JP6873950B2 - 免疫署名：早期診断および健康モニタリングの方法 - Google Patents

免疫署名：早期診断および健康モニタリングの方法 Download PDF

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Description

相互参照
本出願は、２０１２年８月２９日出願の“免疫署名：早期診断および健康モニタリングの方法”なる名称の米国仮出願番号６１／６９４,５９８の利益を主張し、これを引用によりその全体を本明細書に包含させる。
本明細書に記載する全ての刊行物、特許および特許出願は、個々の刊行物、特許および特許出願が具体的にかつ個々に引用により取り込まれることが明示されている場合と同様に引用によって本明細書に包含される。
背景
健康のモニタリングは大きな課題である。ある状態の早期発見は疾患の予後に大きく影響し得るにもかかわらず、ほとんどの状態について、主症状の出現前に疾患を検出できる単一検査は存在しない。多くのグループが、特定の状態を診断できるアッセイの開発を試みているが、このようなアッセイは特定の疾患または診断に限られている。さらに、長期間にわたる健康のモニタリングは、現在利用可能な診断アッセイでは費用的および時間的に無理がある。
発明の概要
ここに開示されるのは、対象の健康をモニタリングするための方法、アレイおよびキットである。ここに開示する態様において、本発明は、長期間にわたり個々の健康のモニタリングを可能にする、健康モニタリングの迅速で、確実で、再現可能な方法を提供する。ある態様において、本方法は、ａ) 複合的生体試料をペプチドアレイと接触させ、ここで、該ペプチドアレイは該生体試料中の少なくとも１種の抗体とオフターゲット結合できる種々のペプチドを含み、ｂ) 該抗体のペプチドアレイ中の複数の異なるペプチドとのオフターゲット結合を測定して免疫署名(immunosignature)を形成し、そしてｃ) 該免疫署名と健康状態を関連させることを含む。
ある態様において、本発明は、処置を提供する方法を提供し、該方法は、ａ) 対象から複合的生体試料を入手し、ｂ) 該複合的生体試料をペプチドアレイと接触させ、ここで、該ペプチドアレイは該生体試料中の少なくとも１種の抗体とオフターゲット結合できる種々のペプチドを含み、ｃ) 該抗体の複数の異なるペプチドへのオフターゲット結合を測定して免疫署名を形成し、ｄ) 該免疫署名と状態を関連させ、そしてｅ) 該状態に対する処置を提供することを含む。
ある態様において、本発明は、状態の予防方法を提供し、該方法は、ａ) 対象から複合的生体試料を得て、ｂ) 該複合的生体試料をペプチドアレイと接触させ、ここで、該ペプチドアレイは複合的生体試料中の少なくとも１種の抗体とオフターゲット結合できる種々のペプチドを含み、ｃ) 該複合的生体試料の複数の異なるペプチドへのオフターゲット結合を測定して免疫署名を形成し、ｄ) 該免疫署名と状態を関連させ、そしてｅ) 該状態のための処置を提供することを含む。
ある態様において、本発明は診断方法を提供し、該方法は、ａ) 対象から複合的生体試料を入手し、ｂ) 該複合的生体試料をペプチドアレイと接触させ、ここで、該ペプチドアレイは該生体試料中の少なくとも１種の抗体とオフターゲット結合できる種々のペプチドを含み、ｃ) 該抗体のペプチドアレイ中の複数の異なるペプチドとのオフターゲット結合を測定して免疫署名を形成し、そしてｄ) 該免疫署名に基づき状態を診断することを含む。
ある態様において、本発明は、対象からの生体試料を入手し、記録し、そして希釈するシステムを提供する。ある態様において、対象からの生物学的システムを入手し、記録し、そして希釈するシステムは完全自動化されている。
ある態様において、免疫署名システムは、１) 対象からの生体試料を入手し、記録し、希釈するための自動化システム；２) 免疫署名アッセイがａ) 希釈試料のペプチドアレイへの適用、ｂ) 一定時間のインキュベーション、ｃ) 未結合試料の洗浄および除去、ｄ) 二次抗体の一定時間の適用、ｅ) 二次抗体の除去およびｆ) 各スポットの蛍光を決定するためのアレイの乾燥および走査を含むものである、自動化免疫署名アッセイのための区画および３) 検出器により蛍光を検出する；各コンポーネントを含む自動化デバイスを含む。
ここに記載する免疫署名アッセイと結合させて使用し得る新規アレイの作製のための方法およびデバイスが、ここに提供される。ある態様において、アレイは、アレイ上のヘテロポリマーを作製するためのパターニング工程数を減らすために製造される。他の態様において、ここに開示する方法およびデバイスは、同時に複数モノマーを付加するための新規パターニングアルゴリズムを利用する。ある態様において、ここに開示するアルゴリズムは、大きなアレイの合成に必要なパターニング工程数を顕著に減少し、原価低減および製造時間短縮を実現する。
ある態様において、ここに開示する方法およびデバイスは、固体支持体上の異なる位置に固定化された多様な長さの複数のインサイツ合成ポリマーを含むアレイを提供し、ここで、ポリマーのインサイツ合成は、固体支持体上の位置の予定した画分に第一モノマーを付加し、固体支持体上の位置の予定した画分に第二モノマーを付加し、ここで、第二モノマーの位置の予定した画分は第一モノマーを含む位置およびモノマーがない位置を含み、固体支持体上の位置の予定した画分に第三モノマーを付加し、ここで、第三モノマーの位置の予定した画分は第一および第二モノマーを含む位置、第二モノマーを含む位置およびモノマーを含まない位置を含み、そして、ポリマーが所望の平均長に達し、画分の和が少なくとも計１００％になるまで、定義された一連のモノマーを用いて工程ａ〜ｃを繰り返す手順を含む。
他の態様において、ここに開示する方法およびデバイスはまた固体支持体上の異なる位置に固定化された多様な長さの複数のインサイツ合成ポリマーを含むアレイを製造する方法を提供し、該方法は、ポリマーを合成する場所である固体支持体として基質を提供し、固体支持体上の位置の予定した画分に第一モノマーを付加し、固体支持体上の位置の予定した画分に第二モノマーを付加し、ここで、第二モノマーの位置の予定した画分は第一モノマーを含む位置およびモノマーがない位置を含み、固体支持体上の位置の予定した画分に第三モノマーを付加し、ここで、第三モノマーの位置の予定した画分は第一および第二モノマーを含む位置、第二モノマーを含む位置およびモノマーを含まない位置を含み、そして、ポリマーが所望の平均長に達し、画分の和が少なくとも計１００％になるまで、定義された一連のモノマーを用いて工程ｂ〜ｄを繰り返す手順を含む。
さらに他の態様において、ここに開示する方法およびデバイスは、対象の健康状態をモニタリングするためにここに記載するアレイを使用する方法を提供し、該方法は、対象から生体試料を採取し、該生体試料と該アレイをハイブリダイズし、該アレイとハイブリダイズする該試料中の成分を決定し、ハイブリダイゼーションの程度を評価し、そして該対象の健康状態を決定する手順を含む。開示したアレイは、ここに記載した免疫署名の作製に使用できるが、また複合的生体試料中の標的の結合活性を測定するためにマイクロチップアレイを利用する他の診断および治療アッセイにも使用できる。
ある態様において、本発明はキットを提供する。キットは、対象から少量採血するための指穿刺デバイスおよび血液試料捕集のための受入表面を含む。ある態様において、本キットは、その使用のための指示書を含む。
試験番号１の相対的群間および群内差異の視覚表示である。１２０個のペプチドおよび１２０名の患者試料の各々の値をプロットし、青色は低結合を示し、赤色は高結合を示す。類似度の指標としてユークリッド距離を使用した階層的クラスタリングを使用して、ペプチド(Ｙ軸)および患者(Ｘ軸)をクラスター化した。左端への階層はこのクラスタリングに基づく。
試験番号１からの試料のヒートマップを示す。パネルＡは、１２０種の選択された特性を使用するトレイニングデータ集合のヒートマップを示す。パネルＢは、同じ１２０個のペプチドを使用してクラスター化した非混合試験データを示す。
試験番号２からの試料のヒートマップを示す。１５１６個の試料(Ｘ軸)を、２５５個の予測ペプチド(Ｙ軸)の各々の値と共に示す。各疾患を括弧内に示す患者総数と共に記載する。
試験番号１の受信者動作特性(ＲＯＣ)曲線のグラフ表示である。試験番号１からの試験データの各疾患コホートについて、感受性および特異性を計算した。別々のＲＯＣ曲線を描き、曲線下面積(ＡＵＣ)値を各分類アルゴリズムに対して各疾患毎に計算した。ＳＶＭのＡＵＣを灰色で示す。パネルＡは、乳癌のＳＶＭグラフについての特異性／感受性ＡＵＣのグラフ表示である。パネルＢは、脳の癌のＳＶＭグラフについての特異性／感受性ＡＵＣのグラフ表示である。パネルＣは、食道癌のＳＶＭグラフについての特異性／感受性ＡＵＣのグラフ表示である。パネルＤは、多発性骨髄腫のＳＶＭグラフについての特異性／感受性ＡＵＣのグラフ表示である。パネルＥは、健常対照のＳＶＭグラフについての特異性／感受性ＡＵＣのグラフ表示である。パネルＦは、膵癌についてのＳＶＭグラフの特異性／感受性ＡＵＣのグラフ表示である。
試験番号１の受信者動作特性(ＲＯＣ)曲線のグラフ表示である。ＰＣＡの曲線下面積(ＡＵＣ)を灰色で示す。パネルＡは、乳癌のＰＣＡグラフについての特異性／感受性ＡＵＣのグラフ表示である。パネルＢは、脳の癌のＰＣＡグラフについての特異性／感受性ＡＵＣのグラフ表示である。パネルＣは、食道癌についてのＰＣＡグラフの特異性／感受性ＡＵＣのグラフ表示である。パネルＤは、多発性骨髄腫についてのＰＣＡグラフの特異性／感受性ＡＵＣのグラフ表示である。パネルＥは、健常対照についてのＰＣＡグラフの特異性／感受性ＡＵＣのグラフ表示である。パネルＦは、膵癌についてのＰＣＡグラフの特異性／感受性ＡＵＣのグラフ表示である。
試験番号１の受信者動作特性(ＲＯＣ)曲線のグラフ表示である。ＮＢの曲線下面積(ＡＵＣ)を灰色で示す。パネルＡは、乳癌のＮＢグラフについての特異性／感受性ＡＵＣのグラフ表示である。パネルＢは、脳の癌のＮＢグラフについての特異性／感受性ＡＵＣのグラフ表示である。パネルＣは、食道癌のＮＢグラフについての特異性／感受性ＡＵＣのグラフ表示である。パネルＤは、多発性骨髄腫のＮＢグラフについての特異性／感受性ＡＵＣのグラフ表示である。パネルＥは、健常対照のＮＢグラフについての特異性／感受性ＡＵＣのグラフ表示である。パネルＦは、膵癌についてのＮＢグラフの特異性／感受性ＡＵＣのグラフ表示である。
試験番号１の受信者動作特性(ＲＯＣ)曲線のグラフ表示である。ＬＤＡの曲線下面積(ＡＵＣ)を灰色で示す。パネルＡは、乳癌についてのＬＤＡグラフの特異性／感受性ＡＵＣのグラフ表示である。パネルＢは、脳の癌についてのＬＤＡグラフの特異性／感受性ＡＵＣのグラフ表示である。パネルＣは、食道癌についてのＬＤＡグラフの特異性／感受性ＡＵＣのグラフ表示である。パネルＤは、多発性骨髄腫についてのＬＤＡグラフの特異性／感受性ＡＵＣのグラフ表示である。パネルＥは、健常対照についてのＬＤＡグラフの特異性／感受性ＡＵＣのグラフ表示である。パネルＦは、膵癌についてのＬＤＡグラフの特異性／感受性ＡＵＣのグラフ表示である。
試験番号１の受信者動作特性(ＲＯＣ)曲線のグラフ表示である。ｋ−ＮＮの曲線下面積(ＡＵＣ)を灰色で示す。パネルＡは、乳癌についてのｋ−ＮＮグラフの特異性／感受性ＡＵＣのグラフ表示である。パネルＢは、脳の癌についてのｋ−ＮＮグラフの特異性／感受性ＡＵＣのグラフ表示である。パネルＣは、食道癌についてのｋ−ＮＮグラフの特異性／感受性ＡＵＣのグラフ表示である。パネルＤは、多発性骨髄腫についてのｋ−ＮＮグラフの特異性／感受性ＡＵＣのグラフ表示である。パネルＥは、健常対照についてのｋ−ＮＮグラフの特異性／感受性ＡＵＣのグラフ表示である。パネルＦは、膵癌についてのｋ−ＮＮグラフの特異性／感受性ＡＵＣのグラフ表示である。
４個の分類器のグラフ表示である。パネルＡはＰＣＡのグラフ表示であり、最初の２個の主成分をプロットする。パネルＢはＬＤＡのグラフ表示であり、Ｘ軸およびＹ軸は、上位２個の線形判別子を示す。パネルＣはＮＢのグラフ表示であり、予測変数をプロットする。パネルＤはｋ−ＮＮのグラフ表示であり、グループワイズ距離をプロットする。
試験番号２からの２５５個の分類器ペプチドのうち３個の線グラフである。この強度プロファイルは、Ｘ軸に個々を示し、Ｙ軸に各ペプチドについて空間およびｌｏｇ１０強度で分けた疾患を示す。パネルＡは、疾患６および９について高く、他に対して低いペプチドの線グラフを示す。パネルＢは、疾患１１に対して高いペプチドの線グラフを示す。パネルＣは、疾患１および疾患９の一部に対して高いペプチドを示す。
本発明の例示態様に関して使用できるコンピューター・システムの第一例アーキテクチャを示すブロック図である。
本発明の例示態様に関して使用できるコンピューター・ネットワークを示す略図である。
本発明の例示態様に関して使用できるコンピューター・システムの第二例アーキテクチャを示すブロック図である。
特徴的ペプチド密度を有する本発明のアレイ例を示す。
インフルエンザワクチン接種後の長期間にわたる複数対象の免疫署名プロファイルを示すヒートマップである。
免疫署名結合パターンを示すヒートマップである。パネルＡは、１日を通した同じ対象由来の異なる生体試料の免疫署名を示す。パネルＢは、パネルＡの一部の拡大図である。
数ヶ月にわたりモニタリングした１対象の免疫署名結合パターンを示すヒートマップである。
２１日間にわたる３対象の免疫署名結合パターンを示すヒートマップである。パネルＡは、ＩｇＭ免疫グロブリンの結合が検出されたときの約１０,０００個のペプチドでのペプチドマイクロアレイのクラスタリングを示す。パネルＢは、ＩｇＭ免疫グロブリンの結合が検出されたときの５０名のペプチドでのペプチドマイクロアレイのクラスタリングを示す。パネルＣは、ＩｇＧ免疫グロブリンの結合が検出されたときの約１０,０００個のペプチドでのペプチドマイクロアレイのクラスタリングを示す。パネルＤは、ＩｇＧ免疫グロブリンの結合が検出されたときの５０名のペプチドでのペプチドマイクロアレイのクラスタリングを示す。
免疫署名結合パターン解析を用いる２名の対象の３０日間健康モニタリング解析を示すヒートマップである。
１７日目に単回インフルエンザワクチンを受けた対象の３０日間の経時的な免疫署名結合パターンを示すヒートマップである。２２個の選択したペプチド配列に対する対象の免疫署名結合プロファイルを特徴的時間枠にわたり示す。
図２０により特徴付けられる対象の２０１３年３月５日の気管支炎の診断を示すヒートマップである。
図２０により特徴付けられる対象の２０１１年１２月１１日のインフルエンザの症状後診断を示すヒートマップである。
肝炎ワクチンでの処置およびその３ヶ月後に最初のブースター処置を受けた対象の免疫署名結合パターンを示すヒートマップである。
複数感染症の分類の概要を示す。パネルＡは、デング、西ナイルウイルス(ＷＮＶ)、梅毒、Ｂ型肝炎ウイルス(ＨＢＶ)、正常血、渓谷熱およびＣ型肝炎ウイルスのクラスター化免疫署名結合プロファイルを示すヒートマップである。パネルＢは、ＰＣＡ分類のグラフ表示である。
本発明の免疫署名システムのコンポーネントの略図である。
パネルＡはファージディスプレーライブラリーを示す。パネルＢはペプチドマイクロアレイを示す。
合成したペプチドの平均長をパターニング工程数に対して示す。Ｘ軸はパターニングサイクル数であり、Ｙ軸は平均ペプチド長である。任意の数のパターニングサイクルを使用して、ここに開示するパターニングアルゴリズムは、パターニング工程をほとんど半減させる。
標準的な層毎のアプローチと対比した新規パターニングアルゴリズムを使用してモノマーとして全２０個のアミノ酸を適用して製造した結果を示す。
平均１２残基長を達成するために６０回未満の工程を必要とした免疫署名態様の結果を示す。
１６種のアミノ酸を使用した７０回工程の最適化アルゴリズムに由来する分布を示す。
ペプチドアレイ製造後に選択したペプチドの長さの分布を示す。
３アミノ酸長、４アミノ酸長または５アミノ酸長である可能な配列の分布を示すグラフである。
選択ペプチドライブラリーに対するペプチドの位置の関数としてのアミノ酸組成を示す。
詳細な記載
“健康”は、ほとんど全ての人間活動および相互作用の連続的に変化する結果を表す複合的状態である。このことが、健康状態を定量的に定義することを困難にする。何千もの生化学的および身体的結果を系統的に測定しなければならない。健康モニタリングの大きな課題は、種々の刺激に対する対象の応答の複雑さである。ほとんどの生物は毎日多くの異なる刺激に曝されているが、また一方で、ある生物はこのような刺激に応答し、疾患の開始または形成を防ぐことができる生物学的構造および過程のシステムを有する。適切に機能するために、このようなシステムは広範な刺激、例えばウイルスまたは寄生蠕虫の存在を検出し、これらのもの、異常細胞および／または組織に対する体内の応答を開始しなければならない。
健康モニタリングにおける必然的な大挑戦は、複合的刺激に対する対象の応答の複雑さである。例えば、生体内の罹患細胞によって惹起される生理学的応答は、感染に対する生理学的応答と異なり得る。さらに、例えば、感染または癌の初期徴候を検出し、処理し、認識し、そして動作する能力は、対象の健康に大きな影響を有し得る。腫瘍細胞が増殖し、免疫系を抑制し、転移コロニーを形成し、組織を損傷させる時間を与える前に癌と診断されたら、治療に対してより好ましく応答することを期待できる。
同様に、対象内の病原体の存在が感染直後に検出されたら、宿主炎症が感染菌の接近を阻害する前に、そして病原体負荷が免疫学的に圧倒的になる前に、抗菌剤を投与することができる。狼瘡のような自己免疫性疾患が、自己抗体レベルが低いうちに早期に検出されたら、免疫学的フレアを鎮静させるための処置ははるかに有効であろう。幸いなことに、免疫系が対象の健康状態を連続的にモニタリングしている。しかしながら、健康モニタリングおよび早期発見のための安定で、信頼でき、有効な方法に対する要請はまだ満たされていない。
免疫署名は、液性免疫の複雑な応答を表示し、それを機械で読み取ることができる定量的形式に変換するマイクロアレイとファージ技術の融合である。免疫署名は、健康状態のほんのわずかな変動でさえ、早期に正確に検出する。抗体レパートリーのこれらの包括的測定は、何らかの病的状態の、迅速、経済的かつ早期の診断のための手段を提供し、最終的に、免疫署名の連続的モニタリングは、危険な疾患状態を症状が出る前に検出する手段を提供し得る。
ここに開示する本発明は、それゆえに、健康モニタリング、診断、処置および予防的健康管理のための、鋭敏、安定、有効かつ信頼し得る方法を提供する。ここに開示する態様は、対象の液性状態とある状態を結びつけるための大規模プラットフォームを提供することにより、多くの種々の状態および健康状態に対する関連マーカーおよび代替マーカーの欠如に対処する。
生理学的システムの如何なる要素も、外来性であれ内在性であれ、ある状態または健康状態のポジティブまたはネガティブマーカーとして役立ち得る。免疫システムは、外来および内在因子を含む広範なマーカーを検出するように設計された、生体内の生物学的構造および過程の生理学的システムである。免疫系は多様な抗体を製造でき、これは個体の末梢血試料に存在しており、内因性に高濃度まで増量できる。抗体は大量になり得て、高標的親和性を有し、極めて多様なエピトープおよび構造的柔軟性を示し得る。
抗体などの免疫系の成分は、極めて安定であり、対象の健康状態の適切なマーカーとして作用し得る。血液、血漿および／または血清中の抗体は加熱、乾燥および／または広範なｐＨ値に付されまたは曝露されたとき、その完全性を維持できる。血液、血漿および／または血清中の抗体は、乾燥、凍結または水分排除状態で長期保存したとき、その完全性を維持できる。抗体は、例えば、抗体を乾燥濾紙上に保存し、送付したとき、完全性を一部および／または完全に維持できる。このような特性により、ほとんどの血液、血漿および／または血清試料が、状態のモニタリング、診断、予防および処置の方法において使用するための生物学的マーカー源としての可能性を有する。
本発明は、血液試料、乾燥血液試料、血清試料、血漿試料、唾液試料、検査綿棒、生検試料、組織試料、皮膚試料、毛髪試料、脳脊髄液試料、糞便試料または尿試料のような生体試料を対象の健康状態と結びつけるためのアレイおよび方法を提供する。ある態様において、生体試料は、非天然ペプチド配列のペプチドアレイと接触させる血液試料である。ある態様において、対象は、例えば“フィンガースティック”または“フィンガープリック”により少量の血液を採取し、それを濾紙もしくは他の吸着材などの表面に添着するかまたはバイアルもしくは容器に入れ、所望により乾燥させてよい。例えば、対象の血液１滴から得て、濾紙に載せた生体試料を、処理をせずに本発明の方法の提供業者に直接送付できる。対象から提供された生体試料を濃縮または希釈してもよい。
本発明のペプチドアレイは、少量の生体試料の、アレイ中の多数のペプチドへの結合パターンを高感度で検出するように構築できる。ある態様において、本発明は、生体試料の多数のペプチドへの結合パターンを検出し、処理し、解析し、ある状態と関連させる方法を提供する。ある態様において、本発明は、対象の健康状態と結びついた“免疫署名”を作成する。
免疫署名は、抗体応答を検出し、数学的に解析できる一群の論理的シグナルに分配する。本発明のアレイおよび方法により得た免疫署名からの一群の論理的シグナルは、癌、炎症、感染および他の生理的状態を含む種々の状態の診断のための安定で、包括的な方法を提供できる。免疫署名は、種々の状態の診断のための、伝統的な、個々のタンパク質または遺伝子バイオマーカーとは異なる、これらに代わる手段である。本発明のアレイおよび方法により得た免疫署名からの一群の論理的シグナルは、予防医療、健康モニタリング、診断の有効な方法としておよび処置方法として使用できる。
抗体バイオマーカーの多重化検出
他のあまり豊富でないバイオマーカーとは異なって、宿主が作製した抗体を検出するように設計した診断方法は、稀な事象を検出するために十分に感受性である可能性が高い。これらのマーカーの途方もなく多様な供給源が循環血に既に存在するため、高親和性、高特異性抗体の豊富な供給を創成する必要がない。抗体を検出するために設計した多重化アレイにおいては、タンパク質またはペプチドの複数パネルを固体支持体に結合させ、次いで血液に曝すだけである。
