JP6900408B2

JP6900408B2 - 抗体へのリンカー薬物の部位特異的コンジュゲーションおよび得られるａｄｃ

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Description

発明の分野

本発明は、リンカー薬物が、操作されたシステインを介して抗体に部位特異的にコンジュゲートされている抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）、ならびにヒト固形腫瘍および血液悪性腫瘍、特に乳癌、胃癌、結腸直腸癌、尿路上皮癌、卵巣癌、子宮癌、肺癌、中皮腫、肝癌、膵癌、前立腺癌、および白血病の治療におけるその使用に関する。

発明の背景

抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）は、伝統的な化学療法よりも治療指数が改善されている標的治療法の新たな種類である。（モノクローナル）抗体（ｍＡｂ）ならびに標的選択に加えて、薬物およびリンカーがＡＤＣ開発の焦点となってきた。しかしながら、近年では、コンジュゲートの均質性の重要性が認識された。抗体への薬物結合の従来の方法は、不均質な混合物をもたらし、その混合物のいくつか個々の成分のｉｎｖｉｖｏでの成績が、低いことがある。部位特異的薬物結合の新たな方法は、より均質なコンジュゲートをもたらし薬物結合の部位の制御ができるようになる。これら僅かな改善は、ｉｎｖｉｖｏ効力および／またはｉｎｖｉｖｏ安全性、ならびにそれによる治療指数に対して大きな効果を有し得る。抗体への部位特異的薬物コンジュゲーションの方法については、Ｃ．Ｒ．ＢｅｈｒｅｎｓａｎｄＢ．ＬｉｕｉｎｍＡｂｓ、Ｖｏｌ．６、Ｉｓｓｕｅ１、２０１４、ｐａｇｅｓ１−８に総合的に概説されている。

従来のＡＤＣは、表面に露出しているリシンまたは鎖間ジスルフィド結合の還元によって生成される遊離システインのいずれかの側鎖を介して抗体にリンカー薬物をコンジュゲートすることにより一般に産生される。抗体は、多くのリシン残基およびシステインジスルフィド結合を含有するので、従来のコンジュゲーションは、解析特性評価ならびに製造に関して課題を示す不均質な混合物を一般に産生する。さらに、これら混合物の個々の成分は、薬物動態、効力および安全性プロファイルに関して異なる物理化学特性ならびに薬理を呈し、この方法を最適化するための合理的な手法を妨げる。

抗体の化学的修飾に関するこれら２つの従来技術を使用して、現在ＦＤＡ販売承認を持つ２つのＡＤＣを構築した。ブレンツキシマブベドチン［Ａｄｃｅｔｒｉｓ（商標）、ＳｅａｔｔｌｅＧｅｎｅｔｉｃｓ］は、天然のシステイン側鎖チオールの修飾によって細胞毒性の高い薬物であるモノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）にコンジュゲートされた抗ＣＤ３０モノクローナル抗体からなる。製造は、溶媒に露出している鎖間ジスルフィドを部分還元し、その後マレイミド含有リンカー薬物によって得られるチオールを修飾することを含む。ブレンツキシマブベドチンの場合、チオールは、マレイミド基（ｍｃ、マレイミドカプロイル）と細胞毒性薬物（ＭＭＡＥ）の間にカテプシンＢプロテアーゼ切断部位（ｖｃ、バリン−シトルリン）および自己分解型リンカー（ＰＡＢ、パラアミノベンジルオキシカルボニル）を組み込んだｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥで修飾された。システイン結合戦略により、還元したジスルフィド当たり最大２つの薬物が得られる。ほとんどのヒトＩｇＧ分子は、溶媒に露出しているジスルフィド結合を４つ有するため、抗体当たり０〜８つの範囲の薬物が考えられる。抗体当たりの薬物の正確な数は、ジスルフィド還元の程度、続いて起こるコンジュゲーション反応に使用されるリンカー薬物のモル当量の数によって決定される。部分還元により、抗体当たり０、２、４、６または８つの薬物を持つ不均質な混合物が一般に得られるが、４つ全てのジスルフィド結合の完全な還元は、抗体当たり８つの薬物を持つ均質な構築物を与える。ブレンツキシマブベドチンは、抗体当たり平均約４つの薬物を有する。

現在ＦＤＡ承認がある他のＡＤＣは、ａｄｏ−トラスツズマブエムタンシン［Ｔ−ＤＭ１、Ｋａｄｃｙｌａ（商標）、Ｒｏｃｈｅ／Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ］であり、これはリシン側鎖アミンの修飾により細胞毒性薬物メイタンシンに抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体トラスツズマブを結合させることにより構築された。メイタンシン（ＤＭ１）のこのバージョンは、マレイミドリンカーに結合できるチオールを含むように修飾された。一端にマレイミド、他端にＮ−ヒドロキシスクシンイミジル（ＮＨＳ）エステルを持つ二官能性リンカー［ＳＭＣＣ、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸］を、リシンの１級アミン側鎖と反応させて安定なアミド結合を形成させる。次いで修飾したメイタンシン（ＤＭ１）を、二官能性リンカーのマレイミド端へのコンジュゲーションにより抗体に結合させる。ブレンツキシマブベドチンに利用されているリンカーとは対照的に、このリンカーには（プロテアーゼ）切断部位がなく、したがって、活性ＤＭ１−リンカー−リシン代謝物を遊離させるにはＡＤＣの抗体部分のリソソームの分解を必要とする。その結合方法により、抗体当たり平均３．５個の薬物を持つ不均質なコンジュゲートの混合物を得た。上記のシステイン方法と比較して、天然のシステイン修飾方法を使用すると最大で８つの異なるシステイン残基しか修飾されないのに対して、２０〜４０個のリシン残基が修飾されることが判明したので、この戦略はより不均質な混合物を与えた。

近年では、ＡＤＣの薬理学的プロファイルを、抗体に操作した表面に露出しているシステイン残基を使用し、次いでリンカー薬物にコンジュゲートし、それにより定義した薬物対抗体比（ＤＡＲ）を持つ部位特異的にコンジュゲートされたＡＤＣを得る部位特異的コンジュゲーション技術を適用することにより改善されえると報告された。従来のリシンおよびシステインコンジュゲーション方法を使用して形成される不均質な混合物と比較して、部位特異的にコンジュゲートしたＡＤＣは、少なくとも等価のｉｎｖｉｖｏ効力、ＰＫの改善および治療濃度域の拡大を一般に実証した。

ＷＯ２００６／０３４４８８に詳述されている通り、最初の部位特異的コンジュゲーション手法は、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈにおいて高いチオール反応性を示す位置で部位特異的突然変異誘発法を使用してシステイン残基を導入することにより開発された。抗体におけるタンパク質修飾のこの慣行は、様々な天然のシステイン残基がすでに存在するので、より複雑になった。不適当な位置における追加のシステイン残基の導入により、鎖間ジスルフィド結合の不適当な形成、そのため抗体の不適当な折りたたみが生じる場合がある。変異させた抗体中の適切な位置に操作されたシステイン残基は、他のチオール、たとえばシステインまたはグルタチオンによりしばしばキャップされて、ジスルフィドを形成する。

変異体残基に対する薬物結合は、天然の鎖間および変異体ジスルフィドの両方を還元し、次いで穏やかな酸化剤、たとえばＣｕＳＯ₄またはデヒドロアスコルビン酸を使用して天然の鎖間システインを再酸化し、続いて遊離の変異体システインとリンカー薬物との標準的なコンジュゲーションにより達成された。最適条件下では、抗体当たり２つの薬物が、結合されることになる（１つのシステインが、ｍＡｂの重鎖または軽鎖の中で操作されている場合）。操作されたシステイン方法は、部位特異的ＡＤＣＳＧＮ−ＣＤ３３Ａ（ＳｅａｔｔｌｅＧｅｎｅｔｉｃｓ）を開発するのに適していることが証明され、その薬物は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の治療として第１相用量増加臨床試験、ならびにシタラビンおよびダウノルビシンを含めた標準的な化学療法と併用する第１ｂ相臨床試験に最近入った。薬物が、ＩｇＧ１ｍＡｂｈ２Ｈ１２（ＤＡＲ１．９；Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄｅｔａｌ．Ｂｌｏｏｄ２０１３；１２２（８）：１４５５−１４６３）のＦｃ部分にある重鎖Ｓ２３９Ｃ位に連結されるように、このＡＤＣは、切断可能なジペプチドリンカー（すなわち、バリン−アラニン）およびＤＮＡ架橋、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）二量体を含む。

ＷＯ２００６／０３４４８８において抗原結合の相互作用に関係せず既存の鎖間ジスルフィド結合から離れている特定の表面の接近しやすいバリン、アラニンおよびセリン残基を置換して、高いチオール反応性を持つ操作されたシステイン残基が得られるのに対して、ＮｏｖａｒｔｉｓのＷＯ２０１４／１２４３１６は、抗体重鎖および軽鎖の定常領域にある表面の接近しやすい部位を同定することに特に重点を置き、そこでのシステイン残基の部位置換が、ペイロードの効果的なコンジュゲーションを可能にし、高い安定性のコンジュゲートを与える。

操作されたシステインコンジュゲーション戦略に加えて、薬物の部位特異的結合の他の方法が開発された。Ｐｆｉｚｅｒは、微生物のグルタミン転移酵素を使用して、抗体上の操作されたグルタミンにアミン含有薬物を結合させるコンジュゲーションの新たな技術を実証した。グルタミン転移酵素は、グルタミン側鎖のアシル基とリシン側鎖の１級アミンとのアミド結合形成を触媒する酵素である。

酵素的コンジュゲーションに加えて、非天然のアミノ酸（特にＡｍｂｒｘおよびＳｕｔｒｏＢｉｏｐｈａｒｍａの技術）を使用して様々なタンパク質を部位特異的に修飾するための直交化学コンジュゲーション（orthogonal chemistry conjugation）も使用されてきた。特に、ｐ−アセチルフェニル−アラニンおよびｐ−アジドメチル−Ｌ−フェニルアラニンは、２０種の天然のアミノ酸側鎖のいずれにも見られないケトンならびにアジド官能基をそれぞれ含有するので、非天然のアミノ酸として選ばれた。これは、他のアミノ酸からの干渉なしにケトンｃｑ．アジド基の特異的修飾を可能にさせる。この方法は、抗体当たり（そのような非天然のアミノ酸当たり）最大２つの薬物を持つＡＤＣを構築するためのさらなる経路を提供した。

これまで開示された従来方法の全てにおいて、均一性および薬物動態特性を改善する目的で、表面／溶媒に露出している位置、高いチオール反応性を示す位置、ならびにモノクローナル抗体の特に定常領域の位置にリンカー薬物を部位特異的にコンジュゲートすることに重点が置かれた。上記従来のリシンおよびシステインコンジュゲーション方法は、ＦＤＡに認可された抗体−薬物コンジュゲートをもたらし、現在前臨床および臨床試験中の大多数のＡＤＣを構築するために使用されているが、許容できる抗原結合特性、ｉｎｖｉｖｏ効力、治療指数および／もしくは安定性を有するＡＤＣを得るためにＡＤＣの物理化学的、薬物動態学的、薬理学的ならびに／または毒性学的性質を（さらに）改善することを目的とした新たなコンジュゲーション戦略の必要性がなお存在する。

発明の簡単な説明

本発明は、リンカー薬物が、前記抗体の１つ以上の特定の位置で、操作されたシステインを介して抗体に部位特異的にコンジュゲートされている抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）、ならびにヒト固形腫瘍および血液悪性腫瘍、特に乳癌、胃癌、結腸直腸癌、尿路上皮癌、卵巣癌、子宮癌、肺癌、中皮腫、肝癌、膵癌、前立腺癌、および白血病の治療におけるその使用に関する。

抗体のＦａｂ部分における適切なリンカー薬物コンジュゲーション位置の同定。抗体のＦａｂ腔におけるデュオカルマイシンリンカー薬物ｖｃ−ｓｅｃｏ−ＤＵＢＡの結合（複数のｖｃ−ｓｅｃｏ−ＤＵＢＡ結合の重ね合せ）。抗体のＦｃ部分における適切なリンカー薬物コンジュゲーション位置の同定。抗体のＦｃ腔におけるデュオカルマイシンリンカー薬物ｖｃ−ｓｅｃｏ−ＤＵＢＡの結合（複数のｖｃ−ｓｅｃｏ−ＤＵＢＡ結合の重ね合せ）。各２ｍｇ／ｋｇでの、媒体対照、比較用の操作されたシステイン抗ＰＳＭＡ（ＣＨＴ１２０Ｃ）ＡＤＣ（ＳＹＤ１０３５）および操作されていない抗ＰＳＭＡ（野生型）ｗｔＡＤＣ（ＳＹＤ９９８）に対する操作されたシステイン抗ＰＳＭＡ（ＶＨＳ４１Ｃ）ＡＤＣ（ＳＹＤ１０９１）のｉｎｖｉｖｏ効力。各１０ｍｇ／ｋｇでの、媒体対照、比較用の操作されたシステイン抗ＰＳＭＡ（ＣＨＴ１２０Ｃ）ＡＤＣ（ＳＹＤ１０３５）および操作されていない抗ＰＳＭＡｗｔＡＤＣ（ＳＹＤ９９８）に対する操作されたシステイン抗ＰＳＭＡ（ＶＨＳ４１Ｃ）ＡＤＣ（ＳＹＤ１０９１）のｉｎｖｉｖｏ効力。各１０ｍｇ／ｋｇでの、媒体対照、比較用の操作されたシステイン抗ＰＳＭＡ（ＣＨＴ１２０Ｃ）ＡＤＣ（ＳＹＤ１０３５）、および操作されていない抗ＰＳＭＡｗｔＡＤＣ（ＳＹＤ９９８）に対する操作されたシステイン抗ＰＳＭＡ（ＶＨＳ４１Ｃ）ＡＤＣ（ＳＹＤ１０９１）の体重に対する効果。各３ｍｇ／ｋｇでの、媒体対照、および操作されていない抗５Ｔ４ｗｔＨ８ＡＤＣ（Ｈ８−ｖｃ−ｓｅｃｏ−ＤＵＢＡ）に対する操作されたシステイン抗５Ｔ４（ＶＨＰ４１Ｃ）Ｈ８ＡＤＣ（Ｈ８−４１Ｃ−ｖｃ−ｓｅｃｏ−ＤＵＢＡ）のｉｎｖｉｖｏ効力。各１０ｍｇ／ｋｇでの、媒体対照、および操作されていない抗５Ｔ４ｗｔＨ８ＡＤＣ（Ｈ８−ｖｃ−ｓｅｃｏ−ＤＵＢＡ）に対する操作されたシステイン抗５Ｔ４（ＶＨＰ４１Ｃ）Ｈ８ＡＤＣ（Ｈ８−４１Ｃ−ｖｃ−ｓｅｃｏ−ＤＵＢＡ）のｉｎｖｉｖｏ効力。

