JP6864855B2 - 微生物の識別方法 - Google Patents

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Description

本発明は、質量分析を利用した微生物の識別方法に関する。
赤痢菌（Shigella）は細菌性赤痢（shigellosis）の原因菌であり、1898年に志賀潔によってはじめて分離された。当時は毎年赤痢の流行が発生しており、36名の赤痢患者のうち34名から同一の菌が分離され、これが後に発見されたShigella dysenteriaeであった。その後、Shigella flezneri、Shigella boydii、Shigella sonneiが発見され、現在、Shigella属には４種種存在している。
しかし、Shigella属菌と大腸菌（Escherichia coli）のＤＮＡ間の相同性は平均85％以上であり（非特許文献１)、この値は一般には同一種内の菌株で示されるものである。Shigella属菌の分類は分類学よりも医学的な重要性に基づいており、細菌分類学上からはEscherichia coliと同じgenospeciesであるため、Shigella属の中の４菌種は実際には生物型にすぎない。したがって、Shigella属菌とEscherichia coliの識別はかなり難しいが、医学上の重要性と習慣から、Shigella属はEscherichia属から独立している（非特許文献２）。
全ての赤痢菌はヒトに対して病原性をもち、菌種により程度の差はあるものの、細菌性の下痢を引き起こす。また、非常に少ない菌量で感染が成立することが知られており（非特許文献３）、これらのことからShigella属菌は食中毒細菌として食品ならび医療分野で管理されなければならず、その迅速な検出ならびに同定識別技術の開発が必要とされている。
Escherichia albertii（以下、「E. albertii」ともいう。）は2003年に新種として正式に発表された種（非特許文献４）である。この種は特徴的な生化学的性状を示さない上に、インチミンの遺伝子eaeAを保有するなど、大腸菌と誤同定されやすい特徴を示す（非特許文献５）。仮にeae及び毒素２ｆの遺伝子保有だけに着目すると、当該株は腸管出血性大腸菌と誤認される可能性もある（非特許文献６、７）。
これらのことから、Escherichia albertiiについても、食中毒細菌として食品ならびに医療分野で管理されなければならず、その迅速な検出ならびに同定識別技術の開発が必要とされている。
これまでに、大腸菌とShigella属及びE. albertiiを識別する方法としてＰＣＲ（非特許文献６、８、９）、パンゲノム解析（非特許文献１０、１１）、マルチローカスシーケンスタイピング法（非特許文献６、１２）、等が報告されている。しかしながら、これらの手法は煩雑な操作が必要で時間がかかるという問題があった。
一方、近年ではマトリックス支援レーザ脱離イオン化法飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ）による微生物同定技術が臨床ならび食品分野で急速に広がっている。この方法は、ごく微量の微生物試料を用いて得られたマススペクトルパターンに基づいて微生物同定を行う手法であり、短時間で分析結果を得ることができ、且つ多検体の連続分析も容易であるため、簡便且つ迅速な微生物同定が可能である。
特開2006-191922号公報 特開2013-085517号公報 特開2015-184020号公報
BRENNER, D. J., Fanning, G. R., Miklos, G. V., & Steigerwalt, A. G., International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, (1973), 23(1), 1-7. 赤痢菌検査・診断マニュアル - 国立感染症研究所、[平成28年3月18日検索]インターネット<URL:www.nih.go.jp/niid/images/lab-manual/shigella.pdf> 平成22年度食品安全確保総合調査「食品により媒介される感染症等に関する文献調査報告書（抜粋）」、株式会社 東レリサーチセンター作成、[平成28年3月18日検索］インターネット<https://www.fsc.go.jp/sonota/hazard/H22_10.pdf> Huys, G. et al., International journal of systematic and evolutionary microbiology, 2003, 53(3), 807-810. Ooka, T. et al., Emerg Infect Dis, 2012, 18(3), 488-492. Hyma, K. E. et al., Journal of bacteriology, 2005, 187(2), 619-628. Murakami, K. et al., Japanese journal of infectious diseases,2014, 67(3), 204-208. Watanabe, H. A. R. U. O. et al., 1990, Journal of bacteriology, 172(2), 619-629. Thiem, V. D. et al., Journal of clinical microbiology,2004, 42(5), 2031-2035. Lukjancenko, O. et al., Microbial ecology, 2010, 60(4), 708-720. Rasko, D. A. et al., Journal of bacteriology, 2008, 190(20), 6881-6893. Oaks, J. L. et al., Escherichia albertii in wild and domestic birds, 2010. Dallagassa, C. B. et al., Genet Mol Res, 2014,13(1), 716-22. Deng, J. et al., Journal of thoracic disease, 2014, 6(5), 539. Khot, P. D., & Fisher, M. A., Journal of clinical microbiology, 2013, 51(11), 3711-3716.