タンパク質アレイは、一回の検査で多数のパラメータを同時に検出できる大容量方法として台頭しつつある。タンパク質標的は、抗体結合のための立体構造エピトープ源を提供するが、直線状エピトープは必ずしも露出しない。Invitrogenは、１枚のスライドに配置された〜９０００種の異なるバキュロウイルス製造ヒトタンパク質を含む、より包括的なタンパク質マイクロアレイの一つを製造する。これらの大規模タンパク質アレイの可能性は、スライドあたりの高い原価、規模拡大性の欠如ならびに組み換えタンパク質生産、精製および安定性が一貫しないことにより抑制されている。インビトロで合成されたタンパク質の使用はタンパク質生産の処理量および成功を改善しているが、配置された数、安定性、翻訳後修飾および膜(表面)に対するバイアス、多量体の大タンパク質の非一貫性は未解決のままである。これらの方法は、既知変異体または病原体由来候補タンパク質を個別に特異的に合成しない限り、自己抗体の検出に限定される。罹患細胞の生化学的分画は、修飾および変異抗原に対する抗体をクエリーとすることを可能にしたが、これは大幅により複雑な方法である(Hanash, S. (2003) Disease proteomics. Nature 422, 226-232)。
タンパク質と比較して、ペプチドは、高度に再現可能であり、純粋かつ長期保存に安定な製品を大量に入手可能とするように化学合成できる。生物学的に有意な修飾または検出分子を結合させることは簡単であり、非天然分子の設計も可能である(Reddy, M.M., et al. Identification of Candidate IgG Biomarkers for Alzheimer's Disease via Combinatorial Library Screening. Cell 144, 132-142)。
ペプチドは、固体支持体に結合しているときでも変わりなく溶液中に提示され、抗体相互作用をバッチ毎の製品差にかかわらず高度に一貫性がある構造に対してスクリーニングされる。ペプチドマイクロアレイは、タンパク質マイクロアレイよりも遙かに古くから利用でき(Panicker, R.C., et al. (2004) Recent advances in peptide-based microarray technologies. Comb Chem High Throughput Screen 7, 547-556)、種々の用途に使用されてきた。酵素(Fu, J., et al. (2010) Exploring peptide space for enzyme modulators. J Am Chem Soc 132, 6419-6424; およびFu, J., et al. (2011) Peptide-modified surfaces for enzyme immobilization. PLoS One 6, e18692)、タンパク質(Diehnelt, C.W., et al. Discovery of high-affinity protein binding ligands-backwards. PLoS One 5, e10728; Greving, M.P., et al. High-throughput screening in two dimensions: binding intensity and off-rate on a peptide microarray. Anal Biochem 402, 93-95; Greving, M.P., et al. Thermodynamic additivity of sequence variations: an algorithm for creating high affinity peptides without large libraries or structural information. PLoS One 5, e15432; Gupta, N., et al. Engineering a synthetic ligand for tumor necrosis factor-alpha. Bioconjug Chem 22, 1473-1478)、ＤＮＡおよび小分子(Boltz, K.W., et al. (2009) Peptide microarrays for carbohydrate recognition. Analyst 134, 650-652; Foong, Y.M., et al. (2012) Current advances in peptide and small molecule microarray technologies. Curr Opin Chem Biol 16, 234-242; Morales Betanzos, C., et al. (2009) Bacterial glycoprofiling by using random sequence peptide microarrays. Chembiochem 10, 877-888)、全細胞(Falsey, J.R., et al. (2001) Peptide and small molecule microarray for high throughput cell adhesion and functional assays. Bioconjug Chem 12, 346-353)および抗体(Cerecedo, I., et al. (2008) Mapping of the IgE and IgG4 sequential epitopes of milk allergens with a peptide microarray-based immunoassay. J Allergy Clin Immunol 122, 589-594; Cretich, M., et al. (2009) Epitope mapping of human chromogranin A by peptide microarrays. Methods Mol Biol 570, 221-232; Lin, J., et al. (2009) Development of a novel peptide microarray for large-scale epitope mapping of food allergens. J Allergy Clin Immunol 124, 315-322, 322 e311-313; Lorenz, P., et al. (2009) Probing the epitope signatures of IgG antibodies in human serum from patients with autoimmune disease. Methods Mol Biol 524, 247-258; Perez-Gordo, M., et al. (2012) Epitope mapping of Atlantic salmon major allergen by peptide microarray immunoassay. Int. Arch Allergy Immunol 157, 31-40; およびShreffler, W.G., et al. (2005) IgE and IgG4 epitope mapping by microarray immunoassay reveals the diversity of immune response to the peanut allergen, Ara h 2. J Allergy Clin Immunol 116, 893-899)は、ペプチドへの結合についてアッセイできる生体分子のほんの一部である。古典的例はエピトープマッピングであり、抗原大の多くのペプチドをタイル張りし、モノクローナル抗体のエピトープを効果的に解読することができる。高特異性抗体はそのエピトープ配列を認識し、結合し、通常、他の抗原由来ペプチドとはほとんど結合しないか測定可能な結合はしない。この方法を用いて、同一抗原に対して誘導された種々のモノクローナルが区別され、特徴付けられる。
交差反応の妥当性
免疫系は、自己タンパク質を無視し、非自己標的と相当な強度で結合する抗体を誘発し、増幅するために進化している。これらの相反する圧は、分子レベルで明らかになる。典型的抗体は、〜１５アミノ酸のエピトープを認識し、そのうち〜５アミノ酸が結合エネルギーを支配する。これらの５残基のいずれかの変化は結合強度に大きく影響する。
他のエピトープ位置の配列変化は、結合領域の空間的配座を変え、全体的強度に中程度に影響する。それゆえに結合強度を最大化すべきであるならば、高親和性残基と低親和性残基が相互作用することを可能にするために条件を調節しなければならない。これは、ストリンジェンシーの低下を意味し、結果的に、エピトープ配列の異型が抗体と結合することを可能にする。さらに交差反応の可能性に関与して、抗体は、多くの重複パラトープを含む５０アミノ酸可変領域(抗体のエピトープ認識部分)を有する(Mohan, S., et al. (2009) Association energetics of cross-reactive and specific antibodies. Biochemistry 48, 1390-1398; Thorpe, I.F., and Brooks, C.L., 3rd (2007) Molecular evolution of affinity and flexibility in the immune system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 104, 8821-8826; およびZhou, Z.H., et al. (2007) Properties and function of polyreactive antibodies and polyreactive antigen-binding B cells. J Autoimmun. 29, 219-228. Epub 2007 Sep 2020)。
これらのパラトープの各々は、パラトープおよびエピトープが、相補性領域の形状および電荷を規定するサイズが類似したストレッチであるように〜１５アミノ酸からなる。パラトープは１個を超えるエピトープと結合でき、単一エピトープは１個を超えるパラトープと結合でき、各対は独特の結合特性を示す。単一抗体が複数パラトープを有するため、抗体は、多様な強度で結合できる、明確な、同時に潜在的に多様なエピトープのセットを有する。この交差反応ならびに特異性および親和性の複合的関係は、差し迫った脅威に対する直接的攻撃および将来的な変異形への暴露の可能性に対する間接的攻撃を編成する精緻な免疫系の特質である。
インビトロで、特定の直線状エピトープに特異的な抗体は、配列関連ペプチドだけでなく、無関係のものにも結合することが示されている(Folgori, A., et al. (1994) A general strategy to identify mimotopes of pathological antigens using only random peptide libraries and human sera. Embo J 13, 2236-2243)。これらの、典型的に立体構造関連性を示すが、配列が関連しないペプチドはミモトープとして知られ、初期ファージディスプレイ研究で最初に報告された(Folgori, A., et al. (1994) A general strategy to identify mimotopes of pathological antigens using only random peptide libraries and human sera. Embo J 13, 2236-2243; Christian, R.B., et al. (1992) Simplified methods for construction, assessment and rapid screening of peptide libraries in bacteriophage. Journal of Molecular Biology 227, 711-718; Liu, R., et al. (2003) Combinatorial peptide library methods for immunobiology research. Experimental Hematology 31, 11-30; Wang, Y., et al. (1995) Detection of Mammary Tumor Virus ENV Gene-like Sequences in Human Breast Cancer. Cancer Research 55, 5173-5179)。
ファージベースのシステムは、他のほとんどのシステムで可能であるよりはるかに大きなリガンド多様性のライブラリーを構築し、スクリーニングする機会を提供する。例えば、ペプチドを提示する大無作為配列ライブラリーを、特定のモノクローナル抗体に対してパニングした。選択工程の反復により、しばしば、同族エピトープだけでなく、数種の無関係ペプチド配列の同定に至る。無作為ペプチド多様性が、生物学的配列多様性を何桁も上回るとの事実は、このペプチドが何らかの生物学的ペプチドと対応していないことを意味する。全ての結合反応は、抗体固有の特性である非同族、交差反応性に依存する。これは、何らかのカテゴリーの抗体に対するリガンドが同定できることを意味する。自己抗原、修飾抗原、変異エピトープまたは非ペプチド性ミモトープ。無作為配列空間でスクリーニングするこれらの利点にもかかわらず、ファージディスプレイ技術は、ファージでのパニングと細菌培養工程の反復、バイナリ選択過程および拡張性の欠如により制限される(Derda, R., et al. (2011) Diversity of phage-displayed libraries of peptides during panning and amplification. Molecules 16, 1776-1803; Szardenings, M. (2003) Phage display of random peptide libraries: applications, limits, and potential. J Recept Signal Transduct Res 23, 307-34953, 54)。今日まで、無作為ファージライブラリーは抗体バイオマーカーを作製していない。
免疫署名
免疫署名は、上記テクノロジーの統合である。第一に、ペプチドを生物学的にファージに提示させるのではなく、合成した、長いペプチドをスライド・ガラス上にアドレス可能な規則的配列で結合させるのは、はるかにシステマティックな方法である。ファージライブラリーの個々のクローンは１０１０個を超え得るが、マイクロアレイは、スライドあたり数千から数百万のスポットに増やされている。原価、信頼性、精度およびアッセイ速度は、マイクロアレイに大きな優位性を付与する。マイクロアレイは、それ自体その低原価および拡張性により、ゲノミクスおよびプロテオミクスに非常に有効であることが証明されており、アレイチャンバーおよびスキャナーが多年にわたって販売されている。
第二に、抗体を疾患としてバイオマーカーを使用することは、安定で容易に入手できる分子および免疫系の多様性、モニタリングおよび生物学的増幅という好都合な特性を利用する。哺乳動物免疫系の複雑さは驚異的であり(Janeway, C., and Travers, J. (1997) Immunobiology: The Immune System in Health and Disease. Current Biology Limited)、それゆえに情報量もそうである。免疫学者がイムノームを調べるに連れて、＞１０１０の異なる分子種が可能な抗体レパートリー(Nobrega, A., et al. (1998) Functional diversity and clonal frequencies of reactivity in the available antibody repertoire. European Journal of Immunology 28, 1204-1215)が、個々の健康状態の過去、現在そしてさらに前駆的動揺のダイナミック・データベースであるとの合意が広まりつつある。
第三に、無作為配列ペプチドの使用は、抗体レパートリーの多様性がスクリーニングすべきリガンドの不偏の包括的ライブラリーにより対合されることを可能にする。無作為配列ペプチドはファージディスプレイライブラリーで使用できるが、それらはバイアスを有し、雑然とした、制御不十分な形式ではない。無作為ペプチド配列が制約がなく、生物学的空間に意図的相同性を有しないため、マイクロアレイは希薄な、しかし極めて広範な配列空間の被覆率を有する。何らかの疾患または生物に対応する正常な、変異した、翻訳後修飾されたおよび模倣のエピトープは同一マイクロアレイ上でスクリーニングできる。この分野の最近の文献は、１０,０００個の独特の無作為配列２０量体ペプチドを使用して、多数の疾患状態を特徴付けしている１、１０(Brown, J.R., et al. (2011) Statistical methods for analyzing immunosignatures. BMC Bioinformatics 12, 349; Hughes, A.K., et al. (2012) Immunosignaturing can detect products from molecular markers in brain cancer. PLoS One 7, e40201; Kroening, K., et al. (2012) Autoreactive antibodies raised by self derived de novo peptides can identify unrelated antigens on protein microarrays. Are autoantibodies really autoantibodies? Exp Mol Pathol 92, 304-311; Kukreja, M., et al. (2012) Comparative study of classification algorithms for immunosignaturing data. BMC Bioinformatics 13, 139; Kukreja, M., et al. (2012) Immunosignaturing Microarrays Distinguish Antibody Profiles of Related Pancreatic Diseases. Journal of Proteomics and Bioinformatics; およびLegutki, J.B., et al. (2010) A general method for characterization of humoral immunity induced by a vaccine or infection. Vaccine 28, 4529-4537)。
ファージディスプレイと免疫署名マイクロアレイで得られた結果に幾つかの顕著な差がある。免疫署名はアレイ上のペプチド全てをクエリーとし、各々について結合値を生じる。ファージディスプレイは、限定的選択で生き残った配列を捉え、典型的にコンセンサス配列しか同定しない。免疫署名マイクロアレイの処理は、数週間ではなく数時間で済む。図１４は、これらのテクノロジーの差異を示す。技術的に、‘免疫署名’は、各々疾患のある状態と他のものを確実に差別できる特定の結合値を有する、統計学的に有意なペプチドのパターンをいう。
テクノロジーのこの統合は、普遍的に適用できる早期診断プラットフォームの目標に向けた進歩となり得る。未解決である重要な課題は、ｉ) 該免疫系が感染性および慢性疾患のどちらにも一貫した疾患特異的液性応答を誘発するか否か、ii) 抗体が、臨床的に有用であるように疾患の病因に十分に早期に応答するか否かおよびiii) 本アッセイが確実な決定のために多数の患者試料をスクリーニングするのに十分に感受性で、情報価値があり、低原価で拡張性があるか否かである。これらの点を充足できたならば、何らかの免疫が関係する疾患の免疫署名を発見できる。反応性のこれらの規定パターンを、その後、早期的および網羅的な疾患診断に使用できる。これらの試験が市民に広く利用可能とすることができれば、免疫署名は、個人だけでなく、疫学的レベルでも重要な意味のある長期健康モニタリングシステムの基礎となる。我々は、この点に関して有望なこのプラットフォームの幾つかの特性を示す。
免疫署名は、上記テクノロジーの統合である。第一に、ペプチドを生物学的にファージに提示させるのではなく、合成した、長いペプチドをスライド・ガラス上にアドレス可能な規則的配列で結合させるのは、はるかにシステマティックな方法である。ファージライブラリーの個々のクローンは１０１０個を超え得るが、マイクロアレイは、スライドあたり数千から数百万のスポットに増やされている。原価、信頼性、精度およびアッセイ速度は、マイクロアレイに大きな優位性を付与する。マイクロアレイは、それ自体その低原価および拡張性により、ゲノミクスおよびプロテオミクスに非常に有効であることが証明されており、アレイチャンバーおよびスキャナーが多年にわたって販売されている。第二に、抗体を疾患としてバイオマーカーを使用することは、安定で容易に入手できる分子および免疫系の多様性、モニタリングおよび生物学的増幅という好都合な特性を利用する。
哺乳動物免疫系の複雑さは驚異的であり、それゆえに情報量もそうである。免疫学者がイムノームを調べるに連れて、＞１０１０の異なる分子種が可能な抗体レパートリーが、個々の健康状態の過去、現在そしてさらに前駆的動揺のダイナミック・データベースであるとの合意が増えている。第三に、無作為配列ペプチドの使用は、抗体レパートリーの多様性がスクリーニングすべきリガンドの不偏の包括的ライブラリーにより対合させることを可能にする。無作為配列ペプチドはファージディスプレイライブラリーで使用できるが、それらはバイアスを有し、雑然とした、制御不十分な形式ではない。無作為ペプチド配列が制約がなく、生物学的空間に意図的相同性を有しないため、マイクロアレイは希薄な、しかし極めて広範な配列空間の被覆率を有する。
何らかの疾患または生物に対応する正常な、変異した、翻訳後修飾されたおよび模倣されたエピトープは同一マイクロアレイ上でスクリーニングできる。この分野の文献は、１０,０００個の独特の無作為配列２０量体ペプチドを使用して、多数の疾患状態を特徴付けしている。ファージディスプレイと免疫署名マイクロアレイで得られた結果に幾つかの顕著な差がある。免疫署名はアレイ上のペプチド全てを問題とし、各々について結合値を生じる。ファージディスプレイは、制限的選択で生き残った配列を与え、典型的にコンセンサス配列しか同定しない。
