JP6908331B2 - ポリジアリルジアルキルアンモニウム塩を使用したアデノ随伴ウイルスを単離する方法 - Google Patents
ポリジアリルジアルキルアンモニウム塩を使用したアデノ随伴ウイルスを単離する方法 Download PDFInfo
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Description
[0001]本発明は、凝集剤を使用してアデノ随伴ウイルス(AAV)を水性バイオマスから選択的に精製する方法に関する。実施形態では、凝集剤は、ポリジアリルジアルキルアンモニウム塩、例えば、ポリジアリルジメチルアンモニウムクロライド(pDADMAC)である。
[0002]アデノ随伴ウイルス(AAV)は、分裂細胞及び非分裂細胞に形質導入できる能力、低い免疫原性、並びに広い又は狭い組織特異性のAAV血清型を生成する能力のため、遺伝子治療においてベクターとして使用されるヘルパーウイルス依存パルボウイルスである。組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)ベクターを使用した多くの成功した組織培養及び小動物の試験の中で、臨床試験へ進んだものは殆どなかった。特に大型動物モデル及び毒性の試験における、前臨床効力試験は、研究室及び研究グレードベクターの殆どの中核施設で容易には産生されないベクター量を必要とする。
[0004]実施形態では、本発明は、アデノ随伴ウイルス(AAV)及び少なくとも1種のAAVヘルパーウイルスを含有する水性バイオマスから、前記アデノ随伴ウイルスを精製する方法であって、(a)前記バイオマスをポリジアリルジアルキルアンモニウム塩に接触させて、凝集体及び清澄化溶液を形成するステップであり、前記凝集体が、前記少なくとも1種のAAVヘルパーウイルスを含む、ステップと、(b)前記凝集体を清澄化溶液から除去するステップと、(c)AAVを清澄化溶液からさらに単離するステップとを含む、方法を提供する。
実施例1
[0034]AAV、AAVヘルパーウイルス(Ad5)及び細胞成分を含んだ細胞ライセートを含む水性バイオマスからの精製したAAVの単離について以下に記載する。操作上のステップを回避し製品損失を最小限にするために、pDADMACを使用した生産リアクター中の細胞培養懸濁液の凝集を制御することによって、収集/上流プロセスを最適化すると共に下流のクロマトグラフィーを強化した。
[0037]ヘルパーウイルス存在下でのAAV回収プロセス(力価に悪影響のない)におけるpDADMAC使用の実現可能性をさらに実証するために、pDADMACを用いる及び用いないAd5を含有する細胞ライセートを既知量のAAVを添加(spiking)することにより試験した。様々な条件からの細胞ライセートを遠心分離によって清澄化後、無菌ろ過し、次いでAd5(qPCR及びHPLC)及びAAV(qPCR)について試験した。データは、0.01〜0.1%の濃度のpDADMACによってAAV力価が影響を受けないことを示す。Ad5では、HPLCの結果はAd5が検出されないことを示唆するが、このアッセイはqPCRほど高感度ではない。qPCRの結果は、約2〜3log低いAd5力価の減少を示した。さらに、使用したpDADMACの量に基づくAd5減少の差も観察された。HPLC及びqPCRの結果は共に、0.05%及び0.1%のpDADMACと比較して、0.01%及び0.025%のpDADMACにおいてAd5の排除率が、より高いことを示した。結果を表2に要約する。
[0038]pDADMACが、AAVウイルスに概して影響を与えていなかったこと、及び他のプロセスにより、AAVの収集に使用され得ることを確認するために、バキュロウイルス系システムを使用して生成したAAVについて凝集プロセスを試験した。この場合では、AAVを昆虫細胞において産生し、pDADMACを0、0.025%、0.050%及び0.1%で培養ライセートに添加した。各試料中のAAVをqPCRによって分析した(表3)。対照試料と、pDADMACを使用して収集した試料との間で、AAV力価の差は予想どおり観察されなかった。
[0039]組換えバキュロウイルスを用いたバキュロウイルスシステム(rBV)でpDADMACも試験した。0、0.025%及び0.1%のpDADMACを用いた培養ライセートを試験した。感染力価アッセイ(BacPAK)を使用して、pDADMACで処理した及び処理しない(標準フィルターを使用して収集した−対照)試料において各試料中の組換えバキュロウイルス(rBV)を試験した。結果を表4に要約する。この実験で得られたデータは、収集のためのpDADMACを使用する手順を標準的手順と比較した場合、rBV感染力価が影響を受けなかったことを示した。
[0100]本明細書に記載の種々の実施形態又は選択肢は全て、任意の及びあらゆる変形において組み合わせることができる。本発明は、本発明のいくつかの実施形態を参照して特に示し説明しているが、それらは限定としてではなく例としてのみ提示されており、形態及び詳細における種々の変更が、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなしに、それらの実施形態においてなされ得ることを当業者は理解するであろう。したがって、本発明の広がり及び範囲は、いかなる上記の例示的実施形態によっても制限されるべきではないが、以下の特許請求の範囲及びこれらの等価物によってのみ定義されるべきである。
Claims (25)