これまでに、複数の研究グループによりＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳを用いたリステリア菌の識別が試みられてきた（非特許文献１３、１４、１５）。非特許文献１３、１４では大腸菌とShigella属菌の株を一部識別することができず、非特許文献１５ではサンプルの９０％を正しく識別できたが、１０％は大腸菌とShigella sonneiの間に誤識別があった。これらの報告で用いられているピークは各ピークやバイオマーカーピークの一つ一つが何のタンパク質に由来するかが特定されておらず、同定識別の理論的根拠や信頼性に乏しいため、一定の見解が得られていない（研究グループによって結果が異なる）のが現状である。つまり、大腸菌、Shigella属菌、E. albertiiの識別に好適に利用可能な信頼性の高いマーカータンパク質は未だ確立されていない。
特許文献１には、微生物菌体を質量分析して得られるピークの約半分がリボソームタンパク質由来であることを利用し、質量分析で得られるピークの質量電荷比を、リボソームタンパク質遺伝子の塩基配列情報を翻訳したアミノ酸配列から推測される計算質量と関連づけることで該ピークの由来となるタンパク質の種類を帰属する手法（Ｓ１０−ＧＥＲＭＳ法）が有用であることが示されている。この手法によれば、質量分析およびそれに付属するソフトウェアを用いて理論的根拠に基づいた信頼性の高い微生物同定を行うことが可能となる（特許文献２）。
また、我々は、大腸菌Ｏ１５７、Ｏ２６及びＯ１１１を迅速に識別するバイオマーカーを見出したが（特許文献３）、これらのバイオマーカーでは、大腸菌とShigella属菌及びE. albertiiの識別を行うには不十分である。
本発明が解決しようとする課題は、大腸菌、Shigella属菌及びE. albertiiの識別に有用な、遺伝的情報に基づいた信頼性の高いバイオマーカーを提供することである。
本発明者は鋭意検討を重ねた結果、質量分析によって試料に含まれる菌種が大腸菌、Shigella属菌及びEscherichia albertiiのいずれであるかを識別するためのマーカータンパク質として１３種類のリボソームタンパク質Ｓ５、Ｌ１５、Ｓ１３、Ｌ３１、Ｌ２２、Ｌ１９、Ｌ２０、Ｌ１３、Ｓ１５、Ｌ２５、ＨＮＳ、ＨｄｅＢ、及びＬ２９が有用であること、これらリボソームタンパク質の少なくとも一つを用いることにより大腸菌、Shigella属菌及びEscherichia albertiiの識別が可能であること、これらの中でも特に７種類のリボソームタンパク質Ｌ３１、Ｌ１３、Ｓ１５、Ｌ２５、ＨＮＳ、ＨｄｅＢ、及びＬ２９の少なくとも一つを用いることにより再現性よく、且つ迅速に大腸菌、Shigella属菌及びEscherichia albertiiの識別が可能であることを発見し、本発明に至った。
すなわち、上記課題を解決するために成された本発明に係る微生物の識別方法は、
a)微生物を含む試料を質量分析してマススペクトルを得るステップと、
b)前記マススペクトルから、マーカータンパク質由来のピークの質量電荷比m/zを読み取る読取ステップと、
c)前記質量電荷比m/zに基づいて前記試料に含まれる微生物が大腸菌、Shigella属菌、及びEscherichia albertiiのいずれの菌種を含むかを識別する識別ステップと
を有し、
前記マーカータンパク質として１３種類のリボソームタンパク質Ｓ５、Ｌ１５、Ｓ１３、Ｌ３１、Ｌ２２、Ｌ１９、Ｌ２０、Ｌ１３、Ｓ１５、Ｌ２５、ＨＮＳ、ＨｄｅＢ、及びＬ２９のうち少なくとも一つを用いることを特徴とする。
特に上記の微生物の識別方法においては、１３種類のリボソームタンパク質のうち７種類のリボソームタンパク質Ｌ３１、Ｌ１３、Ｓ１５、Ｌ２５、ＨＮＳ、ＨｄｅＢ、及びＬ２９のうち、少なくとも一つをマーカータンパク質として用いることが好ましく、特に２種類のリボソームタンパク質Ｌ１３及びＬ２９を用いることが好ましい。
上記の微生物の識別方法は、前記菌種が、Escherichia albertii、Shigella dysenteriae、Shigella flexneri、Shigella sonnei、Shigella boydii、大腸菌のいずれかであることを識別する方法として好適である。
具体的には、識別ステップで識別する菌種がShigella属菌であるときは、前記マーカータンパク質として、少なくとも、リボソームタンパク質Ｌ２９及びＬ１３から成る群、リボソームタンパク質Ｌ３１、ＨｄｅＢ、及びＬ１３から成る群のいずれかを含む。
また、識別ステップで識別する菌種がEscherichia albertiiであるときは、前記マーカータンパク質として、少なくとも、リボソームタンパク質Ｌ３１、ＨｄｅＢ、Ｌ２５及びＨＮＳから成る群、リボソームタンパク質Ｌ２５及びＳ１５から成る群、リボソームタンパク質Ｌ２９のいずれか一つを含む。
さらに、識別ステップで識別する菌種がShigella dysenteriaeであるときは、前記マーカータンパク質として少なくとも、リボソームタンパク質ＨｄｅＢ、Ｌ２９、Ｌ１３のいずれか一つを含む。
