、前記パラジウム（ＩＩ）塩を水に溶解させる工程及び前記ホスフィン配位子を水に溶解させる工程を更に含む、請求項２に記載の方法。
- 前記結合工程の後に、前記Ｐｄ触媒を緩衝する工程を更に含み、任意に前記Ｐｄ触媒が、ｐＨ６．５〜８．０の間で緩衝される、請求項２に記載の方法。
- 前記Ｐｄ触媒を凍結乾燥させる工程を更に含み、任意に前記Ｐｄ触媒を緩衝液で再構築させる工程を更に含む、請求項２に記載の方法。
- 前記緩衝液が、ＨＥＰＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＲＩＳ、ＰＢＳ＋ベンゼンスルフィン酸Ｎａ、ＰＢＳ、ｐ−トルエンスルフィン酸Ｎａ、ジメチルバルビツル酸、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１１又は１２のいずれかに記載の方法。
- ホスフィン配位パラジウムイオンを含むＰｄ触媒の保存方法であって、前記ホスフィン配位子が、以下の化合物、
からなる群から選択されるDANPHOSファミリーの化合物であり、かつパラジウムより６〜１２倍モル過剰に存在し、該方法が、
（ｉ）前記Ｐｄ触媒の水溶液を乾燥状態まで凍結乾燥する工程、
（ｉｉ）前記Ｐｄ触媒を非緩衝状態で保存する工程、
（ｉｉｉ）前記Ｐｄ触媒から分子酸素を除去する工程、
（ｉｖ）低温で保存する工程、及び
（ｖ）密封容器中で保存する工程、
の１つ以上の工程を含み、任意に前記方法が、２つの工程又は４つの工程を含むことを特徴とする、Ｐｄ触媒の保存方法。
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