免疫署名マイクロアレイの処理には、数週間ではなく数時間で済む。‘免疫署名’は、各々疾患のある状態と他とものを確実に分類できる特定の結合値を有する、統計学的に有意なペプチドのパターンをいう。したがって、ここに開示する態様の一つの面は、複合的生体試料で免疫署名アレイのクエリー実行のための比較的速い処理時間であり、ここで、クエリー実行および処理時間は最長１０分、最長２０分、最長３０分、最長４５分、最長６０分、最長９０分、最長２時間、最長３時間、最長４時間または最長５時間かかり得る。あるいは、クエリー実行および処理時間は、長くて１０分、長くて２０分、長くて３０分、長くて４５分、長くて６０分、長くて９０分、長くて２時間、長くて３時間、長くて４時間または長くて５時間かかり得る。
テクノロジーのこの統合は、普遍的に適用できる早期診断プラットフォームの目標に向けた進歩となり得る。未解決である重要な課題は、ｉ) 該免疫系が感染性および慢性疾患のどちらにも一貫した疾患特異的液性応答を誘発するか否か、ii) 抗体が、臨床的に有用であるように疾患の病因に十分に早期に応答するか否か、およびiii) 本アッセイが確実な決定のために多数の患者試料をスクリーニングするのに十分に感受性で、情報価値があり、安価で拡張性があるか否かである。これらの点を充足できたならば、何らかの免疫が関係する疾患の免疫署名を発見できる。
反応性のこれらの規定パターンを、その後、早期的および網羅的な疾患診断に使用できる。これらの試験が市民に広く利用可能とすることができれば、免疫署名は、個人だけでなく、疫学的レベルでも重要な意味のある長期健康モニタリングシステムの基礎となる。我々は、この点に関して有望なこのプラットフォームの幾つかの特性を示す。
免疫署名の独特の特性
抗体パラトープのリガンドに対する親和性に加えて、結合強度は、血清中の抗体種の濃度に左右される。ファージディスプレイと異なり、免疫署名は、これらのパラメータの結果を定量的に測定でき、極めて大きなダイナミック・レンジで定量的測定できる(Legutki, J.B., et al. (2010) A general method for characterization of humoral immunity induced by a vaccine or infection. Vaccine 28, 4529-4537; Stafford, P., and Johnston, S. (2011) Microarray technology displays the complexities of the humoral immune response. Expert Rev Mol Diagn 11, 5-8; Halperin, R.F., et al. (2011) Exploring Antibody Recognition of Sequence Space through Random-Sequence Peptide Microarrays. Molecular & Cellular Proteomics 10)。
科学者は、この能力を使用して、高親和性モノクローナル抗体の免疫署名マイクロアレイへの結合を試験した。その結果、単一モノクローナルが数百個の無作為配列を認識し、これらの独特の結合反応の様々な強度を測定し、比較できることが発見された(Halperin, R.F., et al. (2011) Exploring Antibody Recognition of Sequence Space through Random-Sequence Peptide Microarrays. Molecular & Cellular Proteomics 10)。奇妙なことに、これらのオフターゲットミモトープ相互作用の多くは、同族エピトープより高い結合であった。これらの相互作用の対応する液相結合は低いが、免疫署名マイクロアレイを構築する方法がこれらの相互作用を増強する。免疫署名マイクロアレイへのオフターゲット抗体結合のこの免疫学的現象が、このテクノロジーの中枢である。
他の重要な発見は、低親和性相互作用の検出について、免疫署名がファージディスプレイまたはＥＬＩＳＡベースのアッセイよりも感受性が高いことである(Stafford, P., and Johnston, S. (2011) Microarray technology displays the complexities of the humoral immune response. Expert Rev Mol Diagn 11)。この高感度は、スライド表面上のペプチドが高密度である結果であり、“免疫署名効果”と呼ばれている。これは、機能化ガラス表面上の種々の空間的配置のペプチドのプリントおよび試験により確立されている。アレイが、ペプチドが約９〜約１２nm離れるようにプリントされたら、同族エピトープは、オフターゲット無作為ペプチドよりも有利に抗体と競合する(ただし、非常に強力なミモトープを除く)。
本発明者らは、通常ペプチドを平均１〜２nm離すが、３〜４nm離れたペプチドとのオフターゲット結合が見られる。ペプチドを約１〜約１.５nm離したならば、オフターゲット結合の増加が見られる。密集したペプチドは、アビディティーおよび急速再結合を介して抗体を捕捉するようである。この概念は、極めて再現性があることが示されており、図２６に記載する(Stafford, P., et al. (2012) Physical characterization of the “immunosignaturing effect”. Mol Cell Proteomics 11, M111 011593; Chase, B.A., et al. (2012) Evaluation of biological sample preparation for immunosignature-based diagnostics. Clin Vaccine Immunol 19, 352-358; Hughes, A.K., et al. (2012) Immunosignaturing can detect products from molecular markers in brain cancer. PLoS One 7, e40201; Restrepo, L., et al. (2011) Application of immunosignatures to the assessment of Alzheimer's disease. Annals of Neurology 70, 286-295)。ペプチドの配列は完全に無作為であるが、抗体のオフターゲット捕獲は明らかに無作為ではなく、むしろ、アレイへの血清結合パターンは著しく整合性がある。このテクノロジーに対する初期の懸念は、ある血清試料中の抗体種の大きな多様性が重複結合の競合を生じ、平らで情報価値のない場の強度に終わるはずであるとのことであった。データはこれを実証していない。実際、血清で希釈した精製モノクローナル抗体でさえ、結合をほとんど失うことなく、または全く失うことなく、その特徴的反応性パターンを維持する(Uhlen, M., and Hober, S. (2009) Generation and validation of affinity reagents on a proteome-wide level. J Mol Recognit 22, 57-64)。
従来の核酸マイクロアレイの説明に使用された古典的統計学的モデル(Draghici, S. (2012) Statistics and Data Analysis for Microarrays Using R and Bioconductor. Chapman & Hall/CRC)は、免疫署名アレイにより提示された新しい複雑さに対処するための柔軟性を有していない。マイクロアレイ上の相補的プローブへのＲＮＡまたはＤＮＡ結合を説明する一対一結合モデルよりむしろ、免疫署名ペプチドは１個を超える抗体に結合でき、多様な抗体が同一ペプチドに結合できる。３編の文献が、特に免疫署名について画像解析方法(Yang, Y., et al. (2011) Segmentation and intensity estimation for microarray images with saturated pixels. BMC Bioinformatics 12, 462)、因子解析および混合モデル(Brown, J.R., et al. (2011) Statistical methods for analyzing immunosignatures. BMC Bioinformatics 12, 349)および分類(Kukreja, M., et al. (2012) Comparative study of classification algorithms for immunosignaturing data. BMC Bioinformatics 13, 139)を比較している。疾患の識別を可能とする多くの基本的特性が免疫署名マイクロアレイにある。
第一に、健常ボランティアからの対照血清は、ベースライン結合反応性のかなり広い分布を示す。これにより、本テクノロジーを使用した大規模研究では、集団変動性を調整するために多数の非罹患個体からの血清を集める必要性が課せられる。第二に、ある疾患患者の血清の署名は、非疾患血清と異なり、極めて一致する。この観察は、免疫系が常に局所環境を探査し、反応し、署名の大きな差の原因となることを意味する。しかしながら、ある抗原に指向させたら、抗体は、個体変動性がほとんどない、狭く、かつ明確に定義された署名を形成する傾向にある。
たとえそうであっても、本テクノロジーは、疾患のサブタイプを識別でき(Hughes, A.K., et al. (2012) Immunosignaturing can detect products from molecular markers in brain cancer. PLoS One 7, e40201)、同時に対照対罹患者をなお区別する。複数のペプチド間の一般的関連および共分散の解析は、単一エピトープレベルでは不可能である素晴らしい識別力を提供する。免疫学的に、抗体：ペプチド結合パターンは、非特異的危険信号または天然抗体の活動を生じず、これらは認識できる刺激により製造される。抗体吸着実験は、インフルエンザ感染者からのペプチドが大部分はウイルス特異的抗体に結合し、アルツハイマー病の署名は多くの抗Ａβ抗体に結合することを示す(Legutki, J.B., et al. (2010) A general method for characterization of humoral immunity induced by a vaccine or infection. Vaccine 28, 4529-4537; Restrepo, L., et al. (2011) Application of immunosignatures to the assessment of Alzheimer's disease. Annals of Neurology 70, 286-295)。
免疫署名による疾患判定は、現在の臨床検査によって得られた結果とよく相関している(Hughes, A.K., et al. (2012) Immunosignaturing can detect products from molecular markers in brain cancer. PLoS One 7, e40201; Kukreja, M., et al. (2012) Immunosignaturing Microarrays Distinguish Antibody Profiles of Related Pancreatic Diseases. Journal of Proteomics and Bioinformatics; Legutki, J.B., et al. (2010) A general method for characterization of humoral immunity induced by a vaccine or infection. Vaccine 28, 4529-4537)。免疫署名は、伝統的診断では利用できない健康歴情報を有し、すなわち、即時および記憶応答の両者を検出できる(Legutki, J.B., et al. (2010) A general method for characterization of humoral immunity induced by a vaccine or infection. Vaccine 28, 4529-4537)。今日まで、このアプローチは、マウス、ラット、イヌ、ブタおよびヒト宿主のウイルス、細菌、真菌および寄生虫感染症、癌、糖尿病、自己免疫性疾患、移植片患者および多くの慢性疾患を含む３３種を超える疾患および続発症に適用されている。ペプチド結合パターンの高度に再現可能なパターンが確立でき、病理と関連する。
これらの結合プロファイルは、患者および健常ボランティアから得た盲検の血清試料を正確に分類し、感受性および精度の点で古典的免疫試験より優れている。大規模研究において、免疫署名は、渓谷熱患者を極めて高精度に診断でき、最初は標準的ＥＬＩＳＡ試験で陰性であった患者の正確な診断もあった。患者免疫署名の解析は、癌間および癌内の区別もでき(Brown, J.R., et al. (2011) Statistical methods for analyzing immunosignatures. BMC Bioinformatics 12, 349; Hughes, A.K., et al. (2012) Immunosignaturing can detect products from molecular markers in brain cancer. PLoS One 7, e40201; Kukreja, M., et al. (2012) Immunosignaturing Microarrays Distinguish Antibody Profiles of Related Pancreatic Diseases. Journal of Proteomics and Bioinformatics; およびYang, Y., et al. (2011) Segmentation and intensity estimation for microarray images with saturated pixels. BMC Bioinformatics 12, 462)、薬剤処置に応答するまたはしない癌タイプの正確な診断に至るほどであった(Hughes, A.K., et al. Immunosignaturing can detect products from molecular markers in brain cancer. PLoS One 7, e40201)。
免疫署名テクノロジーの最も独特な特徴の一つは、特に、かつては測定不可能とされた相互作用群である、低下したペプチド−抗体反応の測定であることが判る。すなわち、罹患個体からの血清が正常血清に比して高いシグナルを生じている一方で、健常者に比して一貫して低い結合を示すペプチドもある(Kukreja, M., et al. (2012) Immunosignaturing Microarrays Distinguish Antibody Profiles of Related Pancreatic Diseases. Journal of Proteomics and Bioinformatics; およびLegutki, J.B., et al. (2010), A general method for characterization of humoral immunity induced by a vaccine or infection. Vaccine 28, 4529-4537)。免疫応答におけるこれらの“低い”ペプチドの役割は興味深い。その最も単純なレベルで、これらの“低い”ペプチドは疾患分類の質を高めるが、他では判らない何らかの基礎的免疫現象がある可能性がある。
アレイへの分子の結合
国立癌研究所によると、約１５０種の癌があり、どのように定義するかによって、数百の異なるサブタイプがある。抗体は、しばしば腫瘍細胞が発現した抗原に対して惹起され、その後Ｂ細胞成熟の間に増幅される。抗体はまたワクチンまたは感染に対して応答する間にも惹起される。抗体はまた対象が毎日種々の病原性、ならびに非病原性刺激に曝されている間にも惹起され得る。
対象の体内での抗体増幅過程は、状態に付随する対象特異的マーカーの十分な供給源となり得る。抗体増幅は、対象および／または状態の特定の健康状態に付随する豊富な数の抗体を提供できる。試料中に十分な数の抗体が存在することは、健康モニタリング方法における人工的バイオマーカー増幅の必要性を減らし得る。試料中に十分な数の抗体が存在することは、例えば、健康モニタリング方法において、少量の試料の適用での成功を可能にする。
本発明の方法およびアレイは、対象からの少量の生体試料での健康モニタリング、診断、処置および予防を可能にする。ある態様において、生体試料は、さらに処理することなく、少量で本発明の方法に使用できる。ある態様において、生体試料は、血液、血清、唾液、汗、細胞、組織または何らかの体液を含む。ある態様において、約０.５nl、約１nl、約２nl、約３nl、約４nl、約５nl、約６nl、約７nl、約８nl、約９nl、約１０nl、約１１nl、約１２nl、約１３nl、約１４nl、約１５nl、約１６nl、約１７nl、約１８nl、約１９nl、約２０nl、約２１nl、約２２nl、約２３nl、約２４nl、約２５nl、約２６nl、約２７nl、約２８nl、約２９nl、約３０nl、約３１nl、約３２nl、約３３nl、約３４nl、約３５nl、約３６nl、約３７nl、約３８nl、約３９nl、約４０nl、約４１nl、約４２nl、約４３nl、約４４nl、約４５nl、約４６nl、約４７nl、約４８nl、約４９nlまたは約５０nl、約５１nl、約５２nl、約５３nl、約５４nl、約５５nl、約５６nl、約５７nl、約５８nl、約５９nl、約６０nl、約６１nl、約６２nl、約６３nl、約６４nl、約６５nl、約６６nl、約６７nl、約６８nl、約６９nl、約７０nl、約７１nl、約７２nl、約７３nl、約７４nl、約７５nl、約７６nl、約７７nl、約７８nl、約７９nl、約８０nl、約８１nl、約８２nl、約８３nl、約８４nl、約８５nl、約８６nl、約８７nl、約８８nl、約８９nl、約９０nl、約９１nl、約９２nl、約９３nl、約９４nl、約９５nl、約９６nl、約９７nl、約９８nl、約９９nl、約０.１、約０.２μl、約０.３μl、約０.４μl、約０.５μl、約０.６μl。約０.７μl、約０.８μl、約０.９μl、約１μl、約２μl、約３μl、約４μl、約５μl、約６μl、約７μl、約８μl、約９μl、約１０μl、約１１μl、約１２μl、約１３μl、約１４μl、約１５μl、約１６μl、約１７μl、約１８μl、約１９μl、約２０μl、約２１μl、約２２μl、約２３μl、約２４μl、約２５μl、約２６μl、約２７μl、約２８μl、約２９μl、約３０μl、約３１μl、約３２μl、約３３μl、約３４μl、約３５μl、約３６μl、約３７μl、約３８μl、約３９μl、約４０μl、約４１μl、約４２μl、約４３μl、約４４μl、約４５μl、約４６μl、約４７μl、約４８μl、約４９μlまたは約５０μlの生体試料が、本発明のアレイおよび方法による解析に必要である。
対象からの生体試料を、例えば、対象から採取して、本発明のアレイと直接接触させてよい。ある態様において、生体試料は本発明のアレイとの接触前に調製または処理手順を必要としない。ある態様において、対象からの乾燥血液試料を、本発明のアレイとの接触前に希釈手順で再構成する。希釈により、対象の生体試料からの抗体を、免疫署名のための最適濃度にできる。
本発明の方法およびアレイは、対象からの少量の生体試料で健康モニタリング、診断、処置および予防を可能にする。ある態様において、本発明の方法はわずか約０.５nl〜約５０nl、わずか約１nl〜約１００nl、わずか約１nl〜約１５０nl、わずか約１nl〜約２００nl、わずか約１nl〜約２５０nl、わずか約１nl〜約３００nl、わずか約１nl〜約３５０nl、わずか約１nl〜約４００nl、わずか約１〜約４５０nl、わずか約５nl〜約５００nl、わずか約５nl〜約５５０nl、わずか約５nl〜約６００nl、わずか約５nl〜約６５０nl、わずか約５nl〜約７００nl、わずか約５nl〜約７５０nl、わずか約５nl〜約８００nl、わずか約５nl〜約８５０nl、わずか約５nl〜約９００nl、わずか約５nl〜約９５０nl、わずか約５nl〜約１μl、わずか約０.５μl〜約１μl、わずか約０.５μl〜約５μl、わずか約１μl〜約１０μl、わずか約１μl〜約２０μl、わずか約１μl〜約３０μl、わずか約１μl〜約４０μlまたはわずか約１μl〜約５０μlしか必要としない。
ある態様において、本発明の方法は、少なくとも０.５nl〜約５０nl、少なくとも約１nl〜約１００nl、少なくとも約１nl〜約１５０nl、少なくとも約１nl〜約２００nl、少なくとも約１nl〜約２５０nl、少なくとも約１nl〜約３００nl、少なくとも約１nl〜約３５０nl、少なくとも約１nl〜約４００nl、少なくとも約１〜約４５０nl、少なくとも約５nl〜約５００nl、少なくとも約５nl〜約５５０nl、少なくとも約５nl〜約６００nl、少なくとも約５nl〜約６５０nl、少なくとも約５nl〜約７００nl、少なくとも約５nl〜約７５０nl、少なくとも約５nl〜約８００nl、少なくとも約５nl〜約８５０nl、少なくとも約５nl〜約９００nl、少なくとも約５nl〜約９５０nl、少なくとも約５nl〜約１μl、少なくとも約０.５μl〜約１μl、少なくとも約０.５μl〜約５μl、少なくとも約１μl〜約１０μl、少なくとも約１μl〜約２０μl、少なくとも約１μl〜約３０μl、少なくとも約１μl〜約４０μl、少なくとも約１μl〜約５０μlまたは少なくとも５０μlを必要とする。
対象は、例えば、生検サンプルまたは組織からの固形生体試料を含む複数の生体試料を提供できる。ある態様において、約１mg、約５mg、約１０mg、約１５mg、約２０mg、約２５mg、約３０mg、約３５mg、約４０mg、約４５mg、約５０mg、約５５mg、約６０mg、約６５mg、約７mg、約７５mg、約８０mg、約８５mg、約９０mg、約９５mgまたは約１００mgの生体試料が本発明のアレイおよび方法で必要である。
ある態様において、わずか約１mg〜約５mg、わずか約１mg〜約１０mg、わずか約１mg〜約２０mg、わずか約１mg〜約３０mg、わずか約１mg〜約４０mg、わずか約１mg〜約５０mg、わずか約５０mg〜約６０mg、わずか約５０mg〜約７０mg、わずか約５０mg〜約８０mg、わずか約５０mg〜約９０mg、わずか約５０mg〜約１００mgの生体試料しか本発明の方法およびアレイで必要ではない。