識別ステップで識別する菌種がShigella flexneriであるときは、前記マーカータンパク質として少なくとも、リボソームタンパク質Ｌ３１及びＬ２９のいずれかを含む。
識別ステップで識別する菌種がShigella sonneiであるときは、前記マーカータンパク質として少なくとも、リボソームタンパク質Ｌ１３を含むことを含むことを特徴とする微生物の識別方法。
識別ステップで識別する菌種がShigella boydiiであるときは、前記マーカータンパク質として少なくとも、リボソームタンパク質Ｌ２５、ＨＮＳ、及びＬ１３のうちの一つを含む。
また、上記の微生物の識別方法においては、
少なくともリボソームタンパク質ＨｄｅＢ、ＨＮＳ、及びＬ２９に由来するピークの質量電荷比m/zを指標とするクラスター解析を用いると、前記試料に含まれる微生物がE. albertii、Shigella dysenteriae、Shigella flexneri、Shigella sonnei、Shigella boydii、大腸菌のいずれであるかを精度良く識別することができる。
さらに、少なくともリボソームタンパク質Ｌ３１、Ｌ１３、Ｓ１５、Ｌ２５、ＨＮＳ、ＨｄｅＢ、およびＬ２９に由来するピークの質量電荷比m/zを指標とするクラスター解析を用いると、前記試料に含まれる微生物がEscherichia albertii、Shigella dysenteriae、Shigella flexneri、Shigella sonnei、Shigella boydii、大腸菌のいずれであるかを一層精度良く識別することができる。
この場合、前記クラスター解析による識別結果を表すデンドログラムを作成するステップを、さらに有することが好ましい。
上記本発明に係る微生物の識別方法では、大腸菌、Shigella属菌、及びE. albertiiに特有な変異を示すリボソームタンパク質をマーカータンパク質として用いたため、試料に含まれる微生物が大腸菌、Shigella属菌、及びEscherichia albertiiのいずれの菌種を含むかを再現性よく、且つ迅速に識別することができる。
また、大腸菌、Shigella属菌、及びEscherichia albertiiに特有な変異を示すリボソームタンパク質をマーカータンパク質として用い、マススペクトル上におけるマーカータンパク質由来のピークの質量電荷比m/zを指標としてクラスター解析を行うことにより、複数の試料に含まれる微生物が大腸菌、Shigella属菌、及びEscherichia albertiiのいずれの菌種であるかの識別を一括で行うことができる。
本発明に係る微生物の識別方法に用いられる微生物識別システムの要部を示す構成図。 本発明に係る微生物の識別方法の手順の一例を示すフローチャート。 実施例で使用した大腸菌、Shigella属菌及びE. albertiiの菌種名および菌株名の一覧を示す図。 実施例で使用したプライマーの一覧を示す図。 各アミノ酸の質量を示す図。 実施例で使用した大腸菌、Shigella属菌及びEscherichia albertiiの１４種類のリボソームタンパク質の理論質量値とＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによる実測値の一覧を示す図。 図６Ａにおける帰属番号と各リボソームタンパク質の理論質量値との関係を示す図。 実施例で使用した大腸菌、Shigella属菌及びEscherichia albertiiの１４種類のリボソームタンパク質の実測値の帰属の一覧を示す図。 図７Ａにおける帰属番号と各リボソームタンパク質の理論質量値との関係を示す図。 実施例で使用した大腸菌、Shigella属菌及びEscherichia albertiiの７種類のリボソームタンパク質の実測値の帰属の一覧を示す図。 図８Ａにおける帰属番号と各リボソームタンパク質の理論質量値との関係を示す図。 ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳで得られたチャート。 フィンガープリント方式（ＳＡＲＡＭＩＳ）による識別結果。 ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ測定により得られたピークチャート（その１）。 ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ測定により得られたピークチャート（その２）。 ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ測定により得られたピークチャート（その３）。ム。 ７種類のリボソームタンパク質を使って作成したデンドログラム。 １３種類のリボソームタンパク質を使って作成したデンドログラム。 ＤＮＡ配列表（その１）。 ＤＮＡ配列表（その２）。 ＤＮＡ配列表（その３）。 ＤＮＡ配列表（その４）。 ＤＮＡ配列表（その５）。 ＤＮＡ配列表（その６）。 アミノ酸配列（その１）。 アミノ酸配列（その２）。 アミノ酸配列（その３）。
