JP6851301B2 - 観察対象物カバー、干渉観察用容器、干渉観察装置及び干渉観察方法 - Google Patents

Description

本発明は、観察対象物カバー、干渉観察用容器、干渉観察装置及び干渉観察方法に関する。

干渉観察装置として、第１光、及び第１光よりもコヒーレント長が長い第２光を用いて、第２光の干渉結果に基づいて光路長差を調整しつつ、第１光による観察対象物の干渉光像を取得するものが知られている（例えば特許文献１参照）。

特開２００９−１２２０３３号公報

上述したような干渉観察には、利便性の向上の観点から、観察条件の緩和が望まれる。そこで、本発明は、観察条件が緩和された干渉観察を実現することができる観察対象物カバー、干渉観察用容器、干渉観察装置及び干渉観察方法を提供することを目的とする。

本発明の観察対象物カバーは、第１光、及び第１光よりもコヒーレント長が長い第２光を用いて、第２光の干渉結果に基づいて光路長差を調整しつつ、第１光による観察対象物の干渉光像を取得する干渉観察のための観察対象物カバーであって、第１光を透過させると共に第２光を反射させる透過反射部と、観察対象物が載置される載置面と透過反射部とが所定の間隔を空けて互いに向かい合うように、透過反射部を支持する支持部と、を備える。

この観察対象物カバーでは、観察対象物が載置される載置面と透過反射部とが所定の間隔を空けて互いに向かい合うように、透過反射部が支持される。この観察対象物カバーを用いて干渉観察が行われる際には、載置面上に観察対象物が載置され且つ載置面と透過反射部とが所定の間隔を空けて互いに向かい合った状態において、第１光及び第２光が透過反射部に対して載置面とは反対側から入射する。これらの光のうち、第２光は透過反射部により反射される一方、第１光は、透過反射部を透過して観察対象物により反射された後、透過反射部を再び透過して入射側に戻る。したがって、この観察対象物カバーによれば、第２光を観察対象物に入射させることなく、干渉観察を行うことができる。その結果、第２光が観察対象物に与える影響を考慮する必要がないため、第２光の特性（例えば波長）の選択についての自由度を高めることができる。また、第２光が観察対象物に入射しないため、光透過性を有する観察対象物だけでなく、光透過性を有しない観察対象物をも観察することができる。このように、この観察対象物カバーによれば、観察条件が緩和された干渉観察を実現することができる。

本発明の観察対象物カバーでは、支持部は、第１板部と、第１板部と透過反射部との間に段差が形成されるように第１板部及び透過反射部に接続された第２板部と、を有し、透過反射部が第１光の入射方向において第１板部に対して載置面側に位置するように、透過反射部を支持してもよい。これによれば、透過反射部を載置面（観察対象物）に近づけることができ、ノイズの発生を抑制することができる。また、例えば透過反射部に対して載置面とは反対側に対物レンズが配置される場合に、第２板部及び透過反射部によって画定される空間内に対物レンズを配置することができる。その結果、対物レンズを透過反射部に近づけることができ、対物レンズと載置面（観察面）との間の距離を対物レンズのワーキングディスタンス内に容易に収めることができる。

本発明の観察対象物カバーでは、第２板部は、透過反射部から離れるほど第２板部及び透過反射部によって画定される空間が拡がるように、第１光の入射方向に対して傾斜して延在していてもよい。これによれば、例えば透過反射部に対して載置面とは反対側に対物レンズが配置される場合に、対物レンズを当該空間内に容易に配置することができる。

本発明の観察対象物カバーでは、第２板部及び透過反射部によって画定される空間は、第１光の入射方向に直交する断面において円形状を呈していてもよい。これによれば、例えば透過反射部に対して載置面とは反対側に対物レンズが配置される場合に、対物レンズを空間内に一層容易に配置することができる。

本発明の観察対象物カバーでは、支持部は、第２板部と互いに向かい合うように第１板部から延在する第３板部を更に有していてもよい。これによれば、透過反射部を支持部によって好適に支持することができる。

本発明の観察対象物カバーでは、透過反射部は、光透過性の基板と、基板における載置面側に向く表面に設けられ、第１光を透過させると共に第２光を反射させる光学層と、を有してもよい。これによれば、光学層を載置面（観察対象物）に近づけることができ、ノイズの発生を一層抑制することができる。

本発明の干渉観察用容器は、観察対象物カバーと、載置面が設けられた底壁部、及び、底壁部から載置面と直交する方向に沿って延在する側壁部を有する保持部材と、を備え、観察対象物カバーは、載置面と透過反射部が所定の間隔を空けて互いに向かい合うように、側壁部上に配置される。この干渉観察用容器によれば、上述した理由により、第２光を観察対象物に入射させることなく干渉観察を行うことができ、観察条件が緩和された干渉観察を実現することができる。更に、保持部材が側壁部を有しており、観察対象物カバーが側壁部上に配置されるため、干渉観察用容器の取り扱いを容易化することができる。

本発明の干渉観察用容器では、観察対象物カバーは、観察対象物カバーと保持部材との間が密閉されるように、保持部材に取り付けられてもよい。これによれば、外気中の異物による観察対象物の汚染を抑制することができる。

本発明の干渉観察用容器では、側壁部には、第１螺合部が設けられており、支持部は、第１光の入射方向に沿って延在する第４板部を有し、側壁部には、第１螺合部が設けられており、第４板部には、第１螺合部と螺合する第２螺合部が設けられており、観察対象物カバーは、第１螺合部と第２螺合部とが互いに螺合することにより、保持部材に取り付けられてもよい。これによれば、観察対象物カバーと保持部材とを互いに強固に固定することができる。また、第１螺合部と第２螺合部との間の螺合量を変化させることにより、透過反射部と載置面（観察対象物）との間の距離を調整することができる。

本発明の干渉観察装置は、上記観察対象物カバーと、第１光を出力する第１光源と、第２光を出力する第２光源と、第１光の干渉光、及び第２光の干渉光を出力する干渉光学系と、第１光の干渉光を検出する第１光検出部と、第２光の干渉光を検出する第２光検出部と、載置面が設けられた保持部材と、を備える。この干渉観察装置によれば、上述した理由により、第２光を観察対象物に入射させることなく干渉観察を行うことができ、観察条件が緩和された干渉観察を実現することができる。

