JP6857736B2 - 新規なエクソソーム系抗癌剤 - Google Patents

Description

本発明は、新規な抗癌剤に係り、より具体的には、癌細胞の食細胞作用を増加させる新規なエクソソーム系抗癌剤に関する。

腫瘍（ｔｕｍｏｒ）は、生存・増殖のために、兔疫細胞の表面から発見される受容体と相互作用する活性化及び抑制リガンドを発現することにより、免疫監視（ｉｍｍｕｎｅ ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ）を避ける。腫瘍と免疫細胞との間のこのような相互作用は、免疫系（ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ）によって腫瘍の死滅を防止する（Ｐａｒｄｏｌｌ ＤＭ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ．１２：２５２−６４、２０１２）。腫瘍免疫回避のメカニズムの１つは、腫瘍が先天性免疫監視を避けるようにするＣＤ４７の過発現でＣＤ４７が大食細胞のような先天性免疫細胞の信号調節タンパク質α（ＳＩＲＰα）と結合すれば、樹状細胞は、「私を食べないでください」という信号を活性化させて、腫瘍が食細胞作用（ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ）から避けるように誘導するが、多様な悪性細胞から豊かなＣＤ４７が発現されて、癌患者の生存率が低くなるので、ＣＤ４７−ＳＩＲＰα相互作用の治療標的化のための強力な根拠を提示する。ＳＩＲＰαのＮ末端が、ＣＤ４７のＮ末端と相互作用する免疫グロブリンスーパーファミリーＶ−類似ドメインを含むために、いくつかの競争的拮抗剤が、これらの相互作用を遮断するために開発されたが、ヒトＣＤ４７遮断単一クローン抗体（ＣＤ４７ｍＡｂ）は、多様な前臨床腫瘍モデルで効能を立証し、免疫原性腫瘍のＴ細胞媒介の破壊（ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ）を誘発した（Ｔｓｅｎｇ Ｄ，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１１０：１１１０３−８．２０１３）。また、ＣＤ４７−ＳＩＲＰα相互作用は、組換えＳＩＲＰαタンパク質やＳＩＲＰα−ＦＣ融合タンパク質と共に拮抗効果を示すことができるが、天然ＣＤ４７とＳＩＲＰαとの間の弱い相互作用が治療拮抗剤として野生型ＳＩＲＰαタンパク質の有用性を制限することができるということを勘案する時、ＳＩＲＰαの高親和性（ｈｉｇｈ−ａｆｆｉｎｉｔｙ）変異体が生成されて、癌細胞でＣＤ４７を拮抗すると表われた。しかし、ＳＩＲＰα変異体のみで腫瘍特異的抗体に対する補助剤（ａｄｊｕｖａｎｔｓ）として作用したが、期待以上に大食細胞の食細胞作用と腫瘍成長抑制を刺激しなかった（Ｓｏｃｋｏｌｏｓｋｙ ＪＴ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１１３：Ｅ２６４６−Ｅ５４、２０１６）。これと関連して、米国公開特許第２０１５−０３７６２８８号は、宿主食細胞（ｈｏｓｔ ｐｈａｇｏｃｙｔｉｃ ｃｅｌｌ）上の感染された細胞でＳＩＲＰαでＣＤ４７の結合を減少させる薬剤を投与して、病原体感染を治療する治療方法を開示している。

しかし、前記先行技術の場合、感染性疾患治療のために、抗ＣＤ４７製剤を投与してＳＩＲＰαの結合を減少させるので、抗癌治療のための治療剤としては不適である。

本発明は、前記問題点を含んだ多様な問題点を解決するためのものであって、大食細胞と樹状細胞との食細胞作用を増加させて、癌細胞を除去する抗癌治療に効果的な新規なエクソソーム系抗癌剤を提供することを目的とする。しかし、このような課題は、例示的なものであって、これにより、本発明の範囲が限定されるものではない。

本発明の一観点によれば、貪食作用促進タンパク質がエクソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）表面に提示された組換えエクソソームが提供される。

本発明の他の一観点によれば、治療的に有効な量の前記組換えエクソソーム及び薬学的に許容可能な担体を含む抗癌用薬学的組成物が提供される。

前記のようになされた本発明の一実施例によれば、大食細胞と樹状細胞との癌細胞貪食能を向上させて、抗癌免疫効果が増加した効果的なエクソソーム系抗癌剤の生産効果を具現することができる。特に、本発明の一実施例によるＳｉＲＰが表面に提示された組換えエクソソームは、前記ＳｉＲＰがエクソソーム表面に脂質ラフト（ｌｉｐｉｄ ｒａｆｔ）の形態でクラスタリングされることにより、同様に癌細胞表面に脂質ラフトの形態でクラスタリングしているＣＤ４７タンパク質に対して高い結合能（ｈｉｇｈ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｖｉｄｉｔｙ）を有し、結合するので、少量のエクソソームのみでも、ＳｉＲＰ−ＣＤ４７相互作用を遮断して、抗癌免疫反応をより効率的に刺激可能にする。もちろん、このような効果によって、本発明の範囲が限定されるものではない。