発明の詳細な説明

抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）は、小分子治療法の効力を抗体の標的化能力と組み合わせる抗癌治療法の新たな種類として浮上している。これら２つの成分を新たな単一の分子実体へと組み合わせることにより、細胞毒性が高い小分子薬物を標的癌組織に送達し、それによって小分子の潜在的な全身性毒性副作用を減少させながら効力を向上させることができる。

抗体は、ＤＮＡを結合する（たとえばアントラサイクリン）、ＤＮＡをアルキル化もしくは架橋する（たとえばそれぞれデュオカルマイシンまたはピロロベンゾジアゼピン二量体）、ＤＮＡ鎖切断を引き起こす（たとえばカリケアマイシン）または微小管を阻害する（たとえばマイタンシノイドおよびオーリスタチン）小分子を含めた様々な細胞毒性薬物にコンジュゲートされてきた。

本発明は、抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）化合物であって、リンカー薬物が、重鎖４０、４１、８９（Ｋａｂａｔナンバリング）、１５２、１５３、１５５、１７１、２４７、２９７、３３９、３７５および３７６（Ｅｕナンバリング）、ならびに軽鎖４０、４１（Ｋａｂａｔナンバリング）、１６５および１６８（Ｅｕナンバリング）から選択される前記抗体の１つ以上の位置で操作されたシステインを介して抗体に部位特異的にコンジュゲートされている化合物に関する。

一態様において、本発明は、抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）化合物であって、リンカー薬物が、重鎖４０、４１、８９、１５２、１５３、１５５、１７１、２４７、２９７、３３９および３７５ならびに軽鎖４０、４１および１６５から選択される前記抗体の１つ以上の位置で操作されたシステインを介して抗体に部位特異的にコンジュゲートされている化合物に関する。

特に好ましい態様において、本発明は、抗体−薬物コンジュゲート化合物であって、リンカー薬物が、重鎖４０、４１および８９（Ｋａｂａｔナンバリングによる）ならびに軽鎖４０および４１（Ｋａｂａｔナンバリングによる）から選択される前記抗体の１つ以上の位置で操作されたシステインを介して抗体に部位特異的にコンジュゲートされている化合物に関する。

部位特異的ＡＤＣに関する初期の仕事の焦点は、リンカー薬物と優れた反応性を示し、同時に抗体間でジスルフィド結合を形成する（凝集をもたらす）または抗体構造を妨げる（いわゆるジスルフィド架橋シャフリング）危険性が低いコンジュゲーション位置を見出すことにあったので、コンジュゲーション部位と関連するコンジュゲートの疎水性に対する効果は、評価されてこなかった。加えて、抗体の可変領域の修飾は、抗原結合を部分的または完全に喪失する高いリスクに関連すると一般に考えられるので、焦点は、主に抗体の定常領域内に適切な部位を見つけることであった。

しかしながら、本発明者らは、部位特異的ＡＤＣの疎水性特徴に影響することに重点を置いた。

ＹＡＳＡＲＡソフトウェアパッケージ（ｗｗｗ．ｙａｓａｒａ．ｏｒｇ、：Ｋｒｉｅｇｅｒｅｔａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎｓ２００９；７７Ｓｕｐｐｌ９：１１４−１２２を参照のこと）を利用するｉｎｓｉｌｉｃｏ方法を使用して、リンカー薬物と抗体の強い相互作用の部位を同定した。適切な位置は、疎水性表面の最小の増加を示す。このように同定された相互作用部位の付近において、システインに変換するのに適切な残基（すなわち、十分な近接性）が、同定された。この手法では、いかなる制限も抗体の定常領域にはなく、抗原結合部位の付近にない場合には可変領域アミノ酸も考慮した。Ｆａｂ部分の可変ドメイン内の位置が好ましいと判明した。

様々な抗体のＦａｂおよびＦｃモデルへのリンカー薬物の結合を、ＹＡＳＡＲＡに実装された一般に使用されるＶＩＮＡアルゴリズム（ＴｒｏｔｔＯａｎｄＯｌｓｏｎＡＪ．Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｃｈｅｍ．２０１０；３１：４５５−４６１）でシミュレートした。使用される抗体ＦａｂおよびＦｃモデルは、Ｘ線構造からまたはＹＡＳＡＲＡを使用する相同性モデリングにより得られた。

デュオカルマイシン型リンカー薬物、たとえばｖｃ−ｓｅｃｏ−ＤＵＢＡ（すなわち、ＳＹＤ９８０；そのＡＤＣ化合物を、式ＩＩに表す）は、全ての抗体構造に存在する腔における結合に対する選好が強いことが示された（抗体ＦａｂおよびＦｃ部分について、それぞれ図１Ｂならびに１Ｄを参照のこと）。リンカー薬物結合に対する複数の適切なコンジュゲーション位置が、これらの腔内およびそれに近接して同定され、すなわちこれらの位置において操作されたシステインの近接性は優れていた（抗体ＦａｂおよびＦｃ部分について、それぞれ図１Ａならびに１Ｃを参照のこと）。

本発明の文脈において、重鎖（ＨＣ）および軽鎖（ＬＣ）可変領域内の操作されたシステインのアミノ酸位置を指し示すためにＫａｂａｔナンバリングを使用し、抗体の重鎖および軽鎖定常部内の位置を指し示すためにＥｕナンバリングを使用した。抗体の可変領域における配列変動を考えると、システインによって置換されることになる厳密なアミノ酸は、異なる抗体では異なることがあり得る。ほとんどの抗体、特にＩｇＧ抗体の場合、可変領域の重鎖（ＶＨ）において、通常４０位にＡまたはＳ、４１位にＰおよび８９位にＶがあり、可変領域の軽鎖（ＶＬ）において、通常４０位にＰおよび４１位にＧがある。定常領域の重鎖（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）において、通常１５２位にＥ、１５３位にＰ、１５５位にＴ、１７１位にＰ、２４７位にＰ、２９７位にＮ、３３９位にＡ、３７５位にＳおよび３７６位にＤがあり、κ定常領域の軽鎖（ＣＬ）において、通常１６５位にＥおよび１６８位にＳがある。５つのλ軽鎖アイソタイプ定常領域（ＣＬ）において、通常１６５位にＳおよび１６８位にＳがある。

表現「Ｋａｂａｔナンバリング」とは、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ｅｔａｌ．、ＳｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｔｅｒｅｓｔ、５ｔｈＥｄ．、ＰｕｂｌｉｃＨｅａｌｔｈＳｅｒｖｉｃｅ、ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓｏｆＨｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ．（１９９１）において抗体の重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインの編集に使用されるナンバリング方式のことを指す。このナンバリング方式を使用して、実際の直鎖アミノ酸配列は、可変ドメインのフレームワーク領域（ＦＲ）または相補性決定領域（ＣＤＲ）の短縮もしくはそれらへの挿入に対応する少ないもしくは追加のアミノ酸を含有していてもよい。
残基のＫａｂａｔナンバリングは、抗体の配列の相同性領域における「標準的な」Ｋａｂａｔナンバリングされた配列との整列化により所与の抗体について決定されえる。

表現「Ｅｕナンバリング」とは、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ｅｔａｌ．、ＳｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｔｅｒｅｓｔ、５ｔｈＥｄ．、ＰｕｂｌｉｃＨｅａｌｔｈＳｅｒｖｉｃｅ、ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓｏｆＨｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ．、ＮＩＨｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｎｏ．９１−３２４２、ｐｐ．６６２、６８０、６８９（１９９１）にみられるＥｕ指数のことを指す。「ＫａｂａｔにみられるＥｕ指数」は、ヒトＩｇＧ１Ｅｕ抗体の残基ナンバリングのことを指す［Ｅｄｅｌｍａｎ，Ｇ．Ｍ．ｅｔａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、６３、７８−８５（１９６９）］。

重鎖４０、４１および８９位は可変領域に位置し、１５２、１５３、１５５、１７１、２４７、２９７、３３９、３７５および３７６位は抗体の定常領域に位置する。軽鎖４０および４１位は可変領域に位置し、１６５および１６８位は抗体の定常領域に位置する。

重鎖４０、４１、８９、１５２、１５３、１５５および１７１位ならびに軽鎖置４０、４１、１６５および１６８位はＦａｂ部分に位置し、重鎖２４７、２９７、３３９、３７５および３７６位は抗体のＦｃ部分に位置する。

本発明によると、用語「操作されたシステイン」は、抗体の重鎖または軽鎖内の非システインアミノ酸をシステインにより置きかえることを意味する。当業者に公知であるように、これはアミノ酸レベルで、またはたとえば部位特異的突然変異誘発法を使用することによりＤＮＡレベルのいずれかで行うことができる。

本発明者らは、本発明の部位特異的にコンジュゲートされているＡＤＣ化合物が、リンカー薬物が抗体の天然の鎖間ジスルフィド結合を介してコンジュゲートされているＡＤＣと比較して、さらに本発明者らがこの特許出願において特に請求した先行技術に開示されている位置でリンカー薬物がコンジュゲートされている操作されたシステインＡＤＣと比較して、物理化学的、薬理学的および／または薬物動態学的特性の改善を示すことを驚くべきことに発見した。本発明によるＡＤＣ化合物は、元の抗体と類似の結合特性、優れたｉｎｖｉｖｏ効力、治療指数の増加および／または安定性の改善を有する。特に、ＡＤＣ化合物は、異なる位置で部位特異的にコンジュゲートされているが類似のｉｎｖｉｔｒｏ細胞毒性をなお示すＡＤＣよりも一般に疎水性でなく、カテプシンＢ切断の影響を受けず、したがって腫瘤（腫瘍微小環境）における他の細胞内または細胞外酵素／プロテアーゼの影響も受けない可能性が高いことが判明した。予想外なことに、本発明によるＡＤＣは、他の位置で部位特異的にコンジュゲートされたＡＤＣと比較して、腫瘍異種移植動物モデルにおいてｉｎｖｉｖｏ効力の改善を示す。

どんな原理に束縛されるものでもないが、本発明者らは、ここに請求されるようにリンカー薬物が抗体の特定の位置でコンジュゲートされる場合に、前記リンカー薬物が、抗体のＣＨ１、ＶＨ、ＶＬおよびＣＬドメインによって形成されるＦａｂ腔または抗体の２つのＣＨ２ならびに２つのＣＨ３ドメインによって形成されるＦｃ腔のいずれかに嵌まることを発見した。ＩｇＧ１抗体において、Ｆｃ腔の上部は、重鎖Ｎ２９７位に結合しているグリコシド／炭水化物によって形成される。その結果、リンカー薬物（一般に抗体より疎水性である）は、リンカー薬物が抗体の天然のジスルフィド結合を介してコンジュゲートされているＡＤＣと比較して疎水性がより小さく、リンカー薬物は現在請求されていない異なる位置で部位特異的にコンジュゲートされているＡＤＣと比較してほとんど疎水性でないので、抗体およびＡＤＣを囲む親水性水性環境から保護される。そこではリンカー薬物が抗体の外側に押しやられており、すなわち抗体から離れた方向に向けられている。

特定の一態様において、本発明は、抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）化合物であって、リンカー薬物が、重鎖４０、４１、１５２、１５３、２４７、３３９および３７５ならびに軽鎖４０、４１および１６５から選択される前記抗体の１つ以上の位置で操作されたシステインを介して抗体に部位特異的にコンジュゲートされている化合物に関する。

別の態様において、本発明は、抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）化合物であって、リンカー薬物が、重鎖４０、４１、８９、２４７、２９７および３７６ならびに軽鎖４０および４１から選択される前記抗体の１つ以上の位置で操作されたシステインを介して抗体に部位特異的にコンジュゲートされている化合物に関する。

一態様において、本発明は、抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）化合物であって、リンカー薬物が、前記抗体のＦａｂ部分にある重鎖４０、４１、８９、１５２、１５３、１５５および１７１ならびに軽鎖４０、４１、１６５および１６８から選択される前記抗体の１つ以上の位置で操作されたシステインを介して抗体に部位特異的にコンジュゲートされている化合物に関する。

別の態様において、本発明は、抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）化合物であって、リンカー薬物が、前記抗体のＦａｂ部分にある重鎖４０、４１、１５２および１５３ならびに軽鎖４０、４１および１６５から選択される前記抗体の１つ以上の位置で操作されたシステインを介して抗体に部位特異的にコンジュゲートされている化合物に関する。

抗体の可変部分の修飾は、抗原結合特性の部分的または完全な喪失をもたらし得るので、一般に避けられる。しかしながら、一般的な予想に反して、抗体の重鎖および軽鎖フレームワーク領域にある特定の残基は両方ともコンジュゲーションに適しており、リンカー薬物のコンジュゲーション後に抗原結合の（著しい）減少をもたらさないことが判明した。したがって、特に好ましい態様において、本発明は、抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）化合物であって、前記操作されたシステインが、前記抗体のＦａｂ部分にある重鎖４０、４１および８９ならびに軽鎖４０および４１から選択される前記抗体の１つ以上の位置にある化合物に関する。好ましくは、前記操作されたシステインは、重鎖４０もしくは４１位および／または軽鎖４０もしくは４１位、より好ましくは重鎖４１位および／または軽鎖４０もしくは４１位、最も好ましくは重鎖４１位である。文献から公知であるように、腫瘍微小環境における腫瘍関連プロテアーゼは、ヒンジ領域の下でＦｃ定常ドメインを部分的に切断することができ、Ｆａｂ部分におけるコンジュゲーションはＦｃ部分におけるコンジュゲーションより好ましい。Ｆｃ定常ドメインの切断は、Ｆｃコンジュゲートリンカー薬物を喪失させることになり、それは同様にｉｎｖｉｖｏでのＡＤＣの活性低下をもたらす可能性がある（Ｆａｎｅｔａｌ．ＢｒｅａｓｔＣａｎｃｅｒＲｅｓ．２０１２；１４：Ｒ１１６ａｎｄＢｒｅｚｓｋｙｅｔａｌ．ＰＮＡＳ２００９；１０６：１７８６４−１７８６９）。さらに、Ｆａｂ部分におけるこれらの位置に対するコンジュゲーションは、抗原結合断片の使用も可能にする。