本発明の干渉観察方法は、上記干渉観察装置を用いた干渉観察方法であって、載置面に観察対象物を載置する第１ステップと、第１ステップの後に、載置面と透過反射部とが所定の間隔を空けて互いに向かい合うように観察対象物カバーを配置する第２ステップと、第２ステップの後に、第２光の干渉結果に基づいて光路長差を調整しつつ、第１光による観察対象物の干渉光像を取得する第３ステップと、を含む。この干渉観察方法によれば、上述した理由により、第２光を観察対象物に入射させることなく干渉観察を行うことができ、観察条件が緩和された干渉観察を実現することができる。

本発明によれば、観察条件が緩和された干渉観察を実現することができる観察対象物カバー、干渉観察用容器、干渉観察装置及び干渉観察方法を提供することができる。

実施形態に係る干渉観察装置の構成図である。 第１光及び第２光の強度と光路長差との関係を示す図である。 光路長差調整動作を説明するための図である。 第１動作態様における処理手順を示すフローチャートである。 第１動作態様における光路長差の時間変化を示す図である。 第２動作態様における処理手順を示すフローチャートである。 第２動作態様における光路長差の時間変化を示す図である。 実施形態に係る干渉観察用容器の断面図である。 図８に示される干渉観察用容器の分解斜視図である。 第１変形例に係る干渉観察用容器の断面図である。 第２変形例に係る干渉観察用容器の断面図である。 第３変形例に係る干渉観察用容器の分解斜視図である。 第３変形例に係る干渉観察用容器の断面図である。 第１実施例において取得された干渉光画像を示す図である。 図１５（ａ）〜図１５（ｃ）は、第１実施例において取得された反射光強度画像を示す図である。 図１６（ａ）は、第２実施例において取得された干渉光画像を示す図であり、図１６（ｂ）は、第２実施例において取得された反射強度画像を示す図である。 図１７（ａ）は、図１６（ａ）及び図１６（ｂ）の位相画像を示す図であり、図１７（ｂ）は、図１７（ａ）の位相画像についての位相アンラップ後の位相画像を示す図である。

以下、本発明の一実施形態について、図面を参照しつつ詳細に説明する。なお、以下の説明において、同一又は相当要素には同一符号を用い、重複する説明を省略する。

図１に示される干渉観察装置１は、容器（干渉観察用容器）２内に収容された観察対象物３の表面又は内部を観察するための装置である。観察対象物３の例としては、例えば、細胞等の生体試料、又は電子部品や金属加工片等の工業試料が挙げられる。容器２の詳細については後述する。干渉観察装置１は、容器２に加えて、第１光源１１、第２光源１２、レンズ２１〜２５、アパーチャ２６、光合波器２７、ハーフミラー２８、光分波器２９、撮像部３１、解析部３２、受光部３３、変位検出部３４、ピエゾアクチュエータ３５、駆動部３６、ミラー３７、ステージ３８、駆動部３９及び制御部４０を備えている。容器２は、ステージ３８上に載置されている。

第１光源１１は、インコヒーレントな第１光Ｌ１を出力する。第１光源１１は、例えば、波長帯域４００ｎｍ〜１０００ｎｍの広帯域光を出力するタングステンランプやハロゲンランプ、波長帯域５００ｎｍ〜７００ｎｍの広帯域光を出力する白色ＬＥＤ、波長帯域６１０ｎｍ〜６４０ｎｍのインコヒーレント光を出力する単色ＬＥＤ、或いは単色ＬＥＤの出射光を波長幅３ｎｍ程度に光学的に波長フィルタリングすることによって構成された光源等である。第１光源１１としてタングステンランプやハロゲンランプを用いた場合のコヒーレント長（コヒーレンス長）は、例えば１μｍ〜５μｍである。第１光源１１としてＬＥＤを用いた場合のコヒーレント長は、例えば２μｍ〜２０μｍである。第１光源１１として波長フィルタリングしたＬＥＤを用いた場合のコヒーレント長は、例えば５０μｍ〜１００μｍである。第２光源１２は、コヒーレントな第２光Ｌ２を出力する。第２光Ｌ２のコヒーレント長は、第１光Ｌ１のコヒーレント長よりも長く、例えば１０００μｍ以上である。第２光Ｌ２は、第１光Ｌ１の波長帯域よりも長い波長又は短い波長を有する。第２光源１２は、例えば、波長１.３１μｍのレーザ光を第２光Ｌ２として出力する半導体レーザ光源や、波長７８０μｍのレーザ光を第２光Ｌ２として出力する半導体レーザ光源である。第２光源１２は、コヒーレント長が１ｍ以上のヘリウムネオンレーザ光源、コヒーレント長が１０ｍｍ以上のＤＦＢ型半導体レーザ光源、コヒーレント長が１ｍｍ〜２ｍｍ程度のファブリペロー型半導体レーザ光源、或いはコヒーレント長が数ｍｍ程度の面発光型半導体レーザ光源であってもよい。

光合波器２７は、第１光源１１から出力されてレンズ２１及びアパーチャ２６を経て到達した第１光Ｌ１を反射させると共に、第２光源１２から出力されて到達した第２光Ｌ２を透過させる。光合波器２７は、第１光Ｌ１と第２光Ｌ２とを合波して合波光をレンズ２２へ出力する。

ハーフミラー２８は、光合波器２７から出力されてレンズ２２を経て到達した合波光を分岐させて第１分岐光及び第２分岐光とし、第１分岐光をレンズ２３へ出力し、第２分岐光をレンズ２４へ出力する。ハーフミラー２８は、第１分岐光がレンズ２３を経てミラー３７により反射されて生じる第１反射光を再びレンズ２３を経て入力すると共に、第２分岐光がレンズ２４を経て観察対象物３の表面又は内部で反射されて生じる第２反射光を再びレンズ２４を経て入力する。ハーフミラー２８は、第１反射光と第２反射光とを互いに干渉させて干渉光をレンズ２５へ出力する。ハーフミラー２８は、干渉光学系を構成する。