本発明の一実施例によってＳＩＲＰα変異体（ＳＩＲＰα−エクソソーム）を発現するプラズマＤＮＡの構造を概略的に示す概要図である。 本発明の一実施例によって製造された組換えエクソソーム（ＳＩＲＰα−エクソソーム）の発現を確認したウェスタンブロットゲル写真（Ａ）であり、流細胞分析（ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）を通じてエクソソーム表面のＳＩＲＰαの発現を分析したグラフ（Ｂ）であり、ＳＩＲＰα−エクソソームのイメージを示す電子顕微鏡写真（Ｃ）である。 本発明の一実施例によって製造したＳＩＲＰα−エクソソームのサイズを動的光散乱（ＤＬＳ）法で分析したグラフ（Ａ）であり、ＳＩＲＰα−エクソソームの透過電子顕微鏡写真（Ｂ）であり、流細胞分析グラフ（Ｃ）であり、動的光散乱（ＤＬＳ）分析グラフ（Ｄ）である。 本発明の一実施例によって精製された組換えＳＩＲＰα−Ｍｙｃ単量体タンパク質（ｍＳＩＲＰα）の発現を分析したウェスタンブロットゲル写真（Ａ）であり、組換えＳＩＲＰα−エクソソームのＳＩＲＰαの量を定量したグラフ（Ｂ）である。 本発明の一実施例によって細胞結合分析を通じてＨＴ２９（Ａ）、Ｒａｊｉ（Ｂ）及びＣＴ２６．ＣＬ２５細胞（Ｃ）表面でＣＤ４７の発現を確認したグラフである。 本発明の一実施例によって組換えＳＩＲＰαのＣＤ４７結合能を分析したものであって、ＨＴ２９細胞の蛍光強度を分析したグラフ（Ａ）であり、流細胞分析を行ったグラフ（Ｂ）であり、Ｒａｊｉ及びＣＴ２６．ＣＬ２５細胞の蛍光強度を分析したグラフ（Ｃ）である。 本発明の一実施例によってＨＴ２９細胞で組換えＳＩＲＰαの効果的な結合を示す蛍光顕微鏡写真である。 本発明の一実施例によって骨髄由来大食細胞（ＢＭＤＭｓ）による食細胞作用を分析したものであって、骨髄由来大食細胞の分化を分析したグラフ（Ａ）であり、骨髄由来大食細胞（ＢＭＤＭｓ）によるＨＴ２９細胞の食細胞作用を分析したＦＡＣＳデータ（Ｂ）である。 本発明の一実施例によってＳＩＲＰα−エクソソームによって食細胞作用が増加したことを分析したグラフ（Ａ）であり、骨髄由来大食細胞（ＢＭＤＭｓ）によってＲａｊｉ及びＣＴ２６．ＣＬ２５細胞の食細胞作用を分析したグラフ（Ｂ）であり、食細胞作用指数（ＰＩ）を示しているグラフ（Ｃ）であり、骨髄由来大食細胞（ＢＭＤＭｓ）によってＨＴ２９細胞の形状を示している蛍光顕微鏡写真（Ｄ）である。 本発明の一実施例によって腫瘍保有免疫欠乏マウスでＳＩＲＰα−エクソソームを腫瘍に処理して抗腫瘍効果を観察したものであって、腫瘍の成長（Ａ）、腫瘍の重量（Ｂ）を分析したグラフであり、切開された腫瘍のイメージ（Ｃ）を示す写真である。 本発明の一実施例によってＳＩＲＰα−エクソソームの抗腫瘍効果を分析したものであって、ＨＴ２９腫瘍保有マウスでＣｙ５．５標職されたエクソソームの生体分布を分析した写真（Ａ）であり、ＳＩＲＰα−エクソソームを注入後、２４時間経過時点で腫瘍の蛍光イメージ（Ｂ）であり、腫瘍の平均放射効率の変化を示す写真（Ｃ）である。 本発明の一実施例によってマウスにＣｙ５．５標職されたエクソソームを注射した後、臓器別に分析したＩＶＩＳイメージである。 本発明の一実施例によって免疫欠乏（ｉｍｍｕｎｏ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ）及び免疫感応（ｉｍｍｕｎｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）マウスを用いてＳＩＲＰα−エクソソームの抗腫瘍効果を観察したものであって、ＨＴ２９腫瘍保有ＢＡＬＢ／ｃ免疫欠乏マウスにＳＩＲＰα−エクソソームを注入して腫瘍成長抑制を分析したグラフ（Ａ）及び前記免疫欠乏マウスモデルから切開された腫瘍の重量を分析したグラフ（Ｂ）、ＣＴ２６．ＣＬ２５腫瘍保有免疫感応ＢＡＬＢ／ｃマウスの腫瘍成長において、ＳＩＲＰα−エクソソームの注入による抗腫瘍効果を分析したグラフ（Ｃ）及び前記ＣＴ２６．ＣＬ２５腫瘍保有免疫感応マウスモデルから切開された腫瘍の重量を分析したグラフ（Ｄ）である。 本発明の一実施例によってＳＩＲＰα−エクソソームの抗腫瘍効果を分析したものであって、ＨＴ２９マウスモデルから切開された腫瘍を形状を示している写真（Ａ）であり、ＣＴ２６．ＣＬ２５腫瘍保有マウスモデルから切開された腫瘍の形状を示している写真（Ｂ）である。 本発明の一実施例によって単量体ＳＩＲＰαタンパク質の効果を分析したものであって、単量体ＳＩＲＰαタンパク質がＣＤ４７に結合する程度を分析したグラフ（Ａ）であり、ＨＴ２９細胞で単量体ＳＩＲＰα媒介食細胞作用を分析したグラフ（Ｂ）であり、Ｒａｊｉ及びＣＴ２６．ＣＬ２５細胞で単量体ＳＩＲＰα媒介食細胞作用を分析したグラフ（Ｃ）である。

[用語の定義]
本明細書で使われる用語「エクソソーム」は、ヒト細胞から分泌される２層の膜からなる小さな小体であって、これらは、凝固、細胞間の信号伝達及び細胞の「廃棄物管理」のような専門機能を行い、疾病特異的核酸とタンパク質とを形成し、体液として放出されるものと知られている。

本明細書で使われる用語「ＳＩＲＰ（ｓｉｇｎａｌ−ｒｅｇｕｌａｔｒｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ）」は、骨髄細胞から主に発現され、そして、幹細胞または神経細胞から発現されるＳＩＲＰ族タンパク質のうち、調節性膜糖タンパク質である。前記ＳＩＲＰには、ＳＩＲＰα、ＳＩＲＰβ、ＳＩＲＰγ及びＳＩＲＰδの４種が知られているが、これらのうち、ＳＩＲＰα及びＳＩＲＰγは、抑制性受容体として作用し、広範囲に発現される膜貫通タンパク質であるＣＤ４７タンパク質と相互作用するが、これは、いわゆる「私を食べないで（ｄｏｎ’ｔ ｅａｔ ｍｅ）」信号と呼ばれる。このような相互作用は、宿主細胞貪食作用のような先天的兔疫細胞の効果器作用を陰性的に調節する。これは、Ｉｇ−類似またはＬｙ４９受容体を経由したＭＨＣ Ｉ系分子によって提供される自己信号と類似している。ＣＤ４７を過発現する癌細胞は、ＳＩＲＰαまたはＳＩＲＰγを活性化させて、大食細胞−媒介破壊を抑制する。最近の研究によれば、ＳＩＲＰαの高親和性変異体が癌細胞上でＣＤ４７をマスキングして、癌細胞に対する貪食作用を増加させるという報告がある（Ｗｅｉｓｋｏｐｆ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４１（６１４１）：８８−９１，２０１３）。

本明細書で使われる用語「受容体型チロシンキナーゼ（ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ、ＲＴＫ）」は、細胞の増殖、分化、癌化、形態形成などに関与する重要なタンパク質群であって、例えば、上皮増殖因子受容体、神経生長因子受容体、インスリン受容体、造血管細胞増殖因子受容体など多数がある。受容体は、これら増殖及び分子因子と細胞外で結合する時にのみ細胞内チロシンリン酸化酵素を活性化して、信号を伝達する。