特定の態様において、上記の好ましい態様の抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）化合物は、重鎖１５２、１５３、１５５、１７１、３３９および３７５ならびに軽鎖１６５および１６８から選択される抗体の１つ以上の位置に、追加の操作されたシステインをさらに含んでいてもよい。好ましくは前記さらなる操作されたシステインは、前記抗体のＦｃ部分における重鎖３７５位である。

本発明によると、１つ以上のシステイン残基を、従来の分子クローニング技術を使用することにより抗体に操作することができ、またはシステイン突然変異を保有する抗体の重鎖もしくは軽鎖ドメインは、公知の（ペプチドまたはＤＮＡ）合成装置および手順を使用してそのように合成することができる。

本発明によると、操作されたシステインのチオール基と反応することができる化学基、一般にマレイミドまたはハロアセチル基を有する場合には、ＡＤＣの当業者に公知の任意のリンカー薬物を使用して、抗体に部位特異的にコンジュゲーションさせることができる。適切なリンカー薬物は、細胞毒性薬としてデュオカルマイシン、カリケアマイシン、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）二量体、マイタンシノイドまたはオーリスタチン誘導体を含んでいてもよい。本発明による切断可能なまたは切断不可能ないずれかのリンカーを使用してもよい。マイタンシノイド薬物の適切な例には、ＤＭ１およびＤＭ４がある。オーリスタチン薬物の適切な例には、ＭＭＡＥおよびＭＭＡＦがある。

これらの略語は、当業者に周知である。当業者に公知の適切なリンカー薬物の例には、ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ（ｍｃ−ｖｃ−ＭＭＡＥおよびｖｃ−ＭＭＡＥとも略記される）、ｍｃ−ＭＭＡＦおよびｍｃ−ｖｃ−ＭＭＡＦがある。好ましくは、使用されるリンカーは、切断可能なリンカー、たとえばバリン−シトルリン（ｖｃ）またはバリン−アラニン（ＶＡ）である。

ｖｃ−ＭＭＡＥＡＤＣおよびｍｃ−ＭＭＡＦＡＤＣの一般的な分子構造を、以下に表す。

ｍＡｂに連結されたｖｃ−ＭＭＡＥの分子構造

ｍＡｂに連結されたｍｃ−ＭＭＡＦの分子構造
一態様において、本発明は、前記リンカー薬物がデュオカルマイシン誘導体を含むＡＤＣ化合物に関する。

ストレプトマイセス種の培養液から最初に単離されたデュオカルマイシンは、デュオカルマイシンＡ、デュオカルマイシンＳＡおよびＣＣ−１０６５を含む抗腫瘍抗生物質ファミリーのメンバーである。申し立てによると、これらの非常に強力な薬剤は、副溝内のアデニンのＮ３位置で配列選択的にＤＮＡをアルキル化する能力から生物活性を得て、その活性は、アポトーシスの細胞死機構において停止する事象のカスケードを開始させる。

ＷＯ２０１１／１３３０３９は、ＣＣ−１０６５のデュオカルマイシン誘導体を含む一連のリンカー薬物を開示する。本発明により使用される適切なリンカー−デュオカルマイシン誘導体については、１８２〜１９７頁に開示されている。これら多数のリンカー薬物の化学合成については、ＷＯ２０１１／１３３０３９の例１〜１２に記述されている。

一態様において、本発明は、式（Ｉ）の化合物に関し、

ｎは、０〜３、好ましくは０〜１であり、
ｍは、１〜６、好ましくは１〜４の平均ＤＡＲを表し、
Ｒ¹は、

から選択され、
ｙは、１〜１６であり、
Ｒ²は、

から選択される。

本明細書に示される構造式において、ｎは、０〜３の整数を表し、一方、ｍは、１〜６の平均薬物対抗体比（ＤＡＲ）を表す。当技術分野において周知であるように、ＤＡＲおよび薬物搭載量分布は、たとえば、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）または逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を使用することにより決定できる。
ＨＩＣは、平均ＤＡＲを決定するのに特に適している。

本発明による式（Ｉ）の化合物は、当業者に周知の方法および手順によって得ることができる。リンカー薬物を部位特異的にコンジュゲートする適切な方法は、たとえば、抗体にリンカー薬物ｖｃ−ＭＭＡＥを（部分的に）搭載するための完成した還元戦略について記述しているＷＯ２００５／０８４３９０の例７および８、リンカー薬物を含むマイタンシン（ＤＭ１）の部位特異的コンジュゲーションについて記述しているＷＯ２００６／０３４４８８の例１１および１２、ならびにｍｃ−ＭＭＡＦとのコンジュゲーションについて記述しているＤｏｒｏｎｉｎａｅｔａｌ．ＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＣｈｅｍ．１７（２００６）：１１４−１２４に見ることができる。

本発明の操作されたシステイン部位の２つ以上へのコンジュゲーションは、過度の凝集体を得ることなく、より高いＤＡＲ（特にＤＡＲ４）を持つ疎水性薬物種類を含むＡＤＣの調製を可能にする。

本発明の特定の態様によると、１もしくは２つの操作されたシステインを、それぞれ２もしくは４のＤＡＲを有するＡＤＣ化合物を得るのに最適な反応条件下で抗体の重鎖および／または軽鎖に組み込むことができる。操作されたシステインを１つ導入する場合、そのシステインは、抗体のＦａｂまたはＦｃ部分のいずれかに位置することができる。ＨＣ
４０、４１、８９、１５２もしくは１５３またはＬＣ４０、４１もしくは１６５、好ましくはＨＣ４０、４１もしくは８９またはＬＣ４０、４１もしくは１６５、より好ましくはＨＣ４０もしくは４１またはＬＣ４０もしくは４１、さらにより好ましくはＨＣ４１またはＬＣ４０もしくは４１、最も好ましくはＨＣ４１位で抗体のＦａｂ部分に前記システインを導入することが好ましい。操作されたシステインを２つ導入する場合、これらの２つのシステインは、両方とも抗体のＦａｂもしくはＦｃ部分に位置することができ、あるいは好ましくは、一方は、Ｆａｂ部分、好ましくはＨＣ４０、４１、１５２もしくは１５３またはＬＣ４０、４１もしくは１６５、より好ましくはＨＣ４０もしくは４１またはＬＣ４０もしくは４１、さらにより好ましくはＨＣ４１またはＬＣ４０もしくは４１、最も好ましくはＨＣ４１であることができ、他方は、抗体Ｆｃ部分、好ましくはＨＣ２４７、２９７、３３９もしくは３７５、より好ましくはＨＣ
３３９もしくは３７５、最も好ましくはＨＣ３７５であることができる。操作されたシステインを２つ、抗体のＦａｂ部分に導入する場合、一方のシステイン残基は、重鎖に導入されていてもよく、他方のシステインは抗体、たとえばＨＣ４０または４１およびＬＣ４０または４１の軽鎖に導入される。加えて、操作されたシステインを２つ、抗体のＦａｂ部分に導入する場合、一方のシステイン残基は、本発明において同定された特定の位置のうちの１つ、たとえばＨＣ４０もしくは４１またはＬＣ４０もしくは４１に導入されていてもよく、他方は、より高いＤＡＲおよびなお許容可能な疎水性をもたらす表面に露出している（すなわち、ここで請求されない）操作されたシステイン位置に位置していてもよい。

特定の態様において、本発明は、先に開示した式（Ｉ）の化合物に関し、ｎは、０〜１であり、ｍは、１〜６、好ましくは１〜４、より好ましくは１〜２、最も好ましくは１．５〜２の平均ＤＡＲを表し、
Ｒ¹は、

から選択され、
ｙは、１〜１６、好ましくは１〜４であり、
Ｒ²は、

から選択される。

特定の態様において、本発明は、先に開示した構造式（Ｉ）の化合物に関し、ｎは、０〜１であり、ｍは１．５〜２の平均ＤＡＲを表し、
Ｒ¹は、

であり、
ｙは１〜４であり、Ｒ²は、

から選択される。

特に好ましい態様において、本発明は式（ＩＩ）の化合物に関する。

本発明により、任意の抗体、特に治療活性を有する公知の任意の抗体もしくはＡＤＣの当業者に公知の任意の抗体、またはその任意の抗原結合断片を使用して、ここに請求される特定の抗体位置にリンカー薬物を部位特異的コンジュゲーションすることができる。前記抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧまたはＩｇＭ抗体であることができる。前記抗体は、κ（カッパ）軽鎖またはλ（ラムダ）軽鎖を有することができる。前記ＩｇＧ抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４抗体であることができる。好ましくは、抗体は、腫瘍細胞の細胞膜内または上（たとえば、細胞表面）において発現される抗原標的に結合する、より好ましくは、抗体は、（抗原）標的への結合後に細胞により内部移行され、その後毒素が細胞内に放出される。好ましくは、抗体は、ＩｇＧ抗体、より好ましくはＩｇＧ１抗体、最も好ましくはκ軽鎖を有するＩｇＧ１抗体である。好ましくは、ＩｇＧ抗体は、抗体の重鎖のＮ２９７に結合した天然のグリコシド／炭水化物部分を保有する。

適切な抗体には、抗アネキシンＡ１抗体、抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ２２抗体、抗ＣＤ３０抗体、抗ＣＤ３３抗体、抗ＣＤ３７抗体、抗ＣＤ３８抗体、抗ＣＤ４４抗体、抗ＣＤ４７抗体、抗ＣＤ５６抗体、抗ＣＤ７０抗体、抗ＣＤ７４抗体、抗ＣＤ７９抗体、抗ＣＤ１１５抗体、抗ＣＤ１２３抗体、抗ＣＤ１３８抗体、抗ＣＤ２０３ｃ抗体、抗ＣＤ３０３抗体、抗ＣＥＡＣＡＭ抗体、抗ＣＬＬ−１抗体、抗ｃ−ＭＥＴ（または、抗ＨＧＦＲ）抗体、抗Ｃｒｉｐｔｏ抗体、抗ＤＬＬ３抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＥＰＣＡＭ抗体、抗ＥｐｈＡ２抗体、抗ＥｐｈＢ３抗体、抗ＥＴＢＲ抗体、抗ＦｃＲＬ５抗体、抗ＦＯＬＲ１抗体、抗ＧＣＣ抗体、抗ＧＰＮＭＢ抗体、抗Ｈｅｒ２抗体、抗ＨＭＷ−ＭＡＡ抗体、抗インテグリン抗体、抗ルイスＡ様炭水化物抗体、抗ルイスＹ抗体、抗ＬＩＶ１抗体、抗メソテリン抗体、抗ＭＮ抗体、抗ＭＵＣ１抗体、抗ＭＵＣ１６抗体、抗ＮａＰｉ２ｂ抗体、抗ネクチン−４抗体、抗ＰＳＭＡ抗体、抗ＳＩＲＰα抗体、抗ＳＬＣ４４Ａ４抗体、抗ＳＴＥＡＰ−１抗体、抗５Ｔ４（または、抗ＴＰＢＧ、トロホブラスト糖タンパク質）抗体、抗Ｔａｇ７２抗体、抗ＴＦ（または、抗組織因子）抗体、抗ＴＲＯＰ２抗体および抗ＶＬＡ抗体がある。

好ましくは、抗体は抗アネキシンＡ１抗体、抗ＣＤ１１５抗体、抗ＣＤ１２３抗体、抗ＣＬＬ−１抗体、抗ｃ−ＭＥＴ抗体、抗ＭＵＣ１抗体、抗ＰＳＭＡ抗体、抗５Ｔ４抗体または抗ＴＦ抗体である。より好ましくは、抗体は抗ＰＳＭＡ抗体または抗５Ｔ４抗体である。

本発明によって使用しようとする抗体は、好ましくはモノクローナル抗体（ｍＡｂ）であり、キメラ、ヒト化またはヒトｍＡｂであることができる。本発明によると、より好ましくは、ヒト化またはヒトｍＡｂ、さらにより好ましくはヒト化もしくはヒトＩｇＧ抗体、最も好ましくはヒト化もしくはヒトＩｇＧ１ｍＡｂが使用される。好ましくは、前記抗体は、κ（カッパ）軽鎖を有し、すなわち、ヒト化またはヒトＩｇＧ１−κ抗体である。

ヒト化抗体において、可変領域にある抗原結合ＣＤＲは、ヒト以外の種、一般にマウス、ラットまたはウサギ抗体から得られる。これらのヒト以外のＣＤＲは、可変領域のヒトフレームワーク（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４）内に配置され、ヒト定常領域と組み合わされる。ヒト抗体のように、これらのヒト化抗体は、Ｋａｂａｔナンバリング方式によってナンバリングすることができる。本発明は、ＡＤＣ化合物に特に関し、前記操作されたシステインは、ヒト化抗体のヒトフレームワークにおけるＶＨ４０、ＶＨ４１、ＶＨ８９、ＶＬ４０またはＶＬ４１（すなわち、ＶＨ４０、ＶＨ４１、ＶＬ４０およびＶＬ４１は、ＦＲ２の中央にあり、ＶＨ８９は、ＦＲ３にある）、より具体的にはＶＨ４０、ＶＨ４１、ＶＬ４０もしくはＶＬ４１、さらにより具体的にはＶＨ４１、ＶＬ４０もしくはＶＬ４１、特にＶＨ４１から選択される位置にある。

本発明によると、フレームワーク領域にあるこれら特定の残基は、リンカー薬物のコンジュゲーションとリンカー薬物のコンジュゲーション後に抗体の抗原結合特性を著しく減少させないことの両方に適している。さらに、これらの部位は、抗体だけでなくその任意の抗原結合断片にも適する。

特定の一態様において、先に記述されるように本発明はＡＤＣ化合物に関し、前記抗体は、抗アネキシンＡ１抗体、抗ＣＤ１１５抗体、抗ＣＤ１２３抗体、抗ＣＬＬ−１抗体、抗ｃ−ＭＥＴ抗体、抗ＭＵＣ１抗体、抗ＰＳＭＡ抗体、抗５Ｔ４抗体もしくは抗ＴＦ抗体であり、前記リンカー薬物は、デュオカルマイシン誘導体、好ましくは式（Ｉ）または（ＩＩ）によるＡＤＣ化合物を含む。

さらなる特定の態様において、先に記述されるように本発明はＡＤＣ化合物に関し、前記抗体は、抗ＰＳＭＡ（モノクローナル）抗体もしくは抗５Ｔ４（モノクローナル）抗体であり、前記リンカー薬物は、デュオカルマイシン誘導体、好ましくは、式（Ｉ）または（ＩＩ）によるＡＤＣ化合物を含む。