光分波器２９は、ハーフミラー２８から出力されてレンズ２５を経た干渉光を入力し、干渉光に含まれる第１光Ｌ１を反射させて撮像部３１へ出力し、干渉光に含まれる第２光Ｌ２を透過させて受光部３３へ出力する。レンズ２３〜２５は、ハーフミラー２８から出力されて光分波器２９により分波された第１光Ｌ１を撮像部３１の撮像面上に結像する結像光学系を構成する。レンズ２３は、ミラー３７と向かい合うように配置された対物レンズであり、レンズ２４は、ステージ３８上の容器２と向かい合うように配置された対物レンズである。撮像部３１は、第１光Ｌ１の干渉光を検出する第１光検出部を構成する。撮像部３１は、結像された第１光Ｌ１の干渉光像を撮像する。撮像部３１は、例えば、ＣＣＤカメラ、ＣＭＯＳカメラ等の撮像素子である。受光部３３は、第２光Ｌ２の干渉光を検出する第２光検出部を構成する。受光部３３は、ハーフミラー２８から出力されて光分波器２９により分波された第２光Ｌ２の強度を検出する。受光部３３は、例えば、単一のフォトダイオード、１次元フォトダイオードアレイ等の受光素子である。

ここで、ハーフミラー２８からミラー３７により反射されて再びハーフミラー２８に至るまでの光路長と、ハーフミラー２８から観察対象物３の基準位置により反射されて再びハーフミラー２８に至るまでの光路長との光路長差をＧとする。すなわち、光路長差Ｇは、第１反射光と第２反射光との間の光路長差である。上述したように、第２光源１２から出力され受光部３３に到達する第２光Ｌ２のコヒーレント長は比較的長いので、図２に示されるように、受光部３３に到達する第２光Ｌ２の強度は、比較的広い光路長差Ｇの範囲において周期的に変化する。これに対して、第１光源１１から出力され撮像部３１に到達する第１光Ｌ１のコヒーレント長は比較的短いので、図２に示されるように、撮像部３１に到達する第１光Ｌ１の強度は、比較的狭い光路長差Ｇの範囲において周期的に変化する。しかも、第１光Ｌ１の場合、光路長差Ｇが値０に近いほど干渉の振幅が大きい。

このことを利用して、解析部３２は、光路長差Ｇが複数の目標値のそれぞれに設定されたときに撮像部３１により撮像された第１光Ｌ１の干渉光像を取得する。解析部３２は、取得した干渉光像に基づいて所定の解析を行う。変位検出部３４は、受光部３３により検出された第２光Ｌ２の強度の変化に基づいて光路長差Ｇを検出する。すなわち、受光部３３及び変位検出部３４は、光路長差Ｇを検出する光路長差検出部を構成する。

ピエゾアクチュエータ３５、駆動部３６、ステージ３８及び駆動部３９は、光路長差Ｇを調整する光路長差調整部を構成する。ピエゾアクチュエータ３５は、駆動部３６により駆動され、ハーフミラー２８とミラー３７との間の光学系の光軸に平行な方向にミラー３７を移動させる。ステージ３８は、駆動部３９により駆動され、ハーフミラー２８と観察対象物３との間の光学系の光軸に平行な方向に容器２（観察対象物３）を移動させる。ピエゾアクチュエータ（第１可動部）３５の作動範囲は、ステージ（第２可動部）３８の可動範囲よりも狭く、ピエゾアクチュエータ３５の位置精度は、ステージ３８の位置精度よりも高い。

制御部４０は、変位検出部３４による光路長差Ｇの検出結果に基づいて、光路長差Ｇが複数の目標値に順次になるように、ピエゾアクチュエータ３５及びステージ３８による光路長差調整動作を制御する。制御部４０は、例えば、プロセッサを含むコンピュータによって構成されており、プロセッサにより各処理を実行する。

図３は、光路長差調整動作を説明するための図である。ここで、ハーフミラー２８とレンズ２３との間の間隔をＸ１とし、レンズ２３とミラー３７との間の間隔をＸ２とする。ハーフミラー２８とレンズ２４との間の間隔をＹ１とし、レンズ２４と観察対象物３との間の間隔をＹ２とする。レンズ２４と観察対象物３との間の間隔Ｙ２とは、観察対象物３における観察面（スライス面）までの間隔を意味する。間隔Ｘ２は、ピエゾアクチュエータ３５による移動動作により調整される。間隔Ｙ２は、ステージ３８による移動動作により調整される。ピエゾアクチュエータ３５又はステージ３８により間隔（Ｘ１＋Ｘ２）又は間隔（Ｙ１＋Ｙ２）が変更されることで、光路長差Ｇが調整される。

制御部４０は、複数の目標値のそれぞれにおいて、ピエゾアクチュエータ３５による移動量が作動範囲内の所定範囲内となるように、ステージ３８による移動動作を連続的又は断続的に行わせる。また、制御部４０は、ステージ３８による移動動作の際にも、変位検出部３４による光路長差Ｇの検出結果に基づいて、光路長差Ｇが各目標値になるようにピエゾアクチュエータ３５による移動動作をフィードバック制御する、以下では、２つの動作態様の例を説明する。

図４及び図５に示される第１動作態様では、制御部４０は、ステージ３８による移動動作を連続的に行わせる。ステップＳ１１では、制御部４０は、駆動部３９を介してステージ３８による移動動作を開始させる。光路長差Ｇを或る目標値から次の目標値に一定時間間隔Ｔａで移行させるとし、その移行の際の間隔Ｙ２の変化量をＹａとしたときに、ステージ３８の移動速度は「Ｙａ／Ｔａ」に設定される。これにより、レンズ２４と観察対象物３との間の間隔Ｙ２は、時間の経過に従って略リニアに変化する。しかし、ステージ３８の位置精度が比較的低いことから、間隔Ｙ２の時間的変動は比較的大きい。