本明細書で使われる用語「ＣＤ−４７結合ドメイン（ｒＣＤ−４７ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）」は、ＣＤ４７と結合するＮ末端ドメインであって、Ｎ末端の１１２ａ．ａまでにＣＤ４７と結合することができるドメインを意味する。

[発明の詳細な説明]
本発明の一観点によれば、貪食作用促進タンパク質がエクソソーム表面に提示された組換えエクソソームが提供される。

前記組換えエクソソームにおいて、前記貪食作用促進タンパク質は、受容体型チロシンキナーゼの膜通過ドメインのＮ末端に連結された融合タンパク質であり、前記受容体型チロシンキナーゼは、ＰＤＧＦＲ（ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ＥＧＦＲ（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ＦＧＦＲ（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ＶＥＧＦＲ（ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ＨＧＦＲ（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、Ｔｒｋ（ｔｒｏｐｏｍｙｏｓｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｋｉｎａｓｅ）、ＩＲ（ｉｎｓｕｌｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ＬＴＫ（Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ）、アンジオポエチン受容体（ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ＲＯＲ（ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ−ｌｉｋｅ ｏｒｐｈａｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）、ＤＤＲ（ｄｉｓｃｏｉｄｉｎ ｄｏｍａｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ＲＥＴＲ（ｒｅａｒｒａｎｇｅｄ ｄｕｒｉｎｇ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ＰＴＫ（ｔｙｒｏｓｉｎｅ−ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ−ｌｉｋｅ）、ＲＹＫ（ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ）、またはＭｕＳＫ（ｍｕｓｃｌｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｋｉｎａｓｅ）であり得る。

エクソソームは、細胞によって生成される一種の天然物質であって、生体親和的な物質として免疫反応を最小化し、受容体のような細胞表面に発現される細胞膜タンパク質を細胞と同じ方向に定向させて、表面に提示することができるために、細胞表面提示タンパク質を表面に提示して表出させるのに大きな長所を有している物質である。

前記組換えエクソソームにおいて、前記貪食作用促進タンパク質は、ＳＩＲＰまたは前記ＳＩＲＰのＣＤ４７結合ドメインを含む断片、Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ、Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄまたは抗ＣＤ４７抗体であり、前記ＳＩＲＰは、ＳＩＲＰα、ＳＩＲＰγ、またはこれらの高親和性変異体であり得る。

前記組換えエクソソームにおいて、前記ＳＩＲＰは、配列番号１〜６１のうち何れか１つのアミノ酸配列で構成され、前記エクソソームは、内部に抗癌剤を含み、前記抗癌剤は、抗癌タンパク質または抗癌化合物であり得る。特に、前記貪食作用促進タンパク質は、ＣＤ４７タンパク質のクラスタリング（ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ）による信号伝達体系を遮断することができるものであって、抗ＣＤ４７抗体やＳｉＲＰタンパク質であることが望ましい。特に、エクソソーム表面に提示されたＳＩＲＰは、ＳＩＲＰのエクソソーム表面提示に使われたＰＤＧＦＲの膜通過ドメイン（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｄｏｍａｉｎ）に起因してエクソソーム表面に脂質ラフトの形態でクラスタリングされることにより、同様に癌細胞表面に脂質ラフトの形態でクラスタリングしているＣＤ４７タンパク質に対して高い結合能を有し、結合することにより、少量のエクソソームのみでも、ＳＩＲＰ−ＣＤ４７相互作用を遮断することにより、抗癌免疫反応をより効率的に刺激可能にする。前記のようなエクソソームに積載されたＳｉＲＰαの相乗作用は、本発明者によって初めて究明されたものである。

前記組換えエクソソームにおいて、前記抗癌タンパク質は、アスパラギナーゼ（ａｓｐａｒａｇｉｎａｓｅ）、タンパク質毒素、癌抗原に特異的な抗体または前記抗体の断片、腫瘍抑制遺伝子（ｔｕｍｏｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｇｅｎｅ）または抗血管生成因子（ａｎｔｉａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ ｆａｃｔｏｒ）であり得る。この際、前記タンパク質毒素は、ボツリヌス毒素（Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ ｔｏｘｉｎ）、テタヌス毒素（Ｔｅｔａｎｕｓ ｔｏｘｉｎ）、シガ毒素（Ｓｈｉｇａ ｔｏｘｉｎ）、ジフテリア毒素（Ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ ｔｏｘｉｎ、ＤＴ）、リシン（ｒｉｃｉｎ）、シュードモナス外毒素（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｅｘｏｔｏｘｉｎ、ＰＥ）、サイトリシンＡ（ｃｙｔｏｌｙｓｉｎ Ａ、ＣｌｙＡ）、γ−Ｇｅｌｏｎｉｎであり、前記梗塞組織の組織治療用タンパク質は、血管生成因子であり、前記血管生成因子は、ＶＥＧＦ（ｖｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、アンジオポエチン１（ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ １、Ａｎｇ１）、アンジオポエチン２（Ａｎｇ２）、形質転換成長因子−（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−、ＴＧＦ−β）、インテグリン（ｉｎｔｅｇｒｉｎ）、血管内皮カドヘリン（ＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎ）、プラスミノゲン活性剤（ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ、ＰＡ）、エフリン（ｅｐｈｒｉｎ）、ＡＣ−１３３、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ−１、ｍｏｎｏｃｙｔｅ ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ−１）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、または胎盤成長因子（ｐｌａｃｅｎｔａ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ、ＰＩＧＦ）であり得る。前記腫瘍抑制遺伝子は、腫瘍の発生を抑制する遺伝子であって、代表的に、ＶＨＬ（ｖｏｎ Ｈｉｐｐｅｌ Ｌｉｎｄａｕ）、ＡＰＣ（Ａｄｅｎｏｍａｔｏｕｓ ｐｏｌｙｐｏｓｉｓ ｃｏｌｉ）、ＣＤ９５（ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ９５）、ＳＴ５（Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃｉｔｙ ５）、ＹＰＥＬ３（Ｙｉｐｐｅｅ ｌｉｋｅ ３）、ＳＴ７（Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃｉｔｙ ７）及びＳＴ１４（Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃｉｔｙ １４）であり得る。

前記組換えエクソソームにおいて、前記抗癌化合物は、メトトレキサート（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）、ピリミジン類似体（ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ ａｎａｌｏｇｓ）、ヒドロキシウレア（ｈｙｄｒｏｘｙ ｕｒｅａ）、プリン類似体（ｐｕｒｉｎｅ ａｎａｌｏｇｓ）、アルキル化剤（ａｌｋｙｌａｔｉｎｇ ａｇｅｎｔｓ）、免疫原性細胞死誘導剤、有糸分裂抑制剤（ｍｉｔｏｔｉｃ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ）、新生血管抑制剤、挿入性物質（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇ ａｇｅｎｔｓ）または放射性核種（ｒａｄｉｏｎｕｃｌｉｄｅｓ）であり得る。