好ましい態様において、先に記述されるように本発明はＡＤＣ化合物に関し、前記リンカー薬物は、デュオカルマイシン誘導体を含み、抗ＰＳＭＡ（モノクローナル）抗体または抗５Ｔ４（モノクローナル）抗体の重鎖可変領域の４１位にコンジュゲートされ、最も好ましくは式（ＩＩ）によるＡＤＣ化合物である。適切な抗ＰＳＭＡ抗体は、ＷＯ９８／０３８７３（たとえば、例１２）、ＷＯ０２／０９８８９７（たとえば、図１−２）、ＷＯ２００７／００２２２２（たとえば、表１）およびＷＯ２０１１／０６９０１９（たとえば、図２）に記述されている。適切な抗５Ｔ４抗体には、ＷＯ２００６／０３１６５３に記述されるＨ８、およびＷＯ２００７／１０６７４４に記述されるＡ１およびＡ３抗体、ならびにこれら公知の抗体と同じエピトープに結合する任意の抗体がある。

より好ましい態様において、抗ＰＳＭＡ抗体の重鎖は、配列番号２のアミノ酸配列を含み、抗ＰＳＭＡ抗体の軽鎖は配列番号５のアミノ酸配列を含む。より好ましくは、抗ＰＳＭＡ抗体の重鎖は、配列番号２および配列番号３のアミノ酸配列を含み、抗ＰＳＭＡ抗体の軽鎖は、配列番号５ならびに配列番号６のアミノ酸配列を含む。

特に好ましい態様において、本発明は式（ＩＩ）のＡＤＣ化合物に関し、抗体は抗ＰＳＭＡ抗体であり、前記抗ＰＳＭＡ抗体の重鎖が、配列番号２のアミノ酸配列を含み、前記抗ＰＳＭＡ抗体の軽鎖が、配列番号５のアミノ酸配列を含む。より好ましくは、前記抗ＰＳＭＡ抗体の重鎖は、配列番号２および配列番号３のアミノ酸配列を含み、前記抗ＰＳＭＡ抗体の軽鎖は、配列番号５ならびに配列番号６のアミノ酸配列を含む。

別のより好ましい態様において、抗５Ｔ４抗体の重鎖は、配列番号８のアミノ酸配列を含み、抗５Ｔ４抗体の軽鎖は、配列番号１１のアミノ酸配列を含む。より好ましくは、抗５Ｔ４抗体の重鎖は、配列番号８および配列番号９のアミノ酸配列を含み、抗５Ｔ４抗体の軽鎖は、配列番号１１および配列番号６のアミノ酸配列を含む。

特に好ましい態様において、本発明は式（ＩＩ）のＡＤＣ化合物に関し、抗体は、抗５Ｔ４抗体であり、前記抗５Ｔ４抗体の重鎖は、配列番号８のアミノ酸配列を含み、前記抗５Ｔ４抗体の軽鎖は、配列番号１１のアミノ酸配列を含む。より好ましくは、前記抗５Ｔ４抗体の重鎖は、配列番号８および配列番号９のアミノ酸配列を含み、前記抗５Ｔ４抗体の軽鎖は、配列番号１１および配列番号６のアミノ酸配列を含む。

本発明は、薬剤として使用する先に記述したＡＤＣ化合物にさらに関する。

一態様において、本発明は、ヒト固形腫瘍および血液悪性腫瘍の治療に使用する先に記述したＡＤＣ化合物に関する。

さらなる態様において、本発明は、乳癌、胃癌、結腸直腸癌、尿路上皮癌（たとえば膀胱癌）、卵巣癌、子宮癌、肺癌（特に非小細胞肺癌および小細胞肺癌）、中皮腫（特に悪性胸膜中皮腫）、肝癌、膵癌および前立腺癌からなる群から選択されるヒト固形腫瘍の治療に使用する先に記述したＡＤＣ化合物に関する。

好ましい態様において、本発明は、先に記述したＡＤＣ化合物、特に前立腺癌の治療に使用する抗ＰＳＭＡ（モノクローナル）抗体およびデュオカルマイシン誘導体リンカー薬物を含む化合物に関する。

別の好ましい態様において、本発明は、先に記述したＡＤＣ化合物、特に乳癌、胃癌、結腸直腸癌、卵巣癌、肺癌［特に非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）および小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）］、ならびに悪性胸膜中皮腫からなる群から選択されるヒト固形腫瘍の治療に使用する抗５Ｔ４（モノクローナル）抗体およびデュオカルマイシン誘導体リンカー薬物を含む化合物に関する。

なおさらなる態様において、本発明は、ヒト血液悪性腫瘍、特に急性リンパ性および骨髄性白血病（それぞれＡＬＬおよびＡＭＬ）からなる群から選択される白血病の治療に使用する先に記述したＡＤＣ化合物に関する。

本発明は、先に記述したＡＤＣ化合物および１つ以上の薬学的に許容できる賦形剤を含む医薬組成物にさらに関する。治療用タンパク質、たとえばモノクローナル抗体および（モノクローナル）抗体−薬物コンジュゲートの典型的な医薬製剤は、静脈内注入前に（水性）溶解（すなわち、再構成）を必要とする凍結乾燥ケーキ（凍結乾燥した粉末）、または使用前に解凍を必要とする凍結（水性）溶液の形態をとる。

一般に、医薬組成物は凍結乾燥ケーキの形態で提供される。本発明による医薬組成物（凍結乾燥前）に含めるのに適切な薬学的に許容できる賦形剤には、緩衝液（たとえば水に塩を含有するクエン酸塩、ヒスチジンまたはコハク酸塩）、凍結乾燥保護剤（たとえばスクロース、トレハロース）、張性調節剤（たとえば塩化ナトリウム）、界面活性剤（たとえばポリソルベート）および増量剤（たとえばマンニトール、グリシン）がある。冷凍乾燥タンパク質処方に使用する賦形剤は、凍結乾燥プロセスの間および貯蔵の間のタンパク質変性を防止する能力に対して選択される。たとえば、Ｋａｄｃｙｌａ（商標）（Ｒｏｃｈｅ）の滅菌し、凍結乾燥した粉末の単回使用処方は、注射用の静菌または滅菌水（ＢＷＦＩまたはＳＷＦＩ）で再構成した際に、ｐＨ５．０で２０ｍｇ／ｍＬａｄｏ−トラスツズマブエムタンシン、０．０２％重量／体積ポリソルベート２０、１０ｍＭコハク酸ナトリウムおよび６％重量／体積スクロースを含有する。

本発明は、先に記述したヒト固形腫瘍および血液悪性腫瘍の治療のための先に記述した化合物または医薬組成物の使用にも関する。

本発明は、先に記述したヒト固形腫瘍ならびに血液悪性腫瘍の治療のための、先に記述した化合物もしくは医薬組成物と治療抗体および／もしくは化学療法剤との連続してまたは同時に投与される組合せの使用にさらに関する。

本発明の一態様において、治療抗体は、アデカツムマブ、アレムツズマブ、アマツキシマブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、デノスマブ、エタラシズマブ、ファルレツズマブ、ゲムツズマブ、ラベツズマブ、マパツムマブ、ミンレツモマブ（minretumomab）、ニモツズマブ、ニボルマブ、オレゴボマブ、パニツムマブ、ペムツモマブ（pemtumomab）、ペルツズマブ、ラムシルマブ、シブロツズマブ（sibrotuzumab）、トラスツズマブ、またはボロシキシマブであり、化学療法剤は、ｉ）アルキル化剤、特にナイトロジェンマスタード、たとえばメクロレタミン、クロラムブシル、シクロホスファミド、イホスファミドおよびメルファラン、ニトロソ尿素、たとえばストレプトゾシン、カルムスチンおよびロムスチン、スルホン酸アルキル、たとえばブスルファン、トリアジン、たとえばダカルバジンおよびテモゾロマイド、エチレンイミン、たとえばチオテパおよびアルトレタミン、または白金製剤、たとえばシスプラチン、カルボプラチンおよびオキサリプラチン、ｉｉ）代謝拮抗薬、特に５−フルオロウラシル、６−メルカプトプリン、カペシタビン、シタラビン、フロクスウリジン、フルダラビン、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、メトトレキサートまたはペメトレキセド、ｉｉｉ）抗腫瘍抗生物質、特にダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、アクチノマイシンＤ、ブレオマイシン、マイトマイシンＣまたはミトキサントロン、ｉｖ）トポイソメラーゼ阻害剤、特にトポイソメラーゼＩ阻害剤、たとえばトポテカンおよびイリノテカン、またはトポイソメラーゼＩＩ阻害剤、たとえばエトポシド、テニポシドおよびミトキサントロン、ｖ）分裂抑制因子、特にタクサン、たとえばパクリタキセル、カバジタキセルおよびドセタキセル、エポチロン、たとえばイキサベピロン、ビンカアルカロイド、たとえばビンブラスチン、ビンクリスチンおよびビノレルビン、またはエストラムスチン、ｖｉ）シグナル伝達カスケード阻害剤、特にｍＴＯＲ（ラパマイシンの哺乳動物の標的）阻害剤、たとえばテムシロリムスおよびエベロリムス、またはチロシンキナーゼ阻害剤、たとえばゲフィチニブ、エルロチニブ、イマチニブ、パゾパニブ、セリチニブ、クリゾチニブ、ラパチニブおよびアファチニブ、ｖｉｉ）コルチコステロイド、特にプレドニゾン、メチルプレドニゾロンまたはデキサメタゾン、ｖｉｉｉ）ホルモン治療剤、特にアンドロジェン受容体変調剤、たとえばビカルタミド、エンザルタミドおよびアビラテロン酢酸エステル、抗エストロゲン、たとえばタモキシフェン、またはアロマターゼ阻害もしくはステロイド修飾剤、たとえばアナストロゾール、レトロゾール、フルベストラントおよびエクセメスタン、ｉｘ）ＰＡＲＰ阻害剤、特にオラパリブ、またはｘ）別の化学療法薬、特にＬ−アスパラギナーゼまたはボルテゾミブである。当業者は、先に記述したヒト固形腫瘍および血液悪性腫瘍の治療に使用するのに適切な併用療法の選択に困難はないことになる。

本発明の別の態様において、特にデュオカルマイシン誘導体リンカー薬物を含む抗ＰＳＭＡＡＤＣ化合物の場合、治療抗体は、ベバシズマブ、デノスマブ、ペルツズマブまたはトラスツズマブであり、化学療法剤は、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤、特にミトキサントロン、分裂抑制因子、特にタクサン、とりわけカバジタキセルもしくはドセタキセル、コルチコステロイド、特にプレドニゾン、またはホルモン治療剤、特にアンドロジェン受容体変調剤、とりわけエンザルタミドもしくはアビラテロン酢酸エステルである。

本発明のさらに別の態様において、特にデュオカルマイシン誘導体リンカー薬物を含む抗５Ｔ４ＡＤＣ化合物の場合、治療抗体は、ベバシズマブ、セツキシマブ、ニボルマブもしくはラムシルマブであり、化学療法剤は、アルキル化剤、特に白金製剤、とりわけシスプラチンもしくはカルボプラチン、代謝拮抗薬、特にゲムシタビンもしくはペメトレキセド、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤、特にエトポシド、分裂抑制因子、特にタクサンもしくはビンカアルカロイド、とりわけパクリタキセルもしくはドセタキセル、またはビンブラスチンもしくはビノレルビン、またはシグナル伝達カスケード阻害剤、特にチロシンキナーゼ阻害剤、とりわけエルロチニブ、セリチニブ、クリゾチニブもしくはアファチニブである。

本発明のさらなる態様において、特にデュオカルマイシン誘導体リンカー薬物を含む抗５Ｔ４ＡＤＣ化合物の場合、治療抗体は、ベバシズマブであり、化学療法剤は、アルキル化剤、特にナイトロジェンマスタード、白金製剤もしくはトリアジン、とりわけシクロホスファミド、イホスファミド、シスプラチンもしくはテモゾロマイド、抗腫瘍抗生物質、特にドキソルビシン、代謝拮抗薬、特にゲムシタビン、トポイソメラーゼＩもしくはＩＩ阻害剤、特にトポテカン、イリノテカンもしくはエトポシド、または分裂抑制因子、特にタクサンもしくはビンカアルカロイド、とりわけパクリタキセルもしくはドセタキセル、もしくはビンクリスチンもしくはビノレルビンである。

本発明のなおさらなる態様において、特にデュオカルマイシン誘導体リンカー薬物を含む抗５Ｔ４ＡＤＣ化合物の場合、治療抗体は、アマツキシマブであり、化学療法剤は、アルキル化剤、特に白金製剤、とりわけシスプラチンまたはカルボプラチン、代謝拮抗薬、特にゲムシタビンもしくはペメトレキセド、または分裂抑制因子、特にビンカアルカロイド、とりわけビノレルビンである。

本発明による化合物の治療上有効な量は、約０．０１〜約１５ｍｇ／ｋｇ体重の範囲、特に約０．１〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲、とりわけ約０．３〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲である。この後者の範囲は、ＡＤＣ化合物２０〜８００ｍｇの範囲のフラット用量（flat dose）におよそ対応する。本発明の化合物は、毎週、隔週、３週毎または毎月、たとえば最初の１２週間を毎週次いで疾患が増悪するまで３週間毎に投与してもよい。別の治療計画は、疾患の重症度、患者の年齢、投与されている化合物および主治医により考慮される他のそのような因子に応じて使用されてもよい。

［実施例］
操作されたシステイン（変異体）抗体の一過性発現
１ａ）ｃＤＮＡの調製
重鎖に対するｃＤＮＡ配列は、リーダー配列（配列番号１）、抗ＰＳＭＡ抗体の重鎖可変領域（配列番号２、Ｋａｂａｔナンバリングで４１位にシステイン残基を有する）およびヒトＩｇＧ１重鎖定常領域（配列番号３、連続したナンバリング、アラニン１１８で開始されるＥｕナンバリング）のアミノ酸配列から、その組み合わせたアミノ酸配列を、ヒト細胞（Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ）における発現用に最適化したｃＤＮＡ配列（配列番号４）に逆翻訳することにより得た。

同様に、軽鎖に対するｃＤＮＡ配列は、分泌シグナル（配列番号１）、抗ＰＳＭＡ抗体の軽鎖可変領域（配列番号５、Ｋａｂａｔナンバリング）およびヒトκＩｇ軽鎖定常領域（配列番号６、連続したナンバリング）のアミノ酸配列から、その組み合わせたアミノ酸配列を、ヒト細胞（Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ）における発現用に最適化したｃＤＮＡ配列（配列番号７）に逆翻訳することにより得た。