以下、本発明に係る微生物の識別方法の具体的な実施形態について説明する。
図１は本発明に係る微生物の識別方法に用いられる微生物識別システムの全体図である。この微生物識別システムは、大別して質量分析部１０と微生物判別部２０とから成る。質量分析部１０は、マトリックス支援レーザ脱離イオン化法（ＭＡＬＤＩ）によって試料中の分子や原子をイオン化するイオン化部１１と、イオン化部１１から出射された各種イオンを質量電荷比に応じて分離する飛行時間型質量分離器（ＴＯＦ）１２を備える。
ＴＯＦ１２は、イオン化部１１からイオンを引き出してＴＯＦ１２内のイオン飛行空間に導くための引き出し電極１３と、イオン飛行空間で質量分離されたイオンを検出する検出器１４とを備える。
微生物判別部２０の実体は、ワークステーションやパーソナルコンピュータ等のコンピュータであり、中央演算処理装置であるＣＰＵ（Central Processing Unit）２１にメモリ２２、ＬＣＤ（Liquid Crystal Display）等から成る表示部２３、キーボードやマウス等から成る入力部２４、ハードディスクやＳＳＤ（Solid State Drive）等の大容量記憶装置から成る記憶部３０が互いに接続されている。記憶部３０には、ＯＳ（Operating System）３１、スペクトル作成プログラム３２、属・種決定プログラム３３、および下位分類決定プログラム３５（本発明に係るプログラム）が記憶されると共に、第１データベース３４および第２データベース３６が格納されている。微生物判別部２０は、更に、外部装置との直接的な接続や、外部装置等とのＬＡＮ（Local Area Network）などのネットワークを介した接続を司るためのインターフェース（Ｉ／Ｆ）２５を備えており、該インターフェース２５よりネットワークケーブルＮＷ（又は無線ＬＡＮ）を介して質量分析部１０に接続されている。
図１においては、下位分類決定プログラム３５に係るように、スペクトル取得部３７、m/z読み取り部３８、下位分類判定部３９、クラスター解析部４０、およびデンドログラム（系統図）作成部４１が示されている。これらはいずれも基本的にはＣＰＵ２１が下位分類決定プログラム３５を実行することによりソフトウェア的に実現される機能手段である。なお、下位分類決定プログラム３５は必ずしも単体のプログラムである必要はなく、例えば属・種決定プログラム３３や、質量分析部１０を制御するためのプログラムの一部に組み込まれた機能であってもよく、その形態は特に問わない。なお、属・種決定プログラム３３としては、例えば、従来のフィンガープリント法による微生物同定を行うプログラム等を利用することができる。
また、図１では、ユーザが操作する端末にスペクトル作成プログラム３２、属・種決定プログラム３３、および下位分類決定プログラム３５、第１データベース３４、および第２データベース３６を搭載する構成としたが、これらの少なくとも一部又は全部を前記端末とコンピュータネットワークで接続された別の装置内に設け、前記端末からの指示に従って前記別の装置内に設けられたプログラムによる処理および／又はデータベースへのアクセスが実行される構成としてもよい。
記憶部３０の第１データベース３４には、既知微生物に関する質量リストが多数登録されている。この質量リストは、ある微生物細胞を質量分析した際に検出されるイオンの質量電荷比を列挙したものであり、該質量電荷比の情報に加えて、少なくとも、前記微生物細胞が属する分類群（科、属、種など）の情報（分類情報）を含んでいる。こうした質量リストは、予め各種の微生物細胞を前記質量分析部１０によるものと同様のイオン化法および質量分離法によって実際に質量分析して得られたデータ（実測データ）に基づいて作成することが望ましい。
前記実測データから質量リストを作成する際には、まず、前記実測データとして取得されたマススペクトルから所定の質量電荷比範囲に現れるピークを抽出する。このとき、前記質量電荷比範囲を2,000〜35,000程度とすることにより、主にタンパク質由来のピークを抽出することができる。また、ピークの高さ（相対強度）が所定の閾値以上のものだけを抽出することにより、不所望のピーク（ノイズ）を除外することができる。なお、リボソームタンパク質群は細胞内で大量に発現しているため、前記閾値を適切に設定することにより、質量リストに記載される質量電荷比の大部分をリボソームタンパク質由来のものとすることができる。そして、以上により抽出されたピークの質量電荷比（m/z）を細胞毎にリスト化し、前記分類情報等を付加した上で第１データベース３４に登録する。なお、培養条件による遺伝子発現のばらつきを抑えるため、実測データの採取に用いる各微生物細胞は、予め培養条件を規格化しておくことが望ましい。