前記抗癌化合物は、下記のものなどが使われる。
（ｉ）メトトレキサート；
（ｉｉ）ピリミジン類似体
５−フルオロウラシル（５−ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ）、ゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）及びアラビノシルシトシン（ａｒａｂｉｎｏｓｙｌｃｙｔｏｓｉｎｅ）；
（ｉｉｉ）ヒドロキシウレア；
（ｉｖ）プリン類似体
メルカプトプリン（ｍｅｒｃａｐｔｏｐｕｒｉｎｅ）及びチオグアニン（ｔｈｉｏｇｕａｎｉｎｅ）；
（ｖ）アルキル化剤
ナイトロジェンマスタード（ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｍｕｓｔａｄ）及びシクロスポラミド（ｃｙｃｌｏｓｐｏｒａｍｉｄｅ）；
（ｖｉ）抗生剤（ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ）
アントラサイクリン（ａｎｔｈｒａｃｙｃｌｉｎｅ）、ドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ダウノルビシン（ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、イダルビシン（ｉｄａｒｕｂｉｃｉｎ）及びアクチノマイシンＤ（ａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ Ｄ）；
（ｖｉｉ）有糸分裂抑制剤
ビンクリスチン（ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）及びタキソール（ｔａｘｏｌ）；
（ｖｉｉｉ）抗血管生成剤
ＶＥＧＦに特異的な抗体、コンブレタスタチンＡ４（ｃｏｍｂｒｅｔａｓｔａｔｉｎ Ａ４）、フマギリン（Ｆｕｍａｇｉｌｌｉｎ）、ハービマイシンＡ（ｈｅｒｂｉｍｙｃｉｎ Ａ）、２−メトキシエストラジオール（２−ｍｅｔｈｏｘｙｅｓｔｒａｄｉｏｌ）、ＯＧＴ ２１１５、ＴＮＰ ４７０、トラニラスト（ｔｒａｎｉｌａｓｔ）、ＸＲＰ４４Ｘ、サリドマイド（ｔｈａｌｉｄｏｍｉｄｅ）、エンドスタチン（ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ）、サルモシン（ｓａｌｍｏｓｉｎ）、アンギオスタチン（ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ）またはプラスミノゲン（ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）、またはアポリポタンパク質（ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）のクリングルドメイン（ｋｒｉｎｇｌｅ ｄｏｍａｉｎ）；
（ｉｘ）挿入性物質
カルボプラチン（ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）及びシスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）；及び
（ｘ）放射性核種
^１８Ｆ、^９０Ｙ、^１８８Ｒｅ、^３２Ｐ、^８９Ｓｒ、^１６５Ｄｙ、^１８６Ｒｅ、^１９８Ａｕ、^１５３Ｓｍ、^１３１Ｉ、^１６９Ｅｒ、^１２５Ｉ、^９９Ｔｃ及び^１６６Ｈｏなど。

前記組換えエクソソームにおいて、前記免疫原性細胞死誘導剤は、アントラサイクリン系抗癌剤、抗ＥＧＦＲ抗体、ＢＫチャネル作用剤、ボルテゾミブ（Ｂｏｒｔｅｚｏｍｉｂ）、強心性配糖体（ｃａｒｄｉａｃ ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ）＋非免疫原性細胞死誘導剤、シクロホスファミド系抗癌剤、ＧＡＤＤ３４／ＰＰ１阻害剤＋マイトマイシン、ＬＶ−ｔＳＭＡＣ、Ｍｅａｓｌｅｓウイルス、またはオキサリプラチンであり、前記アントラサイクリン系抗癌剤は、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン（ｅｐｉｒｕｂｉｃｉｎ）、イダルビシン、ピクサントロン（ｐｉｘａｎｔｒｏｎｅ）、サバルビシン（ｓａｂａｒｕｂｉｃｉｎ）、またはバルビシン（ｖａｌｒｕｂｉｃｉｎ）であり得る。

本発明の他の一観点によれば、治療的に有効な量の前記組換えエクソソーム及び薬学的に許容可能な担体を含む抗癌用薬学的組成物が提供される。

前記抗癌用薬学的組成物において、１つ以上の抗癌剤をさらに含みうる。薬学的に許容可能な担体を含む前記組成物は、経口または非経口のさまざまな剤型であり得るが、非経口のための剤型であることが望ましい。製剤化する場合には、通常の充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を使用して調剤される。経口投与のための固型製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれ、このような固型製剤は、１つ以上の化合物に少なくとも１つ以上の賦形剤、例えば、澱粉、炭酸カルシウム、スクロースまたはラクトース、ゼラチンなどを混ぜて調剤される。また、単純な賦形剤の以外に、ステアリン酸マグネシウム、タルクのような潤滑剤も使われる。経口投与のための液状製剤としては、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤などが該当するが、よく使われる単純希釈剤である水、流動パラフィンの以外に、さまざまな賦形剤、例えば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれうる。非経口投与のための製剤には、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、座剤が含まれる。非水性溶剤、懸濁溶剤としては、プロピレングリコール（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性油、オレイン酸エチルのような注射可能なエステルなどが使われる。座剤の基剤としては、ウイテプゾール（ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、マクロゴール、トウイーン（ｔｗｅｅｎ）６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどが使われる。

前記薬学的組成物は、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤及び座剤からなる群から選択される何れか１つの剤型を有しうる。

本発明の薬学的組成物は、経口または非経口投与されうるが、非経口投与される場合、静脈内注射、鼻腔内吸入、筋肉内投与、腹腔内投与、経皮吸収など多様な経路を通じて投与することが可能である。

前記本発明の組成物は、薬学的に有効な量で投与される。

本明細書で使われる用語「薬学的に有効な量」は、医学的治療に適用可能な合理的な恩恵／危険の比率で疾患の治療に十分な量を意味し、有効容量レベルは、個体の種類及び重症度、年齢、性別、薬物の活性、薬物に対する敏感度、投与時間、投与経路及び排出比率、治療期間、同時使われる薬物を含んだ要素及びその他の医学分野によく知られた要素によって決定されうる。本発明の薬学的組成物は、０．１ｍｇ／ｋｇ〜１ｇ／ｋｇの容量で投与され、さらに望ましくは、１ｍｇ／ｋｇ〜５００ｍｇ／ｋｇの投与量で投与される。一方、前記投与量は、患者の年齢、性別及び状態によって適切に調節される。