同様に、抗５Ｔ４抗体Ｈ８−ＨＣ４１の重鎖に対するｃＤＮＡ配列（配列番号１０）は、リーダー配列（配列番号１）、Ｈ８抗体の重鎖可変領域（配列番号８、連続したナンバリング、４１位にシステイン残基を有する）およびヒトＩｇＧ１重鎖定常領域（配列番号９、連続したナンバリング、アラニン１１８で開始されるＥｕナンバリング）のアミノ酸配列から得た。

Ｈ８抗体軽鎖に対するｃＤＮＡ配列（配列番号１２）は、リーダー配列（配列番号１）、Ｈ８抗体の軽鎖可変領域（配列番号１１、Ｋａｂａｔナンバリング）およびヒトκＩｇ軽鎖定常領域（配列番号６、連続したナンバリング）のアミノ酸配列から得た。

ナタリズマブの重鎖に対するｃＤＮＡ配列（配列番号１６）は、リーダー配列（配列番号１３）、ナタリズマブの重鎖可変領域（配列番号１４、Ｋａｂａｔナンバリング）およびヒトＩｇＧ４重鎖定常領域（配列番号１５、連続したナンバリング、アラニン１１８で開始されるＥｕナンバリング；２２５位にプロリン残基および３７５位にシステイン残基を有する）のアミノ酸配列から得た。

ナタリズマブ軽鎖に対するｃＤＮＡ配列（配列番号１９）は、リーダー配列（配列番号１７）、ナタリズマブの軽鎖可変領域（配列番号１８、Ｋａｂａｔナンバリング）およびヒトκＩｇ軽鎖定常領域（配列番号６、連続したナンバリング）のアミノ酸配列から得た。

重鎖および軽鎖ｃＤＮＡ構築物は、商業的供給者（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により化学的に合成され、ならびにそこから入手した。リーダー配列の切断は、ＳｉｇｎａｌＰプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＳｉｇｎａｌＰ／）を使用して予測した切断部位に対応させた。

１ｂ）ベクター構築およびクローニング戦略
抗体鎖の発現用として、哺乳動物発現ベクター００９８を、以下の通りに構築した。ＣＭＶ：ＢＧＨｐＡ発現カセットを、ｐｃＤＮＡ３．１（−）（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）プラスミドから切り出し、同じ起源のベクター（完全なＣＭＶ：ＢＧＨｐＡ発現カセットをまだ含有する）に再挿入し、それによってＣＭＶ：ＢＧＨｐＡ発現カセットを重複させ、単一のプラスミドベクターからＨＣとＬＣの両方のｃＤＮＡの発現を可能にした。その後、ＩＲＥＳ−ＤＨＦＲ断片をベクターｐＯｐｔｉＶＥＣ−ＴＯＰＯ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）から単離し、ＣＭＶ：ＢＧＨｐＡ発現カセットのうち一方のＣＭＶプロモータとＢＧＨｐＡポリアデニル化配列の間に挿入した。

重鎖（ＨＣ）および軽鎖（ＬＣ）に対するｃＤＮＡを、ＳｆｉＩ制限部位を使用してそれぞれｐＭＡ−ＲＱならびにｐＭＡ−Ｔプラスミドベクター（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にライゲーションした。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２に移入し、増殖させた後に、ＬＣｃＤＮＡを、ＡｓｃＩおよびＨｐａＩ制限部位を使用して哺乳動物発現ベクター００９８へ移した。得られたベクターを、ＢａｍＨＩおよびＮｈｅＩ制限酵素で消化し、同じ制限酵素で消化したＨＣｃＤＮＡ断片とライゲーションした。ＨＣとＬＣ発現カセット（それぞれＣＭＶ：ＨＣ：ＢＧＨｐＡおよびＣＭＶ：ＬＣ−ＢＧＨｐＡ）の両方を含有する最終的なベクターを、大腸菌ＮＥＢ５−α細胞（ＮＥＷＥｎｇｌａｎｄ
Ｂｉｏｌａｂｓ）に移し、増やした。

トランスフェクション用の最終的な抗体変異体発現ベクターの大規模産生を、ＭａｘｉまたはＭｅｇａｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して実行した。

２）哺乳動物細胞における一過性発現
市販のＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を製造業者の説明書にしたがってＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅトランスフェクション剤（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、上記１）の下で調製した抗体変異体発現ベクターで以下の通りトランスフェクトした：細胞７５×１０⁷個を、Ｅｘｐｉ２９３発現培地３００ｍＬに播種した；抗体変異体発現ベクター３００μｇを、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅトランスフェクション剤８００μＬと混合し、細胞に添加した。トランスフェクションの１日後に、Ｅｎｈａｎｃｅｒ１１．５ｍＬおよびＥｎｈａｎｃｅｒ２１５ｍＬを培養に添加した。トランスフェクションの６日後に、細胞培養上清を、４，０００ｇで１５分間遠心分離することにより採取し、清澄な採取物をＭＦ７５フィルタ（Ｎａｌｇｅｎｅ）によりろ過した。

３）発現したタンパク質の精製
清澄な採取物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を使用して発現レベルについて最初に確認した。産生が十分であると考えられたので、抗体を、Ａｅｋｔａクロマトグラフィー機器（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、市販のプロテインＡ樹脂（ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅ、ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して精製した。ベッド高２０ｃｍのカラムを、２５ｍｇ／ｍＬ充填樹脂を最大装填量で使用した。そのプロセスは、室温で実行した。

平衡化（ＰＢＳｐＨ７．４）およびローディング後に、精製工程は、２回の洗浄工程（それぞれＰＢＳｐＨ７．４およびＮａＡｃｐＨ５）および溶出工程（２５ｍＭＮａＡｃ、ｐＨ３）を利用し、その後新たなサイクルを開始する前に、それぞれ再生、すすぎおよび清浄工程を続けた。溶出工程の間、標的タンパク質を、吸光度０．０５〜０．１ＡＵ（セル厚み０．２ｃｍ）で始まり、終わるピーク内で採集した。精製後に、タンパク質を−２０℃〜−８０℃で保管した。

４）濃縮およびＡＤＣコンジュゲーション緩衝液への緩衝液交換
プロテインＡ溶出液を、必要に応じて、Ｖｉｖａｓｐｉｎ遠心力装置（５または３０ｋＤａ分画、Ｖｉｖａｐｒｏｄｕｃｔｓ）を使用して２０〜２５ｍｇ／ｍＬに濃縮した。所望の濃度を得た後に、濃縮した溶液（一般に２５ｍｇ／ｍＬ）を、ＰＤ１０カラム（ＧＥ
ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）および４．２ｍＭＬ−ヒスチジン＋５０ｍＭトレハロースｐＨ６．０緩衝液を使用して２回透析した。あるいは、プロテインＡ溶出液濃度がおよそ１０ｍｇ／ｍＬであった場合、濃縮工程を利用せず、溶出液を４．２ｍＭＬ−ヒスチジン＋５０ｍＭトレハロースｐＨ６．０緩衝液に対してｓｎａｋｅｓｋｉｎ透析チューブ（１０ｋＤａ分画、ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して直ちに３回透析した。現れた沈殿物をどれも、透析が完了した後に濾過により除去した。濃度を、Ｎａｎｏｄｒｏｐまたはキュベット紫外線分光光度計（両方ともＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のいずれかを使用して紫外線分光法により測定した。品質分析は、タンパク質が、＞９５％の純度を有し、ＨＰＳＥＣにより決定した通りごく微量の二量体または断片を含有していることを示した。操作されたシステイン変異体の等電点は、野生型と同一であった。

操作されたシステイン（ＶＨ４１Ｃ、Ｋａｂａｔナンバリング）抗ＰＳＭＡ抗体の調製および精製に先に記述したものと同様／同一の手順を使用して、操作されたＨ８−ＨＣ４１（ＶＨ４１Ｃ、Ｋａｂａｔナンバリング）および操作されたシステインナタリズマブ（ＣＨ２２５Ｐ、３７５Ｃ、Ｋａｂａｔナンバリング）抗体、また例の他の抗体を調製し、精製した。

一般的な部位特異的コンジュゲーション手順
システイン操作した抗体（４．２ｍＭヒスチジン、５０ｍＭトレハロース、ｐＨ６中に５〜１０ｍｇ／ｍｌ）の溶液にＥＤＴＡ（水に２５ｍＭ、４％体積／体積）を添加した。
ＴＲＩＳ（水に１Ｍ、ｐＨ８）を使用してｐＨをおよそ７．４に調整し、その後ＴＣＥＰ（水に１０ｍＭ、２０当量）を添加し、得られた混合物を室温で１〜３時間インキュベートした。過剰なＴＣＥＰを、ＰＤ−１０脱塩カラムまたは４．２ｍＭヒスチジン、５０ｍＭトレハロース、ｐＨ６を使用するＶｉｖａｓｐｉｎ遠心濃縮器（３０ｋＤａ分画、ＰＥＳ）のいずれかにより除去した。ＴＲＩＳ（水に１Ｍ、ｐＨ８）を使用して得られた抗体溶液のｐＨをおよそ７．４に上げ、その後デヒドロアスコルビン酸（水中に１０ｍＭ、２０当量）を添加し、得られた混合物を室温で１〜２時間インキュベートした。ＤＭＡ、続いてリンカー薬物溶液（ＤＭＡに１０ｍＭ）を添加した。ＤＭＡの終濃度は、５〜１０％であった。得られた混合物を、遮光下で、室温で１〜１６時間インキュベートした。過剰なリンカー薬物を除去するために、活性炭を添加し、混合物を室温で１時間インキュベートした。炭を０．２μｍＰＥＳフィルタを使用して除去し、得られたＡＤＣを、Ｖｉｖａｓｐｉｎ遠心濃縮器（３０ｋＤａ分画、ＰＥＳ）を使用して４．２ｍＭヒスチジン、５０ｍＭトレハロース、ｐＨ６中に製剤化した。最終的に、ＡＤＣ溶液は、０．２２μｍのＰＥＳフィルタを使用して濾過滅菌した。

部分的に還元された内在性ジスルフィドを介するコンジュゲーションの一般的なコンジュゲーション手順（ｗｔコンジュゲーション）
抗体（４．２ｍＭヒスチジン、５０ｍＭトレハロース、ｐＨ６中に５〜１０ｍｇ／ｍｌ）の溶液に、ＥＤＴＡ（水に２５ｍＭ、４％体積／体積）を添加した。ＴＲＩＳ（水に１Ｍ、ｐＨ８）を使用してｐＨをおよそ７．４に調整し、その後ＴＣＥＰ（水に１０ｍＭ、抗体および所望のＤＡＲに応じて１〜３当量）を添加し、得られた混合物を室温で１〜３時間インキュベートした。ＤＭＡ、続いてリンカー薬物溶液（ＤＭＡに１０ｍＭ）を添加した。ＤＭＡの終濃度は、５〜１０％であった。得られた混合物を、遮光下で、室温で１〜１６時間インキュベートした。過剰なリンカー薬物を除去するために、活性炭を添加し、混合物を室温で１時間インキュベートした。炭を０．２μｍＰＥＳフィルタを使用して除去し、得られたＡＤＣを、Ｖｉｖａｓｐｉｎ遠心濃縮器（３０ｋＤａ分画、ＰＥＳ）を使用して４．２ｍＭヒスチジン、５０ｍＭトレハロース、ｐＨ６中に製剤化した。最終的に、ＡＤＣ溶液は、０．２２μｍのＰＥＳフィルタを使用して濾過滅菌した。

上記の一般的な手順を使用して、ｖｃ−ｓｅｃｏ−ＤＵＢＡ（ＳＹＤ９８０；すなわち、ＷＯ２０１１／１３３０３９の２０９頁の例１０にある化合物１８ｂ、ｎ＝１）、ｖｃ−ＭＭＡＥおよびｍｃ−ＭＭＡＦリンカー薬物に基づいてシステイン操作したおよび野生型のＡＤＣを合成し、分析疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、遮蔽疎水性相クロマトグラフィー（Shielded Hydrophobic Phase Chromatography）（ＳＨＰＣ）、ＲＰ−ＨＰＬＣならびにＬＡＬエンドトキシン−試験を使用して特徴づけた。

分析ＨＩＣの場合、サンプル（１ｍｇ／ｍｌ）５〜１０μＬを、ＴＳＫｇｅｌブチル−ＮＰＲカラム（４．６ｍｍＩＤ×３．５ｃｍＬ、ＴｏｓｏｈＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号１４９４７）に注入した。溶出方法は、緩衝液Ａ（２５ｍＭリン酸ナトリウム、１．５Ｍ硫酸アンモニウム、ｐＨ６．９５）１００％から緩衝液Ｂ（２５ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．９５、２０％イソプロパノール）１００％へ０．４ｍｌ／分で２０分間の直線勾配からなった。ＰＤＡ−検出器およびＥｍｐｏｗｅｒソフトウェアを備えたＷａｔｅｒｓＡｃｑｕｉｔｙＨ−クラスＵＰＬＣシステムを使用した。吸光度を２１４ｎｍで測定し、ＡＤＣの保持時間を決定した。

分析ＨＩＣにより明らかになった通り、ｗｔコンジュゲートと対比してシステインを操作した異なるＡＤＣのＤＡＲ２種について保持時間（ＲＴ）に差異があった（表１、２および３）。最も興味深いことに、Ｆａｂ腔もしくはＦｃ腔の内側の特定の部位（分子モデリングアルゴリズムにより予測した）におけるリンカー薬物のコンジュゲートが、部分的に還元した内在性ジスルフィドを介してコンジュゲートしたＡＤＣと比較して保持時間の（劇的な）減少を引き起こすことから、本発明者らは、ＨＩＣデータに基づいて、リンカー薬物をＦａｂまたはＦｃ腔内の特定の部位にコンジュゲートした操作されたＡＤＣが、ｗｔコンジュゲートより疎水性が低いという結論を導いた。さらにこの効果を定量化するために、用語、相対的疎水性を導入し、それを：
（ＲＴ_DAR2−ＲＴ_DAR0）／（ＲＴ_{DAR2、wt-ADC}−ＲＴ_{DAR0、wt-ADC}）と定義した。本質的には、相対的疎水性は、ＨＩＣデータに基づいてｗｔコンジュゲートした相対物と対比して操作されたＡＤＣの疎水性を容易に比較できるようにする尺度である。データを、表１、２および３に要約した。