そこで、ステップＳ１２では、制御部４０は、光路長差Ｇが目標値になるように、駆動部３６を介してピエゾアクチュエータ３５による移動動作をフィードバック制御する。このとき、ピエゾアクチュエータ３５により間隔Ｘ２が調整されて、光路長差Ｇ＝｛(Ｙ１＋Ｙ２)−(Ｘ１＋Ｘ２)｝が高精度に設定される。ステップＳ１３では、制御部４０は、光路長差が或る目標値に設定されてから一定時間間隔Ｔａが経過したか否かを判断し、一定時間間隔Ｔａが経過したらステップＳ１４の処理に進む。ステップＳ１４では、制御部４０は、次の目標値が有るか否かを判断し、次の目標値が有ればステップＳ１５の処理に進み、次の目標値が無ければステップＳ１８の処理に進む。

ステップＳ１５では、制御部４０は、光路長差Ｇが次の目標値に移行される前に、その移行後の目標値においてピエゾアクチュエータ３５による移動量が所定範囲から外れるか否かを判断する。制御部４０は、移動量が所定範囲から外れると判断した場合にはステップＳ１６を経てステップＳ１７の処理に進む。制御部４０は、移動量が所定範囲内にあると判断した場合には直ちにステップＳ１７の処理に進む。ステップＳ１６では、制御部４０は、次の目標値に移行した後にピエゾアクチュエータ３５による移動量が所定範囲内に入るようにステージ３８による移動動作の速さを調整する。

ステップＳ１７では、制御部４０は、光路長差Ｇを次の目標値に設定し、駆動部３６を介してピエゾアクチュエータ３５を所定量だけステップ的に移動させる。その後、制御部４０は、ステップＳ１２の処理に戻り、光路長差Ｇが新たな目標値になるように、駆動部３６を介してピエゾアクチュエータ３５による移動動作をフィードバック制御する。ステップＳ１８では、制御部４０は、駆動部３９を介してステージ３８による移動動作を終了させる。

このような第１動作態様によれば、制御部４０がピエゾアクチュエータ３５及びステージ３８のそれぞれの移動動作を制御することにより、ステージ３８の移動動作の広いダイナミックレンジ、及び、ピエゾアクチュエータ３５の移動動作の高い位置精度の双方を活かすことができ、高精度且つ広いダイナミックレンジで観察対象物３を観察することができる。なお、光路長差Ｇの目標値の個数をＮとしたときに、Ｎ×Ｔａの時間内にステージ３８を速度「Ｙａ／Ｔａ」で等速移動させたときの移動距離が十分な精度（例えば誤差が±１μｍ以下）であれば、ステップＳ１５，１６は不要であり、ステップＳ１４の後に直ちにステップＳ１７の処理に進めばよい。

図６及び図７に示される第２動作態様では、制御部４０は、ステージ３８による移動動作を断続的に行わせる。第２動作態様では、ステップＳ１１が省略されており、直ちにステップＳ１２の処理が実行される。そのためステップＳ１２の実行時においてステージ３８は移動していないが、ステージ３８の位置精度が比較的低いことから、間隔Ｙ２の時間的変動は比較的大きい。しかし、ステップＳ１２の処理により、ピエゾアクチュエータ３５により間隔Ｘ２が調整されて、光路長差Ｇが高精度に設定される。

第２動作態様では、ステップＳ１８が省略されている。すなわち、制御部４０は、ステップＳ１４において次の目標値が無いと判断した場合、処理を終了する。制御部４０は、ステップＳ１４において次の目標値が有ると判断した場合、ステップＳ１６に代えてステップＳ１９の処理に進み、その後にステップＳ１７に進む。ステップＳ１９では、制御部４０は、次の目標値に移行した後にピエゾアクチュエータ３５による移動量が所定範囲内に入るようにステージ３８を移動させ、その後にステージ３８を停止させる。また、制御部４０は、ステージ３８が移動している期間にも、光路長差Ｇが各目標値になるようにピエゾアクチュエータ３５による移動動作を制御する。

このような第２動作態様によっても、ステージ３８の移動動作の広いダイナミックレンジ、及び、ピエゾアクチュエータ３５の移動動作の高い位置精度の双方を活かすことができ、高精度且つ広いダイナミックレンジで観察対象物３を観察することができる。

続いて、図８及び図９を参照しつつ、容器２の詳細を説明する。容器２は、保持部材５０と、観察対象物カバー６０と、を備えている。保持部材５０は、例えばガラス又はプラスチック等によって構成されており、底壁部５１及び側壁部５２を有している。底壁部５１は、例えば円板状に形成されており、観察対象物３が載置される載置面５１ａを有している。側壁部５２は、例えば、底壁部５１の縁部から載置面５１ａと直交する方向に沿って延在しており、円筒状を呈している。本実施形態では、側壁部５２の高さは、底壁部５１の直径よりも小さい。観察対象物３が細胞である場合、保持部材５０は、汎用の細胞培養ディッシュであってもよい。底壁部５１の中央部に凹部が設けられていてもよい。

観察対象物カバー６０は、第１光Ｌ１を透過させると共に第２光Ｌ２を反射させる透過反射部６１と、透過反射部６１を支持する支持部６２と、を備えている。透過反射部６１は、基板６３及び光学層６４を有している。基板６３は、例えば、光透過性を有する材料によって円板状に形成されている。光学層６４は、基板６３の表面６３ａ上にわたって設けられた光学コーティング（ビームスプリッタ面）であり、第１光Ｌ１を透過させると共に第２光Ｌ２を反射させる。基板６３の表面６３ａは、観察対象物カバー６０が側壁部５２上に配置された状態（図８に示される状態）において底壁部５１の載置面５１ａ側に向く表面である。透過反射部６１の両面には、第１光Ｌ１の波長帯域に対する低反射層が設けられていてもよい。

支持部６２は、第１板部６５、第２板部６６及び第３板部６７を有している。第１板部６５、第２板部６６及び第３板部６７は、例えば互いに一体に形成されている。支持部６２は、プラスチックやガラス等の透明材料によって構成されてもよいし、金属等の非透明材料によって構成されてもよい。支持部６２が透明であると、容器２内の観察対象物３を外部から目視により確認することができる。