ある態様において、少なくとも約１mg〜約５mg、少なくとも約１mg〜約１０mg、少なくとも約１mg〜約２０mg、少なくとも約１mg〜約３０mg、少なくとも約１mg〜約４０mg、少なくとも約１mg〜約５０mg、少なくとも約５０mg〜約６０mg、少なくとも約５０mg〜約７０mg、少なくとも約５０mg〜約８０mg、少なくとも約５０mg〜約９０mg、少なくとも約５０mg〜約１００mgの生体試料が本発明の方法およびアレイで必要である。
本発明の方法およびアレイは、対象からの少量の生体試料で健康モニタリング、状態の診断、処置および予防のための高感度な方法を提供する。ある態様において、対象からの生体試料は濃縮されすぎており、本発明のアレイとの接触前に希釈が必要である。生体試料を複数回希釈後に、該試料と本発明のアレイを接触させてよい。希釈は、対数形式で濃度の等比数列をもたらすことができる連続希釈でよい。例えば、１０倍連続希釈は１Ｍ、０.０１Ｍ、０.００１Ｍおよびその等比数列であり得る。希釈は、例えば、１倍希釈、２倍希釈、３倍希釈、４倍希釈、５倍希釈、６倍希釈、７倍希釈、８倍希釈、９倍希釈、１０倍希釈、１６倍希釈、２５倍希釈、３２倍希釈、６４倍希釈および／または１２５倍希釈であってよい。
生体試料は対象の身体の複数の起源に由来してよく、生体試料を対象から複数の異なる環境で採取してよい。生体試料は、例えば、毎年の身体検査での採血のような日常的医療相談中に採取できる。生体試料は、非日常的相談の過程で採取でき、例えば、生体試料を、生検の経過中に採取できる。対象はまた生体試料を自分で採取し、対象は直販形式で本発明の方法およびシステムにより処理した生体試料を提供できる。ある態様において、生体試料を本発明の方法およびアレイの提供業者に送付できる。ある態様において、濾紙上の対象からの乾燥血液試料のような乾燥生体試料を、本発明の方法およびアレイの提供業者に送付できる。
ある分子の本発明のアレイへの結合は、条件と関係させ得る結合パターンを形成する。ある分子がアレイ中のあるペプチドへ結合する親和性は、数学的に条件と関係させ得る。ある抗体が複数の異なる本発明のペプチドへオフターゲット結合するパターンは、数学的に条件と関係させ得る。ある分子が複数の異なる本発明のペプチドへの結合するアビディティーは、数学的に条件と関係させ得る。オフターゲット結合およびアビディティーは、生体試料中のある分子と、ペプチドアレイ中の多数の、非同一ペプチドとの相互作用を含み得る。ある分子と、あるペプチドアレイ中の多数の、非同一ペプチドの結合アビディティーは、該分子の該ペプチドアレイに対する結合定数を決定し得る。ある態様において、試料中の抗体濃度は、例えば、該アレイ中で臨界数の抗体を捕捉し、抗体をアレイへ急速再結合をさせることにより、該ペプチドアレイへの結合アビディティーに寄与する。
複数生物学的分子のアレイへの結合アビディティーは、複数結合相互作用の組み合わせにより決定できる。抗体のペプチドアレイ中の複数ペプチドへの交差反応は、結合アビディティーに寄与し得る。ある態様において、抗体は、約３アミノ酸、約４アミノ酸、約５アミノ酸、約６アミノ酸、約７アミノ酸、約８アミノ酸、約９アミノ酸、約１０アミノ酸、約１１アミノ酸、約１２アミノ酸、約１３アミノ酸、約１４アミノ酸、約１５アミノ酸、約１６アミノ酸または約１７アミノ酸のエピトープを認識できる。ある態様において、約５アミノ酸の配列は、抗体のペプチドへの結合エネルギーを支配する。
分子の本発明のアレイへのオフターゲット結合および／またはアビディティーは、例えば、フェムトモル濃度(fM)からマイクロモル濃度(μM)解離定数の範囲の結合親和性を、ダイナミック・レンジの３対数のみを使用して定量的に測定できる範囲に効果的に圧縮し得る。分子は、アレイ中の多数のペプチドに１０３Ｍ−１以上の結合定数で結合できる。分子は、アレイ中の多数のペプチドに、１０３〜１０６Ｍ−１、２×１０３Ｍ−１〜１０６Ｍ−１の範囲の結合定数および／または１０４Ｍ−１〜１０６Ｍ−１の範囲の結合定数で結合できる。分子は、アレイ中の多数のペプチドに、約１fM、約２fM、約３fM、約４fM、約５fM、約６fM、約７fM、約８fM、約９fM、約１０fM、約２０fM、約３０fM、約４０fM、約５０fM、約６０fM、約７０fM、約８０fM、約９０fM、約１００fM、約２００fM、約３００fM、約４００fM、約５００fM、約６００fM、約７００fM、約８００fM、約９００fM、約１ピコモル濃度(pM)、約２pM、約３pM、約４pM、約５pM、約６pM、約７pM、約８pM、約９pM、約１０pM、約２０pM、約３０pM、約４０pM、約５０pM、約６０pM、約７pM、約８０pM、約９０pM、約１００pM、約２００pM、約３００pM、約４００pM、約５００pM、約６００pM、約７００pM、約８００pM、約９００pM、約１ナノモル濃度(nM)、約２nM、約３nM、約４nM、約５nM、約６nM、約７nM、約８nM、約９nM、約１０nM、約２０nM、約３０nM、約４０nM、約５０nm、約６０nM、約７０nM、約８０nM、約９０nM、約１００nM、約２００nM、約３００nM、約４００nM、約５００nM、約６００nM、約７００nM、約８００nM、約９００nM、約１μM、約２μM、約３μM、約４μM、約５μM、約６μM、約７μM、約８μM、約９μM、約１０μM、約２０μM、約３０μM、約４０μM、約５０μM、約６０μM、約７０μM、約８０μM、約９０μMまたは約１００μMの解離定数で結合できる。
分子は、アレイ中の多数のペプチドに、少なくとも１fM、少なくとも２fM、少なくとも３fM、少なくとも４fM、少なくとも５fM、少なくとも６fM、少なくとも７fM、少なくとも８fM、少なくとも９fM、少なくとも１０fM、少なくとも２０fM、少なくとも３０fM、少なくとも４０fM、少なくとも５０fM、少なくとも６０fM、少なくとも７０fM、少なくとも８０fM、少なくとも９０fM、少なくとも１００fM、少なくとも２００fM、少なくとも３００fM、少なくとも４００fM、少なくとも５００fM、少なくとも６００fM、少なくとも７００fM、少なくとも８００fM、少なくとも９００fM、少なくとも１ピコモル濃度(pM)、少なくとも２pM、少なくとも３pM、少なくとも４pM、少なくとも５pM、少なくとも６pM、少なくとも７pM、少なくとも８pM、少なくとも９pM、少なくとも１０pM、少なくとも２０pM、少なくとも３０pM、少なくとも４０pM、少なくとも５０pM、少なくとも６０pM、少なくとも７pM、少なくとも８０pM、少なくとも９０pM、少なくとも１００pM、少なくとも２００pM、少なくとも３００pM、少なくとも４００pM、少なくとも５００pM、少なくとも６００pM、少なくとも７００pM、少なくとも８００pM、少なくとも９００pM、少なくとも１ナノモル濃度(nM)、少なくとも２nM、少なくとも３nM、少なくとも４nM、少なくとも５nM、少なくとも６nM、少なくとも７nM、少なくとも８nM、少なくとも９nM、少なくとも１０nM、少なくとも２０nM、少なくとも３０nM、少なくとも４０nM、少なくとも５０nm、少なくとも６０nM、少なくとも７０nM、少なくとも８０nM、少なくとも９０nM、少なくとも１００nM、少なくとも２００nM、少なくとも３００nM、少なくとも４００nM、少なくとも５００nM、少なくとも６００nM、少なくとも７００nM、少なくとも８００nM、少なくとも９００nM、少なくとも１μM、少なくとも２μM、少なくとも３μM、少なくとも４μM、少なくとも５μM、少なくとも６μM、少なくとも７μM、少なくとも８μM、少なくとも９μM、少なくとも１０μM、少なくとも２０μM、少なくとも３０μM、少なくとも４０μM、少なくとも５０μM、少なくとも６０μM、少なくとも７０μM、少なくとも８０μM、少なくとも９０μMまたは約１００μMの解離定数で結合できる。
生体試料由来の抗体のペプチドマイクロアレイへの結合のダイナミック・レンジは、結合のシグナルの検出された最大値と最小値の間の比として表される。結合のシグナルは、例えば、二次抗体を用いて検出した蛍光シグナルである。伝統的アッセイは、既定の、狭い結合のダイナミック・レンジにより制限される。本発明の方法およびアレイは、本発明のアレイにおけるペプチドへの抗体の結合を広範なダイナミック・レンジで検出できる。ある態様において、抗体結合の広いダイナミック・レンジは、対数尺度で検出できる。ある態様において、本発明の方法およびアレイは、最大２対数のダイナミック・レンジ、最大３対数のダイナミック・レンジ、最大４対数のダイナミック・レンジまたは最大５対数のダイナミック・レンジを使用する、アレイへの複数の抗体の結合パターンの検出を可能とする。
アレイにおける分子の組成は、分子のアレイへの結合アビディティーを規定し得る。複数の異なる分子を、健康状態の予防、処置、診断またはモニタリングに使用するアレイに存在させ得る。生体分子の非限定的例は、アミノ酸、ペプチド、ペプチド模倣物、タンパク質、組み換えタンパク質抗体(モノクローナルまたはポリクローナル)、抗体フラグメント、抗原、エピトープ、炭水化物、脂質、脂肪酸、酵素、天然産物、核酸(ＤＮＡ、ＲＮＡ、ヌクレオシド、ヌクレオチド、その構造類似体または組み合わせを含む)、栄養素、受容体およびビタミンを含む。ある態様において、アレイにおける分子は、エピトープの構造を模倣し、エピトープ誘発抗体と結合できる分子であるミモトープである。ある態様において、アレイにおける分子は、抗原のエピトープと結合する抗体(またはＴ細胞受容体)の可変領域中の部位を含む、パラトープまたはパラトープ模倣物である。ある態様において、本発明のアレイは、無作為ペプチド配列を含むペプチドアレイである。
ペプチドアレイ中の内部アミノ酸(intra-amino acid)距離は、ペプチドマイクロアレイの各ペプチド間の距離である。内部アミノ酸距離は、分子のアレイへのオフターゲット結合および／または結合アビディティーに寄与し得る。内部アミノ酸距離は、約０.５nm、約１nm、約１nm、１.１nm、約１.２nm、約１.３nm、約１.４nm、約１.５nm、約１.６nm、約１.７nm、約１.８nm、約１.９nm、約２nm、約２.１nm、約２.２nm、約２.３nm、約２.４nm、約２.５nm、約２.６nm、約２.７nm、約２.８nm、約２.９nm、約３nm、約３.１nm、約３.２nm、約３.３nm、約３.４nm、約３.５nm、約３.６nm、約３.７nm、約３.８nm、約３.９nm、約４nm、約４.１nm、約４.２nm、約４.３nm、約４.４nm、約４.５nm、約４.６nm、約４.７nm、約４.８nm、約４.９nm、約５nm、約５.１nm、約５.２nm、約５.３nm、約５.４nm、約５.５nm、約５.６nm、約５.７nm、約５.８nm、約５.９nmおよび／または約６nmであり得る。ある態様において、内部アミノ酸距離は６ナノメートル(nm)未満である。
内部アミノ酸距離は少なくとも０.５nm、少なくとも１nm、少なくとも１nm、少なくとも１.１nm、少なくとも１.２nm、少なくとも１.３nm、少なくとも１.４nm、少なくとも１.５nm、少なくとも１.６nm、少なくとも１.７nm、少なくとも１.８nm、少なくとも１.９nm、少なくとも２nm、少なくとも２.１nm、少なくとも２.２nm、少なくとも２.３nm、少なくとも２.４nm、少なくとも２.５nm、少なくとも２.６nm、少なくとも２.７nm、少なくとも２.８nm、少なくとも２.９nm、少なくとも３nm、少なくとも３.１nm、少なくとも３.２nm、少なくとも３.３nm、少なくとも３.４nm、少なくとも３.５nm、少なくとも３.６nm、少なくとも３.７nm、少なくとも３.８nm、少なくとも３.９nm、少なくとも４nm、少なくとも４.１nm、少なくとも４.２nm、少なくとも４.３nm、少なくとも４.４nm、少なくとも４.５nm、少なくとも４.６nm、少なくとも４.７nm、少なくとも４.８nm、少なくとも４.９nm、少なくとも５nm、少なくとも５.１nm、少なくとも５.２nm、少なくとも５.３nm、少なくとも５.４nm、少なくとも５.５nm、少なくとも５.６nm、少なくとも５.７nm、少なくとも５.８nmまたは少なくとも５.９nmであり得る。
内部アミノ酸距離は長くて０.５nm、長くて１nm、長くて１nm、長くて１.１nm、長くて１.２nm、長くて１.３nm、長くて１.４nm、長くて１.５nm、長くて１.６nm、長くて１.７nm、長くて１.８nm、長くて１.９nm、長くて２nm、長くて２.１nm、長くて２.２nm、長くて２.３nm、長くて２.４nm、長くて２.５nm、長くて２.６nm、長くて２.７nm、長くて２.８nm、長くて２.９nm、長くて３nm、長くて３.１nm、長くて３.２nm、長くて３.３nm、長くて３.４nm、長くて３.５nm、長くて３.６nm、長くて３.７nm、長くて３.８nm、長くて３.９nm、長くて４nm、長くて４.１nm、長くて４.２nm、長くて４.３nm、長くて４.４nm、長くて４.５nm、長くて４.６nm、長くて４.７nm、長くて４.８nm、長くて４.９nm、長くて５nm、長くて５.１nm、長くて５.２nm、長くて５.３nm、長くて５.４nm、長くて５.５nm、長くて５.６nm、長くて５.７nm、長くて５.８nm、長くて５.９nmおよび／または長くて６nmであり得る。ある態様において、内部アミノ酸距離は長くて６ナノメートル(nm)である。
内部アミノ酸距離は０.５nm〜１nm、０.５nm〜２nm、０.５nm〜３nm、０.５nm〜３nm、０.５nm〜４nm、０.５nm〜５nm、０.５nm〜６nm、１nm〜２nm、１nm〜３nm、１nm〜４nm、１nm〜５nm、１nm〜６nm、２nm〜３nm、２nm〜４nm、２nm〜５nm、２nm〜６nm、３nm〜４nm、３nm〜５nm、３nm〜６nm、４nm〜５nm、４nm〜６nmおよび／または５nm〜６nmの範囲であり得る。
ペプチドアレイは、表面に複数の異なるペプチドパターンを含み得る。ペプチドアレイは、例えば、種々の複数のペプチドおよび／または分子の１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個および／または１０個の複製を含み得る。ある態様において、複数の異なるペプチドを、ペプチドアレイの表面に複写で(in replica)スポットする。ペプチドアレイは、例えば、アレイ上に均一に分散した多数のペプチドを含み得る。ペプチドアレイは、例えば、アレイ上に不均一に分散した多数のペプチドを含み得る。
ペプチドを、ペプチドアレイに“スポット”し得る。ペプチドスポットは種々の幾何学的形状を有してよく、例えば、ペプチドスポットは円形、方形、矩形および／または三角形であり得る。ペプチドスポットは複数の径を有し得る。ペプチドスポット径の非限定的例は、約３μm〜約８μm、約３〜約１０mm、約５〜約１０mm、約１０μm〜約２０μm、約３０μm、約４０μm、約５０μm、約６０μm、約７０μm、約８０μm、約９０μm、約１００μm、約１１０μm、約１２０μm、約１３０μm、約１４０μm、約１５０μm、約１６０μm、約１７０μm、約１８０μm、約１９０μm、約２００μm、約２１０μm、約２２０μm、約２３０μm、約２４０μmおよび／または約２５０μmである。
ペプチドアレイは、多くの異なるペプチドを含み得る。ある態様において、ペプチドアレイは、約１０個のペプチド、約５０個のペプチド、約１００個のペプチド、約２００個のペプチド、約３００個のペプチド、約４００個のペプチド、約５００個のペプチド、約７５０個のペプチド、約１０００個のペプチド、約１２５０個のペプチド、約１５００個のペプチド、約１７５０個のペプチド、約２,０００個のペプチド、約２,２５０個のペプチド、約２,５００個のペプチド、約２,７５０個のペプチド、約３,０００個のペプチド、約３,２５０個のペプチド、約３,５００個のペプチド、約３,７５０個のペプチド、約４,０００個のペプチド、約４,２５０個のペプチド、約４,５００個のペプチド、約４,７５０個のペプチド、約５,０００個のペプチド、約５,２５０個のペプチド、約５,５００個のペプチド、約５,７５０個のペプチド、約６,０００個のペプチド、約６,２５０個のペプチド、約６,５００個のペプチド、約７,５００個のペプチド、約７,７２５個のペプチド８,０００個のペプチド、約８,２５０個のペプチド、約８,５００個のペプチド、約８,７５０個のペプチド、約９,０００個のペプチド、約９,２５０個のペプチド、約１０,０００個のペプチド、約１０,２５０個のペプチド、約１０,５００個のペプチド、約１０,７５０個のペプチド、約１１,０００個のペプチド、約１１,２５０個のペプチド、約１１,５００個のペプチド、約１１,７５０個のペプチド、約１２,０００個のペプチド、約１２,２５０個のペプチド、約１２,５００個のペプチド、約１２,７５０個のペプチド、約１３,０００個のペプチド、約１３,２５０個のペプチド、約１３,５００個のペプチド、約１３,７５０個のペプチド、約１４,０００個のペプチド、約１４,２５０個のペプチド、約１４,５００個のペプチド、約１４,７５０個のペプチド、約１５,０００個のペプチド、約１５,２５０個のペプチド、約１５,５００個のペプチド、約１５,７５０個のペプチド、約１６,０００個のペプチド、約１６,２５０個のペプチド、約１６,５００個のペプチド、約１６,７５０個のペプチド、約１７,０００個のペプチド、約１７,２５０個のペプチド、約１７,５００個のペプチド、約１７,７５０個のペプチド、約１８,０００個のペプチド、約１８,２５０個のペプチド、約１８,５００個のペプチド、約１８,７５０個のペプチド、約１９,０００個のペプチド、約１９,２５０個のペプチド、約１９,５００個のペプチド、約１９,７５０個のペプチド、約２０,０００個のペプチド、約２０,２５０個のペプチド、約２０,５００個のペプチド、約２０,７５０個のペプチド、約２１,０００個のペプチド、約２１,２５０個のペプチド、約２１,５００個のペプチド、約２１,７５０個のペプチド、約２２,０００個のペプチド、約２２,２５０個のペプチド、約２２,５００個のペプチド、約２２,７５０個のペプチド、約２３,０００個のペプチド、約２３,２５０個のペプチド、約２３,５００個のペプチド、約２３,７５０個のペプチド、約２４,０００個のペプチド、約２４,２５０個のペプチド、約２４,５００個のペプチド、約２４,７５０個のペプチド、約２５,０００個のペプチド、約２５,２５０個のペプチド、約２５,５００個のペプチド、約２５,７５０個のペプチドおよび／または約３０,０００個のペプチドを含む。
ある態様において、健康モニタリング方法、処置方法、診断方法および状態の予防方法に使用するペプチドアレイは、３０,０００個を超えるペプチドを含む。ある態様において、健康モニタリング方法に使用するペプチドアレイは、約３３０,０００個のペプチド含む。ある態様において、アレイは約３０,０００個のペプチド、約３５,０００個のペプチド、約４０,０００個のペプチド、約４５,０００個のペプチド、約５０,０００個のペプチド、約５５,０００個のペプチド、約６０,０００個のペプチド、約６５,０００個のペプチド、約７０,０００個のペプチド、約７５,０００個のペプチド、約８０,０００個のペプチド、約８５,０００個のペプチド、約９０,０００個のペプチド、約９５,０００個のペプチド、約１００,０００個のペプチド、約１０５,０００個のペプチド、約１１０,０００個のペプチド、約１１５,０００個のペプチド、約１２０,０００個のペプチド、約１２５,０００個のペプチド、約１３０,０００個のペプチド、約１３５,０００個のペプチド、約１４０,０００個のペプチド、約１４５,０００個のペプチド、約１５０,０００個のペプチド、約１５５,０００個のペプチド、約１６０,０００個のペプチド、約１６５,０００個のペプチド、約１７０,０００個のペプチド、約１７５,０００個のペプチド、約１８０,０００個のペプチド、約１８５,０００個のペプチド、約１９０,０００個のペプチド、約１９５,０００個のペプチド、約２００,０００個のペプチド、約２１０,０００個のペプチド、約２１５,０００個のペプチド、約２２０,０００個のペプチド、約２２５,０００個のペプチド、約２３０,０００個のペプチド、約２４０,０００個のペプチド、約２４５,０００個のペプチド、約２５０,０００個のペプチド、約２５５,０００個のペプチド、約２６０,０００個のペプチド、約２６５,０００個のペプチド、約２７０,０００個のペプチド、約２７５,０００個のペプチド、約２８０,０００個のペプチド、約２８５,０００個のペプチド、約２９０,０００個のペプチド、約２９５,０００個のペプチド、約３００,０００個のペプチド、約３０５,０００個のペプチド、約３１０,０００個のペプチド、約３１５,０００個のペプチド、約３２０,０００個のペプチド、約３２５,０００個のペプチド、約３３０,０００個のペプチド、約３３５,０００個のペプチド、約３４０,０００個のペプチド、約３４５,０００個のペプチドおよび／または約３５０,０００個のペプチドを含む。ある態様において、健康モニタリング方法に使用するペプチドアレイは、３３０,０００個を超えるペプチドを含む。
ペプチドアレイは、多くの異なる個のペプチドを含み得る。ある態様において、ペプチドアレイは、少なくとも２,０００個のペプチド、少なくとも３,０００個のペプチド、少なくとも４,０００個のペプチド、少なくとも５,０００個のペプチド、少なくとも６,０００個のペプチド、少なくとも７,０００個のペプチド、少なくとも８,０００個のペプチド、少なくとも９,０００個のペプチド、少なくとも１０,０００個のペプチド、少なくとも１１,０００個のペプチド、少なくとも１２,０００個のペプチド、少なくとも１３,０００個のペプチド、少なくとも１４,０００個のペプチド、少なくとも１５,０００個のペプチド、少なくとも１６,０００個のペプチド、少なくとも１７,０００個のペプチド、少なくとも１８,０００個のペプチド、少なくとも１９,０００個のペプチド、少なくとも２０,０００個のペプチド、少なくとも２１,０００個のペプチド、少なくとも２２,０００個のペプチド、少なくとも２３,０００個のペプチド、少なくとも２４,０００個のペプチド、少なくとも２５,０００個のペプチド、少なくとも３０,０００個のペプチド、少なくとも４０,０００個のペプチド、少なくとも５０,０００個のペプチド、少なくとも６０,０００個のペプチド、少なくとも７０,０００個のペプチド、少なくとも８０,０００個のペプチド、少なくとも９０,０００個のペプチド、少なくとも１００,０００個のペプチド、少なくとも１１０,０００個のペプチド、少なくとも１２０,０００個のペプチド、少なくとも１３０,０００個のペプチド、少なくとも１４０,０００個のペプチド、少なくとも１５０,０００個のペプチド、少なくとも１６０,０００個のペプチド、少なくとも約１７０,０００個、少なくとも１８０,０００個のペプチド、少なくとも１９０,０００個のペプチド、少なくとも２００,０００個のペプチド、少なくとも２１０,０００個のペプチド、少なくとも２２０,０００個のペプチド、少なくとも２３０,０００個のペプチド、少なくとも２４０,０００個のペプチド、少なくとも２５０,０００個のペプチド、少なくとも２６０,０００個のペプチド、少なくとも２７０,０００個のペプチド、少なくとも２８０,０００個のペプチド、少なくとも２９０,０００個のペプチド、少なくとも３００,０００個のペプチド、少なくとも３１０,０００個のペプチド、少なくとも３２０,０００個のペプチド、少なくとも３３０,０００個のペプチド、少なくとも３４０,０００個のペプチド、少なくとも３５０,０００個のペプチドを含む。ある態様において、健康モニタリング方法に使用するペプチドアレイは、少なくとも３３０,０００個のペプチドを含む。