表１事前に指定した分析ＨＩＣカラムに対するｖｃ−ｓｅｃｏ−ＤＵＢＡＡＤＣの相対的疎水性：

¹ ランダム−非部位特異的−結合
² ＨＭＷは高分子量種であり、形成された凝集体の量を反映している
³ （ＲＴ_DAR2−ＲＴ_DAR0）／（ＲＴ_{DAR2、wt-ADC}−ＲＴ_{DAR0、wt-ADC}）と定義した、ＲＴは保持時間である
⁴ ＭＳデータに基づく
⁵ ＲＴ、ｗｔＤＡＲ４種＝１２．２
⁶ 外側に向いているシステイン残基にコンジュゲートされたリンカー薬物を持つ比較用ＡＤＣ
⁷ Ｆａｂ腔内にあるシステインの１つおよび外側に向いているシステイン残基の１つにコンジュゲートされたリンカー薬物を持つＡＤＣ；プロセスはまだ最適化されていない
⁸ また、ＩｇＧ４の二量体化を防止するための２２５Ｐ突然変異
表２事前に指定した分析ＨＩＣカラムに対するｖｃ−ＭＭＡＥＡＤＣの相対的疎水性：

¹ ＨＭＷは高分子量種であり、形成された凝集体の量を反映している
² （ＲＴ_DAR2−ＲＴ_DAR0）／（ＲＴ_{DAR2、wt-ADC}−ＲＴ_{DAR0、wt-ADC}）と定義した、ＲＴは保持時間である
³ ＮＤは、決定していない；野生型Ｈ８−ｖｃ−ＭＭＡＥは調製しなかった
表３事前に指定した分析ＨＩＣカラムに対するｍｃ−ＭＭＡＦＡＤＣの相対的疎水性：

¹ ＨＭＷは高分子量種であり、形成された凝集体の量を反映している
² （ＲＴ_DAR2−ＲＴ_DAR0）／（ＲＴ_{DAR2、wt-ADC}−ＲＴ_{DAR0、wt-ADC}）と定義した、ＲＴは保持時間である
細胞結合
抗ＰＳＭＡＡＤＣＳＹＤ９９８（ｗｔ）、ＳＹＤ１０９１（ＨＣ４１）および比較用ＳＹＤ１０３５（ＨＣ１２０）の３つは、ＰＳＭＡ発現ＬＮＣａＰ−Ｃ４．２細胞に対して野生型抗体と類似の等しい結合親和性を有し（ＥＣ₅₀ ０．１〜０．２μｇ／ｍｌの範囲）、３つ全てのＡＤＣが、ＰＳＭＡ−陰性ＤＵ−１４５細胞に結合できなかった（ＥＣ₅₀＞１０μｇ／ｍｌ）。

抗５Ｔ４ＡＤＣＨ８−ｗｔおよびＨ８−ＨＣ４０の２つは、５Ｔ４発現ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞に対して野生型Ｈ８抗体と類似の等しい結合親和性を有し（ＥＣ₅₀ ０．１〜１．２μｇ／ｍｌの範囲）、両方のＡＤＣが５Ｔ４−陰性ＳＫ−ＭＥＬ−３０細胞に結合できなかった（ＥＣ₅₀＞１０μｇ／ｍｌ）。

したがって、ＡＤＣの抗原結合特性は、結合したデュオカルマイシン誘導体リンカー薬物に影響を受けなかった。

ｉｎｖｉｔｒｏ細胞毒性
ＰＳＭＡ発現ＬＮＣａＰ−Ｃ４．２細胞に対する部位特異的にコンジュゲートされている抗ＰＳＭＡＡＤＣの効力は、従来通り連結した野生型ＡＤＣ（ＳＹＤ９９８）と類似していた（ＩＣ₅₀ ０．１〜０．５ｎＭの範囲、薬物当量に基づく、下記表４を参照のこと）。全てのＡＤＣがＰＳＭＡ−陰性ＤＵ−１４５細胞に対して不活性だった（ＩＣ₅₀＞７０ｎＭ）ことは、ＰＳＭＡによる腫瘍細胞の選択的致死を示した。

結合しない２つの対照ＡＤＣは、評価した細胞系のそれぞれに対して抗ＰＳＭＡＡＤＣより少なくとも５０倍弱かった。

表４ＰＳＭＡを発現しているヒト腫瘍細胞における抗ＰＳＭＡ−ｖｃ−ｓｅｃｏ−ＤＵＢＡＡＤＣのｉｎｖｉｔｒｏ細胞毒性

¹ ９５％ＣＩは、９５％信頼区間である
² パーセンテージ効力は、試験した最高濃度（およそ１００ｎＭ）で得られ、各薬物またはＡＤＣに対して測定した発光を無処理細胞（増殖培地だけ）の総平均値（average mean）で割り１００を掛けることにより算出した。

抗ＰＳＭＡ抗体上のＨＣ４１、ＬＣ４０およびＬＣ４１位へのｖｃ−ＭＭＡＥのコンジュゲーションは、ＰＳＭＡ陽性ＬＮＣａＰ−Ｃ４．２細胞においてこれらのシステイン部位に連結した抗ＰＳＭＡ−ｖｃ−ｓｅｃｏ−ＤＵＢＡと類似の細胞毒性効力をもたらした（表４および５）。抗ＰＳＭＡ−ｖｃ−ＭＭＡＥＡＤＣは、ＰＳＭＡ陰性ＤＵ−１４５細胞に対する活性を欠いた（ＩＣ₅₀＞７０ｎＭ）。

表５ＰＳＭＡを発現しているヒト腫瘍細胞における抗ＰＳＭＡ−ｖｃ−ＭＭＡＥＡＤＣのｉｎｖｉｔｒｏ細胞毒性

５Ｔ４発現ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞に対する操作した抗５Ｔ４ＡＤＣの効力は、従来通り連結したＡＤＣＨ８−ｗｔと等しかった（ＩＣ₅₀ ０．０７〜０．０９ｎＭ、表６）。抗５Ｔ４ＡＤＣは、５Ｔ４−陰性ＳＫ−ＭＥＬ−３０細胞に対して不活性であった（ＩＣ₅₀＞９０ｎＭ）。

表６５Ｔ４を発現しているヒト腫瘍細胞における抗５Ｔ４−ｖｃ−ｓｅｃｏ−ＤＵＢＡＡＤＣのｉｎｖｉｔｒｏ細胞毒性

これらのデータを合わせると、部位特異的コンジュゲーションについて試験したシステイン位置が、２つの異なるリンカー薬物を含むＡＤＣの腫瘍細胞致死効力に影響しなかったことが示される。さらに、異なる抗体のＦａｂ部分の可変領域におけるリンカー薬物の部位特異的連結が、一般に適用できる。

カテプシンＢによる酵素的切断
ｖｃ−ｓｅｃｏ−ＤＵＢＡ（ＳＹＤ９８０）およびｖｃ−ＭＭＡＥを持つＡＤＣのリンカーに存在するバリン−シトルリン部分は、システインプロテアーゼ、たとえばカテプシンＢにより切断することができ、その切断により、（ｓｅｃｏ−）ＤＵＢＡまたはＭＭＡＥ薬物は、腫瘍リソソーム内部で細胞内にもしくは細胞外の腫瘍微小環境にその後放出される。カテプシンＢに対する感受性を評価するために、ＡＤＣを活性化カテプシンＢ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）で２分および４時間処理した。抗ＰＳＭＡＡＤＣから放出された薬物の細胞毒性活性を、ＰＳＭＡ−陰性ＤＵ−１４５細胞において測定した。抗５Ｔ４ＡＤＣから放出された薬物の細胞毒性活性を、５Ｔ４−陰性ＳＫ−ＭＥＬ−３０細胞において測定した。３７℃でのプレインキュベーション工程の間に、１ｍｇ／ｍｌの各ＡＤＣを、４ｍＭＤＴＴを含有する０．１Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ５中の５μｇ／ｍｌカテプシンＢと混合した（０．０４単位／ウェル）。対照として、１ｍｇ／ｍｌの各ＡＤＣを、培地（ＲＰＭＩ１６４０、１０％検定済みＦＢＳ）に直接希釈した。段階希釈を、これらのＡＤＣ溶液から培地に作製した。それぞれの遊離毒素ＤＵＢＡまたはＭＭＡＥの放出を測定するために、ＰＳＭＡ−陰性ＤＵ−１４５細胞（１，０００個細胞／ウェル）および５Ｔ４−陰性ＳＫ−ＭＥＬ−３０細胞（２，０００個細胞／ウェル）をＡＤＣと６日間培養し、６日後に細胞生存率を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（商標）（ＣＴＧ）アッセイキットを使用して測定した。

ＰＳＭＡ−陰性ＤＵ−１４５細胞および５Ｔ４−陰性ＳＫ−ＭＥＬ−３０細胞に対する放出された薬物の効力の差異は、ＡＤＣから切断される薬物の量、それによるカテプシンＢに対するバリン−シトルリン切断部位の近接性を反映する。表７に示す通り、活性化カテプシンＢに４時間曝露した後、タンパク質分解性切断に対する感受性は、ＡＤＣの間で異なった（ＩＣ₅₀値を参照のこと）、一方ＡＤＣのいずれも、カテプシンＢによる２分間の短時間の曝露後に切断されなかった（ＩＣ₅₀＞１０ｎＭ、表においてデータ不掲載）。

これらのデータを合わせると、コンジュゲーションの部位は、酵素的切断に対するリンカー薬物の近接性に影響を及ぼし、抗ＰＳＭＡＡＤＣＡＤＣ−ＨＣ４１、ＡＤＣ−ＨＣ１５２、ＡＤＣ−ＨＣ３３９、ＡＤＣ−ＨＣ３７５、ＡＤＣ−ＬＣ４１およびＡＤＣ−ＬＣ１６５におけるｖｃ−ｓｅｃｏ−ＤＵＢＡ（ＳＹＤ９８０）リンカー薬物が、前記酵素による切断から最も保護されていることが示される。抗ＰＳＭＡ抗体のＨＣ４１およびＬＣ４１位置に対するｖｃ−ＭＭＡＥのコンジュゲーションにより、バリン−シトルリン切断部位と類似の保護が得られた（表７）。類似の傾向が、同じＨＣ４１位を介してｖｃ−ｓｅｃｏ−ＤＵＢＡ（ＳＹＤ９８０）にコンジュゲートした抗５Ｔ４抗体Ｈ８−ＨＣ４１に対しても見られた。

これらのデータは共に、特に４１Ｃ位が、様々な抗体に対するリンカー−薬物の部位特異的コンジュゲーションに適する位置であることを示す。

表７カテプシンＢにより切断された遊離薬物の細胞毒性

^* ＬＮＣａＰ−Ｃ４．２を、５Ｔ４−陰性細胞系として使用した。

腫瘍異種移植動物モデル
３つの抗ＰＳＭＡＡＤＣのｉｎｖｉｖｏ効力を、ＬＮＣａＰＣ４−２前立腺癌異種移植モデルにおいて評価した。ＬｎＣａＰ−Ｃ４．２細胞系は、親であるアンドロゲン依存的ＬｎＣａＰ−ＦＧＣ異種移植細胞系の去勢誘導再発および再燃後のマウスにおいて連続的に増殖した異種移植から得られるヒト前立腺癌腫上皮細胞系である。

腫瘍を、雄のＣＢ１７−ＳＣＩＤマウスの右の側腹部にマトリゲル（５０：５０、体積：体積）を含有するＲＰＭＩ１６４０２００μＬ中のＬｎＣａｐＣ４．２細胞１×１０⁷個を注射することにより皮下誘導した。ＬｎＣａＰ−Ｃ４．２腫瘍細胞移植は、γ−線源（１．４４Ｇｙ、⁶⁰Ｃｏ、ＢｉｏＭｅｐ、Ｂｒｅｔｅｎｉｅｒｅｓ、フランス）による全身照射の２４〜７２時間後に実行した。腫瘍が、平均体積１００〜２００ｍｍ³に達したら、治療を開始した。マウスを、個々の腫瘍体積によって群にランダム化し、尾静脈に抗ＰＳＭＡＡＤＣ（２または１０ｍｇ／ｋｇ）または媒体の単回静脈注射を投与した。腫瘍体積（図２）および体重（図３）の変化を、監視した。３つ全てのＡＤＣが、およそ１．８の平均ＤＡＲを有した。

図２Ａは、２ｍｇ／ｋｇにおいて、比較用の操作されたシステイン抗ＰＳＭＡＡＤＣ
ＳＹＤ１０３５が、天然の操作されていないシステインＳＹＤ９９８と比較して活性が低いことを実証している。しかしながら、本発明による操作されたシステインＡＤＣであるＳＹＤ１０９１の効力は、比較用のＳＹＤ１０３５より有意に優れており、天然の操作されていないＳＹＤ９９８より優れていた。図２Ｂに示す通り比較用ＳＹＤ１０３５とＳＹＤ１０９１間の差異は、１０ｍｇ／ｋｇにおいてなお一層顕著であった。図３に例示した通り、ＬｎＣａｐＣ４．２腫瘍を持つマウスは悪液質を発症する。この体重の減少は、有効な治療の投与後にしばしば回復し、高感度の効力バイオマーカと考えられる。ＳＹＤ１０９１による治療は、比較用のＳＹＤ１０３５または天然の操作されていないＳＹＤ９９８で見られるより非常に速く体重を回復させた（図３）。

２つの抗５Ｔ４ＡＤＣ、すなわち天然のＨ８−ｖｃ−ｓｅｃｏ−ＤＵＢＡ（平均ＤＡＲ２．０）および操作されたシステイン（ＶＨＰ４１Ｃ）ＡＤＣＨ８−４１Ｃ−ｖｃ−ｓｅｃｏ−ＤＵＢＡ（平均ＤＡＲ１．７）のｉｎｖｉｖｏ効力を、ＰＡ−１卵巣癌異種移植モデルにおいて評価した。ＰＡ−１細胞系は、卵巣癌腫の女性から採集した腹水液から取った細胞から樹立された（ＺｅｕｔｈｅｎＪ．ｅｔａｌ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ１９８０；２５（１）：１９−３２）。

ＰＡ−１腫瘍を、雌のＢａｌｂ／ｃヌードマウスの右側腹部にマトリゲル（５０／５０、体積／体積）を含有するＲＰＭＩ１６４０培地１００μＬ中の細胞１×１０⁷個を注射することにより皮下誘導した。ＰＡ−１腫瘍細胞注射は、γ−線源（２Ｇｙ、⁶⁰Ｃｏ、ＢｉｏＭｅｐ、Ｂｒｅｔｅｎｉｅｒｅｓ、フランス）による全身照射の２４〜７２時間後に実行した。腫瘍が、平均体積２００〜３００ｍｍ³に達したら、治療を開始した。マウスを、個々の腫瘍体積によって群にランダム化し、尾静脈に抗５Ｔ４ＡＤＣ（３または１０ｍｇ／ｋｇ）または媒体の単回静脈注射を投与し、腫瘍体積の変化を監視した（図４Ａおよび４Ｂ）。両方のバリアントは、より高い用量１０ｍｇ／ｋｇにおいて類似の効力を有した（図４Ｂ）が、３ｍｇ／ｋｇにおいて天然の操作されていない抗５Ｔ４ＡＤＣ、Ｈ８−ｖｃ−ｓｅｃｏ−ＤＵＢＡ（図４Ａ）と比較した場合、操作されたシステイン抗５Ｔ４ＡＤＣＨ８−４１Ｃ−ｖｃ−ｓｅｃｏ−ＤＵＢＡは、明らかにより活性であった。