本発明の薬学的組成物は、個別治療剤として投与するか、他の抗癌剤と併用して投与され、従来の他の抗癌剤と順次または同時に投与される。そして、単一または多重投与される。前記要素をいずれも考慮して副作用なしに最小限の量で最大効果が得られる量を投与することが重要であり、当業者によって容易に決定されうる。

以下、実施例を通じて本発明をさらに詳しく説明する。しかし、本発明は、以下で開示される実施例及び実験例に限定されるものではなく、互いに異なる多様な形態として具現可能なものであって、以下の実施例及び実験例は、本発明の開示を完全にし、当業者に発明の範疇を完全に知らせるために提供されるものである。

[プラズマＤＮＡ構築]
本発明の一実施例によって腫瘍細胞表面でＣＤ４７を遮断して食細胞作用を増加させるＳＩＲＰα変異体（ＳＩＲＰα−エクソソームｓ）を発現するプラスミドＤＮＡを構築した。具体的に、ＳＩＲＰα変異体遺伝子は、遺伝子合成サービス（Ｃｏｓｍｏ Ｇｅｎｅｔｅｃｈ Ｃｏ．）を通じて収得し、前記ＳＩＲＰα変異体（配列番号１）をエンコーディングするＤＮＡ配列（配列番号６２）をｐＤｉｓｐｌａｙベクターで血小板由来成長因子受容体（ＰＤＧＦＲ）のＮ末端の信号ペプチド及びメンブレンアンカーの間のフレームに挿入した（図１）。

[エクソソーム分離]
本発明の一実施例によってエクソソーム分離のために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（６ｘ１０^６）は、１０％ ＦＢＳ、１％ 抗生剤が添加された高ブドウ糖培養培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ、ＤＭＥＭ、４，５００ｍｇ／Ｌ ｇｌｕｃｏｓｅ）で培養し、３７℃、５％ ＣＯ_２条件で保持され、１５ｃｍ培養皿で８０〜９０％の細胞飽和度（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ）を示す時、インスリン−トランスフェリン−セレン（ｉｎｓｕｌｉｎ−ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ−ｓｅｌｅｎｉｕｍ、Ｇｉｂｃｏ）を添加した無血清ＤＭＥＭ培養液に取り替えた。２時間経過後、前記細胞を製造社の指針によって形質感染試薬（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してＳＩＲＰα変異体をエンコーディングするプラズマＤＮＡ（２０μｇ）で形質感染（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）させた。次いで、エクソソームを分離するために、形質注入４８時間後、細胞培養上澄み液を分別遠心分離（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ）方法で収得し、詳細な方法は、下記の通りである：
まず、エクソソームを含む培養液から細胞の滓と他の細胞成分とを除去するために、３００ｇで１０分、２０００ｇで１０分及び１００００ｇで３０分間順次に遠心分離を行い、前記培養液を０．２２μｍフィルターで濾過後、７０ Ｔｉ ｒｏｔｏｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて３６，９００ｒｐｍで２時間超遠心分離（ｕｌｔｒａ−ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ）を行った。以後、収得した組換えエクソソーム（ＳＩＲＰα−エクソソーム）は、タンパク質分解酵素抑制剤（Ｒｏｃｈｅ）を含むＰＢＳに再懸濁し、ＢＣＡタンパク質分析キット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて、前記分離されたエクソソームのタンパク質濃度を測定した。

[組換えエクソソームの特性分析]
本発明の一実施例によって製造された組換えエクソソーム（ＳＩＲＰα−エクソソーム）の品質と特徴は、下記のようにウェスタンブロット（ＷＢ）、流細胞分析、動的光散乱（ＤＬＳ）及び透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）を用いて確認した。

まず、ウェスタンブロット分析のために、前記超遠心分離された組換えエクソソームペレットは、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を含むＲＩＰＡ緩衝液（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて溶解し、エクソソームタンパク質同量（１０μｇ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、ニトロセルロース膜（ｍｅｍｂｒａｎｅｓ）で転写させた。次いで、ＳＩＲＰα発現を探知するために、ブロットに抗Ｍｙｃ抗体（１：３０００、Ａｂｃａｍ、ａｂ９１０６）及び抗ＨＡ抗体（１：５００、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｓ、ｓｃ−８０５）を添加した後、４℃の条件で一晩放置し、抗Ａｌｉｘ抗体（１：５００、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｓ、ｓｃ−９９０１０）、抗Ｔｓｇ１０１抗体（１：５００、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｓ、ｓｃ−２２７７４）及び抗ＣＤ６３抗体（１：５００、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｓ、ｓｃ−１５３６３）をエクソソームマーカー（ｅｘｏｓｏｍｅ ｍａｒｋｅｒ）として使用した。次いで、前記膜にＨＲＰ結合された２次抗体（１：４０００、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加し、化学発光（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）によって視覚化された。また、エクソソーム表面のＳＩＲＰαの発現を流細胞分析を用いて分析した。まず、エクソソーム１０μｇを常温で２時間最終ボリューム１ｍｌ ＰＢＳで４μｍ アルデヒド／硫酸塩ラテックスビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で挿入し、次いで、０．５％ ＢＳＡを添加したＰＢＳで２回洗浄し、Ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ ４８８標職された２次抗体（１：８００、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）と培養した後、４℃で１時間抗Ｍｙｃ抗体（１：４００、Ａｂｃａｍ、ａｂ９１０６）と共に培養して、ＳＩＲＰαを染色した。蛍光信号（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｓｉｇｎａｌｓ）は、Ａｃｃｕｒｉ^ＴＭ Ｃ６流細胞分析器（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及びＦｌｏｗＪｏ＿Ｖ１０ソフトウェア（ＦｌｏｗＪｏ）を使用して分析した。

同時に、組換えエクソソームの形態は、まず、サンプルを炭素フィルム（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ｓｃｉｅｎｃｅ）が備えられた銅格子（ｃｏｐｐｅｒ ｇｒｉｄｓ）に位置し、酢酸ウラニル溶液を用いて陰性で染色した。ＳＩＲＰαの内部発現は、免疫電子顕微鏡イメージを通じて確認し、表面ＳＩＲＰαは、抗Ｍｙｃ抗体（１：１００、Ａｂｃａｍ、ａｂ９１０６）及び金結合抗体（１：５０、Ａｕｒｉｏｎ）を用いてキャプチャーし、透過電子顕微鏡（Ｔｅｃｎａｉ）を用いて分析した。最後に、組換えエクソソームのサイズ分布は、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｌｔｄ．，ＵＫ）利用した動的光散乱分析法（ｄｙｎａｍｉｃ ｌｉｇｈｔ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ、ＤＬＳ）を通じて分析し、エクソソームサイズは、装備から提供されたソフトウェアを用いて２５℃条件で１７３゜の固定された角度で数比率（ｚ−ａｖｅｒａｇｅ）を通じて分析した。