記憶部３０の第２データベース３６には、属・種決定プログラム３３により識別可能な分類レベルよりも下位のレベル（種、亜種、病原型、血清型、株など）で既知微生物を識別するためのマーカータンパク質に関する情報が登録されている。該マーカータンパク質に関する情報としては、少なくとも既知微生物における該マーカータンパク質の質量電荷比（m/z）の情報が含まれる。本実施形態における第２データベース３６には、被検微生物が大腸菌、Shigella属菌、及びE. albertiiのいずれの菌種を含むかを判定するためのマーカータンパク質に関する情報として、少なくとも７種類のリボソームタンパク質Ｌ３１、Ｌ１３、Ｓ１５、Ｌ２５、ＨＮＳ、ＨｄｅＢ、Ｌ２９の質量電荷比の値が記憶されている。これら７種類のリボソームタンパク質の質量電荷比の値については後述する。
第２データベース３６に記憶するマーカータンパク質の質量電荷比の値としては、各マーカータンパク質の塩基配列をアミノ酸配列に翻訳することにより求められた計算質量と、実測により検出される質量電荷比を比較して選別することが望ましい。なお、マーカータンパク質の塩基配列は、シークエンスによって決定するほか、公共のデータベース、例えばＮＣＢＩ（国立生物工学情報センター：National Center for Biotechnology Information）のデータベース等から取得したものを用いることもできる。前記アミノ酸配列から計算質量を求める際には、翻訳後修飾としてＮ−末端メチオニン残基の切断を考慮することが望ましい。具体的には、最後から２番目のアミノ酸残基がGly, Ala, Ser, Pro, Val, Thr, 又はCysである場合に、Ｎ−末端メチオニンが切断されるものとして前記理論値を算出する。また、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳで実際に観測されるのはプロトンが付加した分子であるため、そのプロトンの分も加味して前記計算質量（すなわち各タンパク質をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳで分析した場合に得られるイオンの質量電荷比の理論値）を求めることが望ましい。
本実施形態に係る微生物識別システムを用いた大腸菌、Shigella属菌、及びE. albertiiの識別手順についてフローチャートを参照しつつ説明を行う。
まず、ユーザは被検微生物の構成成分を含む試料を調製し、質量分析部１０にセットして質量分析を実行させる。このとき、前記試料としては、細胞抽出物、又は細胞抽出物からリボソームタンパク質等の細胞構成成分を精製したものの他、菌体や細胞懸濁液をそのまま使用することもできる。
スペクトル作成プログラム３２は、質量分析部１０の検出器１４から得られる検出信号をインターフェース２５を介して取得し、該検出信号に基づいて被検微生物のマススペクトルを作成する（ステップＳ１０１）。
次に、種決定プログラム３３が、前記被検微生物のマススペクトルを第１データベース３４に収録されている既知微生物の質量リストと照合し、被検微生物のマススペクトルに類似した質量電荷比パターンを有する既知微生物の質量リスト、例えば被検微生物のマススペクトル中の各ピークと所定の誤差範囲で一致するピークが多く含まれている質量リストを抽出する（ステップＳ１０２）。種決定プログラム３３は、続いてステップＳ１０２で抽出した質量リストと対応付けて第１データベース３４に記憶された分類情報を参照することで、該質量リストに対応した既知微生物が属する生物種を特定する（ステップＳ１０３）。そして、この生物種が大腸菌、Shigella属菌、及びE. albertiiのいずれでもなかった場合（ステップＳ１０４でNoの場合）は、該生物種を被検微生物の生物種として表示部２３に出力し（ステップＳ１０９）、識別処理を終了する。一方、前記生物種が大腸菌、Shigella属菌、及びE. albertiiのいずれかであった場合（ステップＳ１０４でYesの場合）は、続いて下位分類決定プログラム３５による識別処理に進む。なお、あらかじめ他の方法で、試料中に大腸菌、Shigella属菌、及びE. albertiiを含むことが判定されている場合は、マススペクトルを用いた種決定プログラムを利用せずに、下位分類決定プログラム３５に進めばよい。
下位分類決定プログラム３５では、まず下位分類判定部３９がマーカータンパク質である７種のリボソームタンパク質Ｌ３１、Ｌ１３、Ｓ１５、Ｌ２５、ＨＮＳ、ＨｄｅＢ、Ｌ２９の質量電荷比の値をそれぞれ第２データベース３６から読み出す（ステップＳ１０５）。続いてスペクトル取得部３７が、ステップＳ１０１で作成された被検微生物のマススペクトルを取得する。そして、m/z読み取り部３８が、該マススペクトル上において、前記の各マーカータンパク質に関連付けて第２データベース３６に記憶された質量電荷比範囲に現れるピークを各マーカータンパク質に対応するピークとして選出し、その質量電荷比を読み取る（ステップＳ１０６）。そして、読み取った質量電荷比を指標とするクラスター解析を実行する。具体的には、下位分類判定部３９が、この質量電荷比と前記第２データベース３６から読み出した各マーカータンパク質の質量電荷比の値を比較し、該読み取った質量電荷比についてタンパク質の帰属を決定する（ステップＳ１０７）。そして、決定した帰属に基づきクラスター解析を実行して被検微生物の種を判定し（ステップＳ１０８）、その旨を被検微生物の識別結果として表示部２３に出力する（ステップＳ１０９）。