これらの所見を合わせると、ｉｎｖｉｖｏで、本発明による部位特異的に操作されたシステインＡＤＣは、マウス腫瘍モデルにおいて効力に関して好ましい特性を示すことが実証された。
配列番号１（ＨＡＶＴ２０リーダー配列）
1 MACPGFLWAL VISTCLEFSM A
配列番号２（抗ＰＳＭＡ抗体ＨＣＳ４１Ｃ）
1 EVQLVQSGAE VKKPGASVKI SCKTSGYTFT EYTIHWVKQA CGKGLEWIGN
51 INPNNGGTTY NQKFEDRATL TVDKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCAAGW
101 NFDYWGQGTT VTVSS
配列番号３（ヒトＩｇＧ１抗体ＨＣ定常領域）
1 ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV
51 HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKKVEP
101 KSCDKTHTCP PCPAPELLGG PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS
151 HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK
201 EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSRDE LTKNQVSLTC
251 LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW
301 QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPGK
配列番号４（抗ＰＳＭＡ抗体ＨＣＳ４１ＣｃＤＮＡ）
1 ATGGCCTGTC CTGGATTTCT GTGGGCCCTC GTGATCAGCA CCTGTCTGGA ATTCAGCATG
61 GCCGAGGTGC AGCTGGTGCA GTCTGGCGCC GAAGTGAAGA AACCAGGCGC CAGCGTGAAG
121 ATCAGCTGCA AGACCAGCGG CTACACCTTC ACCGAGTACA CCATCCACTG GGTCAAGCAG
181 GCCTGTGGCA AGGGCCTGGA ATGGATCGGC AACATCAACC CCAACAACGG CGGCACCACC
241 TACAACCAGA AGTTCGAGGA CCGGGCCACC CTGACCGTGG ACAAGAGCAC AAGCACCGCC
301 TACATGGAAC TGAGCAGCCT GCGGAGCGAG GACACCGCCG TGTACTATTG TGCCGCCGGA
361 TGGAACTTCG ACTACTGGGG CCAGGGCACC ACCGTGACAG TGTCTAGCGC CAGCACAAAG
421 GGCCCCAGCG TGTTCCCTCT GGCCCCTAGC AGCAAGTCTA CCTCTGGCGG AACAGCCGCC
481 CTGGGCTGCC TCGTGAAGGA CTACTTTCCC GAGCCCGTGA CCGTGTCCTG GAACTCTGGC
541 GCTCTGACAA GCGGCGTGCA CACCTTTCCA GCCGTGCTGC AGAGCAGCGG CCTGTACTCT
601 CTGAGCAGCG TCGTGACTGT GCCCAGCAGC AGCCTGGGCA CCCAGACCTA CATCTGCAAC
661 GTGAACCACA AGCCCAGCAA CACCAAGGTG GACAAAAAGG TGGAACCCAA GAGCTGCGAC
721 AAGACCCACA CCTGTCCCCC TTGTCCTGCC CCTGAACTGC TGGGCGGACC TTCCGTGTTC
781 CTGTTCCCCC CAAAGCCCAA GGACACCCTG ATGATCAGCC GGACCCCCGA AGTGACCTGC
841 GTGGTGGTGG ATGTGTCCCA CGAGGACCCT GAAGTGAAGT TCAATTGGTA CGTGGACGGC
901 GTGGAAGTGC ACAACGCCAA GACCAAGCCC AGAGAGGAAC AGTACAACAG CACCTACCGG
961 GTGGTGTCCG TGCTGACAGT GCTGCACCAG GACTGGCTGA ACGGCAAAGA GTACAAGTGC
1021 AAGGTGTCCA ACAAGGCCCT GCCTGCCCCC ATCGAGAAAA CCATCAGCAA GGCCAAGGGC
1081 CAGCCCCGCG AACCCCAGGT GTACACACTG CCTCCCAGCA GGGACGAGCT GACCAAGAAC
1141 CAGGTGTCCC TGACATGCCT CGTGAAAGGC TTCTACCCCT CCGATATCGC CGTGGAATGG
1201 GAGAGCAACG GCCAGCCCGA GAACAACTAC AAGACCACCC CCCCTGTGCT GGACAGCGAC
1261 GGCTCATTCT TCCTGTACAG CAAGCTGACT GTGGATAAGT CCCGGTGGCA GCAGGGCAAC
1321 GTGTTCAGCT GCAGCGTGAT GCACGAGGCC CTGCACAACC ACTACACCCA GAAAAGCCTG
1381 TCCCTGAGCC CCGGCAAG
配列番号５（抗ＰＳＭＡ抗体ＬＣ）
1 DIVMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKASQDVG TAVDWYQQKP GKAPKLLIYW
51 ASTRHTGVPD RFTGSGSGTD FTLTISSLQP EDFADYFCQQ YNSYPLTFGG
101 GTKLEIK
配列番号６（ヒトＩｇＧ抗体ＬＣκ定常領域）
1 RTVAAPSVFI FPPSDEQLKS GTASVVCLLN NFYPREAKVQ WKVDNALQSG
51 NSQESVTEQD SKDSTYSLSS TLTLSKADYE KHKVYACEVT HQGLSSPVTK
101 SFNRGEC
配列番号７（抗ＰＳＭＡ抗体ＬＣｃＤＮＡ）
1 ATGGCTTGTC CTGGATTTCT GTGGGCCCTC GTGATCAGCA CCTGTCTGGA ATTCAGCATG
61 GCCGACATCG TGATGACCCA GAGCCCCAGC TCTCTGAGCG CCAGCGTGGG CGACAGAGTG
121 ACCATCACAT GCAAGGCCAG CCAGGACGTG GGCACCGCCG TGGATTGGTA TCAGCAGAAG
181 CCTGGCAAGG CCCCCAAGCT GCTGATCTAC TGGGCCAGCA CCAGACACAC CGGCGTGCCC
241 GATAGATTCA CAGGCAGCGG CTCCGGCACC GACTTCACCC TGACAATCAG CAGCCTGCAG
301 CCCGAGGACT TCGCCGACTA CTTCTGCCAG CAGTACAACA GCTACCCCCT GACCTTCGGC
361 GGAGGCACCA AGCTGGAAAT CAAGCGGACA GTGGCCGCTC CCAGCGTGTT CATCTTCCCA
421 CCTAGCGACG AGCAGCTGAA GTCTGGCACC GCCTCTGTCG TGTGCCTGCT GAACAACTTC
481 TACCCCCGCG AGGCCAAGGT GCAGTGGAAG GTGGACAATG CCCTGCAGAG CGGCAACAGC
541 CAGGAAAGCG TGACCGAGCA GGACAGCAAG GACTCCACCT ACAGCCTGAG CAGCACCCTG
601 ACCCTGAGCA AGGCCGACTA CGAGAAGCAC AAGGTGTACG CCTGCGAAGT GACCCACCAG
661 GGCCTGTCTA GCCCCGTGAC CAAGAGCTTC AACCGGGGCG AGTGC
配列番号８（Ｈ８ＨＣＰ４１Ｃ）
1 QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYSFT GYYMHWVKQS CGQGLEWIGR
51 INPNNGVTLY NQKFKDRVTM TRDTSISTAY MELSRLRSDD TAVYYCARST
101 MITNYVMDYW GQGTLVTVSS
配列番号９（ヒトＩｇＧ１抗体ＨＣ定常領域）
1 ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV
51 HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKKVEP
101 KSCDKTHTCP PCPAPELLGG PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS
151 HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK
201 EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSREE MTKNQVSLTC
251 LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW
301 QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPGK
配列番号１０（Ｈ８ＨＣＰ４１ＣｃＤＮＡ）
1 ATGGCCTGTC CTGGATTTCT GTGGGCCCTC GTGATCAGCA CCTGTCTGGA ATTCAGCATG
61 GCCCAGGTGC AGCTGGTGCA GTCTGGCGCC GAAGTGAAGA AACCAGGCGC CAGCGTGAAG
121 GTGTCCTGCA AGGCCAGCGG CTACAGCTTC ACCGGCTACT ACATGCACTG GGTCAAGCAG
181 AGCTGCGGCC AGGGCCTGGA ATGGATCGGC AGAATCAACC CCAACAACGG CGTGACCCTG
241 TACAACCAGA AATTCAAGGA CCGCGTGACC ATGACCCGGG ACACCAGCAT CAGCACCGCC
301 TACATGGAAC TGAGCCGGCT GAGAAGCGAC GACACCGCCG TGTACTACTG CGCCCGGTCC
361 ACCATGATCA CCAACTACGT GATGGACTAC TGGGGCCAGG GCACCCTCGT GACAGTGTCT
421 AGCGCCAGCA CAAAGGGCCC CAGCGTGTTC CCTCTGGCCC CTAGCAGCAA GAGCACATCT
481 GGCGGAACAG CCGCCCTGGG CTGCCTCGTG AAGGATTACT TCCCCGAGCC CGTGACCGTG
541 TCCTGGAATA GCGGAGCCCT GACAAGCGGC GTGCACACCT TTCCAGCCGT GCTGCAGAGC
601 AGCGGCCTGT ACTCTCTGAG CAGCGTCGTG ACTGTGCCCA GCAGCAGCCT GGGCACCCAG
661 ACCTACATCT GCAACGTGAA CCACAAGCCC AGCAACACCA AGGTGGACAA GAAGGTGGAA
721 CCCAAGAGCT GCGACAAGAC CCACACCTGT CCCCCTTGTC CTGCCCCTGA ACTGCTGGGC
781 GGACCTTCCG TGTTCCTGTT CCCCCCAAAG CCCAAGGACA CCCTGATGAT CAGCCGGACC
841 CCCGAAGTGA CCTGCGTGGT GGTGGATGTG TCCCACGAGG ACCCTGAAGT GAAGTTCAAT
901 TGGTACGTGG ACGGCGTGGA AGTGCACAAC GCCAAGACCA AGCCCAGAGA GGAACAGTAC
961 AACAGCACCT ACCGGGTGGT GTCCGTGCTG ACAGTGCTGC ACCAGGACTG GCTGAACGGC
1021 AAAGAGTACA AGTGCAAGGT GTCCAACAAA GCCCTGCCTG CCCCCATCGA GAAAACCATC
1081 AGCAAGGCCA AGGGCCAGCC CCGCGAACCC CAGGTGTACA CACTGCCTCC CAGCCGGGAA
1141 GAGATGACCA AGAACCAGGT GTCCCTGACA TGCCTCGTGA AAGGCTTCTA CCCCTCCGAT
1201 ATCGCCGTGG AATGGGAGAG CAACGGCCAG CCCGAGAACA ACTACAAGAC CACCCCCCCT
1261 GTGCTGGACA GCGACGGCTC ATTCTTCCTG TACAGCAAGC TGACCGTGGA CAAGTCCCGG
1321 TGGCAGCAGG GCAACGTGTT CAGCTGCAGC GTGATGCACG AGGCCCTGCA CAACCACTAC
1381 ACCCAGAAGT CCCTGAGCCT GAGCCCCGGC AAA
配列番号１１（Ｈ８ＬＣ）
1 DIVMTQSPDS LAVSLGERAT INCKASQSVS NDVAWYQQKP GQSPKLLISY
51 TSSRYAGVPD RFSGSGSGTD FTLTISSLQA EDVAVYFCQQ DYNSPPTFGG
101 GTKLEIK
配列番号１２（Ｈ８ＬＣｃＤＮＡ）
1 ATGGCCTGTC CTGGATTTCT GTGGGCCCTC GTGATCAGCA CCTGTCTGGA ATTCAGCATG
61 GCCGACATCG TGATGACCCA GAGCCCCGAT AGCCTGGCCG TGTCTCTGGG AGAGAGAGCC
121 ACCATCAACT GCAAGGCCAG CCAGAGCGTG TCCAACGACG TGGCCTGGTA TCAGCAGAAG
181 CCCGGCCAGA GCCCTAAGCT GCTGATCTCC TACACCAGCA GCAGATATGC CGGCGTGCCC
241 GACAGATTTT CCGGCAGCGG CTCTGGCACC GACTTCACCC TGACAATCAG CTCCCTGCAG
301 GCCGAGGACG TGGCCGTGTA CTTCTGTCAG CAAGACTACA ACAGCCCCCC CACCTTCGGC
361 GGAGGCACCA AGCTGGAAAT CAAGCGGACA GTGGCCGCTC CCAGCGTGTT CATCTTCCCA
421 CCTAGCGACG AGCAGCTGAA GTCCGGCACA GCCTCTGTCG TGTGCCTGCT GAACAACTTC
481 TACCCCCGCG AGGCCAAGGT GCAGTGGAAG GTGGACAATG CCCTGCAGAG CGGCAACAGC
541 CAGGAAAGCG TGACCGAGCA GGACAGCAAG GACTCCACCT ACAGCCTGAG CAGCACCCTG
601 ACCCTGAGCA AGGCCGACTA CGAGAAGCAC AAGGTGTACG CCTGCGAAGT GACCCACCAG
661 GGACTGAGCA GCCCTGTGAC CAAGAGCTTC AACCGGGGCG AGTGC
配列番号１３（生殖細胞系リーダー配列）
1 MDWTWRILFL VAAATGAHS
配列番号１４（ナタリズマブＨＣ）
1 QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGFNIK DTYIHWVRQA PGQRLEWMGR
51 IDPANGYTKY DPKFQGRVTI TADTSASTAY MELSSLRSED TAVYYCAREG
101 YYGNYGVYAM DYWGQGTLVT VSS
配列番号１５（ナタリズマブＨＣＳ２２５Ｐ、Ｓ３７５Ｃ）
1 ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV
51 HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTKT YTCNVDHKPS NTKVDKRVES
101 KYGPPCPPCP APEFLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSQED
151 PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK
201 CKVSNKGLPS SIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSQEEMTK NQVSLTCLVK
251 GFYPCDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSRL TVDKSRWQEG
301 NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSLGK
配列番号１６（ナタリズマブＨＣＳ２２５Ｐ、Ｓ３７５ＣｃＤＮＡ）
1 ATGGACTGGA CCTGGCGCAT CCTGTTTCTG GTGGCCGCTG CTACCGGCGC TCACTCCCAG
61 GTGCAGCTGG TGCAGTCTGG CGCCGAAGTG AAGAAACCTG GCGCCTCCGT GAAGGTGTCC
121 TGCAAGGCCT CCGGCTTCAA CATCAAGGAC ACCTACATCC ACTGGGTCCG ACAGGCCCCT
181 GGACAGCGGC TGGAATGGAT GGGCAGAATC GACCCCGCCA ACGGCTACAC TAAGTACGAC
241 CCCAAGTTCC AGGGCAGAGT GACCATCACC GCCGACACCT CCGCCTCCAC AGCCTACATG
301 GAACTGTCCT CCCTGCGGAG CGAGGACACC GCCGTGTACT ACTGCGCCAG AGAGGGCTAC
361 TACGGCAACT ACGGCGTGTA CGCCATGGAC TACTGGGGCC AGGGCACCCT GGTCACCGTG
421 TCCTCCGCTT CCACCAAGGG CCCCTCCGTG TTCCCTCTGG CCCCTTGCTC CCGGTCCACC
481 TCCGAGTCTA CCGCCGCTCT GGGCTGCCTG GTCAAGGACT ACTTCCCCGA GCCCGTGACC
541 GTGTCCTGGA ACTCTGGCGC CCTGACCTCT GGCGTGCACA CCTTCCCTGC TGTGCTGCAG
601 TCCTCCGGCC TGTACTCCCT GTCCTCCGTC GTGACCGTGC CCTCCAGCTC CCTGGGCACC
661 AAGACCTACA CCTGTAACGT GGACCACAAG CCCTCCAACA CCAAGGTGGA CAAGCGGGTG
721 GAATCTAAGT ACGGCCCTCC CTGCCCCCCC TGCCCTGCCC CTGAATTTCT GGGCGGACCT
781 TCCGTGTTCC TGTTCCCCCC AAAGCCCAAG GACACCCTGA TGATCTCCCG GACCCCCGAA
841 GTGACCTGCG TGGTGGTGGA CGTGTCCCAG GAAGATCCCG AGGTCCAGTT CAATTGGTAC
901 GTGGACGGCG TGGAAGTGCA CAACGCCAAG ACCAAGCCCA GAGAGGAACA GTTCAACTCC
961 ACCTACCGGG TGGTGTCCGT GCTGACCGTG CTGCACCAGG ACTGGCTGAA CGGCAAAGAG
1021 TACAAGTGCA AGGTGTCCAA CAAGGGCCTG CCCAGCTCCA TCGAAAAGAC CATCTCCAAG
1081 GCCAAGGGAC AGCCTCGCGA GCCCCAGGTG TACACCCTGC CTCCAAGCCA GGAAGAGATG
1141 ACCAAGAACC AGGTGTCCCT GACCTGTCTG GTCAAGGGCT TCTACCCCTG CGATATCGCC
1201 GTGGAATGGG AGTCCAACGG CCAGCCCGAG AACAACTACA AGACCACCCC CCCTGTGCTG
1261 GACTCCGACG GCTCCTTCTT CCTGTACTCT CGGCTGACCG TGGACAAGTC CCGGTGGCAG
1321 GAAGGCAACG TCTTCTCCTG CTCCGTGATG CACGAGGCCC TGCACAACCA CTACACCCAG
1381 AAGTCCCTGT CCCTGAGCCT GGGCAAG
配列番号１７（生殖細胞系リーダー配列）
1 MDMRVPAQLL GLLLLWLRGA RC
配列番号１８（ナタリズマブＬＣ）
1 DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKTSQDIN KYMAWYQQTP GKAPRLLIHY
51 TSALQPGIPS RFSGSGSGRD YTFTISSLQP EDIATYYCLQ YDNLWTFGQG
101 TKVEIK
配列番号１９（ナタリズマブＬＣｃＤＮＡ）
1 ATGGACATGA GAGTGCCCGC CCAGCTGCTG GGACTGCTGC TGCTGTGGCT GAGAGGCGCC
61 AGATGCGACA TCCAGATGAC CCAGTCCCCC TCCAGCCTGT CCGCCTCCGT GGGCGACAGA
121 GTGACCATCA CATGCAAGAC CTCCCAGGAC ATCAACAAGT ACATGGCCTG GTATCAGCAG
181 ACCCCCGGCA AGGCCCCTCG GCTGCTGATC CACTACACCT CCGCTCTGCA GCCTGGCATC
241 CCCTCCAGAT TCTCCGGCTC CGGCTCTGGC CGGGACTATA CCTTCACCAT CTCCAGTCTG
301 CAGCCCGAGG ATATCGCCAC CTACTACTGC CTGCAGTACG ACAACCTGTG GACCTTCGGC
361 CAGGGCACCA AGGTGGAAAT CAAGCGGACC GTGGCCGCTC CCTCCGTGTT CATCTTCCCA
421 CCCTCCGACG AGCAGCTGAA GTCCGGCACC GCCTCCGTCG TGTGCCTGCT GAACAACTTC
481 TACCCCCGCG AGGCCAAGGT GCAGTGGAAG GTGGACAACG CCCTGCAGTC CGGCAACTCC
541 CAGGAATCCG TCACCGAGCA GGACTCCAAG GACAGCACCT ACTCCCTGTC TCCACCCTG
601 ACCCTGTCCA AGGCCGACTA CGAGAAGCAC AAGGTGTACG CCTGCGAAGT GACCCACCAG
661 GGCCTGTCCA GCCCCGTGAC CAAGTCCTTC AACCGGGGCG AGTGC
以下に、当初の特許請求の範囲に記載していた発明を付記する。
［１］
リンカー薬物が、重鎖４０、４１および８９（Ｋａｂａｔナンバリングによる）；ならびに軽鎖４０および４１（Ｋａｂａｔナンバリングによる）から選択される抗体の１つ以上の位置で操作されたシステインを介して前記抗体に部位特異的にコンジュゲートされている抗体−薬物コンジュゲート化合物。
［２］
前記操作されたシステインが、前記抗体のＦａｂ部分にある重鎖４０および４１ならびに軽鎖４０および４１から選択される前記抗体の１つ以上の位置にある、［１］に記載の化合物。
［３］
前記抗体のＦｃ部分にある３７５位（Ｅｕナンバリングによる）に操作されたシステインをさらに含む、［１］または［２］に記載の化合物。
［４］
前記リンカー薬物がデュオカルマイシン誘導体を含む、［１］から［３］のいずれか一に記載の化合物。
［５］
リンカー薬物が、重鎖４０、４１および８９（Ｋａｂａｔナンバリングによる）；重鎖１５２、１５３、１５５、１７１、２４７、２９７、３３９、３７５および３７６（Ｅｕナンバリングによる）；ならびに軽鎖４０、４１、１６５および１６８（Ｋａｂａｔナンバリングによる）から選択される前記抗体の１つ以上の位置で操作されたシステインを介して抗体またはその抗原結合断片に部位特異的にコンジュゲートされており、前記リンカー薬物が、デュオカルマイシン誘導体を含む抗体−薬物コンジュゲート化合物。
［６］
式（Ｉ）の［１］から［５］のいずれか一に記載の化合物であって