その結果、前記精製したＳＩＲＰα−エクソソームは、表面膜上にＳＩＲＰα変異体（ｖａｒｉａｎｔ）を保有しており、エクソソームマーカータンパク質を含有していることを観察した（図２）。また、透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）イメージと動的光散乱（ＤＬＳ）分析結果、組換えエクソソームの平均サイズが、１００ｎｍの平均サイズを有した丸状であることを確認した（図３）。

[単量体ＳＩＲＰαタンパク質の発現及び精製]
本発明の一実施例によって単量体（ｍｏｎｏｍｅｒ）ＳＩＰＲαタンパク質（ｍＳＩＲＰα）を得るために、ＮＨ２−Ｎｄｅ Ｉ−ＳＩＲＰα変異体−Ｍｙｃ−Ｈｉｎｄ ＩＩＩ−ＣＯＯＨをエンコーディングするプライマーを利用したＰＣＲ増幅を通じて遺伝子クローン（ｇｅｎｅ ｃｌｏｎｅ）を製造し、前記遺伝子クローンは、Ｎ末端ヒスチジンタグと共にＳＩＲＰαを発現するために、ｐＥＴ−２８ａプラスミドベクターで結紮した。

以後、形質転換された細菌細胞は、３７℃でＯ．Ｄ．_６００が０．５になるまでカナマイシンを含むＬＢ培地で培養し、ｍＳＩＲＰαを生産するために、０．５ｍＭ イソプロピルβ−Ｄ−１−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（ＩＰＴＧ）（Ｂｉｏｎｅｅｒ、大韓民国）を添加して誘導した。２０℃で１８時間培養した後に、前記細胞は、６０００ｇで１０分間遠心分離を通じて収得し、超音波粉砕機を用いて均一化した後、前記ペレットを溶解バッファ（１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＰＭＳＦ）に再懸濁し、Ｎｉ−ＮＴＡ親和度クロマトグラフィーを通じてｍＳＩＲＰαを精製し、抗Ｍｙｃ抗体（１：５０００、Ａｂｃａｍ、ａｂ９１０６）及びＨＲＰ連結された２次抗体（１：４０００、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を利用したウェスタンブロットで分析した。

その結果、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞から１００μｇの総タンパク質とＳＩＲＰα−エクソソーム２ｘ１０^９を収得し、精製された組換えＳＩＲＰα−Ｍｙｃ単量体タンパク質（ｍＳＩＲＰα）のウェスタンブロットイメージから標準曲線（ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｕｒｖｅ）を使用してエクソソームのＳＩＲＰαの量を定量し、前記測定されたＳＩＲＰα−エクソソームの量は、１μｇ ｅｘｏｓｏｍｅｓ当たり５ｎｇ以下に確認された（図４）。前記ＰＣＲ増幅に使われたプライマーについての情報を下記表１に表示した。

[細胞結合分析]
本発明の一実施例による細胞結合分析は、ＨＴ２９ヒト結腸腺癌腫（ＡＴＣＣ）、ＲａｊｉヒトＢ細胞リンパ腫（ＡＴＣＣ）及びＣＴ２６．ＣＬ２５マウス結腸癌（ＡＴＣＣ）細胞を１０％ ＦＢＳ及び１％ 抗生剤を添加したＲＰＭＩ−１６４０培養培地で培養し、３７℃及び５％ ＣＯ_２条件で保持した。次いで、ＨＴ２９及びＲａｊｉ細胞は、抗ヒトＣＤ４７抗体［Ｂ６Ｈ１２．２］（Ａｂｃａｍ、ａｂ３２８３）を添加して培養し、癌細胞表面でＣＤ４７発現を探知するために、ＣＴ２６．ＣＬ２５細胞は、抗マウスＣＤ４７抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｓ、ｓｃ−１２７３１）を添加して培養した。細胞結合分析のために、ＨＴ２９、Ｒａｊｉ及びＣＴ２６．ＣＬ２５細胞（１ｘ１０^６）は、ＰＢＳ、エクソソームまたはｍＳＩＲＰαを添加して４℃で３０分間培養した。次いで、前記細胞は、抗Ｍｙｃ抗体（１：４００、Ａｂｃａｍ、ａｂ９１０６）を添加して培養し、Ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ４８８結合された２次抗体（１：８００、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を添加して探知した。引き続き、前記細胞は、Ａｃｃｕｒｉ^ＴＭ Ｃ６流細胞分析器（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて測定し、ＦｌｏｗＪｏ＿Ｖ１０ソフトウェア（ＦｌｏｗＪｏ）を用いて分析した。ＳＩＲＰα−エクソソームのＣＤ４７に対する結合特異性は、抗ヒトＣＤ４７抗体（１：１００、Ａｂｃａｍ、ａｂ３２８３）を添加した細胞を前培養する方法を通じるブロック実験で分析した。

また、蛍光顕微鏡分析のために、ＨＴ２９細胞（２ｘ１０^５）は、前述したように、ガラス底４ウェルチャンバに播種し、抗Ｍｙｃ抗体（１：４００、Ａｂｃａｍ、ａｂ９１０６）及びＡｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ ４８８結合された２次抗体（１：８００、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を添加して培養した。残留非特異性信号（ｎｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｉｇｎａｌｓ）の除去後に、前記細胞は、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３２５８を用いて２５℃で１０分間核染色した後に、４％ パラホルムアルデヒドを用いて７分間固定した。エクソソームの細胞結合能は、蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｔｉ、Ｎｉｋｏｎ）で観察し、ＬＡＳ ＡＦ Ｌｉｔｅソフトウェア（Ｌｅｉｃａ）を用いて分析した。

その結果、腫瘍細胞をエクソソームと共に培養して、ＣＤ４７＋ヒト腫瘍細胞株で細胞表面ＣＤ４７を拮抗するＳＩＲＰα−エクソソームの能力を確認した（図５）。また、ＳＩＲＰα−エクソソームは、効果がＳＩＲＰα−エクソソーム濃度依存的に確認された対照群のエクソソームと比較して、ＨＴ２９腫瘍細胞表面の結合でさらに高いＣＤ４７に対する親和力を示した。ＳＩＲＰα−エクソソームの結合は、抗ヒトＣＤ４７抗体との事前培養によって減少して、ＳＩＲＰα−エクソソームが腫瘍細胞表面のＣＤ４７に特異的に結合するということを示し、ヒトＲａｊｉ Ｂｕｒｋｉｔｔ’ｓリンパ腫（Ｒａｊｉ）及びマウスＣＴ２６．ＣＬ２５結腸癌細胞でＳＩＲＰα−エクソソームのＣＤ４７結合の類似した結果を観察した。前記結果は、エクソソームで膜関連ＳＩＲＰα変異体の発現が癌細胞でＣＤ４７に結合する能力を有していることを明らかにする（図６及び図７）。