第１板部６５は、例えば、透過反射部６１に対する第１光Ｌ１の入射方向Ｄから見た場合に円環状を呈する平板状の部材である。第２板部６６は、第１板部６５と透過反射部６１との間に段差Ｗが形成されるように、第１板部６５及び透過反射部６１（基板６３）に接続されている。また、第２板部６６は、第１板部６５と透過反射部６１とが互いに平行に配置されるように、第１板部６５及び透過反射部６１に接続されている。本実施形態では、第２板部６６は、第１板部６５の内縁と透過反射部６１の外縁との間に全周にわたって延在する筒状の部材である。透過反射部６１は、例えば接着によって第２板部６６に固定されている。

第２板部６６は、透過反射部６１と共に空間Ｓを画定している。第２板部６６は、透過反射部６１から離れるほど空間Ｓが拡がるように、入射方向Ｄに対して傾斜して延在している。すなわち、第２板部６６はテーパ形状に形成されている。本実施形態では、空間Ｓは、円錐台形状であり、入射方向Ｄに直交する各断面において円形状を呈している。透過反射部６１は、空間Ｓの底部（入射方向Ｄにおける第１板部６５とは反対側の端部）に配置されている。第３板部６７は、第２板部６６と互いに向かい合うように第１板部６５から延在している。本実施形態では、第３板部６７は、第１板部６５の外縁（第１板部６５における第２板部６６とは反対側の縁）から入射方向Ｄに沿って延在しており、偏平な円筒状を呈している。

支持部６２は、載置面５１ａと透過反射部６１とが所定の間隔Ａを空けて互いに平行に向かい合うように、透過反射部６１を支持する。本実施形態では、図８に示されるように、第３板部６７が側壁部５２の外側に位置するように観察対象物カバー６０が保持部材５０に被せられ、第１板部６５が側壁部５２上に載置される。これにより、観察対象物カバー６０が側壁部５２上に配置され、載置面５１ａと透過反射部６１とが間隔Ａを空けて互いに向かい合う。この状態においては、透過反射部６１が入射方向Ｄにおいて第１板部６５に対して載置面５１ａ側に位置する。また、第２板部６６と側壁部５２とが互いに向かい合い、第２板部６６と側壁部５２との間に空隙が形成される。間隔Ａは、レンズ２４と載置面５１ａ（観察面）との間の距離がレンズ２４のワーキングディスタンス内となるように、設定される。間隔Ａは、例えば０．４ｍｍ程度である。

容器２は、載置面５１ａ上に観察対象物３が載置された後に、観察対象物カバー６０が側壁部５２上に配置されることにより、観察対象物３を収容する。容器２は、観察対象物３を収容した状態で、ステージ３８上に載置される。容器２は、透過反射部６１及び載置面５１ａが第２分岐光の光路（ハーフミラー２８と観察対象物３との間の光路）上に位置するように、ステージ３８上に載置される。これにより、ハーフミラー２８（レンズ２４）から出力される第２分岐光が透過反射部６１に入射可能な状態となる。

干渉観察の際には、まず、載置面５１ａに観察対象物３が載置される（第１ステップ）。続いて、載置面５１ａと透過反射部６１とが間隔Ａを空けて互いに向かい合うように、観察対象物カバー６０が配置される（第２ステップ）。続いて、容器２が、透過反射部６１及び載置面５１ａが第２分岐光の光路上に位置するように、ステージ３８上に載置される。これらの作業は、例えば作業機械又は作業者等により行なわれる。続いて、上述したように、第２光Ｌ２の干渉結果に基づいて光路長差Ｇが調整されつつ、第１光Ｌ１による観察対象物３の干渉光像が取得される（第３ステップ）。

続いて、観察対象物カバー６０の作用効果を説明する。上述したように、観察対象物カバー６０では、載置面５１ａと透過反射部６１とが間隔Ａを空けて互いに向かい合うように、透過反射部６１が支持される。観察対象物カバー６０を用いて干渉観察が行われる際には、載置面５１ａ上に観察対象物３が載置され且つ載置面５１ａと透過反射部６１とが間隔Ａを空けて互いに向かい合った状態において、第１光Ｌ１及び第２光Ｌ２が透過反射部６１に対して載置面５１ａとは反対側から入射する。これらの光のうち、第２光Ｌ２は透過反射部６１により反射される一方、第１光Ｌ１は、透過反射部６１を透過して観察対象物３により反射された後、透過反射部６１を再び透過して入射側に戻る。したがって、観察対象物カバー６０によれば、第２光Ｌ２を観察対象物３に入射させることなく、干渉観察を行うことができる。その結果、第２光Ｌ２が観察対象物３に与える影響を考慮する必要がないため、第２光Ｌ２の特性（例えば波長）の選択についての自由度を高めることができる。例えば、観察対象物３が紫外光に対する耐性を有しない場合でも、第２光Ｌ２として紫外光を使用することができる。また、第２光Ｌ２が観察対象物３に入射しないため、光透過性を有する観察対象物３だけでなく、光透過性を有しない観察対象物３をも観察することができる。光透過性を有しない観察対象物３の例としては、例えば不透明な工業試料が挙げられる。このように、観察対象物カバー６０によれば、観察条件が緩和された干渉観察を実現することができる。

更に、仮に、本実施形態とは異なり、第１光Ｌ１及び第２光Ｌ２を反射させる光反射層が載置面５１ａ上に形成された構成を採用した場合、当該光反射層上に観察対象物３を載置する必要がある。この場合、観察対象物３の種類によっては、光反射層上に観察対象物３を載置したことが観察結果に影響を及ぼす可能性がある。例えば、観察対象物３が細胞であり、細胞を光反射層上に播種する場合、汎用の細胞培養ディッシュ上ではなく光反射層上に細胞を培養したことが観察結果の信頼性に影響を及ぼす可能性がある。また、生理学的アセスメントにおける他の手法とのトレーサビリティを確保することが困難となる可能性もある。これに対し、本実施形態の観察対象物カバー６０によれば、透過反射部６１が載置面５１ａとは別に設けられており、載置面５１ａを任意に構成することができるため、そのような事態の発生を抑制することができる。