ｎが、０〜３であり、
ｍが、１〜６の平均ＤＡＲを表し、
Ｒ ¹ が、

から選択され、
ｙが、１〜１６であり、
Ｒ ² が、

から選択される、化合物。
［７］
ｎが、０〜１であり、
ｍが１．５〜２の平均ＤＡＲを表し、
Ｒ ¹ が、

であり、
ｙが、１〜４であり、
Ｒ ² が、

から選択される、［６］に記載の化合物。
［８］
式（ＩＩ）の［１］から［７］のいずれか一に記載の化合物。

［９］
前記抗体が、腫瘍細胞の細胞膜内または上において発現される抗原標的に結合し、前記抗体が、前記標的に結合後に細胞により内部移行される、［１］から［８］のいずれか一に記載の化合物。
［１０］
前記抗体が、抗アネキシンＡ１抗体、抗ＣＤ１１５抗体、抗ＣＤ１２３抗体、抗ＣＬＬ−１抗体、抗ｃ−ＭＥＴ抗体、抗ＭＵＣ１抗体、抗ＰＳＭＡ抗体、抗５Ｔ４抗体または抗ＴＦ抗体である、［１］から［９］のいずれか一に記載の化合物。
［１１］
前記抗体が、抗ＰＳＭＡモノクローナル抗体または抗５Ｔ４モノクローナル抗体である、［１］から［１０］のいずれか一に記載の化合物。
［１２］
前記リンカー薬物が、前記抗ＰＳＭＡ抗体の重鎖可変領域の４１位にコンジュゲートされ、好ましくは前記抗ＰＳＭＡ抗体の重鎖が配列番号２のアミノ酸配列を含み、前記抗ＰＳＭＡ抗体の軽鎖が配列番号５のアミノ酸配列を含む、［１１］に記載の化合物。
［１３］
前記リンカー薬物が、前記抗５Ｔ４抗体の重鎖可変領域の４１位でコンジュゲートされ、好ましくは前記抗５Ｔ４抗体の重鎖が、配列番号８のアミノ酸配列を含み、前記抗５Ｔ４抗体の軽鎖が、配列番号１１のアミノ酸配列を含む、［１１］に記載の化合物。
［１４］
［１］から［１３］のいずれか一に記載の化合物および１つ以上の薬学的に許容できる賦形剤を含み、好ましくは凍結乾燥された粉末の形態である医薬組成物。
［１５］
薬剤として使用するための、［１］から［１３］のいずれか一に記載の化合物または［１４］に記載の医薬組成物。
［１６］
ヒト固形腫瘍および血液悪性腫瘍の治療に使用するための、［１］から［１３］のいずれか一に記載の化合物または［１４］に記載の医薬組成物。
［１７］
前記ヒト固形腫瘍が、乳癌、胃癌、結腸直腸癌、尿路上皮癌、卵巣癌、子宮癌、肺癌、中皮腫、肝癌、膵癌および前立腺癌からなる群から選択される、［１６］に記載の化合物または医薬組成物。

Claims

リンカー薬物が、Ｋａｂａｔナンバリングによる重鎖４１；Ｋａｂａｔナンバリングによる軽鎖４０；およびＫａｂａｔナンバリングによる軽鎖４１から選択される抗体またはその抗原結合断片の１つ以上の位置で操作されたシステインを介して前記抗体またはその抗原結合断片に部位特異的にコンジュゲートされている抗体−薬物コンジュゲート化合物。
前記抗体またはその抗原結合断片のＦｃ部分にある、Ｅｕナンバリングによる３７５位に操作されたシステインをさらに含む、請求項１に記載の化合物。
前記リンカー薬物がデュオカルマイシン誘導体を含む、請求項１または２に記載の化合物。（ただし、デュオカルマイシン誘導体が抗体またはその抗原結合断片に、前記抗体またはその抗原結合断片にある、Ｋａｂａｔナンバリングによる重鎖の４１位における操作されたシステインを介して部位特異的にコンジュゲートされている抗体−薬物コンジュゲート化合物を除く。）
式（Ｉ）の請求項３に記載の化合物であって

ｎが、０〜３であり、
ｍが、１〜６の平均ＤＡＲを表し、
Ｒ¹が、

から選択され、
ｙが、１〜１６であり、
Ｒ²が、

から選択される、化合物。
ｎが、０〜１であり、
ｍが１．５〜２の平均ＤＡＲを表し、
Ｒ¹が、

であり、
ｙが、１〜４であり、
Ｒ²が、

から選択される、請求項４に記載の化合物。
式（ＩＩ）の請求項５に記載の化合物。
前記抗体またはその抗原結合断片が、腫瘍細胞の細胞膜内または上において発現される抗原標的に結合し、前記抗体またはその抗原結合断片が、前記標的に結合後に細胞により内部移行される、請求項１から６のいずれか一項に記載の化合物。
前記抗体が、抗アネキシンＡ１抗体、抗ＣＤ１１５抗体、抗ＣＤ１２３抗体、抗ＣＬＬ−１抗体、抗ｃ−ＭＥＴ抗体、抗ＭＵＣ１抗体、抗ＰＳＭＡ抗体、抗５Ｔ４抗体または抗ＴＦ抗体である、請求項１から７のいずれか一項に記載の化合物。
前記抗体が、抗ＰＳＭＡモノクローナル抗体または抗５Ｔ４モノクローナル抗体である、請求項１から８のいずれか一項に記載の化合物。
前記リンカー薬物が、前記抗ＰＳＭＡ抗体の重鎖可変領域の４１位にコンジュゲートされる、請求項９に記載の化合物。（ただし、デュオカルマイシン誘導体が抗体またはその抗原結合断片に、前記抗体またはその抗原結合断片にある、Ｋａｂａｔナンバリングによる重鎖の４１位における操作されたシステインを介して部位特異的にコンジュゲートされている抗体−薬物コンジュゲート化合物を除く。）
前記抗ＰＳＭＡ抗体の重鎖が配列番号２のアミノ酸配列を含み、前記抗ＰＳＭＡ抗体の軽鎖が配列番号５のアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載の化合物。
前記リンカー薬物が、前記抗５Ｔ４抗体の重鎖可変領域の４１位でコンジュゲートされる、請求項９に記載の化合物。（ただし、デュオカルマイシン誘導体が抗体またはその抗原結合断片に、前記抗体またはその抗原結合断片にある、Ｋａｂａｔナンバリングによる重鎖の４１位における操作されたシステインを介して部位特異的にコンジュゲートされている抗体−薬物コンジュゲート化合物を除く。）
前記抗５Ｔ４抗体の重鎖が、配列番号８のアミノ酸配列を含み、前記抗５Ｔ４抗体の軽鎖が、配列番号１１のアミノ酸配列を含む、請求項１２に記載の化合物。
請求項１から１３のいずれか一項に記載の化合物および１つ以上の薬学的に許容できる賦形剤を含む医薬組成物。
凍結乾燥された粉末の形態である請求項１４に記載の医薬組成物。
薬剤として使用するための、請求項１から１３のいずれか一項に記載の化合物または請求項１４または請求項１５に記載の医薬組成物。
ヒト固形腫瘍および血液悪性腫瘍の治療に使用するための、請求項１から１３のいずれか一項に記載の化合物または請求項１４または請求項１５に記載の医薬組成物。
前記ヒト固形腫瘍が、乳癌、胃癌、結腸直腸癌、尿路上皮癌、卵巣癌、子宮癌、肺癌、中皮腫、肝癌、膵癌および前立腺癌からなる群から選択される、請求項１７に記載の化合物または医薬組成物。