[食細胞作用分析]
本発明の一実施例によって腫瘍細胞の拮抗作用を有したＣＤ４７が、腫瘍細胞の大食細胞媒介食細胞作用（ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ）を増加させるか否かを観察するために、食細胞作用分析を行った。具体的に、体外（Ｉｎ ｖｉｔｒｏ）食細胞作用分析のための骨髄由来大食細胞（ＢＭＤＭｓ）を製造するために、ＢＡＬＢ／ｃマウスを犠牲させ、骨髄細胞を足骨（ｌｅｇ ｂｏｎｅｓ）から分離した。前記分離した骨髄細胞を１０％ ＦＢＳ及び１％ 抗生剤が添加されたＲＰＭＩ培地で保持させ、７日間大食細胞コロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）に分化させた。食細胞作用は、ＢＭＤＭと癌細胞とを無血清ＲＰＭＩ培地で４時間共培養して分析した。流細胞分析のために、分化された大食細胞（２．５ｘ１０^５）は、０．５μＭ ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ^ＴＭ Ｇｒｅｅｎで染色し、エクソソームまたはｍＳＩＲＰαタンパク質を癌細胞と事前培養した後、ＢＭＤＭを４時間混合物と共に培養した。食細胞作用の比率は、Ａｃｃｕｒｉ^ＴＭ Ｃ６流細胞分析器（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及びＦｌｏｗＪｏ＿Ｖ１０ソフトウェア（ＦｌｏｗＪｏ）を使用して二重陽性信号（ｄｏｕｂｌｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｓｉｇｎａｌｓ）の百分率で評価した。

また、食細胞作用指数（ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ ｉｎｄｅｘ、ＰＩ）を測定するための蛍光顕微鏡分析のために、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ^ＴＭ Ｇｒｅｅｎ（Ｔｈｅｒｍｏ ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で染色したＢＭＤＭを２．５ｘ１０^５の密度で３５ｍｍガラス底ディッシュに播種し、ＨＴ２９細胞（１ｘ１０^６）の混合物をｐＨｒｏｄｏ Ｄｅｅｐ ｒｅｄ（Ｔｈｅｒｍｏ ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で染色し、エクソソームを大食細胞で処理した。４時間の共培養後、大食細胞によるＨＴ２９細胞の貪食（ｅｎｇｕｌｆｍｅｎｔ）は、蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｔｉ、Ｎｉｋｏｎ）によって大食細胞での捕食細胞形成と関連した赤色陽性信号で分析した。

その結果、二重陽性信号（濃い赤色及び緑色）を有する大食細胞の食細胞作用は、対照群（ＰＢＳ処理または対照群−エクソソーム処理）と比較して、ＳＩＲＰα−エクソソーム処理群で濃度依存的に増加すると表われ（図８）、ＳＩＲＰα−エクソソームを処理したＲａｊｉ及びＣＴ２６．ＣＬ２５結腸癌細胞でも、類似して表われた。また、ＳＩＲＰα−エクソソームの処理が腫瘍細胞の貪食を増加させ、これにより、ＰＩがＳＩＲＰα−エクソソーム処理群で有意に増加したと表われた（図９）。したがって、ＳＩＲＰα−エクソソームによるＣＤ４７−ＳＩＲＰα相互作用を遮断することは、骨髄由来大食細胞（ＢＭＤＭｓ）によって多様な癌細胞の食細胞作用の増加を誘導するということを明らかにする。

[生体分布（ｂｉｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）研究]
本発明の一実施例によってＳＩＲＰα−エクソソームの生体分布を調査するために、エクソソームをＣｙ５．５−ＮＨＳで標識し、Ｃｙ５．５−ＮＨＳ染料（１μｇ）を１００μｇのエクソソームに処理した後、室温で２時間培養し、ａｉｒｆｕｓｅ遠心分離機（Ｂｅｃｋｍａｎ ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して４５分間遠心分離した。以後、非結合された染料を除去するために、２回洗浄を行った後に、標職されたエクソソームペレットをＰＢＳに再懸濁し、蛍光強度（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）は、蛍光マイクロプレート判読器（Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００ Ｐｒｏ、ＴＥＣＡＮ）を使用して測定し、調整した。また、ＨＴ２９腫瘍保有ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスにＣｙ５．５標職されたエクソソーム（５００μｇ）、ガラス染料及びＰＢＳを静脈内（ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓｌｙ）投与し、あらゆるサンプルの蛍光強度は、蛍光マイクロプレート判読器で収得したデータに基づいて同じ値で調整した。マウスの生体（Ｉｎ ｖｉｖｏ）全身イメージングは、ＩＶＩＳスペクトル（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して多様な時点（５分、２時間、４時間、８時間、１６時間及び２４時間）で行った。同時に、腫瘍の蛍光強度を分析するために、Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎソフトウェア（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）を使用して関心領域（ＲＯＩ）で立体角（ｓｔｅｒａｄｉａｎ）当たりセンチメートルスクエア当たり総光子（ｔｏｔａｌ ｐｈｏｔｏｎｓ）を計算し、注入後、２４時間経過時点でマウスを犠牲させ、肝、肺、脾臓、腎臓及び心臓を含んだ腫瘍及び主要器官を前記と同じ方法で切除し、分析した。

その結果、切除された腫瘍の平均重量は、腫瘍成長の観察された退化（ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ）と一致して、対照群よりもＳＩＲＰα−エクソソーム処理群で著しく低く表われた（図１０）。