更に、仮に、本実施形態とは異なり、第１光Ｌ１及び第２光Ｌ２を反射させる光反射層が載置面５１ａ上に形成された構成を採用した場合、当該光反射層上に観察対象物３を載置する必要があり、観察対象物３が光反射層に接触する。これに対し、本実施形態の観察対象物カバー６０によれば、載置面５１ａと透過反射部６１とが間隔Ａを空けて互いに向かい合うため、観察対象物３が透過反射部６１に接触し難い。そのため、観察対象物３に破損や汚染が生じるのを抑制することができる。例えば、観察対象物３が生体試料である場合、生体試料が菌やウィルスにより汚染されるのを抑制することができる。また、観察対象物３が工業試料である場合、工業試料に傷が付いたり汚れが付着したりするのを抑制することができる。

また、観察対象物カバー６０では、第２板部６６が、第１板部６５と透過反射部６１との間に段差Ｗが形成されるように第１板部６５及び透過反射部６１に接続されており、支持部６２は、透過反射部６１が入射方向Ｄにおいて第１板部６５に対して載置面５１ａ側に位置するように、透過反射部６１を支持する。これにより、透過反射部６１を載置面５１ａ（観察対象物３）に近づけることができ、ノイズの発生を抑制することができる。また、第２板部６６及び透過反射部６１によって画定される空間Ｓ内にレンズ２４を配置することができる。その結果、レンズ２４を透過反射部６１に近づけることができ、レンズ２４と載置面５１ａ（観察面）との間の距離をレンズ２４のワーキングディスタンス内に容易に収めることができる。

また、観察対象物カバー６０では、第２板部６６が、透過反射部６１から離れるほど空間Ｓが拡がるように、入射方向Ｄに対して傾斜して延在している。これにより、レンズ２４を空間Ｓ内に容易に配置することができる。

また、観察対象物カバー６０では、空間Ｓが、入射方向Ｄに直交する断面において円形状を呈している。これにより、レンズ２４を空間Ｓ内に一層容易に配置することができる。このことは、レンズ２４が略円柱状の対物レンズである場合に特に顕著となる。

また、観察対象物カバー６０では、支持部６２が、第２板部６６と互いに向かい合うように第１板部６５から延在する第３板部６７を有している。これにより、透過反射部６１を支持部６２によって好適に支持することができる。

また、観察対象物カバー６０では、透過反射部６１が、光透過性の基板６３と、基板６３における載置面５１ａ側に向く表面６３ａに設けられ、第１光Ｌ１を透過させると共に第２光Ｌ２を反射させる光学層６４と、を有している。これにより、光学層６４を載置面５１ａ（観察対象物３）に近づけることができ、ノイズの発生を一層抑制することができる。

また、容器２では、保持部材５０が側壁部５２を有しており、観察対象物カバー６０が側壁部５２上に配置されるため、容器２の取り扱いを容易化することができる。また、容器２では、第２板部６６と側壁部５２とが互いに向かい合い、第２板部６６と側壁部５２との間に空隙が形成される。これにより、例えば観察対象物３が液体を含む場合に、当該空隙に当該液体を逃がすことができる。このことは、観察対象物３が細胞であり、液体が培養液であるときに、特に有用である。

以上、本発明の一実施形態について説明したが、本発明は、上記実施形態に限られない。例えば、図１０に示される第１変形例、又は、図１１に示される第２変形例ように容器２が構成されてもよい。第１変形例では、側壁部５２における底壁部５１とは反対側の端部の外面に第１螺合部５２ａが設けられている。支持部６２は、第１板部６５及び第４板部６８を有している。透過反射部６１は、第１板部６５によって画定される開口部を覆うように第１板部６５上に配置され、第１板部６５に接続されている。第４板部６８は、第１板部６５の外縁から入射方向Ｄに沿って延在している。第４板部６８には、第１螺合部５２ａと螺合する第２螺合部６８ａが設けられている。第２螺合部６８ａは、第４板部６８において、第１板部６５とは反対側の端部を含む領域に配置されている。第１変形例では、観察対象物カバー６０は、第１螺合部５２ａと第２螺合部６８ａとが互いに螺合することにより、保持部材５０に取り付けられる。この取付状態においては、第１螺合部５２ａと第２螺合部６８ａとが互いに螺合することにより、観察対象物カバー６０と保持部材５０との間が密閉される。

第２変形例では、支持部６２は、第１板部６５、第２板部６６及び第４板部６８を有している。透過反射部６１は、第２板部６６に接続されている。第４板部６８は、第２板部６６と互いに向かい合うように、第１板部６５の外縁から入射方向Ｄに沿って延在している。これらの点以外は第１変形例と同様である。

このような第１変形例及び第２変形例によっても、上記実施形態と同様に、観察条件が緩和された干渉観察を実現することができる。また、第１変形例及び第２変形例では、観察対象物カバー６０と保持部材５０との間が密閉されるため、外気中の異物による観察対象物３の汚染を抑制することができる。このことは、観察対象物３が工業試料である場合に特に効果的である。また、第１螺合部５２ａと第２螺合部６８ａとが互いに螺合することにより、観察対象物カバー６０が保持部材５０に取り付けられるため、観察対象物カバー６０と保持部材５０とを互いに強固に固定することができる。また、第１螺合部５２ａと第２螺合部６８ａとの間の螺合量を変化させることにより、透過反射部６１と載置面５１ａ（観察対象物３）との間の距離を調整することができる。なお、第１変形例及び第２変形例では、取付状態において第４板部６８が側壁部５２の外側に位置していたが、第４板部６８が側壁部５２の内側に位置するように構成されてもよい。この場合、側壁部５２の内面に第１螺合部５２ａが設けられ、第４板部６８の外面に第２螺合部６８ａが設けられてもよい。

図１２及び図１３に示される第３変形例のように容器２が構成されてもよい。第３変形例では、容器２は、保持部材５０Ａ、観察対象物カバー６０Ａ及びヒータ７１を備えている。保持部材５０Ａは、上記実施形態の保持部材５０に相当するディッシュ部５３と、チャンバ部５４と、を有している。チャンバ部５４は、例えばガラス又はプラスチック等によって構成されており、底壁部５５及び側壁部５６を有している。底壁部５５は、例えば矩形板状に形成されている。底壁部５５には、ディッシュ部５３及びヒータ７１が配置される凹部５５ａが設けられている。側壁部５６は、底壁部５５の縁部から底壁部５５と直交する方向に沿って延在している。側壁部５６には、通気用の開口５６ａが複数設けられている。