以上、本発明を実施するための形態について図面を参照しつつ説明を行ったが、本発明は上記実施形態に限定されるものではなく、本発明の趣旨の範囲で適宜変更が許容される。
（１）使用菌株
図３に記載の、菌株保存機関理化学研究所 バイオリソースセンター微生物材料開発室 （ＪＣＭ、つくば、日本）、独立行政法人製品評価技術基盤機構生物遺伝資源センター（ＮＢＲＣ、 木更津、 日本）およびナショナルバイオリソースプロジェクトGTCコレクション（岐阜、日本）から入手可能な大腸菌、Escherichia arbertii及びShigella属菌を解析に使用した。
（２）ＤＮＡの解析
図４に示す、コンセンサス配列に基づいて設計したプライマーによりＳ１０-spc-alphaオペロンおよびバイオマーカーとなりうるリボソームタンパク質遺伝子のＤＮＡ配列を解析した。詳述すると、各菌株より常法にてゲノム抽出し、それを鋳型としてKOD plusによりＰＣＲを行い、目的遺伝子領域を増幅した。得られたＰＣＲ産物を精製し、それをシーケンス解析の鋳型とした。シーケンス解析にはBig Dye ver. 3.1 Cycle Sequencing Kit（アプライド・バイオシステムズ, Foster City, カリフォルニア州）を用いて行った。遺伝子のＤＮＡ配列からそれぞれの遺伝子のアミノ酸配列に変換し、図５のアミノ酸質量に基づき、質量電荷比を算出し、理論質量値とした。
（３）ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳによる分析
ＬＢ寒天培地に生育した菌体を分析サンプルとしホールセル分析を行なった。１０μＬのシナピン酸マトリックス剤（50 v/v％アセトニトリル、1 v/v％トリフルオロ酢酸溶液中に20 mg/mLのシナピン酸（和光純薬工業株式会社、大阪、日本））に上記分析サンプル１コロニー分を加え良く撹拌し、そのうち1.2 μLをサンプルプレートに搭載し自然乾燥した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ測定にはAXIMA微生物同定システム（島津製作所、 京都、 日本）を使用し、ポジティブリニアモード、スペクトルレンジ2000m/z〜35000m/zにて試料の測定を行った。上述の計算質量を測定された質量電荷比と許容誤差500 ppmでマッチングし、適宜修正を施した。なお、質量分析装置のキャリブレーションには大腸菌ＤＨ５α株を用い、説明書に従い実施した。
（４）大腸菌、E. albertii、Shigella属菌の識別用データベースの構築
上記（２）で得られたリボソームタンパク質の理論質量値と、（３）で得られたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳによるピークチャートを照合し、実測で検出できたタンパク質に関して、遺伝子配列から求めた理論質量値と実測値に相違がないことを確認した。そして、Ｓ１０-spc-αオペロン内のリボソームタンパク質および菌株により異なる質量を示したその他バイオマーカーとなりうるタンパク質の理論質量値および実測値をデータベースとして図６Ａにまとめた。図６では、各リボソームタンパク質の欄の左列の数字は遺伝子から求めた質量電荷比（m/z）の理論質量を、右列の数字は帰属番号を示す。図６Ｂに、各リボソームームタンパク質の質量電荷比と図６Ａに示す帰属番号との関係を示す。また、各リボソームタンパク質の欄の最下段の「〇」、「△」の記号は、実測での質量ピーク検出結果を表している。「〇」の記号はＡＸＩＭＡ微生物同定システムのデフォルトのピーク処理設定（Threshold offset ; 0.015mV, Threshold response ; 1.200）で理論値の500 ppm範囲内のピークとして検出されたことを意味する。「△」の記号は、各菌株における理論値質量差または他のリボソームタンパク質のピークとの差がそれぞれ500 ppm以内であり、ピークは検出されてもその質量差が識別できなかったことを意味する。
ここからわかるように、Ｓ１０-spc-alphaオペロン内にコードされているリボソームタンパク質Ｓ５、Ｌ１５、Ｓ１３、Ｌ２９、およびオペロン外のＬ３１、Ｌ２２、Ｌ１９、Ｌ２０、Ｌ１３および特許文献３で示したＳ１５、Ｌ２５、ＨＮＳ、ＨｄｅＢ（計１３種類）は、その理論質量値が大腸菌、Escherichia arbertii及びShigella属菌株によって異なるため、識別に使用できる有用なタンパク質マーカーである可能性が示された。
しかしながら、Ｓ５、Ｌ１５、Ｓ１３、Ｌ２２、Ｌ１９およびＬ２０は理論質量差が500 ppm以上離れている菌株が存在しこれら菌株の識別のための有力なバイオマーカーとなりうることが分かるが、実測において検出することができなかったため、バイオマーカーとしては好適ではないものと考えられた。