[抗腫瘍効果分析]
本発明の一実施例によって生体内実験（ｉｎ ｖｉｖｏ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ）のために、免疫欠乏ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス及び免疫感応ＢＡＬＢ／ｃマウスは、７週齢になった時点で腫瘍を移植し、韓国科学技術研究院（ＫＩＳＴ）の収容施設で管理された。次いで、ＨＴ２９細胞（１×１０^７）をＢＡＬＢ／ｃヌードマウスの左側足に皮下接種し、腫瘍を一週間成長させた後、対照群−エクソソーム、ＳＩＲＰα−エクソソーム及び対照群ＰＢＳを３日ごとに５回ずつ注入した。次いで、局所抗腫瘍効果の分析のために、１００μｇのエクソソームをマウスの腫瘍内に注入した。腫瘍成長に対するＳＩＲＰα−エクソソームの全身効果（ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｅｆｆｅｃｔ）のために、エクソソーム（２００μｇ）及びＰＢＳをＨＴ２９腫瘍保有マウスに３日ごとに５回ずつ注入し、腫瘍が１０００ｍｍ^３まで成長させた後、切開し、重量を測定した。また、ＣＴ２６．ＣＬ２５細胞（１×１０^６）を免疫感応ＢＡＬＢ／ｃマウスの左側足の皮下に移植し、平均サイズが８０ｍｍ^３である腫瘍の安定化のために、一週間経過後、エクソソーム ２００μｇ、ＳＩＲＰα−エクソソーム ２００μｇ、ｍＳＩＲＰα １μｇ（ＳＩＲＰα−エクソソームｓ ２００μｇでＳＩＲＰα量に該当）またはＰＢＳをそれぞれ前記マウス（それぞれｎ＝７マウスグループ）のしっぽ静脈を通じて注入し、総５回処理が完了すれば、腫瘍を切開し、重量を測定した。

その結果、Ｃｙ５．５染料で標職されたＳＩＲＰα−エクソソームは、腫瘍部位に連続して蓄積され、これは、腫瘍細胞から過発現されたＣＤ４７との相互作用だけではなく、ナノ粒子のようなエクソソームの浸透性及び保有効果が向上したことを明らかにする（図１１）。また、体外（ｅｘ ｖｉｖｏ）イメージ分析結果、マウスの肝と腎臓とでＣｙ５．５に標職されたエクソソームが蓄積されて、全体動物イメージング分析結果を裏付け（図１２）、ＳＩＲＰα−エクソソームで処理したマウスは、対照群と比較して腫瘍成長が多少減少したが、有意な差を示さなかった。一方、免疫欠乏及び免疫感応マウスを用いてＳＩＲＰα−エクソソーム注入による抗腫瘍効果を観察した結果、ＨＴ２９腫瘍保有ＢＡＬＢ／ｃ免疫欠乏マウスにＳＩＲＰα−エクソソームを投与する場合、腫瘍の成長を少し減少させるが、有意なレベルではなかった一方、ＣＴ２６．ＣＬ２５腫瘍保有免疫感応ＢＡＬＢ／ｃマウスにＳＩＲＰα−エクソソームを投与する場合には、非常に優れた抗腫瘍効果を示した。これは、本発明のＳＩＲＰα−エクソソームを投与することにより、免疫機能を経由したＳＩＲＰα−エクソソームの顕著な抗腫瘍効果を立証するものである（図１３及び図１４）。一方、組換えＳＩＲＰαタンパク質（ｍＳＩＲＰα）を投与する場合には、癌細胞のＣＤ４７に効率的に結合することができるにも拘らず、腫瘍の食細胞作用を正しく誘導することはできなかった（図１５）。

結論的に、本発明の一実施例によって製造した組換えエクソソーム（ＳＩＲＰα−エクソソーム）は、ＣＤ４７−ＳＩＲＰα相互作用を遮断することによって、大食細胞と樹状細胞との食細胞作用を増加させて、試験管内条件はもとより、動物モデル実験で非常に顕著な抗腫瘍効果を示したので、癌治療のための新規な抗癌剤として活用可能である。

本発明は、実施例を参考にして説明されたが、これは例示的なものに過ぎず、当業者ならば、これより多様な変形及び均等な他実施例が可能であるという点を理解できるであろう。したがって、本発明の真の技術的保護範囲は、特許請求の範囲の技術的思想によって決定されるべきである。

Claims (13)

1. ＳＩＲＰまたは前記ＳＩＲＰのＣＤ４７結合ドメインを含む断片、Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ、Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄ及び抗ＣＤ４７抗体からなる群から選択される貪食作用促進タンパク質がエクソソーム表面に提示された組換えエクソソーム。
2. 前記貪食作用促進タンパク質は、受容体型チロシンキナーゼの膜通過ドメインのＮ末端に連結された融合タンパク質である請求項１に記載の組換えエクソソーム。
3. 前記受容体型チロシンキナーゼは、ＰＤＧＦＲ、ＥＧＦＲ、ＦＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ、ＨＧＦＲ、Ｔｒｋ、ＩＲ、ＬＴＫ、アンジオポエチン受容体、ＲＯＲ、ＤＤＲ、ＲＥＴＲ、ＰＴＫ、ＲＹＫ、またはＭｕＳＫである請求項２に記載の組換えエクソソーム。
4. 前記ＳＩＲＰは、ＳＩＲＰα、ＳＩＲＰγ、またはこれらの高親和性変異体である請求項１ないし請求項３のうち何れか一項に記載の組換えエクソソーム。
5. 前記ＳＩＲＰは、配列番号１〜６１のうち何れか１つのアミノ酸配列で構成される請求項４に記載の組換えエクソソーム。
6. 前記エクソソームは、内部に抗癌剤を含む請求項１に記載の組換えエクソソーム。
7. 前記抗癌剤は、抗癌タンパク質または抗癌化合物である請求項６に記載の組換えエクソソーム。
8. 前記抗癌タンパク質は、アスパラギナーゼ、タンパク質毒素、癌抗原に特異的な抗体または前記抗体の断片、腫瘍抑制遺伝子または抗血管生成因子である請求項７に記載の組換えエクソソーム。
9. 前記抗癌化合物は、メトトレキサート、ピリミジン類似体、ヒドロキシウレア、プリン類似体、アルキル化剤、免疫原性細胞死誘導剤、有糸分裂抑制剤、新生血管抑制剤、挿入性物質または放射性核種である請求項７に記載の組換えエクソソーム。
10. 前記免疫原性細胞死誘導剤は、アントラサイクリン系抗癌剤、抗ＥＧＦＲ抗体、ＢＫチャネル作用剤、ボルテゾミブ、強心性配糖体＋非免疫原性細胞死誘導剤、シクロホスファミド系抗癌剤、ＧＡＤＤ３４／ＰＰ１阻害剤＋マイトマイシン、ＬＶ−ｔＳＭＡＣ、Ｍｅａｓｌｅｓウイルス、またはオキサリプラチンである請求項９に記載の組換えエクソソーム。
11. 前記アントラサイクリン系抗癌剤は、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ピクサントロン、サバルビシン、またはバルビシンである請求項１０に記載の組換えエクソソーム。
12. 治療的に有効な量の請求項１ないし請求項１１のうち何れか一項に記載の組換えエクソソーム及び薬学的に許容可能な担体を含む抗癌用薬学的組成物。
13. １つ以上の抗癌剤をさらに含む請求項１２に記載の抗癌用薬学的組成物。

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