観察対象物カバー６０Ａでは、支持部６２は、第１板部６５、第２板部６６及び蓋部６９を有している。蓋部６９は、例えば、底壁部５５の形状に対応した矩形板状に形成されている。蓋部６９の中央部には、第１板部６５の形状に対応した断面円形状の開口６９ａが設けられている。第１板部６５は、開口６９ａの縁を覆うように蓋部６９上に配置され、蓋部６９に接続されている。第２板部６６は、開口６９ａから第１板部６５とは反対側に突出している。

第３変形例では、蓋部６９が側壁部５６上に載置され、蓋部６９と側壁部５６とが互いに固定されることにより、観察対象物カバー６０Ａ（支持部６２）が保持部材５０に取り付けられる。より詳細には、側壁部５６の先端面に複数のねじ穴５６ｂが設けられる共に、蓋部６９において側壁部５６と重なる位置に複数の貫通孔６９ｂが設けられている。貫通孔６９ｂに通されたネジ（図示省略）がねじ穴５６ｂに締結されることにより、蓋部６９と側壁部５６とが互いに固定される。ヒータ７１は、観察対象物３の周囲の温度を所定の温度範囲に保つために備えられている。ヒータ７１は、略円筒状に形成されており、ディッシュ部５３を包囲するように配置される。このような第３変形例によっても、上記実施形態と同様に、観察条件が緩和された干渉観察を実現することができる。

他の変形として、上記実施形態では、透過反射部６１が波長の違いにより第１光Ｌ１と第２光Ｌ２とを分離したが、透過反射部６１は、偏光成分の違いにより第１光Ｌ１と第２光Ｌ２とを分離するように構成されてもよい。すなわち、透過反射部６１は、偏光ビームスプリッタであってもよい。上記実施形態において、観察対象物カバー６０は、観察対象物カバー６０と保持部材５０との間に通気口が形成されるように、側壁部５２上に配置されてもよい。例えば、側壁部５２の先端面に少なくとも３つの突起が設けられ、当該突起によって第１板部６５が支持されることにより、観察対象物カバー６０と保持部材５０との間に通気口が形成されてもよい。上記実施形態において、保持部材５０が省略され、観察対象物カバー６０がステージ３８に直接に配置されてもよい。

上記実施形態では第２板部６６がテーパ形状に形成されていたが、第２板部６６は、入射方向Ｄに沿って延在してもよい。空間Ｓは、入射方向Ｄに直交する断面において円形状以外の形状、例えば矩形状等を呈してもよい。光学層６４は、基板６３における表面６３ａとは反対側の表面に設けられていてもよい。この場合、観察対象物３が光学層６４に一層接触し難くなる。上記実施形態において、ピエゾアクチュエータ３５及びステージ３８の少なくとも一方がフィードバック制御されればよく、例えばピエゾアクチュエータ３５のみがフィードバック制御されてもよい。各構成の材料及び形状には、上述した材料及び形状に限らず、様々な材料及び形状を採用することができる。

続いて、図１４〜図１７を参照しつつ、第１実施例及び第２実施例について説明する。第１実施例では、観察対象物３としてレンズクリーニング用ペーパを用いた。第１光源１１として、波長帯域５００ｎｍ〜７００ｎｍでスペクトルのピーク波長が５８０ｎｍの白色ＬＥＤを用いた。第２光源１２として、波長７８０ｎｍのレーザダイオードを用いた。レンズ２３として、補正環の無い２０倍対物レンズを用いた。レンズ２４として、補正環付きの２０倍対物レンズを用いた。これは、レンズ２４と観察対象物３との間に透過反射部６１が配置されるためである。透過反射部６１として、カットオフ波長が７２０ｎｍであり、直径２５ｍｍ程度、厚さ１．１ｍｍ程度のサイズを有するダイクロイックミラーを用いた。補正環付きのレンズ２４における補正環の値は１．１ｍｍに設定した。

第１実施例では、第１光源１１のピーク波長５８０ｎｍの１／４に相当する１４５ｎｍの間隔で光路長差Ｇを順次目標値に設定しながら、１４８ステップにわたってステージ３８をスキャンして、第１光Ｌ１の干渉光像を取得した。なお、光路長差Ｇのスキャン距離は、１４５ｎｍ×１４８ステップ＝２１．４６μｍであるが、光路長差Ｇは往復での値であるから、実際にステージ３８が動いた距離は１０．７３μｍとなる。図１４は、１４８枚の干渉光画像から抜き出した画像の一例を示す図である。図１４から、レンズクリーニング用ペーパの各繊維が可視化されていることが分かる。また、図１４では、各繊維の表面からの反射光による干渉縞が繊維の表面に見えている。第１光Ｌ１の１／４波長ずつ光路長差Ｇが異なる４枚の連続する干渉縞画像、Ｉ１,Ｉ２,Ｉ３,Ｉ４から、Ｐ＝(Ｉ１−Ｉ３)^２＋(Ｉ２−Ｉ４)^２により反射光強度Ｐを画像として得ることができる。ステージ３８の各位置において、この反射光強度Ｐを計算することにより、スタック画像を得ることができる。図１５は３つのスライス位置における反射光強度画像の例である。このスタック画像から、３Ｄレンダリングされた３次元ボリューム画像を得ることもできる。また、各繊維の表面からの反射光による干渉縞の１周期は、第１光源１１のピーク波長５８０ｎｍの半分である２９０ｎｍの高さの違いに相当することから、干渉縞画像に基づいて、各スライス位置における繊維の三次元的分布を波長未満の精度で測定することもできる。