一方、Ｌ３１、Ｌ２９、Ｌ１３、ＨｄｅＢ、Ｓ１５、Ｌ２５およびＨＮＳの、計７種類のタンパク質は、菌株によらず安定的に検出され、さらに菌株による質量差も500 ppm以上であることから、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳにおける大腸菌、Escherichia arbertii及びShigella属菌の識別のためのバイオマーカーとして有用であることがわかった。そこで、以下の実験では、これら７種類のリボソームタンパク質をバイオマーカーとして用いることとした。
（５）ソフトウェアによる、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ実測値の帰属
上記７種類のタンパク質Ｌ３１、Ｌ２９、Ｌ１３、ＨｄｅＢ、Ｓ１５、Ｌ２５およびＨＮＳの理論質量値を特許文献２に示されるようなソフトウェアに登録した。なお、Ｌ２９に関しては、m/z7274の位置に夾雑ピークを持つ株があるため、バイオマーカーピークとしてはm/z7261.45、m/z7302.5、m/z7288.47の3本のみを登録した。
次に、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳにおける実測データを本ソフトウェアで解析し、それぞれのバイオマーカーが、登録された質量ピークとして正しく帰属されるかを調べた。その結果、図７Ａに示すように、すべての菌株のすべてのバイオマーカー質量ピークが登録した質量数として帰属された。なお、図７Ｂに、各リボソームームタンパク質の質量電荷比と図７Ａに示す帰属番号との関係を示す。各菌株の血清型を照らし合わせたところ、Escherichia arbertii、Shigella dyseteriae、Shigella flexneri、Shigella sonnei、Shigella boydiiの各タイプストレインと大腸菌Ｋ１２株、Ｏ１５７株、Ｏ２６株及びＯ１１１株を識別することができた。
このことから、Ｌ３１、Ｌ２９、Ｌ１３、ＨｄｅＢ、Ｓ１５、Ｌ２５およびＨＮＳの質量をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ分析のバイオマーカーとすることは、大腸菌、Escherichia arbertii及びShigella属菌の識別に有用であることがわかった。
今回見出したバイオマーカーは、非特許文献１５で報告された質量ピーク[m/z] 2400、3792、4162、4856、5096、5752、7288、7302、8323、8455、9711、9736、10458と異なり、遺伝子情報から正確な質量が算出されており、実測値とも照合されている。これにより、今回初めて信頼性の高い質量データベースを提供することが可能となった。
（６）バイオマーカーの遺伝子配列およびアミノ酸配列
大腸菌、Escherichia arbertii及びShigella属菌の菌株によって異なる理論質量値を示した、Ｓ１０-spc-alphaオペロン内およびオペロン外にコードされているタンパク質Ｌ３１、Ｌ２９、Ｌ１３、ＨｄｅＢ、Ｓ１５、Ｌ２５およびＨＮＳの各菌株におけるＤＮＡ配列及びアミノ酸配列を図１４Ａ〜図１４Ｆ及び図１５Ａ〜図１５Ｂにまとめた。
（７）Escherichia coli 、Escherichia arbertii、Shigella dyseteriae、Shigella flexneri、Shigella sonneiおよびShigella boydiiの実測
既存のフィンガープリント方式(SARAMIS)による識別結果と、図８Ｂに示す各バイオマーカーの理論質量値を指標とした識別結果を比較した。まず、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳにおける実測では図９に示すようなチャートが得られた。本結果をAXIMA微生物同定システムの説明書に従いSARAMISにて解析した。これにより得られた結果を図１０に示す。図１０からわかるように、Escherichia coli は識別率90％以上で『Escherichia coli』と同定された。しかし、Escherichia arbertii、Shigella dyseteriae、Shigella flexneri、Shigella sonneiおよびShigella boydiiも識別率89〜99％で全て『Escherichia coli』と誤同定された。
そこで、これらの菌株の実測結果を図８Ｂに示した理論質量データベースをもとに識別可能かを試みた。なお、Ｌ２９のｍ/ｚ7274.44は異なる理論質量の株にもm/z 7274.44付近に夾雑ピークがあらわれるため、これ以外のm/z 7261.45、m/z 7302.497、m/z 7288.471をバイオマーカーピークとして利用した。図１１Ａ〜図１１Ｃは図９のチャート図から、バイオマーカーのピーク部分を拡大したものである。ここからわかるように、それぞれのバイオマーカーの質量電荷比がシフトしていることにより、ピークを区別することができる。また、これら７種類のバイオマーカーの実測値を理論値と比較し帰属したところ、図８Ａに示す結果が得られた。図８Ａに示す帰属番号と理論値との関係は、図８Ｂに示す通りである。