- アデノ随伴ウイルス(AAV)及び少なくとも1種のAAVヘルパーウイルスを含有する水性バイオマスから、前記アデノ随伴ウイルスを精製する方法であって、
a.前記バイオマスをポリジアリルジアルキルアンモニウム塩に接触させて、凝集体及び清澄化溶液を形成するステップであり、前記凝集体が、前記少なくとも1種のAAVヘルパーウイルスを含む、ステップと、
b.前記凝集体を前記清澄化溶液から除去するステップと、
c.前記AAVを前記清澄化溶液からさらに単離するステップと
を含む、方法。 - 前記清澄化溶液中のAAVヘルパーウイルスが、著しく減少する、請求項1に記載の方法。
- 前記ポリジアリルジアルキルアンモニウム塩が、ポリジアリルジメチルアンモニウム塩である、請求項1に記載の方法。
- 前記ポリジアリルジアルキルアンモニウム塩が、ポリジアリルジメチルアンモニウムクロライド(pDADMAC)である、請求項1に記載の方法。
- 前記少なくとも1種のAAVヘルパーウイルスが、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス及びバキュロウイルスからなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記少なくとも1種のAAVヘルパーウイルスが、アデノウイルスである、請求項2に記載の方法。
- 前記少なくとも1種のAAVヘルパーウイルスが、バキュロウイルスである、請求項2に記載の方法。
- 前記バイオマスが、細胞ライセートである、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ポリジアリルジアルキルアンモニウム塩が、0.01%〜0.5%(w/v)の濃度で前記バイオマスに存在する、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ポリジアリルジアルキルアンモニウム塩が、0.025%〜0.1%(w/v)の濃度で前記バイオマスに存在する、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 標的導入遺伝子を含有するアデノ随伴ウイルス(AAV)を単離する方法であって、
a.産生細胞に前記AAV及びAAVヘルパーウイルスをトランスフェクトして、トランスフェクトされた産生細胞を作製するステップと、
b.前記トランスフェクトされた産生細胞を培養するステップと、
c.前記トランスフェクトされた産生細胞を溶解して、水性バイオマスを創出するステップと、
d.ポリジアリルジアルキルアンモニウム塩を前記バイオマスに導入して、前記AAVヘルパーウイルスを含む凝集体及び前記AAVを含む清澄化溶液を作製するステップと、
e.前記清澄化溶液を精製カラムに接触させて、単離されたAAVを作製するステップと
を含む、方法。 - 標的導入遺伝子を含有するアデノ随伴ウイルス(AAV)を単離する方法であって、
a.産生細胞に前記AAV及びAAVヘルパーウイルスをトランスフェクトして、トランスフェクトされた産生細胞を作製するステップと、
b.前記トランスフェクトされた産生細胞を培養して、水性バイオマスを作製するステップと、
c.ポリジアリルジアルキルアンモニウム塩を前記バイオマスに導入して、前記AAVヘルパーウイルスを含む凝集体及び前記AAVを含む清澄化溶液を作製するステップと、
d.前記清澄化溶液を精製カラムで処理して、単離されたAAVを作製するステップと
を含む、方法。 - 前記AAVヘルパーウイルスが、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス及びバキュロウイルスからなる群から選択される、請求項11又は12に記載の方法。
- 前記ポリジアリルジアルキルアンモニウム塩が、ポリジアリルジメチルアンモニウム塩である、請求項11〜13のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ポリジアリルジアルキルアンモニウム塩が、ポリジアリルジメチルアンモニウムクロライド(pDADMAC)である、請求項11〜13のいずれか一項に記載の方法。
- 前記AAVヘルパーウイルスが、アデノウイルスである、請求項11〜15のいずれか一項に記載の方法。
- 前記AAVヘルパーウイルスが、バキュロウイルスである、請求項11〜15のいずれか一項に記載の方法。
- 前記産生細胞株が、HeLa細胞株、CHO細胞株、HEK293細胞若しくはスポドプテラ・フルギペルダ(Sf9)細胞株又は他の任意の産生細胞株である、請求項11〜17のいずれか一項に記載の方法。
- 前記産生細胞が、HeLa細胞である、請求項18に記載の方法。
- 前記産生細胞が、スポドプテラ・フルギペルダ細胞である、請求項18に記載の方法。
- 前記産生細胞をAAVの集合に必要な追加の遺伝子要素に接触させるステップをさらに含む、請求項11〜20のいずれか一項に記載の方法。
- 前記遺伝子要素が、AAV非構造タンパク質、AAV構造タンパク質及び高分子合成に必要な細胞因子からなる群から選択される、請求項21に記載の方法。
- 前記細胞因子が、レプリカーゼ及びカプシドタンパク質をコードする配列である、請求項22に記載の方法。
- 前記AAVが、導入遺伝子を含む、請求項11〜23のいずれか一項に記載の方法。
- 前記導入遺伝子が、遺伝子治療のあらゆる標的からなる群から選択される、請求項24に記載の方法。
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