ペプチドは、リンカー分子によりペプチドアレイに物理的に拘束されていてよいペプチドのＮ末端またはＣ末端をリンカー分子と結合できる。リンカー分子は、例えば、イミド官能基、アミン官能基、ヒドロキシル官能基、カルボキシル官能基、アルデヒド官能基および／またはスルフヒドリル官能基のような、アレイの表面に存在する複数性官能基(functional plurality)の分子であり得る。リンカー分子は、例えば、ポリマーであり得る。ある態様において、リンカーはマレイミドである。ある態様において、リンカーはグリシン−セリン−システイン(ＧＳＣ)またはグリシン−グリシン−システイン(ＧＧＣ)リンカーである。ある態様において、リンカーは、種々の長さまたは組成のポリペチドからなる。ある場合、リンカーは種々の長さのポリエチレングリコールである。さらに他の場合、リンカーは、ヒドロキシメチル安息香酸、４−ヒドロキシ−２−メトキシベンズアルデヒド、４−スルファモイル安息香酸またはペプチドを固形基質に結合させるのに適する他のものである。
ペプチドアレイの表面は複数の異なる材料を含み得る。ペプチドアレイの表面は、例えば、ガラスであり得る。ペプチドアレイの表面を構成し得る材料の非限定的例は、ガラス、官能基化ガラス、ケイ素、ゲルマニウム、ガリウムヒ素、ガリウムリン、二酸化ケイ素、酸化ナトリウム、シリコン窒化物、ニトロセルロース、ナイロン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリビニリデンジフルオリド、ポリスチレン、ポリカーボネート、メタクリレートまたはこれらの組み合わせを含み得る。
ペプチドアレイの表面は平面でも、凹面でも、凸面でもよい。ペプチドアレイの表面は均一であってよく、アレイの表面は不均一であってよい。ある態様において、ペプチドアレイの表面は平面である。
ペプチドアレイの表面をコーティングで被覆してよい。コーティングは、例えば、本発明のアレイの接着能を改善できる。コーティングは、例えば、生体試料の本発明のアレイへの背景接着を減少できる。ある態様において、本発明のペプチドアレイは、アミノシランコーティングされたスライド・ガラスを含む。
ペプチドアレイは、複数の寸法を有し得る。ペプチドアレイはペプチドマイクロアレイであり得る。
アレイの製造
上記ペプチドアレイのような複合的バイオアレイを製造するためのパターニング技術を容易にするための方法もここに開示する。既存の方法は、表面上の規定位置にヘテロポリマーのライブラリーを製造するためのリソグラフィーまたは他のパターニング技術の使用が実現の可能性があることを示している。本方法は、ＤＮＡおよびペプチドアレイに広範に適用されている。最も単純な手法は、層状のヘテロポリマーのライブラリーの製造である。Ｍ個のモノマーの配列からなる長さＮのヘテロポリマーで論じる。一般に、層あたりパターニングがＭ工程あり、各モノマーあたり１工程である。Ｎ長の配列では、Ｎ層のパターニングとなる。パターニング工程の総数は、それゆえにＮ×Ｍである。
パターニングの他の面は、二進法事象であることである。換言すると、各パターニング工程における表面の任意領域は“露出”または“非露出”であり、ここで、露出は、パターニングに使用する放射、化学、エフェクターまたは力がどんなものであれそれに対する。この方法でのアッセイのパターニングは、ＭＮの可能性の配列空間を２Ｒ(ここで、Ｒはパターニング工程の総数である)の可能性の二進法空間に投影することである。原則として、Ｒの最小値は、二つの発現を等しく設定したときに与えられ、質問の回答は
Figure 0006873950
 に至る。
これは、ＭＮ空間の何らかのヘテロポリマーを、２Ｒ空間における一連のパターニング工程により表すことが可能であることを願うならば、パターニング工程の理論的最小値を表す。層毎のアルゴリズム(Ｍ×Ｎ)のパターニング工程数と上記Ｒの最小値を比較でき、下記表１に示す。
Figure 0006873950
Figure 0006873950
層毎の手法に含まれる工程数は、二進法表示の理論的最小値と比較して極めて大きい。通常のフォトリソグラフィー処理下で、各アミノ酸を別々に添加し、それゆえに、この手法を使用して異なるアミノ酸を選別するであろう二進コードを直接インプリントする方法がないことが問題である。しかしながら、一度に１層にのみアミノ酸を添加することも不要であり、必要なサイクル数を顕著に変化させる。
本発明の新規パターニング方法を以下に記載する。例示的態様において、１０種のモノマーを使用して形成したヘテロポリマーのアレイを使用し、ヘテロポリマーを形成するためのモノマーのパーセンテージは等しく、すなわち、各モノマーにつき１０％である。第一パターニング工程はモノマーＡを添加する、すなわちヘテロポリマーの１０％は第一層にＡを有する。第二工程はモノマーＢと見なす。この態様において、第一層に割り当てられたモノマーの１０％はＢを有するが、さらに、現在利用可能な第二層の１０％(すなわち、第一層でＡを受けた１０％)はまたＢモノマーを受ける準備ができている。それゆえに、Ｂは実際に総アミン部位の１１％と結合する。モノマーＣを添加する第三工程で、第一層としてＣを受ける１０％のヘテロポリマーと、第二層の１０％の部位および既にＡおよびＢのいずれも添加されている第三層のために新しく開いた１０％の部位がある。この方法を継続し、最終的に表面上の各モノマーが、層あたり特定のモノマーを１０％しか添加していなくても、利用可能なアミンが２０％に近づいたレベルで安定化させる。これは、層毎の合成と比較して、特定の工程数で製造されるポリマーの平均長を約２倍増やす。
本方法をアルゴリズム形態で述べることができる。簡単にいうと、本方法は、再帰的に次モノマーを順番に命令した配列が利用可能な全層に付加する。特定の順番で、１サイクルのモノマーを何度も繰り返したとき、アルゴリズムは最大効果を有する。一般に、アルゴリズムは次の方法で働く。
・ ヘテロポリマーを製造するための一連のモノマーの選択。
・ 層あたり(残基あたり)カバーされている付加部位(例えば、ペプチド合成におけるアミン)の比の各モノマーへの割り当て。
○ 一つの態様において、比を１／(モノマー数)となるよう選択する。
○ 他の態様において、モノマーは合計１００％となる種々の比を有する。
○ 他の態様において、疑似無作為ペプチド配列を作製するとき、モノマーと関係する比は１００％を超えてよい。
・ 疑似無作為または無作為配列の使用を含む、一連の所望のヘテロポリマー配列の製造。
・ パターン化化学方法の使用：ヘテロポリマーのどの残基の位置が付加のために利用可能であるかに関係なく、所望の配列に従いペプチドを正確に伸長するであろう全位置に一モノマーを一度に添加。
○ 一つの態様において、本工程は、予定された順番でのモノマーにわたる循環を含む。これは、最小数のパターニング工程で最長ペプチドをもたらす。
各サイクルでの順番または付加は変えてもよく、または完全に無作為でもよいが、無作為の順番のパターニングは、特定の平均長を達成するために必要なパターニング工程数を増やす。
上記の比の割り当てを前提とすれば、何れかの特定の層があるモノマーの一定の比のみを持つ場合でも、このアルゴリズムを使用したパターニング工程で付加される実際の比はそれより可成り高い。パターニング工程における付加モノマー量を次のとおり評価できる。ｆｊは特定のモノマーを付加した層の比を意味するとする。全層に付加されたモノマーの比の全ての合計は
Figure 0006873950
 〔式中、ｉは現在のパターニング工程数であり；Ｚは、現在のモノマーを最後に添加したとき以来添加した異なるモノマーの数である。〕
となり、それゆえに、合計は、現在のモノマーを最後に添加したとき以来添加された全モノマーに関する層辺りの比を超える。
例示的態様をここに示す。この場合、１６アミノ酸を所定の１０,０００ペプチド配列の構築に使用する。図２７は、パターニング工程数の関数として合成したペプチドの平均長を示す。Ｙ軸は平均ペプチド長であり、Ｘ軸はパターニングサイクル数である。ほぼ全ての数のパターニングサイクルに関して、最適化モデルは、約２倍製造効率を改善していることが解る。
本発明を使用する疑似無作為ペプチドを製造するための他の手法は、この方法を使用してコンピューター的に極めて多数のペプチド配列を製造することであるが、そうであれば、アレイの生産に最長の１個を含むだけである。この手法は、アミノ酸が添加された順番に類する順番を有する配列へのバイアスをもたらす(一般に連続的ではないが)。得られた配列は、なお大量の空間を被覆し、無作為の程度は実施者がどの分散の比を選択するかによる。図３０を参照して、１６種のアミノ酸を使用した最適化アルゴリズムの７０工程に由来する分散の態様を下に記載する。これらの配列の上位５％は平均約１２残基長であり、アレイの実際の合成のために選択でき、他の配列を廃棄する。パターニング工程数を６０まで減らしたら、最長ペプチドの０.５％の選択によりほぼ同一平均ペプチド長を得ることができる。再び、使用するパターニング工程数が少ないと、ペプチドのライブラリーに大きな配列バイアスがかかるが、あるバイアスが許容できる程度まで、パターニング工程数を大きく減らしてよい。
ある態様において、本発明の使用は、１００あまりのパターニング工程で、１６種の酸を使用して１２残基の平均長を有する規定配列のペプチドのアレイを製造できる。しかしながら、特異的集合の配列で特異的集合のヘテロポリマーの製造を試みる態様では、各配列の最後まで本質的にＭ×Ｎパターニング工程まで到達しなかった。配列画分が予定より１または２モノマー短く終了する態様において、我々は、Ｍ×Ｎよりはるかに少ない工程で配列を製造できた。図２８は、標準的な層毎のアプローチと最適化アルゴリズムを使用した全２０アミノ酸を使用した結果を示す。
他の態様は、間にヒトプロテオームのような全プロテオームをカバーする重複ペプチド配列の製造を考慮する。エピトープの発見またはタンパク質または小分子の結合部位を同定するためにこのようなアレイを使用できる。直鎖状エピトープを、例えば、３〜５アミノ酸重複を伴う１２〜１５残基長のペプチドのアレイを使用して同定できる。このようなアレイを製造するために、表面上にさらに数百万のペプチドを必要とする。これは、最適化アルゴリズムを使用して約１４０工程、層毎の手法を使用して２６０手順を必要とする平均長１３残基のアレイの製造により達成される。
ここに開示したアレイを上記免疫署名と共に使用できる。免疫署名と共に使用するとき、アレイ上の多様な長さのペプチドが許容され、また望ましいこともある。平均１２残基のペプチドおよび１６種のアミノ酸の使用が、免疫署名についてうまく機能することが示されており、図２７に示すとおり、このようなペプチドの無作為アレイを、１００あまりのパターニング工程で製造できる。対照的に、層毎の合成には１９２工程を要する。
免疫署名の使用はまた完全には無作為ではないペプチドを用いても効果的に達成できる。純粋に無作為なものより少ない工程で疑似無作為ペプチドを製造するためにこのアルゴリズムを使用するには２つの方法がある。１６タイプのモノマー、すなわちアミノ酸を使用するアレイの例を考える場合、１６個ではなく８個のみのアミノ酸を使用するようにアミノ酸サイクルを単純化できるが、その後、使用した８アミノ酸の複数セットを交互に使用する。このモノマー付加方法は、シリーズの最初の少ないアミノ酸が、最初の８個のセットへのバイアスがかかることを意味する。最終的に、バイアスは減っていくが、完全には消失しない。図２９はこの態様の結果を示し、６０回未満の工程で平均１２残基長を達成できる。
検出
試料成分とアレイの結合相互作用を多様な形式で検出できる。いくつかの形式において、試料成分を標識する。標識はとりわけ放射性同位体または色素であり得る。標識は、試料を得る前に標識を患者に投与することにより、または試料もしくはその中の選択的成分に標識を結合させることにより、供給できる。
結合相互作用を、抗体のような二次検出剤を使用しても検出できる。例えば、試料中の抗体のアレイへの結合を、抗体のアイソタイプ(例えば、ＩｇＧ(ＩｇＧｌ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４のようなあらゆるサブタイプを含む)、ＩｇＡ、ＩｇＭ)に特異的な二次抗体を使用して検出できる。二次抗体は、通常標識され、特定のアイソタイプの解析する試料中の全抗体と結合できる。種々のアイソタイプ特性を有する種々の二次抗体を使用できる。同一試料中の種々のアイソタイプの抗体が結合する化合物が実質的に重複することはしばしばあるが、プロファイルの差異もある。
結合相互作用を、表面プラズモン共鳴(ＳＰＲ)およびマススペクトロメトリーのような無標識方法を使用しても検出できる。ＳＰＲは、解離定数および解離速度の指標を提供できる。例えば、A-100 Biocore/GE装置がこのタイプの解析に適する。FLEXchipsを使用して、同一支持体上の最大４００の結合反応を分析できる。
所望により、試料成分とアレイの結合相互作用を競合形式で検出できる。結合の競合的阻害剤の存在下および非存在下の、アレイの試料への結合プロファイルの差異は、試料の特徴付けに有用であり得る。競合的阻害剤は、例えば、病原体または病原体に対する抗体のような疾患状態と関係する既知タンパク質であり得る。このような競合剤存在下でのアレイのメンバーの試料への結合の減少は、病原体の存在を示す。ライブラリーメンバーを標的と接触させるときの塩、イオン強度、有機溶媒含量および温度を変えることによりストリンジェンシーを調節できる。
酵素結合免疫吸着検定法(ＥＬＩＳＡ)のような抗体ベースの検出方法を使用して、本発明のアレイへの結合パターンを検出できる。例えば、免疫グロブリンの特定のアイソタイプ、例えばＩｇＭアイソタイプを検出する二次抗体を使用して、対象の複合的生体試料からの複数のＩｇＭ抗体のアレイへの結合パターンを検出できる。二次抗体は、例えば蛍光基または放射性標識のような検出可能標識に結合してよい。
本発明は、複数の異なる抗体の本発明のアレイへのオフターゲット結合を検出するためのアレイおよび方法を提供する。複合的生体試料中の複数の抗体は、ペプチドマイクロアレイの多数のペプチドとオフターゲット結合できる。ある態様において、少なくとも１抗体のペプチドアレイ中の多数のペプチドへのオフターゲット結合の検出が免疫署名を形成し得る。抗体の複数クラスまたはアイソタイプは、アレイのオフターゲット結合パターンを提供できる。抗体または免疫グロブリンはＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよび／またはＩｇＭ抗体であり得る。
複合的生体試料からの少なくとも１個のＩｇＭ抗体のペプチドアレイへの結合パターンは免疫署名を形成できる。ＩｇＭ抗体は、複数免疫グロブリンが互いにジスルフィド結合により共有結合しているポリマを形成できる。ＩｇＭポリマーは五量体であり得る。ＩｇＭアイソタイプに備わった抗体の多量体性質は、試料のアレイへのオフターゲット結合を増やし得る。抗体の多量体性質は、試料のアレイへの結合アビディティーを高め得る。例えば、多量体ＩｇＭアイソタイプ抗体である抗体のペプチドマイクロアレイへの結合パターンは、独特な五量体誘導免疫署名を形成できる。
ＩｇＡ抗体はＩｇＡ１またはＩｇＡ２抗体であり得る。ＩｇＡアイソタイプの抗体は二量体を形成できる。ＩｇＧ抗体はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４抗体であり得る。ＩｇＧアイソタイプ抗体は単量体として存在する。ＩｇＤおよび／またはＩｇＥ抗体は単量体を形成できる。ある態様において、本発明は、対象の複合的生体試料からの少なくとも１個のＩｇＭ抗体のペプチドアレイへのオフターゲット結合を検出できる。
対象の生涯にわたる対象のモニタリング
本発明の方法、デバイス、キット、アレイおよびシステムは、対象の生涯にわたり対象をモニタリングするのに使用できる。対象の生涯は生まれてから対象に何が起こっているかを意味し得る。本発明の方法、アレイ、キットおよびシステムでの対象の健康のモニタリングは、対象のカルテまたは電子カルテ(ＥＭＲ)に含ませてよい。
電子カルテ(ＥＭＲ)は、対象の医師、臨床医、保険会社、病院および／または対象が患者である他の施設により得られ、保存された記録に関し得る。ある態様において、医師は医師、歯科医、検眼士、セラピスト、カイロプラクターおよび対象に医療サービスを提供する誰かであり得る。電子カルテ(ＥＭＲ)は、例えば、ＣＡＴスキャン、ＭＲＩ、超音波、血糖値、診断法、アレルギー、臨床検査結果、ＥＫＧ、投薬、デイリーチャート、投与薬、身体検査、入院時看護記録、看護計画、照会、現在および過去の症状、病歴、ライフスタイル、身体検査結果、試験、方法、処置、投薬、退院、歴史、日記、問題、所見、免疫処置、入院時診療記録、申し送り記録、経過記録、術前記録、手術記録、術後記録、治療記録、分娩記録、分娩後記録および退院記録を含み得る。
処置および状態
本発明のアレイおよび方法は、例えば、対象の複数の異なる状態の診断、モニタリング、特徴づけおよび処置指針として使用できる。対象はヒト、モルモット、イヌ、ネコ、ウマ、マウス、ウサギおよび種々の他の動物であってよい。対象はあらゆる年齢であってよく、例えば、対象は乳児、幼児、小児、少年期、青年期、成人または高齢者であり得る。
対象の状態は、疾患状態または健康な状態に対応し得る。ある態様において、対象の状態は健康な状態であり、本発明の方法は健康な状態をモニタリングする。ある態様において、対象の状態は疾患状態であり、本発明の方法を状態および／または該状態の進行の診断／モニタリングに使用する。本発明の方法はまた状態の予防にも使用できる。ある態様において、本発明の方法を予防処置と共に使用する。
ここに開示するアレイデバイスおよび方法は、重要なことに多様な疾患および／または状態を同時に検出かつモニタリングする。例えば、ここに開示するアレイデバイスおよび方法は、同一アレイで炎症状態、癌疾患および病原性感染を同時に検出できる。したがって、わずか１個のアレイしか、すなわち１個の免疫署名アッセイしか、広範な疾患および状態の検出に必要ではない。それゆえに、対象の生涯にわたるモニタリングは、実施した全免疫署名により、対象の健康状態の時系列のスナップショットを提供する。これは、対象の健康状態の包括的なおよび特異的な変化を検出する強力な手段となり、免疫署名アッセイの高感度と共に、個々の健康状態の何らかの変化の極めて早期の段階での検出が可能なシステムを提供する。
したがって、ここに開示する方法、システムおよびアレイデバイスは、疾患および／または状態の早期段階で、疾患および／または状態の検出、診断、モニタリング、予防および／または処置ができる。例えば、ここに開示する方法、システムおよびアレイデバイスは、従来のバイオマーカーベースのアッセイより数日または数週間早く、疾患および／または状態を検出、診断およびモニタリングできる。さらに、わずか１個のアレイ、すなわち、１個の免疫署名アッセイしか、炎症状態、癌および病原性感染症を含む広範な疾患および状態の検出、診断およびモニタリングに必要としない。
本発明のアレイおよび方法はまた、例えば、癌の診断、モニタリング、予防および／または処置にも使用できる。本発明のアレイおよび方法で診断、モニタリング、予防および／または処置できる癌の非限定的例は、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄球性白血病、副腎皮質癌、ＡＩＤＳ関連癌、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、肛門癌、虫垂癌、星状細胞腫、基底細胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨の癌、脳腫瘍、例えば小脳星状細胞腫、脳星状細胞腫／悪性神経膠腫、上衣腫、髄芽腫、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、視覚路および視床下部神経膠腫、乳癌、気管支腺腫、バーキットリンパ腫、原発不明癌、中枢神経系リンパ腫、小脳星状細胞腫、子宮頸部癌、小児癌、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄増殖性障害、結腸癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、子宮内膜癌、上衣腫、食道癌、ユーイング肉腫、胚細胞腫瘍、胆嚢癌、胃癌、消化器カルチノイド腫瘍、消化器間質腫瘍、神経膠腫、ヘアリー細胞白血病、頭頸部癌、心癌、肝細胞(肝臓)癌、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、眼内黒色腫、島細胞癌、カポジ肉腫、腎癌、喉頭癌、口唇および口腔癌、脂肪肉腫、肝癌、肺癌、例えば非小細胞および小細胞肺癌、リンパ腫、白血病、マクログロブリン血症、骨の悪性線維性組織球腫／骨肉腫、髄芽腫、黒色腫、中皮腫、原発不明の転移扁平上皮頸部癌、口腔の癌、多発性内分泌腫瘍症候群、骨髄異形成症候群、骨髄球性白血病、鼻腔および副鼻腔癌、鼻咽頭癌、神経芽腫、非ホジキンリンパ腫、非小細胞性肺癌、口腔癌、中咽頭癌、骨肉腫／骨の悪性線維性組織球腫、卵巣癌、卵巣上皮癌、卵巣胚細胞腫瘍、膵癌、膵癌島細胞、副鼻腔および鼻腔癌、副甲状腺癌、陰茎癌、咽頭癌、褐色細胞腫、松果体星状細胞腫、松果体胚細胞腫、下垂体腺腫、胸膜肺芽細胞腫、血漿細胞腫瘍、原発性中枢神経系リンパ腫、前立腺癌、直腸癌、腎細胞癌、腎盂および輸尿管移行細胞癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、肉腫、皮膚癌、皮膚癌のメルケル細胞、小腸癌、軟組織肉腫、扁平上皮細胞癌、胃癌、Ｔ細胞リンパ腫、咽頭、胸腺腫、胸腺癌、甲状腺癌、栄養膜腫瘍(妊娠性)、原発部位未知癌、尿道癌、子宮肉腫、膣癌、外陰癌、ワルデンストレームマクログロブリン血症およびウィルムス腫瘍を含み得る。