第２実施例では、観察対象物３としてアルマイト加工されたアルミニウム製の金属片を用い、当該金属片の表面画像を取得した。この点以外は実施例１と同様とした。ただし、位相シフトのステップ数は、１４８ステップではなく５ステップのみとし、ステージ３８の動作は行わずにピエゾアクチュエータ３５の動作のみによって位相シフトを行った。図１６（ａ）は、第２実施例において取得された干渉光画像を示す図である。第１光Ｌ１の１／４波長ずつ光路長差Ｇが異なる５枚の連続する干渉縞画像、Ｉ１,Ｉ２,Ｉ３,Ｉ４,Ｉ５から、Ｐ＝(Ｉ１−２×Ｉ３＋Ｉ５)^２＋(２×Ｉ２−２×Ｉ４)^２の計算により反射光強度Ｐを画像として得ることができる。また、反射光の位相φについては、φ＝ａｒｇ((Ｉ１−２×Ｉ３＋Ｉ５)＋ｉ×(２×Ｉ２−２×Ｉ４))の計算によって得ることができる。ここで、ａｒｇは複素数の偏角を計算する操作であり、ｉは虚数単位である。

図１７（ａ）は、これにより得られた図１６（ａ）及び図１６（ｂ）の位相画像を示す図であり、図１７（ｂ）は、図１７（ａ）の位相画像についての位相アンラップ後の位相画像を示す図である。１波長に対応する位相が２π＝６．２８であることから、図１７（ａ）及び図１７（ｂ）の画像には、波長の約１６倍程度の凹凸が存在している。従来の手法では、このような粗面からの反射光については、フィードバック用の干渉信号を得ることは難しい。これに対し、観察対象物カバー６０によれば、透過反射部６１が第２光Ｌ２を反射するため、このような観察対象物３の場合でも適切なフィードバック用の干渉信号を得ることができる。すなわち、従来の手法では観察対象物３に対して第２光Ｌ２を反射させるためのコーティングをすることが難しい、或いはコーティングをすることができたとしても観察対象物３の表面の凹凸が大き過ぎるためにフィードバック制御用の干渉信号を十分に得られないような場合でも、観察対象物カバー６０によれば、観察対象物３とは別に透過反射部６１が基準反射面として設けられるため、フィードバック用の干渉信号のＳ／Ｎを向上することができる。

１…干渉観察装置、２…干渉観察用容器、１１…第１光源、１２…第２光源、２８…ハーフミラー（干渉光学系）、３１…撮像部（第１光検出部）、３３…受光部（第２光検出部）、５０…保持部材、５１…底壁部、５１ａ…載置面、５２…側壁部、５２ａ…第１螺合部、６０…観察対象物カバー、６１…透過反射部、６２…支持部、６３…基板、６３ａ…表面、６４…光学層、６５…第１板部、６６…第２板部、６７…第３板部、６８…第４板部、６８ａ…第２螺合部、Ａ…間隔、Ｄ…入射方向、Ｓ…空間、Ｗ…段差。

Claims (11)

1. 第１光、及び前記第１光よりもコヒーレント長が長い第２光を用いて、前記第２光の干渉結果に基づいて光路長差を調整しつつ、前記第１光による観察対象物の干渉光像を取得する干渉観察のための観察対象物カバーであって、
   前記第１光を透過させると共に前記第２光を反射させる透過反射部と、
   前記観察対象物が載置される載置面と前記透過反射部とが所定の間隔を空けて互いに向かい合うように、前記透過反射部を支持する支持部と、を備える、観察対象物カバー。
2. 前記支持部は、第１板部と、前記第１板部と前記透過反射部との間に段差が形成されるように前記第１板部及び前記透過反射部に接続された第２板部と、を有し、前記透過反射部が前記第１光の入射方向において前記第１板部に対して前記載置面側に位置するように、前記透過反射部を支持する、請求項１に記載の観察対象物カバー。
3. 前記第２板部は、前記透過反射部から離れるほど前記第２板部及び前記透過反射部によって画定される空間が拡がるように、前記第１光の前記入射方向に対して傾斜して延在している、請求項２に記載の観察対象物カバー。
4. 前記第２板部及び前記透過反射部によって画定される空間は、前記第１光の入射方向に直交する断面において円形状を呈している、請求項２又は３に記載の観察対象物カバー。
5. 前記支持部は、前記第２板部と互いに向かい合うように前記第１板部から延在する第３板部を更に有している、請求項２〜４のいずれか一項に記載の観察対象物カバー。
6. 前記透過反射部は、光透過性の基板と、前記基板における前記載置面側に向く表面に設けられ、前記第１光を透過させると共に前記第２光を反射させる光学層と、を有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の観察対象物カバー。
7. 請求項１〜６のいずれか一項に記載の観察対象物カバーと、
   前記載置面が設けられた底壁部、及び、前記底壁部から前記載置面と直交する方向に沿って延在する側壁部を有する保持部材と、を備え、
   前記観察対象物カバーは、前記載置面と前記透過反射部が所定の間隔を空けて互いに向かい合うように、前記側壁部上に配置される、干渉観察用容器。
8. 前記観察対象物カバーは、前記観察対象物カバーと前記保持部材との間が密閉されるように、前記保持部材に取り付けられる、請求項７に記載の干渉観察用容器。
9. 前記側壁部には、第１螺合部が設けられており、
   前記支持部は、前記第１光の入射方向に沿って延在する第４板部を有し、
   前記第４板部には、前記第１螺合部と螺合する第２螺合部が設けられており、
   前記観察対象物カバーは、前記第１螺合部と前記第２螺合部とが互いに螺合することにより、前記保持部材に取り付けられる、請求項７又は８に記載の干渉観察用容器。
10. 請求項１〜６のいずれか一項に記載の観察対象物カバーと、
    前記第１光を出力する第１光源と、
    前記第２光を出力する第２光源と、
    前記第１光の干渉光、及び前記第２光の干渉光を出力する干渉光学系と、
    前記第１光の干渉光を検出する第１光検出部と、
    前記第２光の干渉光を検出する第２光検出部と、
    前記載置面が設けられた保持部材と、を備える、干渉観察装置。
11. 請求項１０に記載の干渉観察装置を用いた干渉観察方法であって、
    前記載置面に前記観察対象物を載置する第１ステップと、
    前記第１ステップの後に、前記載置面と前記透過反射部とが所定の間隔を空けて互いに向かい合うように前記観察対象物カバーを配置する第２ステップと、
    前記第２ステップの後に、前記第２光の干渉結果に基づいて光路長差を調整しつつ、前記第１光による観察対象物の干渉光像を取得する第３ステップと、を含む干渉観察方法。

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