７種類のバイオマーカーの帰属結果を用いて描いた系統図を図１２に示す。また、１３種類のバイオマーカーの帰属結果（図７Ａ）を用いて描いた系統図を図１３に示す。いずれにおいても種が識別できていることがわかる。以上より、本発明で見出したバイオマーカーの質量差を用いた識別方法は非常に有効な手法であることがわかった。
１０…質量分析部
１１…イオン化部
１２…ＴＯＦ
１３…引き出し電極
１４…検出器
２０…微生物判別部
２１…ＣＰＵ
２２…メモリ
２３…表示部
２４…入力部
２５…Ｉ／Ｆ
３０…記憶部
３１…ＯＳ
３２…スペクトル作成プログラム
３３…属・種決定プログラム
３４…第１データベース
３５…下位分類決定プログラム
３６…第２データベース
３７…スペクトル取得部
３８…m/z読み取り部
３９…下位分類判定部
４０…クラスター解析部
４１…デンドログラム作成部

Claims (7)

  1. a)微生物を含む試料を質量分析してマススペクトルを得るステップと、
    b)前記マススペクトルから、マーカータンパク質由来のピークの質量電荷比m/zを読み取る読取ステップと、
    c)前記質量電荷比m/zに基づいて前記試料に含まれる微生物がShigella dysenteriae、Shigella flexneri、Shigella sonnei、Shigella boydiiのいずれを含むかを識別する識別ステップと
    を有し、
    前記マーカータンパク質として、少なくとも、リボソームタンパク質Ｌ２９、Ｌ１３及びＬ３１を含むことを特徴とする微生物の識別方法。
  2. a)微生物を含む試料を質量分析してマススペクトルを得るステップと、
    b)前記マススペクトルから、マーカータンパク質由来のピークの質量電荷比m/zを読み取る読取ステップと、
    c)前記質量電荷比m/zに基づいて前記試料に含まれる微生物がEscherichia albertiiを含むかを識別する識別ステップと
    を有し、
    前記マーカータンパク質として、少なくとも、リボソームタンパク質Ｌ３１、ＨｄｅＢ、Ｌ２５及びＨＮＳから成る組、リボソームタンパク質Ｌ２５及びＳ１５から成る組、リボソームタンパク質Ｌ２９のいずれか一組又は一つを含むことを特徴とする微生物の識別方法。
  3. a)微生物を含む試料を質量分析してマススペクトルを得るステップと、
    b)前記マススペクトルから、マーカータンパク質由来のピークの質量電荷比m/zを読み取る読取ステップと、
    c)前記質量電荷比m/zに基づいて前記試料に含まれる微生物がShigella dysenteriaeを含むかを識別する識別ステップと
    を有し、
    前記マーカータンパク質として少なくとも、リボソームタンパク質ＨｄｅＢ、Ｌ２９、Ｌ１３のいずれか一つを含むことを特徴とする微生物の識別方法。
  4. a)微生物を含む試料を質量分析してマススペクトルを得るステップと、
    b)前記マススペクトルから、マーカータンパク質由来のピークの質量電荷比m/zを読み取る読取ステップと、
    c)前記質量電荷比m/zに基づいて前記試料に含まれる微生物がShigella flexneriを含むかを識別する識別ステップと
    を有し、
    前記マーカータンパク質として少なくとも、リボソームタンパク質Ｌ３１及びＬ２９のいずれかを含むことを特徴とする微生物の識別方法。
  5. a)微生物を含む試料を質量分析してマススペクトルを得るステップと、
    b)前記マススペクトルから、マーカータンパク質由来のピークの質量電荷比m/zを読み取る読取ステップと、
    c)前記質量電荷比m/zに基づいて前記試料に含まれる微生物がShigella sonneiを含むかを識別する識別ステップと
    を有し、
    前記マーカータンパク質として少なくとも、リボソームタンパク質Ｌ１３を含むことを含むことを特徴とする微生物の識別方法。
  6. a)微生物を含む試料を質量分析してマススペクトルを得るステップと、
    b)前記マススペクトルから、マーカータンパク質由来のピークの質量電荷比m/zを読み取る読取ステップと、
    c)前記質量電荷比m/zに基づいて前記試料に含まれる微生物がShigella boydiiを含むかを識別する識別ステップと
    を有し、
    前記マーカータンパク質として少なくとも、リボソームタンパク質Ｌ２５、ＨＮＳ、及びＬ１３のうちの一つを含むことを特徴とする微生物の識別方法。
  7. コンピュータに請求項１〜６のいずれか１つの請求項に記載の全てのステップを実行させるためのプログラム。
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