ある態様において、本発明の方法は、免疫系が関係する状態を診断、モニタリング、予防および／または処置できる。免疫系が関係する障害の非限定的例は、自己免疫障害、炎症性疾患、ＨＩＶ、リウマチ性関節炎、Ｉ型糖尿病、全身性エリテマトーデス、強皮症、多発性硬化症、重症複合免疫不全(ＳＣＩＤ)、ディジョージ症候群、毛細血管拡張性運動失調症、季節性アレルギー、通年性アレルギー、食物アレルギー、アナフィラキシー、肥満細胞症、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、パーキンソン、アルツハイマー、脾機能亢進、白血球粘着不全症、Ｘ連鎖型リンパ増殖性疾患、Ｘ連鎖型無ガンマグロブリン血症、選択的免疫グロブリンＡ不全症、高ＩｇＭ症候群、自己免疫性リンパ増殖性症候群、ウィスコット・アルドリッチ症候群、慢性肉芽腫性疾患、分類不能型免疫不全症(ＣＶＩＤ)、高免疫グロブリンＥ症候群および橋本甲状腺炎を含み得る。
本発明は状態の予防方法を提供でき、該方法は、ａ) 対象から複合的生体試料を得て；ｂ) 該複合的生体試料をペプチドアレイと接触させ、ここで、該ペプチドアレイは複合的生体試料中の少なくとも１種の抗体とオフターゲット結合できる種々のペプチドを含み、ｃ) 該複合的生体試料の複数の異なるペプチドへのオフターゲット結合を測定して免疫署名を形成し、ｄ) 該免疫署名と状態を関連させ、そしてｅ) 該状態のための処置を受けることを含む。
ある態様において、本発明の方法は予防処置と組み合わせて使用できる。例えば、ワクチンが予防処置であり得る。予防処置として機能するワクチンの非限定的例は、ポリオワクチン、天然痘ワクチン、麻疹ワクチン、ムンプスワクチン、ヒト乳頭腫ウイルス(ＨＰＶ)ワクチンおよびインフルエンザワクチンを含む。ある態様において、本発明の方法を、例えば、予防ワクチンに対する対象の応答のモニタリングに使用できる。
ある態様において、本発明は、処置を提供する方法を提供し、該方法は、ａ) 対象から複合的生体試料を入手し、ｂ) 該複合的生体試料をペプチドアレイと接触させ、ここで、該ペプチドアレイは該生体試料中の少なくとも１種の抗体とオフターゲット結合できる種々のペプチドを含み、ｃ) 該抗体の複数の異なるペプチドへのオフターゲット結合を測定して免疫署名を形成し、ｄ) 該免疫署名と状態を関連させ、そしてｅ) 該状態に対する処置を提供することを含む。
ある態様において、本発明は診断方法を提供でき、該方法は、ａ) 対象から複合的生体試料を入手し、ｂ) 該複合的生体試料をペプチドアレイと接触させ、ここで、該ペプチドアレイは該生体試料中の少なくとも１種の抗体とオフターゲット結合できる種々のペプチドを含み、ｃ) 該複合的生体試料の一群の種々のペプチドへのオフターゲット結合を測定して免疫署名を形成し、そしてｄ) 該免疫署名に基づき状態を診断することを含む。
ある態様において、本発明の方法は、状態の診断、モニタリングおよび処置方法として提供できる。状態の処置方法は、対象の状態または疾患の処置を目的とした治療剤の処方を必要とし得る。ある態様において、治療剤は、約１mg〜約２０００mg、約５mg〜約１０００mg、約１０mg〜約５００mg、約５０mg〜約２５０mg、約１００mg〜約２００mg、約１mg〜約５０mg、約５０mg〜約１００mg、約１００mg〜約１５０mg、約１５０mg〜約２００mg、約２００mg〜約２５０mg、約２５０mg〜約３００mg、約３００mg〜約３５０mg、約３５０mg〜約４００mg、約４００mg〜約４５０mg、約４５０mg〜約５００mg、約５００mg〜約５５０mg、約５５０mg〜約６００mg、約６００mg〜約６５０mg、約６５０mg〜約７００mg、約７００mg〜約７５０mg、約７５０mg〜約８００mg、約８００mg〜約８５０mg、約８５０mg〜約９００mg、約９００mg〜約９５０mgまたは約９５０mg〜約１０００mgの範囲で処方され得る。
ある態様において、少なくとも１mg、少なくとも５mg、少なくとも１５mg、少なくとも１５mg、少なくとも２０mg、少なくとも２５mg、少なくとも３０mg、少なくとも３５mg、少なくとも４０mg、少なくとも４５mg、少なくとも５０mg、少なくとも５５mg、少なくとも６０mg、少なくとも６５mg、少なくとも７０mg、少なくとも８０mg、少なくとも８５mg、少なくとも９０mg、少なくとも１００mg、少なくとも１５０mg、少なくとも２００mg、少なくとも２５０mg、少なくとも３００mg、少なくとも３５０mg、少なくとも４００mg、少なくとも４５０mg、少なくとも５００mg、少なくとも５５０mg、少なくとも６００mg、少なくとも６５０mg、少なくとも７００mg、少なくとも７５０mg、少なくとも８００mg、少なくとも８５０mg、少なくとも９００mg、少なくとも９５０mgまたは少なくとも１０００mgの治療剤が処方される。
本発明のアレイおよび方法は使用者により使用できる。複数の使用者が、状態の発症をモニタリング、診断、処置または予防するために本発明の方法を使用できる。使用者は、例えば、自分の健康をモニタリングすることを望む人であり得る。使用者は、例えば、健康管理提供業者であり得る。健康管理提供業者は、例えば、医師であり得る。ある態様において、使用者は、対象を看護する健康管理提供業者である。本発明の使用者であり得る医師および健康管理提供業者の非限定的例は、麻酔科医、肥満外科手術専門家、血液貯蔵輸血医学専門家、心臓電気生理学者、心臓外科医、心臓病専門医、看護助手、臨床的心臓電気生理学専門家、臨床的神経生理学専門家、専門看護師、結腸直腸外科医、救命医療専門家、救命医療外科専門医、歯科衛生士、歯科医、皮膚科医、救命士、救急医療医、消化器外科医、血液学者、ホスピスケアおよび緩和医療専門家、ホメオパシー専門家、感染性疾患専門家、内科医、顎顔面外科医、医療助手、検察医、遺伝医学者、腫瘍内科医、助産師、新生児−周産期専門家、腎臓学者、神経学者、神経外科医、核医学専門家、看護師、上級看護師、産科医、腫瘍学者、口腔外科医、矯正歯科医、整形外科専門家、疼痛管理専門家、病理学者、小児科医、灌流技師、歯周治療専門医、形成外科医、足病医、肛門科医、装具専門家、精神医学者、呼吸器科医、放射線科医、外科医、胸部専門家、移植専門家、血管専門家、血管外科医および獣医師を含み得る。本発明のアレイおよび方法で確認した診断を対象のカルテに含ませてよい。
キット
本発明のデバイスをキットとして包装できる。ある態様において、キットはデバイス使用のための指示書を含む。書類は、例えば、ラベルであり得る。書類は、投与の方法の条件を示唆し得る。指示は、対象およびモニタリング医に、治療実施により最適臨床的アウトカムを達成するための最良の指導を提供する。
実施例１：癌の診断方法としての免疫署名
次の実施例は、本発明のアレイの例を用いる癌の診断方法を示す。本実施例では、複数の対象から、複数の異なる場所で採取した生体試料で本発明の方法を試験した、試験番号１および試験番号２の２試験を記載する。
ペプチドアレイ
種々の配列を含む、１０,０００個の非天然配列ペプチドの２種のライブラリーを２種のペプチドアレイにプリントした。ペプチドアレイ＃１は１０,４２０ペプチドを含み、試験番号１として実験的に試験した。ペプチドアレイ＃２は１０,２８６ペプチドを含み、試験番号２として実験的に試験した。
ライブラリー１は、１枚のスライド上で２個の完全なアッセイが利用可能であるが、アッセイあたりの配列あたり単一ペプチドしか利用可能でないようにプリントした。ライブラリー１スライドを、各チャンバーに分けたフレキシブルガスケット(Agilent, Santa Clara, CA)を備えた２個の物理的に分かれたチャンバーに区画化した。ライブラリー２は二個のペプチドをプリントしたが、スライドあたり一アッセイしか利用可能ではない。
試験番号１のペプチドはSigma Genosys(St. Louis, MO)および試験番号２のペプチドはAlta Biosciences(Birmingham, UK)が、アミン末端(試験番号１) またはカルボキシ末端(試験番号２) の一般的ＧＳＣリンカーと続く１７個の完全に無作為化したアミノ酸を用いて合成した。
アレイを、非接触ピエゾプリント技術を使用して、Applied arrays(Tempe, AZ)によりアミノシラン被覆スライド・ガラス(Schott, Jena, Germany)にプリントした。アレイを遮断緩衝液(ＢＢ＝１０nMリン酸緩衝化食塩水、ｐＨ７.３および０５％ＢＳＡ[Sigma Aldrich]、０.５％Ｔｗｅｅｎ)で１時間プレインキュベートし、１：５００希釈の血清を試料緩衝液(ＳＢ＝０.５％ＴｗｅｅｎのないＢＢ)で１時間、２５℃でインキュベートする。スライドを５nMのAlexaFluor 647結合抗ヒト二次(Rockland Antibodies, Gilbertsville, PA)に、１時間、ＳＢ中、２５℃で曝し、ＳＢで３回、続いて18MOhm水で５回洗浄し、１８００ｇで５’遠沈させて、乾燥する。アレイをAgilent ‘C'スキャナーで、高レーザー出力および７０％ＰＭＴを使用して、１０um解像度で６４７nmでスキャンする。ＴＩＦＦ画像をペプチド名と強度を結びつける対応するgalファイルと連携させる。
研究設計および生体試料
制御された実験を、癌診断について免疫署名システムを試験するために設計した。試験番号１は、古典的一連／盲検試験パラダイムを使用して、疾患あたり２〜３の異なるコホートから採取した少数の試料を試験する。試験番号２は、多数の採取場所由来の不均衡な多様なコホートからなる、数年にわたり処理した多数の疾患試料の交差検定である。
試験番号１の研究設計および生体試料：盲検式の一連試験の治験を、各５個の異なる癌と２０の他の点では健常な対照を使用して、２０個の非盲検式トレイニング試料の３個の技術的反復製造した。サイズを同等にした試験コホートを、盲検のままの試料のみ選択する以外、同じ無作為選択方法を使用して製造した。採取場所、採取日、年齢および性別を無作為化した。試料は、各２〜１０mlの静脈採血による血清または血漿であり、種々の時間−２０℃で保存した。試料を表２にさらに記載する。試料を複数の異なる場所で採取しており、その略語は次のとおりである：ASU: Arizona State University collection, Tempe, AZ; BNI: Barrow Neurological Institute, St. Joseph's Hospital and Medical Center, Phoenix, AZ; CC: Cleveland Clinic, Cleveland, OH; FHCRC: Fred Hutchison Cancer Research Center, Seattle, WA; MSKCC: Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, New York, NY; MMRF: Multiple Myeloma Research Foundation, Norwalk, CT; MS: Mt. Sinai Hospital, New York, NY; PCRT: Pancreatic Cancer Research Team, Phoenix, AZ; UTSW: University of Texas Southwestern Medical Center, Dallas, TX; UCI: University of California Irvine, Irvine, CA; UPitt: University of Pittsburg Dept. of Immunology, Pittsburgh, PA; およびUW: University of Washington Medical Center, Seattle, WA。表２では、共同研究者が採取を、しばしば種々の場所で採取した。略語は共同研究者がどこ出身かである。
Figure 0006873950
進行性膵癌(ＰＣ)、未処置多形神経膠芽腫(侵襲型の星状細胞腫)(ＧＢＭ)、食道腺癌(ＥＣ)、多発性骨髄腫(ＭＭ)およびステージIV乳癌(ＢＣ)の患者からの２０個の無作為に選択した血清試料を試験番号１で試験し、同時に２０個の混合した‘非疾患’対照(表２)も試験した。表２は、診断時に記され、分類に使用した原発性疾患状態を記載する。報告された全ての併存症は、分類目的で無視した。
試験番号２の研究設計および生体試料：１０の異なる共同研究者からの２１１８試料を、２００７年９月から２０１１年１月の間に試験番号２で免疫署名した。この治験で解析した血清銀行は、疾患、年齢、性別、民族性、報告された併存症あたりの患者数および“非疾患”コホートに貢献した対照数の点で本質的に不均衡である。技術的反復がピアソン相関係数＜０.８５を有した独立したアレイは解析しなかった。残ったアレイをComBatを使用してアレイバッチバイアスについて解析した。１５１６個の試料がこの試験で有用であると見なされた。
表３は試験番号２で使用した１５１６個の試料の詳細である。列１に挙げた各疾患状態について、利用可能な試料数を列２、疾患コホートに記載する。１００倍再サンプリング方法は、トレイニングで使用するための各疾患の約1/4の試料を選択した。トレイニングコホートの平均および標準偏差を列３、トレイニングサイズに記載する。試料を恵与された共同研究者の役職を列４、共同研究者に記載する。
Figure 0006873950
試験番号１
試験番号１は、本発明の方法による複数の癌の同時の、高精度分類を示す。試験番号１は、複数採取場所からの同数のトレイニングおよび試験試料での制御された実験を記載する(表２)。進行性膵癌(ＰＣ)、未処置多形神経膠芽腫(ＧＭＢ)、食道腺癌(ＥＣ)、多発性骨髄腫(ＭＭ)およびステージIV乳癌(ＢＣ)の患者からの２０の血清試料ならびに種々の場所で採取した２０の混合した“非疾患”対照を試験した。
トレイニングセットの全１２０試料での２回の技術的反復を通した平均ピアソン相関係数は０.９２±０.０５であった。乳癌は最低平均反復相関(０.８７)を示し、食道癌は最高(０.９６)であった。各疾患と健常者の間の差異の強度および整合性を計測するために、我々は、Ｎ＝２０の癌およびＮ＝２０の対照群の各々で一つずつＴ検定を行った。ｐ＜９.６×１０−５(１ＦＰ許容)のペプチドの数を、表４に絶対最小ｐ値と共に記載する。
表４は、試験番号１ペプチドのＴ検定統計解析結果を要約する。Ｔ検定を使用して、２０個の対照に対して各疾患の２０個のトレイニング試料を比較した。列１は疾患コホートを記載する。列２はペプチドの数をｐ値＜９.６×１０−５(１ＦＰ／１０,４８０ペプチドに対応)と共に記載する。列３はその比較での最小ｐ値である。列４は、少なくとも１個の他の疾患のペプチドと重複する上位１００の最も有意なものからのペプチドの数である。乳癌は他の疾患との重複は無かったが、ＧＭＢは他の３疾患のペプチドと重複した。
Figure 0006873950
Ｔ検定でＦＷＥＲ＝５％を有するペプチドのみを使用して、分類器としてサポートベクターマシン(ＳＶＭ)を使用して疾患対健常の完全二進法分類が可能であった。しかしながら、これは複数疾患分類性能の問題には対応しなかった。表４の最右端列は、各疾患で最も有意なＴ検定ペプチドの１００個を比較したとき少なくとも１種の他の疾患と重複するペプチドの数である。ある疾患は、他のものよりペプチド重複が多かった。
複数疾患の分類能を改善するために、重複特異性を有するペプチドにフィルターをかけた。第一に、ＡＮＯＶＡ／ＦＷＥＲ＝０.０５％をトレイニングセットに適応して、６群の各々と総平均が有意に異なる４,６２０個のペプチドを同定した。第二に、GeneSpring 7.3.1でのパターンマッチングを使用して、１個を超える疾患で高シグナルのペプチドを除いた。計１２０個のペプチドの最終特徴集合のために疾患あたり２４個のペプチドをこうして選択した。膵臓および乳癌は相対的に低い全体的シグナルを有し、食道および脳の癌ははるかに高いシグナルであったが、この選択方法は、分類器が強いシグナルおよび多くの有意なペプチドを有する疾患に圧倒されることを防いだ。トレイニングセットの一個抜き交差検証は、サポートベクターマシン(ＳＶＭ)を使用したとき２個の誤割り当てを生じた。次いで、試験デーデータセットをこれらの１２０個のペプチドを使用して分類し、表５に示すスコアとなった。
Figure 0006873950
アレイデータ解析
試験番号１について、３技術的反復を平均し、生物学的反復は平均しなかった。ピアソン相関係数＞０.８５に達しなかった技術的反復を再処理した。データは線グラフへの描出のためにメディアン正規化され、ｌｏｇ１０変換された。分類のための最初のペプチドの選択はＡＮＯＶＡを使用して行い、５％に設定したファミリー基準過誤率(ＦＷＥＲ)を使用してＴ検定を複数試験を補正した。ペプチドのさらなるフィルタリングを、類似性測度としてユークリッド距離／平均結合を用いてGeneSpringの“発現プロファイル”を使用して行った。このフィルターのために、各疾患群(疾患)を他の全疾患群(非疾患と累積的に呼ぶ)と比較した。疾患で一貫して高いシグナルかつ非疾患で一貫して低いシグナルのペプチドを選択し、疾患と非疾患の間のシグナル平均差が＞３倍であることを確実にした。多疾患分類のために、疾患辺り同数のペプチド(特性)が、高平均シグナルが特性選択にバイアスがかかることを妨げるが、分類性能がほぼ生の値に基づくことを確実にするために、さらなるデータ前処理は行わなかった。
分類を、分類器としてサポートベクターマシン(ＳＭＶ)を使用してR version 2.6.2で行った。サポートベクターマシン(ＳＶＭ)を使用した試験番号１の誤分類スコアを表６に示す。真および偽判定を灰色領域で示し、性能統計を白色領域に示す。平均精度は０.９５で、第９５パーセンタイル値ＣＩ＝０.８９４３、０.９９８１、カッパ＝０.９４であった。正確な判定は固有ベクトルにあり、ある群の何らかの誤割り当ては他群で偽陽性を与える。
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図１は、ここに記載するクラスタリングおよび分類方法で決定した相対的群間および群内差の視覚表示を示す。図１に示す定量的差は表６に記載する。左上：ＰＣＡからの最初の主成分(分類するために使用せず、示すだけ)をＸ軸およびＹ軸にプロットする。試験デーデータセットからの２０試料を疾患で標識する：ＢＣ＝乳癌；ＥＣ＝食道癌；Ｎ＝正常ドナー；ＰＣ＝膵癌；ＭＭ＝多発性骨髄腫；およびＢｒＣ＝ＧＭＢ脳の癌。右上：ＬＤＡからの最初の２個の線形判別子を、Ｘ軸およびＹ軸に上記の疾患略語を用いプロットした。左した：選択で残ったサポートベクターの２個をＸ軸およびＹ軸にプロットする。右下：２個の単純ベイズ予測変数をＸ軸およびＹ軸にプロットする。
図２は、ノードを概算するためにユークリッド距離と平均結合を使用した対立階層的クラスタリングを使用した１２０ペプチド(Ｙ軸)および１２０患者(Ｘ軸)のヒートマップを示す。
この階層は、有色系統樹を左に明示的に示す。ペプチドのｋ平均法クラスタリング(ｋ＝５群、１〜Ｖに番号付け)の結果を各ヒートマップの左に示す。非癌対照を非疾患ペプチドの選択に使用せず、それゆえに、５群のペプチドと６群の患者がある。パネルＡは、１２０種の選択された特性を使用するトレイニングデータ集合のヒートマップを示す。パネルＢは、同じ１２０個のペプチドを使用してクラスター化した非混合試験データを示す。注：ペプチド群番号はｋ平均法に従うが、ペプチドを最クラスター化した。
試験番号２
試験番号２は、免疫署名が、乳癌の３サブタイプを含む１４種の疾患を分類できるかを試験した。１５３６試料を使用して、一連の２５５の差別的なペプチドを製造した。交差検証試験において、免疫署名は９８％正確であった。表３は、試験番号２で解析した１５１６試料コホートで使用した試料を記載する。表４に記載するとおり、１００個のＴ検定ペプチドを各疾患対対照群で選択した。
試験番号２について、分類性能の非バイアス評価をするための再サンプリング方法を使用した。次の工程を１００回繰り返し、結果は１００トレイニング／試験反復の平均である。第一に、各疾患について「２５％±７％の試料を補充せずに除き、特性選択のトレイニングに使用した。特性選択は、各回正確に２５５総ペプチドを選択した。コホートサイズの７％偏差は疾患有病率および／または試料利用能の自然の偏差を模倣する。交差検証を、トレイニングから選択した２５５特性を使用する残った〜７５％の試料の分類により実施した。第９５パーセンタイル値信頼区間を全統計学的評価から計算した。試験番号２は、試験番号１で実行されたとおりサポートベクターマシン(ＳＶＭ)を使用した。
表７は、１００回再サンプリングおよび最解析からの第９５パーセンタイル値信頼区間と共にＬＤＡ、ＮＢおよびＳＶＭ分類の結果を示す。予測を、予測疾患が他の疾患カテゴリーの予測として現れたならば偽陽性と判定し、正確なカテゴリーを誤ったならば偽陰性と判定した。試験番号１の高い精度を考えると、高い固有の患者変動性を伴うさらに小さなコホートでも、直線状超平面(これはいずれかのトレイニング点からその平面への距離を最適化する)を使用して、正確な免疫署名を可能にする。
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低い信頼区間は直線状の確率的分類器も、多数の不均衡群または多数のペプチド特性に特にバイアスがかかっていないことを示す。試験番号１と同様、各群と正常試料の分離はＳＶＭで見られた。Ｔ検定ペプチドからの重複は、少なくとも１種の他の疾患と重複する少なくとも１個および平均１５個のペプチドを生じた。少なくとも１種の他の疾患と重複する少なくとも１個のペプチドを含んでいなかったＴ検定ペプチドの組はなかった。
表８の値は、各分類器(ＰＣＡ、ＮＢおよびＬＤＡおよびｋ−ＮＮ)で行った実際の判定である。判定を予測(列ヘッダー)対真の疾患(行)に、列１、行１がＰＣＡ分類器により正確に識別された判定数を含むように記載する。列１、行２は、乳癌(ＢＣ)を脳の癌(ＢｒＣ)として識別した分類器の回数を含む。重度の矛盾判定をした分類アルゴリズムがなかったこと示すために、この表に多くの分類器を含ませる。
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図３は、１５１６患者試料にわたる２５５個の分類器ペプチドを示すヒートマップであり、コホートサイズを括弧内に示す。色は高い(赤色)から低い(青色)強度を示し、両ペプチド(Ｙ軸および患者(Ｘ軸)の階層的クラスタリングに残るパターンは、疾患コホート内およびコホート間にわたる相対的差の可視化を助ける。併存症があることが分かっている患者を除外せず、対照試料は高度に多様なシグナルを示す。
図４は、２５５個の分類器ペプチドから選択した選択ペプチドの行動を示す。あるペプチドは、特定の癌に高度に選択的であり、分類精度に完全に貢献する。多くのペプチドは、疾患内の一貫性が不完全であった。１個を超える疾患に高いペプチドもあった。別の受信者動作特性(ＲＯＣ)曲線を描き、曲線下面積(ＡＵＣ)値を各分類アルゴリズムに対して各疾患毎に計算した。ＳＶＭのＡＵＣ灰色で示す。パネルＡは、乳癌についてのＲＯＣ曲線のグラフ表示である。パネルＢは、脳の癌についてのＲＯＣ曲線のグラフ表示である。パネルＣは、食道癌についてのＲＯＣ曲線のグラフ表示である。パネルＤは、多発性骨髄腫についてのＲＯＣ曲線のグラフ表示である。パネルＥは、健常対照についてのＲＯＣ曲線のグラフ表示である。パネルＦは、膵癌についてのＲＯＣ曲線のグラフ表示である。
図５はグラフ表示試験番号１の受信者動作特性(ＲＯＣ)曲線のグラフ表示である。ＰＣＡの曲線下面積(ＡＵＣ)を灰色で示す。
図６は試験番号１の受信者動作特性(ＲＯＣ)曲線のグラフ表示である。ＮＢの曲線下面積(ＡＵＣ)を灰色で示す。
図７は試験番号１の受信者動作特性(ＲＯＣ)曲線のグラフ表示である。ＬＤＡの曲線下面積(ＡＵＣ)を灰色で示す。
図８は試験番号１の受信者動作特性(ＲＯＣ)曲線のグラフ表示である。ｋ−ＮＮの曲線下面積(ＡＵＣ)を灰色で示す。
図９は、ＰＣＡ、ＬＤＡ、ＮＢおよびｋ−ＮＮの４分類器の要約であり、これは、ＳＶＭについて図１におけるような関連分類性能の図示的説明を提供できる。パネルＡはＰＣＡのグラフ表示であり、最初の２個の主成分をプロットする。パネルＢはＬＤＡのグラフ表示であり、Ｘ軸およびＹ軸は、上位２個の線形判別子を示す。パネルＣはＮＢのグラフ表示であり、予測変数をプロットする。パネルＤはｋ−ＮＮのグラフ表示であり、グループワイズ距離をプロットする。
図１０は験番号２からの２５５個の分類器ペプチドのうち３個の線グラフである。この強度プロファイルは、Ｘ軸に個々を示し、Ｙ軸に各ペプチドについて空間およびｌｏｇ１０強度で分けた疾患を示す。特異性の３例を示す。パネルＡは、疾患６および９について高く、他に対して低いペプチドの線グラフを示す。これは、他の９疾患に対する特異性を増強するが、疾患６と９の誤った解釈の可能性をもたらす。パネルＢは、疾患１１に対して他の疾患より平均９倍高い、ペプチドを示す。疾患３、５および６は高偏差であるが、疾患１１は高度に一貫し、疾患１１に対する特異性を高める。パネルＣは、疾患１および疾患９の一部に対して高いペプチドを示す。コホートで違うが、疾患特異的であるペプチドは、この疾患の特異性に悪影響はないが、感受性に影響し得る。疾患１内の相対的に高いシグナルを考慮して、このペプチドは、疾患９のみの区別には中程度にしか成功しないが、疾患２〜８および１０〜１１に対する識別は極めて成功する。
健康モニタリング方法、診断方法、処置方法および予防医療方法としての免疫署名
疾患の診断、健康モニタリング、処置および予防が立ち向かう困難さは、試料コホート変動性、異なる採血法および試料の凍結−融解サイクルへの承伏である。試験番号１および試験番号２は、本発明がこれらの困難性に打ち勝つことができることを示し、試験番号１および試験番号２は、本発明の方法での広範な対象の高い状態分類特異性を示した。試験番号１および試験番号２はまた免疫署名が高体積試料処理に使用できることも示し、発見相でのより多くの疾患および対照試料を可能にする。この免疫署名の特性は、標準的バイオマーカー発見の共通課題である過剰適合に打ち勝つことができる。
試験番号１および試験番号２は、免疫署名が標準的トレイニング、盲検式試験アッセイにおける、種々のタイプの癌の高精度分類が可能な方法として示す。アレイにおけるペプチドの数の変動、アレイにおけるペプチド近接の最適化およびアレイにおける分子タイプの変動により、免疫署名を、健康の多数の異なる状態の健康モニタリング、診断、処置および予防の強力な方法とする。
実施例２：免疫署名システムで用いるためのコンピューターアーキテクチャ
本発明のアレイで検出されたデータを、種々のコンピューターアーキテクチャを有する複数のコンピューターで解析できる。図１１は、本発明の例示態様と組み合わせて使用できるコンピューター・システム１１００のアーキテクチャの第一例を示すブロック図である。図１１に示すとおり、コンピューター・システム例は、処理指示のためのプロセッサー１１０２を含み得る。プロセッサーの非限定的例は、Intel Core i7TMプロセッサー、Intel Core i5TMプロセッサー、Intel Core i3TMプロセッサー、Intel XeonTMプロセッサー、AMD OpteronTMプロセッサー、Samsung 32-bit RISC ARM 1176JZ(F)-S v1.0TMプロセッサー、ARM Cortex-A8 Samsung S5PC100TMプロセッサー、ARM Cortex-A8 Apple A4TMプロセッサー、Marvell PXA 930TMプロセッサーまたは機能的に同等なプロセッサーを含む。複数スレッド実行を平行処理のために使用できる。ある態様において、複数プロセッサーまたは複数コアのプロセッサーを、一コンピューター・システムであれ、クラスターであれ、複数のコンピューター、携帯電話および／または携帯用情報端末デバイスを含むネットワーク上のシステムに分散されていても、使用できる。
データ獲得、処理および保存
図１１に示すとおり、高速キャッシュ１１０１をプロセッサー１１０２に接続するかまたは組み込み、最近またはしばしばプロセッサー１１０２により使用されている指示用高速記憶またはデータを得る。プロセッサー１１０２をプロセッサーバス１１０５によりノースブリッジ１１０６に接続する。ノースブリッジ１１０６を、記憶バス１１０４により即時呼び出し記憶装置(ＲＡＭ)１１０３に接続し、プロセッサー１１０２によるＲＡＭ１１０３へのアクセスを管理する。ノースブリッジ１１０６をまたチップセットバス１１０７によりサウスブリッジ１１０８に接続する。サウスブリッジ１１０８を、次に周辺バス１１０９に接続する。周辺バスは、例えば、PCI、PCI-X、PCI Expressまたは他の周辺バスであり得る。ノースブリッジおよびサウスブリッジはしばしばプロセッサーチップセットと呼ばれ、プロセッサー、ＲＡＭおよび周辺バス１１０９上の末端コンポーネントの間のデータ移送を管理する。あるアーキテクチャにおいて、別のノースブリッジチップを使用する代わりに、ノースブリッジの機能性を、プロセッサーに組み込む。
ある態様において、システム１１００は、周辺バス１１０９に連結したアクセレレーターカード１１１２を含み得る。アクセレレーターは、ある処理を加速するためのフィールドプログラマブルゲートアレイ(ＦＰＧＡ)または他のハードウェアを含み得る。
ソフトウェアインターフェイス
ソフトウェアおよびデータは、外部記憶装置１１１３に保存でき、プロセッサーが使用するためにＲＡＭ１１０３および／またはキャッシュ１１０１にロードできる。システム１１００は、システムリソースを管理するためのオペレーティングシステムを含み、オペレーティングシステムの非限定的例は、Linux、WindowsTM、MAC OSTM、BlackBerry OSTM、iOSTMおよび他の機能的に同等なオペレーティングシステム、ならびにオペレーティングシステムのトップで起動できるアプリケーションソフトウェアを含む。
本例において、システム１１００は、分散された平行処理に使用できるネットワーク接続記憶装置(ＮＡＳ)および他のコンピューター・システムのような外部記憶装置へのネットワークインターフェイスを提供するために周辺バスに接続したネットワークインターフェイスカード(ＮＩＣ)１１１０および１１１１も含む。
コンピューター・システム
図１２は、複数のコンピューター・システム１２０２ａおよび１２０２ｂ、複数の携帯電話および携帯用情報端末１２０２ｃおよびネットワーク接続記憶装置(ＮＡＳ)１２０１ａおよび１２０１ｂを有するネットワーク１２００を示す略図である。ある態様において、システム１２０２ａ、１２０２ｂおよび１２０２ｃはデータ記憶装置を管理し、ネットワーク接続記憶装置(ＮＡＳ)１２０１ａおよび１２０２ｂに保存されたデータへのデータアクセスを最適化する。数学的モデルをデータに対して使用でき、コンピューター・システム１２０２ａおよび１２０２ｂおよび携帯電話および携帯用情報端末システム１２０２ｃの間の分散された平行処理を使用して表かできる。コンピューター・システム１２０２ａおよび１２０２ｂおよび携帯電話および携帯用情報端末システム１２０２ｃは、ネットワーク接続記憶装置(ＮＡＳ)１２０１ａおよび１２０１ｂに保存されたデータの適応データ再構築のための平行処理も提供する。図１２は例として示すのみであり、多種多様な他のコンピューターアーキテクチャおよびシステムを本発明の種々の態様と組み合わせて使用できる。例えば、ブレードサーバを使用して、平行処理を提供できる。プロセッサーブレードをバックプレーンを通して接続して、平行処理を提供する。記憶装置もバックプレーンにまたはネットワーク接続記憶装置(ＮＡＳ)として別のネットワークインターフェイスを通して接続できる。
ある態様において、プロセッサーは別の記憶空間を維持し、データを他のプロセッサーによる平行処理のためにネットワークインターフェイス、バックプレーンまたは他のコネクターをとおして伝達する。ある態様において、プロセッサーの一部または全てが、共有仮想アドレス記憶空間を使用できる。
仮想システム
図１３は、共有仮想アドレス記憶空間を使用するマルチプロセッサーコンピューター・システのブロック図である。本システムは、共有記憶サブシステム１３０２にアクセスできる複数のプロセッサー１３０１ａ〜ｆを含む。本システムは、複数のプログラマブルハードウェア記憶アルゴリズムプロセッサー(ＭＡＰ)１３０３ａ〜ｆを記憶サブシステム１３０２内に組み込む。各ＭＡＰ１３０３ａ〜ｆはメモリ１３０４ａ〜ｆおよび１個以上のフィールドプログラマブルゲートアレイ(ＦＰＧＡ)１３０５ａ〜ｆを含む。ＭＡＰは、設定可能機能ユニットおよび特定のアルゴリズムを提供するかまたはアルゴリズムの一部を各プロセッサーと緊密な連携で処理ためにＦＰＧＡ１３０５ａ〜ｆに提供できる。本例において、各ＭＡＰはこれらの目的でプロセッサー全てに広くアクセス可能である。一つの配置において、各ＭＡＰは、連結したメモリ１３０４ａ〜ｆにアクセスするための直接メモリアクセス(ＤＭＡ)を使用でき、各マイクロプロセッサー１３０１ａ〜ｆと独立したそして非同期的なタスク実行を可能にする。この配置で、ＭＡＰはアルゴリズムの連続送信および平行実行のために他のＭＡＰに直接結果を送ることができる。
上記コンピューターアーキテクチャおよびシステムは単なる例であり、多種多様な他のコンピューター、携帯電話および携帯用情報端末アーキテクチャおよびシステムを本実施例態様で使用でき、一般的プロセッサー、コプロセッサー、ＦＰＧＡおよび他のプログラマブルロジカル・デバイス、システムオンチップ(ＳＯＣ)、特定用途向け集積回路(ＡＳＩＣ)および他の処理および論理素子の任意の組み合わせを使用するシステムを含む。あらゆる多様なデータ記憶装置メディアを実施例態様と組み合わせて使用でき、即時呼び出し記憶装置、ハード・ドライブ、フラッシュメモリ、テープドライブ、ディスクアレイ、ネットワーク接続記憶装置(ＮＡＳ)および他の局所または分散されたデータ記憶装置デバイスおよびシステムを含む。
例示的態様において、コンピューター・システムは、上記のまたは他のコンピューターアーキテクチャおよびシステムのいずれかで実行するソフトウェアモジュールを使用して実施できる。他の態様において、システムの機能をファームウェア、プログラマブルロジカル・デバイス、例えば図１３に示すフィールドプログラマブルゲートアレイ(ＦＰＧＡ)、システムオンチップ(ＳＯＣ)、特定用途向け集積回路(ＡＳＩＣ)または他の処理および論理素子で部分的にまたは完全に実施できる。例えば、セットプロセッサーおよびオプティマイザーを、図１１に示すアクセレレーターカード１１１２のようなハードウェアアクセレレーターカードを介するハードウェア加速と共に実施できる。
図１４は、異なるペプチド密度の本発明のアレイの例を示す。上記コンピューターアーキテクチャのいずれも免疫署名検出、処理および解析に使用できる。
実施例３：状態の健康モニタリング方法、診断方法、処置方法および予防方法
対象の健康を、処置剤の投与前および投与後を含む、対象の生涯における複数の時点でモニタリングできる。次の実施例は、６名の対象の健康モニタリングにおける本発明の方法およびアレイの例の適用を記載する。ここに記載する実施例において、６名の対象の１名以上の状態の診断、処置、モニタリングおよび予防方法をペプチドアレイの例で試験した。本実施例に記載する実験は、約１０,０００ペプチドの特定のマイクロアレイで実施した。本発明のマイクロアレイのいずれも、本発明の方法と組み合わせて使用できる。
健康モニタリング
複数対象の健康を、対象をインフルエンザワクチン１回投与により処置する“前”および“後”に追跡した。図１５は、インフルエンザワクチン投与後長期間にわたる６名の対象の免疫署名プロファイルを示すヒートマップである。図１５において、“前”はワクチン接種１〜２週間前をいい、“後”はワクチン接種後２１日間の６回の異なる時点の一つを示し得る。図１５において、６名の対象の免疫署名結合パターンを次のとおり説明できる。１) ６名の非特定化された対象を番号１１２、１１３、３３、４３、７３および８４で示す。２) 免疫署名結合パターンをａ) 対象１１２、“赤色タブ”、ワクチン接種前、１日目、５日目、７日目、１４日目、２１日目；ｂ) 対象１１３、“緑色タブ”、ワクチン接種前、１日目、５日目、７日目、１４日目、２１日目；ｃ) 対象３３、“青色タブ”、ワクチン接種前、１日目、５日目、７日目、１４日目、２１日目；ｄ) 対象４３、“橙色タブ”、ワクチン接種前、１日目、５日目、７日目、１４日目、２１日目；ｅ) 対象７３、“薄桃色タブ”、ワクチン接種前、２１日目；およびｆ) 対象８４、“黄色タブ”、ワクチン接種前、１日目、５日目、７日目、１４日目、２１日目としてクラスター化する。
生体試料タイプ
この実施例に記載する６名の対象の１名の体内の種々の源から生体試料を採取した。対象のうち１名の健康を１日、毎時モニタリングした。図１６パネルＡは、１日を通した同じ対象由来の異なる生体試料の免疫署名を示す。生体試料を２カ所の唾液の異なる源および静脈血の３箇所から得た。２カ所の唾液採取場所は：ａ) 耳下腺、“黄色タブ”でクラスター化；およびｂ) 下顎試料、“青色タブ”としてクラスター化であった。血液からの生体試料は、対象の静脈血由来である。パネルＡは、１１回の時点にわたる種々の生体試料のクラスタリングを示すヒートマップである。パネルＢは、パネルＡに示すヒートマップのある領域の高解像度解析である。パネルＢは、１０,０００個のペプチドアレイにおける種々の生体試料のクラスタリングの差を示す。
生体試料のさらなる源を本発明のアレイおよび方法に使用でき、試験できる。
予防医療
対象の１名の健康を、数ヶ月にわたり定期的に追跡した。この間、対象は、２０１０年１１月２５日の前に体調不良を報告した。図１７は、数ヶ月にわたりモニタリングした対象の免疫署名結合パターンを示すヒートマップである。パネルＡは２０１０年１１月０７日付近の対象の免疫署名結合パターンのピークを示す。パネルＡの免疫署名結合パターンは、対象が症状を報告する前のピークと、その後の減少を示す。パネルＢは、抗体の正常変動に入る疾患署名を有する全１０,０００個のペプチドにわたる一貫性を示す。これは、本発明の方法が、症状出現前に状態に関係する免疫署名結合パターンを同定できることを示す。
症状出現前の状態と関係する結合パターンは、発症または状態進行を含む、状態の予防に使用できる。医師は、例えば、症状出現前に同定された状態を処置するための医薬を処方できるであろう。
アレイへの結合の異なるパターンの検出およびクラスタリング
１個を超える方法を、アレイへの生体試料の結合パターンの検出に適用できる。我々は、ここで、本発明のアレイへのＩｇＭおよびＩｇＧ抗体の結合パターン検出への適用を示す。
対象のうち３名の健康を、本発明のアレイおよび方法でモニタリングした。３名の対象からのＩｇＭ抗体およびＩｇＧ抗体の結合のパターンの検出およびクラスタリングを、ペプチドアレイで解析した。図１８は、２１日間にわたる３名の対象の０日目、１日目、２日目、５日目、７日目および２１日目の経時的免疫署名結合パターンを示すヒートマップである。パネルＡは、ＩｇＭ免疫グロブリンの結合を検出したときの約１０,０００個のペプチドのペプチドアレイのクラスタリングを示す。パネルＢは、ＩｇＭ免疫グロブリンを検出したときの５０ペプチドのペプチドアレイのクラスタリングを示す。パネルＣは、ＩｇＧ免疫グロブリンの結合を検出したときの約１０,０００個のペプチドのペプチドアレイのクラスタリングを示す。パネルＤは、ＩｇＧ免疫グロブリンを検出したときの５０ペプチドのペプチドアレイのクラスタリングを示す。ＩｇＭ免疫グロブリンのペプチドアレイへの結合パターンを検出し、階層的距離を使用してクラスター化したとき、１０,０００個のペプチド群のアレイは、採血した日に対応する正確なグループへの個々の対象の組織化ができなかった(パネルＢ)。アレイへのＩｇＧ免疫グロブリンの結合をパターンを検出し、階層的距離を使用してクラスター化したとき、対象の正体および採血日は正確にクラスターされた。パネルＢについて、２方向ＡＮＯＶＡ解析からの上位５０ペプチドを示す。パネルＣについて、２方向ＡＮＯＶＡ解析からの上位５０ペプチドを示す。各群は対象に対応する。
健康モニタリング
対象のうち一人の健康を数ヶ月にわたり追跡した。図１９は、免疫署名結合パターン解析した２名の対象の３０日経時解析を示すヒートマップである。時間経過は、２名の対象の免疫署名結合プロファイルの年度毎のクラスタリングを含む。
対象の一人である対象８４は、記載する時間経過の１７日目に１回インフルエンザワクチンを受けた。図２０は、２２特異的ペプチド配列についての対象８４の免疫署名結合プロファイルを示すヒートマップである。図２０は、対象８４の免疫署名結合プロファイルの年度毎のクラスタリングを含む。２２ペプチドの配列は：配列番号１：ＣＳＧＳＹＮＭＤＫＹＦＴＹＳＷＹＲＥＥＲ；配列番号２：ＣＳＧＷＤＳＦＲＨＹＥＲＩＴＤＲＨＱＧＤ；配列番号３：ＣＳＧＲＹＦＭＨＭＥＰＴＩＮＨＹＹＥＧＭ；配列番号４：ＣＳＣＶＭＭＰＤＹＲＩＨＶＨＷＳＮＷＴＧ；配列番号５：ＣＳＧＬＲＨＹＮＶＹＤＦＲＳＮＤＲＨＷＡ；配列番号６：ＣＳＧＶＭＡＨＴＧＨＳＧＲＭＧＰＰＤＦＱ；配列番号７：ＣＳＧＮＤＨＳＱＨＤＦＡＰＶＥＳＹＩＭＭ；配列番号８：ＣＳＧＩＬＦＦＴＲＥＴＤＶＨＹＰＡＮＥＧ；配列番号９：ＣＳＧＶＤＰＷＲＳＨＡＮＱＲＥＹＡＪＡＮ；配列番号１０：ＣＳＧＮＧＶＨＥＦＳＡＭＬＩＭＤＭＩＩＦ；配列番号１１：ＣＳＧＩＧＤＨＭＰＬＮＥＰＮＰＬＲＤＬＫ；配列番号１２：ＣＳＧチアＴＮＰＬＮＶＱＹＶＭＶＱＳ；配列番号１３：ＣＳＧＴＲＫＥＨＹＬＥＨＶＡＫＨＭＥＶＷ；配列番号１４：ＣＳＧＰＴＤＩＴＥＬＭＭＲＰＫＹＳＲＩＮ；配列番号１５：ＣＳＧＤＱＱＧＴＷＧＲＶＤＭＷＳＮＲＭＨ；配列番号１６：ＣＳＧＩＭＫＲＩＨＡＱＴＭＷＹＳＰＩＴＤ；配列番号１７：ＣＳＧＳＦＦＹＶＮＫＱＶＮＮＫＮＹＱＴＩ；配列番号１８：ＣＳＧＬＹＡＫＱＶＡＡＱＲＰＩＫＹＷＤＨ；配列番号１９：ＣＳＧＭＭＷＹＨＧＹＰＨＶＨＡＮＤＡＨＷ；配列番号２０：ＣＳＧＲＹＨＰＮＹＧＤＡＫＫＨＢＭＳＲＦ；配列番号２１：ＣＳＧＨＷＫＧＤＬＲＳＧＲＨＹＨＨＱＥＦ；および配列番号２２：ＣＳＧＥＤＴＲＲＧＨＡＷＫＦＳＥＩＳＰＨである。
図２１は、気管支炎診断後約２０日間の対象８４の血液試料の免疫署名結合プロファイルを示すヒートマップである。図２１は、１４の選択した本発明のペプチドに対する生体試料の結合パターンを示す。１４ペプチドの配列は：配列番号２３：ＣＳＧＷＶＲＫＩＬＫＫＲＩＷＴＤＰＴＮＹ；配列番号２４：ＣＳＧＹＰＲＳＷＦＶＹＹＴＰＷＫＬＦＫＧ；配列番号２５：ＣＳＧＳＨＭＱＤＩＹＲＴＶＲＳＬＧＫＳＭ；配列番号２６：ＣＳＧＶＱＬＳＳＹＴＬＫＬＧＫＶＹＱＥＲ；配列番号２７：ＣＳＧＫＴＭＴＴＱＷＲＳＳＬＦＫＦＡＧＭ；配列番号２８：ＣＳＧＭＫＹＮＰＦＰＫＹＫＳＹＬＱＹＶＮ；配列番号２９：ＣＳＧＩＳＴＫＦＷＷＫＲＮＳＩＶＦＰＫＬ；配列番号３０：ＣＳＧＴＲＧＲＷＹＤＲＲＳＰＳＫＦＬＧＹ；配列番号３１：ＣＳＧＱＮＶＳＡＫＹＶＫＧＲＳＶＱＳＷＩ；配列番号３２：ＣＳＧＨＩＭＧＲＫＲＨＷＰＭＳＴＳＹＧＶ；配列番号３３：ＣＳＧＦＮＫＰＹＶＬＫＹＫＭＤＴＩＨＹＮ；配列番号３４：ＣＳＧＹＹＡＱＶＲＹＡＴＲＦＷＮＫＧＫＹ；配列番号３５：ＣＳＧＷＫＨＫＹＨＫＡＡＡＹＦＨＫＰＦＷ；および配列番号３６：ＣＳＧＷＳＫＰＨＰＫＭＩＡＲＮＦＦＲＨＬである。
図２２は、図２０で１２／１１／２０１１のインフルエンザと特徴づけられた対象の症状後診断を示すヒートマップである。図２３は、肝炎ワクチン処置およびその３ヶ月後に最初のブースター処置を受けた対象の免疫署名結合パターンを示すヒートマップである。
複数感染症の同時同定
図２４は、本発明の方法およびアレイでの複数感染症の同定を示す。図２４は、複数感染症の分類の要約を示す。パネルＡは、デング、西ナイルウイルス(ＷＮＶ)、梅毒、Ｂ型肝炎ウイルス(ＨＢＶ)、正常血、渓谷熱およびＣ型肝炎ウイルスのクラスター化免疫署名結合プロファイルを示すヒートマップである。パネルＢは、ＰＣＡ分類のグラフ表示である。
実施例４：免疫署名システム
次の実施例は、免疫署名用自動化システムを記載する。
自動化システムは、数コンポーネント：１) 対象からの血液または唾液試料のような生体試料を入手し、記録し、希釈するための自動化システムを含む。自動化システムは、生体試料と本発明のペプチドマイクロアレイを接触させる。
対象の免疫署名を、ａ) 希釈試料のペプチドアレイへの適用；ｂ) 一定時間のインキュベーション；ｃ) 試料の除去とアレイの洗浄；ｄ) 二次抗体の一定時間の適用；ｅ) 洗浄手順での未結合および／または過剰二次抗体の除去；およびｆ) 乾各スポットの蛍光を決定するためのアレイの乾燥および走査の自動化工程からなる対象の免疫署名アッセイにおいて得ることができる。図２５は、本発明の免疫署名システムのコンポーネントの略図である。
データ採取および解析
アレイをアラインし、標準的署名に対して署名を決定する。標準的署名は、健康対象の署名または未結合ペプチドの対照シグナルである。
本発明のシステムで得た免疫署名に基づき、診断を提供できる
図２６パネルＡはファージディスプレーライブラリーを示す。パネルＡは、ａ) コンビナトリアル合成でのファージライブラリーの作製、ｂ) ファージ−ディスプレイされた無作為抗原に対する血清のパニングおよびｃ) 選択および配列決定の手順を示す。パネルＢはペプチドマイクロアレイを示す。
実施例５：ペプチドアレイ設計および製造
ペプチドアレイ製造に対する一連のマスクを次の基準に合うように設計した：
・ １８種アミノ酸使用
・ アレイに３３１,０００個のペプチド
・ 各ペプチド１０〜１６アミノ酸長
・ ペプチド配列を示される五量体の総数を最大化するように最適化した(配列多様性多様性を最大化する一方法として、できるだけ多くの多様な５アミノ酸配列を、アレイ上のペプチド配列に示す多)。
・ Ｎ末端に１８種のアミノ酸のいずれか１個を有することが可能なペプチドは６％を超えない
・ ライブラリーは、９０マスク(９０リソグラフィー工程)を使用して製造することが可能でなければならない。
次の手順を実施した。
大きなセット(〜１０１０)の１６残基ペプチド配列を無作為数ジェネレーターで製造した。
先に略記した(上記“アレイ製造”参照)このアプローチのコンピューターシミュレーションを使用して、１０１０ペプチドセットのペプチドの各々のできるだけ多くの配列を、９０リソグラフィー工程しか使用せずに製造した。
シミュレーションした合成からのペプチド配列で、１０〜１６アミノ酸の長さのペプチドのみを選択した。
長さで選択したペプチドから、できるだけ多くの異なる五量体配列(５アミノ酸配列長)を含ませるために最適化したペプチドのサブセットを選択した。
五量体選択したペプチドから、Ｎ末端アミノ酸組成が特定のアミノ酸のいずれかを６％までしか含まないペプチドを選択した。
併せて、上記基準全てを満たすように選択した最終ペプチド配列群は３３１,０００であった。
図３１のグラフは、上記のとおり選択したペプチド配列の長さの分布を示す。Ｙ軸は特定の長さのペプチドの数である。この軸は０〜１００,０００の範囲である。Ｘ軸はペプチドの長さをアミノ酸で示す。上記基準で要求されるように、全ペプチドは１０〜１６アミノ酸であった。平均長は約１１.５アミノ酸であった。
図３２に示すグラフは、３アミノ酸長、４アミノ酸長または５アミノ酸長である可能な配列の分布を示す。上の２個のグラフは、三量体配列(３アミノ酸長ペプチド)の分散を示す。１８×１８×１８＝５８３２種の可能な三量体配列がある。左側は、上記のとおり選択したペプチドに対するこれらの三量体配列の集団分布を示す。右側は、無作為数ジェネレーターを使用して製造したペプチド配列のライブラリーに対する分布を示す。各グラフについて、Ｘ軸は、ライブラリーに特定の三量体配列が存在する回数を示す。Ｙ軸は、Ｘ軸上に示された回数存在する三量体配列の数を示す。それゆえに、無作為数ジェネレーターを使用して製造されたペプチド配列について、５８３２の三量体配列ほぼ全てが、ライブラリーに４００〜６００回現れることを示すことが読み取れる。左側の選択されたペプチドについて、対照的に、三量体配列の分布は広く、ある三量体配列は約１００回しか存在せず、他のものは１０００回を超えて存在する。全ての可能な三量体配列は、ライブラリーに複数回示される。
中央のグラフは四量体配列(４アミノ酸配列)についてである。軸は三量体について記載したものに準じる。ほとんどの四量体配列が、無作為数ジェネレーターを使用して製造されたこのサイズのライブラリー(右パネル)で、約３０回存在することが読み取れる。上記のとおり選択したペプチドライブラリー(左パネル)において、分布のピークは約２０であり、無作為数ジェネレーターで製造した配列で見られるよりも幅が広い。１８４＝１０４９７６の可能な四量体配列がある。全ての可能な四量体配列の９９.９９％が、上記のとおり選択したペプチドライブラリーに示される。
下部グラフは五量体配列(５アミノ酸配列)についてである。軸は三量体について記載したとおりである。１,８８９,５６８の可能な五量体配列がある。上記のとおり選択したペプチド配列(左パネル)において、全ての可能な五量体配列の１４％が示されていないことは注目に値する(これはグラフの最初の棒である)。五量体配列のほとんどが１回示され(２番目の棒)、少数が１回を超えて示される。纏めると、全ての可能な五量体配列の８６％が選択ライブラリーに示される。対照的に、全五量体の約７５％しか無作為数ジェネレーターを使用して製造したペプチド配列のライブラリーに示されない(右パネル)。無作為に作製した配列についての右のグラフの棒が、ライブラリーに示されない配列を表し、上記のとおり選択したペプチドについての左のグラフの最初の棒より大きいことが読み取れる。
図３３は、上記のとおり選択したペプチドライブラリーについてのペプチドにおける位置の関数としてアミノ酸組成を示す。Ｎ末端は１位であり、Ｃ末端は１０〜１６位である(上記のとおり、このライブラリーにおいてはペプチド長の分散がある)。これはＸ軸上に示す。Ｙ軸は、Ｘ軸に示す位置で特定のアミノ酸を含むペプチドの比を示す。各線(各色)は１８種のアミノ酸のうち一つを示す。Ｎ末端で、アミノ酸の２個が幾分低く示されていることが読み取れる(Ｎ末端にこれらのアミノ酸を含むペプチドの５％未満)。この配列のほとんどをとおして、アミノ酸組成はほぼ一定であり、平均５％より少し上である。これは、１８アミノ酸の均一分散で期待されるものである(１／１８＝〜０.０５６)。Ｃ末端近位の逸脱も、この領域の長さが長くなるに連れてペプチド数が減るために起こる。
態様
次の非限定的態様は、本発明の説明用の例を提供するが、本発明の範囲を限定するものではない。
態様１. 健康モニタリング方法であって、ａ) 複合的生体試料をペプチドアレイと接触させ、ここで、該ペプチドアレイは該生体試料中の少なくとも１種の抗体とオフターゲット結合できる種々のペプチドを含み、ｂ) 該抗体のペプチドアレイ中の複数の異なるペプチドとのオフターゲット結合を測定して免疫署名を形成し、そしてｃ) 該免疫署名と健康状態を関連させることを含む、方法。
態様２. ペプチドアレイ上の異なるペプチドが８〜３５残基長である、態様１に記載の方法。
態様３. ペプチドアレイ上の異なるペプチドが１５〜２５残基長である、態様１または２に記載の方法。
態様４. ペプチドアレイ上の異なるペプチドが２〜４nmの範囲の平均的間隙を有する、態様１〜３のいずれかに記載の方法。
態様５. ペプチドアレイ上の異なるペプチドが３〜６nmの範囲の平均的間隙を有する、態様１〜４のいずれかに記載の方法。
態様６. 異なるペプチドが分子に約１０３Ｍ−１の結合定数で結合する、態様１〜５のいずれかに記載の方法。
態様７. 異なるペプチドが分子に１０３〜１０６Ｍ−１の範囲の結合定数で結合する、態様１〜６のいずれかに記載の方法。
態様８. 異なるペプチドが分子に２×１０３〜１０６Ｍ−１の範囲の結合定数で結合する、態様１〜７のいずれかに記載の方法。
態様９. 異なるペプチドが分子に１０４〜１０６Ｍ−１の範囲の結合定数で結合する、態様１〜８のいずれかに記載の方法。
態様１０. 異なるペプチドがペプチド模倣物を含む、態様１〜９のいずれかに記載の方法。
態様１１. 異なるペプチドが無作為アミノ酸配列を有する、態様１〜１０のいずれかに記載の方法。
態様１２. 異なるペプチドが非天然アミノ酸を含む、態様１〜１１のいずれかに記載の方法。
態様１３. 処置を提供する方法であって、ａ) 対象から複合的生体試料を入手し、ｂ) 該複合的生体試料をペプチドアレイと接触させ、ここで、該ペプチドアレイは該生体試料中の少なくとも１種の抗体とオフターゲット結合できる種々のペプチドを含み、ｃ) 該抗体の複数の異なるペプチドへのオフターゲット結合を測定して免疫署名を形成し、ｄ) 該免疫署名と状態を関連させ、そしてｅ) 該状態に対する処置を提供することを含む、方法。
態様１４. ペプチドアレイ上の異なるペプチドが８〜３５残基長である、態様１３に記載の方法。
態様１５. ペプチドアレイ上の異なるペプチドが１５〜２５残基長である、態様１３または１４に記載の方法。
態様１６. ペプチドアレイ上の異なるペプチドが２〜４nmの範囲の平均的間隙を有する、態様１３〜１５のいずれかに記載の方法。
態様１７. ペプチドアレイ上の異なるペプチドが３〜６nmの範囲の平均的間隙を有する、態様１３〜１６のいずれかに記載の方法。
態様１８. 異なるペプチドが分子に約１０３Ｍ−１の結合定数で結合する、態様１３〜１７のいずれかに記載の方法。
態様１９. 異なるペプチドが分子に１０３〜１０６Ｍ−１の範囲の結合定数で結合する、態様１３〜１８のいずれかに記載の方法。
態様２０. 異なるペプチドが分子に２×１０３〜１０６Ｍ−１の範囲の結合定数で結合する、態様１３〜１９のいずれかに記載の方法。
態様２１. 異なるペプチドが分子に１０４〜１０６Ｍ−１の範囲の結合定数で結合する、態様１３〜２０のいずれかに記載の方法。
態様２２. 異なるペプチドがペプチド模倣物を含む、態様１３〜２１のいずれかに記載の方法。
態様２３. 異なるペプチドが無作為アミノ酸配列を有する、態様１３〜２２のいずれかに記載の方法。
態様２４. 異なるペプチドが非天然アミノ酸を含む、態様１３〜２３のいずれかに記載の方法。
態様２５. 状態の予防方法であって、ａ) 対象から複合的生体試料を得て；ｂ) 該複合的生体試料をペプチドアレイと接触させ、ここで、該ペプチドアレイは複合的生体試料中の少なくとも１種の抗体とオフターゲット結合できる種々のペプチドを含み、ｃ) 該複合的生体試料の複数の異なるペプチドへのオフターゲット結合を測定して免疫署名を形成し、ｄ) 該免疫署名と状態を関連させ、そしてｅ) 該状態のための処置を入手することを含む、方法。
態様２６. ペプチドアレイ上の異なるペプチドが８〜３５残基長である、態様２５に記載の方法。
態様２７. ペプチドマイクロアレイ上の異なるペプチドが１５〜２５残基長である、態様２５または２６に記載の方法。
態様２８. ペプチドアレイ上の異なるペプチドが２〜４nmの範囲の平均的間隙を有する、態様２５〜２７のいずれかに記載の方法。
態様２９. ペプチドアレイ上の異なるペプチドが３〜６nmの範囲の平均的間隙を有する、態様２５〜２８のいずれかに記載の方法。
態様３０. 異なるペプチドが分子に約１０３Ｍ−１の結合定数で結合する、態様２５〜２９のいずれかに記載の方法。
態様３１. 異なるペプチドが分子に１０３〜１０６Ｍ−１の範囲の結合定数で結合する、態様２５〜３０のいずれかに記載の方法。
態様３２. 異なるペプチドが分子に２×１０３〜１０６Ｍ−１の範囲の結合定数で結合する、態様２５〜３１のいずれかに記載の方法。
態様３３. 異なるペプチドが分子に１０４〜１０６Ｍ−１の範囲の結合定数で結合する、態様２５〜３２のいずれかに記載の方法。
態様３４. 異なるペプチドがペプチド模倣物を含む、態様２５〜３３のいずれかに記載の方法。
態様３５. 異なるペプチドが無作為アミノ酸配列を有する、態様２５〜３４のいずれかに記載の方法。
態様３６. 異なるペプチドが非天然アミノ酸を含む、態様２５〜３５のいずれかに記載の方法。
態様３７. 診断方法であって、ａ) 対象から複合的生体試料を入手し、ｂ) 該複合的生体試料をペプチドアレイと接触させ、ここで、該ペプチドアレイは該生体試料中の少なくとも１種の抗体とオフターゲット結合できる種々のペプチドを含み、ｃ) 該複合的生体試料の一群の種々のペプチドへのオフターゲット結合を測定して免疫署名を形成し、そしてｄ) 該免疫署名に基づき状態を診断することを含む、方法。
態様３８. ペプチドアレイ上の異なるペプチドが８〜３５残基長である、態様３７に記載の方法。
態様３９. ペプチドアレイ上の異なるペプチドが１５〜２５残基長である、態様３７または３８に記載の方法。
態様４０. ペプチドアレイ上の異なるペプチドが２〜４nmの範囲の平均的間隙を有する、態様３７〜３９のいずれかに記載の方法。
態様４１. ペプチドアレイ上の異なるペプチドが３〜６nmの範囲の平均的間隙を有する、態様３７〜４０のいずれかに記載の方法。
態様４２. 異なるペプチドが分子に約１０３Ｍ−１の結合定数で結合する、態様３７〜４１のいずれかに記載の方法。
態様４３. 異なるペプチドが分子に１０３〜１０６Ｍ−１の範囲の結合定数で結合する、態様３７〜４２のいずれかに記載の方法。
態様４４. 異なるペプチドが分子に２×１０３〜１０６Ｍ−１の範囲の結合定数で結合する、態様３７〜４３のいずれかに記載の方法。
態様４５. 異なるペプチドが分子に１０４〜１０６Ｍ−１の範囲の結合定数で結合する、態様３７〜４４のいずれかに記載の方法。
態様４６. 異なるペプチドがペプチド模倣物を含む、態様３７〜４５のいずれかに記載の方法。
態様４７. 異なるペプチドが無作為アミノ酸配列を有する、態様３７〜４６のいずれかに記載の方法。
態様４８. 異なるペプチドが一パラトープに結合する、態様３７〜４７のいずれかに記載の方法。
態様４９. 固体支持体上の様々な位置に固定化された多様な長さの複数のインサイツ合成ポリマーを含むアレイであって、ポリマーのインサイツ合成が
ａ. 固体支持体上の位置の予定した画分に第一モノマーを付加し、
ｂ. 固体支持体上の位置の予定した画分に第二モノマーを付加し、ここで、第二モノマーの位置の予定した画分は第一モノマーを含む位置およびモノマーがない位置を含み、
ｃ. 固体支持体上の位置の予定した画分に第三モノマーを付加し、ここで、第三モノマーの位置の予定した画分は第一および第二モノマーを含む位置、第二モノマーを含む位置およびモノマーを含まない位置を含み、そして
ｄ. ポリマーが所望の平均長に達し、画分の和が少なくとも計１００％になるまで、定義された一連のモノマーを用いて手順ａ〜ｃを繰り返す工程を含む、
アレイ。
態様５０. 疑似無作為アレイである、態様４９に記載のアレイ。
態様５１. 無作為アレイである、態様４９に記載のアレイ。
態様５２. モノマーがアミノ酸、核酸およびペプチド核酸からなる群から選択される、態様４９に記載のアレイ。
態様５３. 定義された一連のモノマーにおけるモノマーが１回以上出現する、態様４９に記載のアレイ。
態様５４. 定義された一連のモノマーにおける異なるモノマーの数が少なくとも２である、態様４９に記載のアレイ。
態様５５. ポリマーが少なくとも１０残基の平均長を有する、態様４９に記載のアレイ。
態様５６. ポリマーが少なくとも１２残基の平均長を有する、態様４９に記載のアレイ。
態様５７. ポリマーが少なくとも５残基の平均長を有する、態様４９に記載のアレイ。
態様５８. ポリマーの少なくとも５％が少なくとも１２残基の長さを有する、態様４９に記載のアレイ。
態様５９. ポリマーが試料の成分に結合できる、態様４９に記載のアレイ。
態様６０. 画分の和が計１００％である、態様４９に記載のアレイ。
態様６１. 画分の和が１００％より大きい、態様４９に記載のアレイ。
態様６２. ポリマー数が３,０００より大きい、態様４９に記載のアレイ。
態様６３. ポリマー数が１０,０００より大きい、態様４９に記載のアレイ。
態様６４. ポリマー数が１００,０００より大きい、態様４９に記載のアレイ。
態様６５. ポリマー数が３３０,０００より大きい、態様４９に記載のアレイ。
態様６６. 固体支持体上の様々な位置に固定化された多様な長さの複数のインサイツ合成ポリマーを含むアレイを組み立てる方法であって、
ａ. ポリマーを合成する場所である固体支持体として基質を提供し、
ｂ. 固体支持体上の位置の予定した画分に第一モノマーを付加し、
ｃ. 固体支持体上の位置の予定した画分に第二モノマーを付加し、ここで、第二モノマーの位置の予定した画分は第一モノマーを含む位置およびモノマーがない位置を含み、
ｄ. 固体支持体上の位置の予定した画分に第三モノマーを付加し、ここで、第三モノマーの位置の予定した画分は第一および第二モノマーを含む位置、第二モノマーを含む位置およびモノマーを含まない位置を含み、そして
ｅ. ポリマーが所望の平均長に達し、画分の和が少なくとも計１００％になるまで、定義された一連のモノマーを用いて手順ｂ〜ｄを繰り返す工程を含む、
方法。
態様６７. 疑似無作為アレイである、態様６６に記載の方法。
態様６８. 疑似無作為アレイである、態様６６に記載の方法。
態様６９. 無作為アレイである、態様６６に記載の方法。
態様７０. モノマーがアミノ酸、核酸およびペプチド核酸からなる群から選択される、態様６６に記載の方法。
態様７１. 定義された一連のモノマーにおけるモノマーが１回以上出現する、態様６６に記載の方法。
態様７２. 定義された一連のモノマーにおける異なるモノマーの数が少なくとも２である、態様６６に記載の方法。
態様７３. ポリマーが少なくとも１０残基の平均長を有する、態様６６に記載の方法。
態様７４. ポリマーが少なくとも１２残基の平均長を有する、態様６６に記載の方法。
態様７５. ポリマーが少なくとも５残基の平均長を有する、態様６６に記載の方法。
態様７６. ポリマーの少なくとも５％が少なくとも１２残基の長さを有する、態様６６に記載の方法。
態様７７. ポリマーが試料の成分に結合できる、態様６６に記載の方法。
態様７８. 画分の和が計１００％である、態様６６に記載の方法。
態様７９. 画分の和が１００％より大きい、態様６６に記載の方法。
態様８０. ポリマー数が３,０００より大きい、態様６６に記載の方法。
態様８１. ポリマー数が１０,０００より大きい、態様６６に記載の方法。
態様８２. ポリマー数が１００,０００より大きい、態様６６に記載の方法。
態様８３. ポリマー数が３３０,０００より大きい、態様６６に記載の方法。
態様８９. アレイを対象の健康状態をモニタリングに使用する方法であって、
ａ) 複合的生体試料と態様４９〜６５のいずれかに記載のペプチドアレイを接触させ；
ｂ) 抗体の複数のペプチドアレイ中の異なるペプチドに対するオフターゲット結合を測定して免疫署名を形成させ；そして
ｃ) 免疫署名と健康状態を関連させる
手順を含む、方法。

Claims (17)

  1. 患者から得た乾燥血液試料で行う健康モニタリング方法であって、
    ａ）乾燥血液試料を溶液で再構成し、
    ｂ）該再構成した試料とペプチドアレイを接触させ、ここで、該アレイは固体支持体上の予定した様々な位置に固定化された複数のインサイツ合成ペプチドを含み、該ペプチドのインサイツ合成が下記工程：
    ａ. 固体支持体上の位置の予定した画分に第一モノマーを付加し、
    ｂ. 固体支持体上の位置の予定した画分に第二モノマーを付加し、ここで、第二モノマーの位置の予定した画分は第一モノマーを含む位置およびモノマーがない位置を含み、
    ｃ. 固体支持体上の位置の予定した画分に第三モノマーを付加し、ここで、第二モノマーの位置の予定した画分は第一および第二モノマーを含む位置、第二モノマーを含む位置およびモノマーを含まない位置を含み、そして
    ｄ. モノマーが所望の平均長の少なくとも１種のペプチドを形成し、画分の和が少なくとも計１００％になるまで、定義された一連のモノマーを用いて手順ａ〜ｃを繰り返し、ここで、複数の種々のペプチドは再構成した乾燥血液試料中の少なくとも１種の抗体とオフターゲット結合できる
    を含み、
    ｃ）少なくとも１種の抗体のペプチドアレイ中の複数の異なるペプチドに対するオフターゲット結合を測定して免疫署名を形成させ、そして
    ｄ）免疫署名に基づいて健康状態を同定し、ここで、免疫署名は、対照と比較した、該再構成した血液試料からの抗体のペプチドアレイへの結合における変化を測定する
    手順を含む、方法。
  2. 再構成した乾燥血液試料をペプチドアレイと接触させる前に希釈する、請求項１に記載の方法。
  3. 再構成した乾燥血液試料中の複数の再構成した抗体がペプチドアレイに結合する、請求項１または２に記載の方法。
  4. 対象の健康状態が、健康、乳癌の罹患、卵巣癌の罹患、膵癌の罹患、脳の癌の罹患、食道癌の罹患、多発性骨髄腫の罹患、自己免疫障害の罹患、またはリウマチ性関節炎の罹患である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
  5. ペプチドアレイ上の複数の異なるペプチドが８〜３５残基長である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
  6. ペプチドアレイが３,０００を超える異なるペプチドを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
  7. ペプチドアレイ上の異なるペプチドが、ペプチドアレイ上のスポット内の１nm〜１.５nmの範囲の平均的間隙を有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 複数の異なるペプチドが少なくとも２種の抗体に１０３〜１０６Ｍ−１の範囲の結合定数で結合する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 複数の異なるペプチドが少なくとも２種の抗体に１０４〜１０６Ｍ−１の範囲の結合定数で結合する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 該アレイが、複数の異なるペプチドが完全には無作為ではない配列を有する疑似無作為アレイ、または複数の異なるペプチドが無作為の配列を有する無作為アレイである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 該アレイが核酸およびペプチド核酸からなる群から選択されるモノマーをさらに含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. モノマーがリンカー分子によって該アレイに結合されている、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. ペプチドの少なくとも５％が少なくとも１０残基の長さを有する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
  14. 免疫署名システムで行われ、該免疫署名システムは以下のコンポーネントからなる自動化デバイスを含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法：
    １）対象からの乾燥血液試料を入手し、および再構成し、それによって請求項１に記載の方法のａ）の手順を行うための自動化システム；
    ２）自動化免疫署名アッセイのための区画であって、免疫署名アッセイが
    ａ）希釈試料のペプチドアレイへの適用、
    ｂ）一定時間のインキュベーション、
    ｃ）未結合試料の洗浄および除去、
    ｄ）二次抗体溶液の一定時間の適用、
    ｅ）過剰の二次抗体の洗浄および除去、および
    ｆ）各スポットの蛍光を決定するためのアレイの乾燥および走査
    を含むものであり、それによって請求項１に記載の方法のｃ）の手順を行うための自動化免疫署名アッセイのための区画、および
    ３）コンピューター・システムを使用して、対照と比較した、再構成した乾燥血液試料からの抗体のペプチドアレイへの結合における変化を測定し、それによって請求項１に記載の方法のｄ）の手順を行う。
  15. アレイが無作為配列空間から選択されたペプチドからなるアレイである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
  16. ペプチドが化学的多様性に関連して細分化される、請求項１５に記載の方法。
  17. ペプチドが配列多様性に関連して細分化される、請求項１５に記載の方法。
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