JP6815598B2 - FokIヌクレアーゼドメイン結合性核酸アプタマー - Google Patents
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Description
(1) FokIヌクレアーゼドメインに対して特異的に結合する核酸アプタマー。
(2) 20〜35個の塩基長を有する、上記(1)記載の核酸アプタマー。
(3) デオキシリボヌクレオシドを構成単位とするポリヌクレオチドである、上記(1)又は(2)記載の核酸アプタマー。
(4) ELONA(酵素結合オリゴヌクレオチドアッセイ(Enzyme-linked oligonucleotide assay))法で測定した場合に100nM以下の解離定数(Kd)を有する、上記(1)〜(3)のいずれか記載の核酸アプタマー。
(5) 配列番号6、7、9、14〜16、及び20から選択される塩基配列からなる、上記(1)〜(4)のいずれか記載の核酸アプタマー。
(6) FokIヌクレアーゼをDNA切断ドメインとして含む人工ヌクレアーゼを、上記(1)〜(5)のいずれかに記載の核酸アプタマーを介してナノニードル表面に結合するステップと、人工ヌクレアーゼが結合したナノニードルを細胞に穿刺するステップとを含む、細胞への人工ヌクレアーゼの導入方法。
(7) 人工ヌクレアーゼがジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)または転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)である、上記(6)記載の方法。
(8) 上記(1)〜(5)のいずれか記載の核酸アプタマーを介して人工ヌクレアーゼを表面に結合させたナノニードル。
(9) 人工ヌクレアーゼがZFNまたはTALENである、上記(8)記載のナノニードル。
(10) ナノニードル表面に結合可能な上記(1)〜(5)のいずれか記載の核酸アプタマーと、ナノニードルとを含む、人工ヌクレアーゼの細胞導入用キット。
(11) 核酸アプタマーとナノニードル表面との結合が、直接もしくはリンカーを介した共有結合又は非共有結合である、上記(10)記載のキット。
(12) 人工ヌクレアーゼがZFNまたはTALENである、上記(11)記載のキット。
本発明は、FokIヌクレアーゼドメイン(FokI、FokIドメイン又はFokIヌクレアーゼということもある)に対して特異的に結合する核酸アプタマーを提供する。本発明のアプタマーは、人工ヌクレアーゼのFokIヌクレアーゼドメインに結合し、ゲノム編集技術において好適に使用することができる。
本発明はまた、FokIヌクレアーゼをDNA切断ドメインとして含む人工ヌクレアーゼを、上記の本発明の核酸アプタマーを介してナノニードル表面に結合するステップと、人工ヌクレアーゼが結合したナノニードルを細胞に穿刺するステップとを含む、細胞への人工ヌクレアーゼの導入方法を提供する。
本発明はまた、上記の核酸アプタマーを介して人工ヌクレアーゼを表面に結合させたナノニードルを提供する。本発明のナノニードルは、ゲノム編集のために好適に使用することができる。
24塩基のランダム領域を含むランダムDNAライブラリーを用い、SELEX法によってFokIヌクレアーゼドメイン結合アプタマーの探索を行った。本実施例で用いたランダムDNAライブラリー、PCRに用いたプライマー及びブロック配列を表1に示す。
実施例1で選択したアプタマー候補配列がFokIヌクレアーゼドメインに対して結合するか、また特異性を持つかをアプタマーブロッティングにより評価した。
実施例2で選択した7種のアプタマーについて更に結合評価を行った。5'ビオチン修飾したこれらのアプタマー、もしくは24 merのpolyTをTBSバッファー (10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA) 中で希釈し、95℃で10分間熱処理後、30分間かけて25℃まで徐冷した。
FokIヌクレアーゼドメイン (100または150 nM) をMaxiSorpTMポリスチレン96穴プレートに加え、3時間室温で振盪して吸着固定した。TBSTバッファーで洗浄後、2%(w/v)BSAを含むTBSTバッファーを加え1時間振盪してブロッキングを行い、洗浄した。その後、熱処理を行った5'-ビオチン修飾アプタマー (最終濃度0, 10, 50, 100, 250, 500, 1000 nM) を加えて1時間振盪した。洗浄後、NeutrAvidin HRP(Thermo Fisher Scientifics)を加え更に1時間振盪した。その後洗浄し、化学発光基質(BM chemiluminescence enzyme-linked immunosorbent assay substrate(POD)(Roche))を加えてプレートリーダーで化学発光強度を測定した。
実施例2で選択した7種のアプタマーを5'-フルオレセイン修飾し、実施例3と同様にTBS バッファー (EDTAを含まない) 中で希釈し、熱処理を行った。その後、アプタマーとFokIヌクレアーゼドメインを混合し (最終濃度はそれぞれ500 nM)、37℃で1時間インキュベートした。インキュベート後のサンプルを20% (w/v) ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動を行い、Typhoon8600(GE healthcare社製)を用いてフルオレセインの蛍光を検出した。
本実施例では、FokIヌクレアーゼドメインに対する強い結合が認められたF6#8(配列番号6)及びF6#71(配列番号20)、並びにFokIヌクレアーゼドメインに対する結合がpolyTよりも弱いF6#11(配列番号7)を用い、アプタマーの存在によってFokIヌクレアーゼ活性が変動し得るか否かを検討した。
本実施例の評価のために、ヒト胎児腎細胞 (HEK293)に赤色蛍光蛋白質、DesRedを発現するベクターを導入し、培養したものを用いた。ナノニードルアレイにビオチンBSAを修飾した後、ストレプトアビジンを結合させた。その後、5'-ビオチン修飾アプタマーを添加して室温で1時間静置し、アプタマー修飾ナノニードルアレイを作製した。TBS バッファーで洗浄後、GFP融合ZFN (GFP-ZFN) を添加して30分室温で静置して、アプタマーを介してGFP-ZFNを固定した。PBSで洗浄後、HEK293へナノニードルを挿入し、0分、30分後のDesRed及びGFPの蛍光を共焦点顕微鏡により観察した。0分後において、評価したF6#8、F6#71及びpolyTを用いてGFP-ZFNを固定したサンプル全てにおいて、GFPの蛍光がナノニードル上に観察された (図5)。これより、獲得したアプタマーはGFP-ZFNをナノニードルに固定できることが示唆された。また、30分後の蛍光を同様に観察した結果、F6#8及びF6#71においてナノニードル上のGFP由来蛍光強度が減少していた。一方でpolyTでは蛍光強度は変化しなかった。これより、本発明のアプタマーが細胞存在下でGFP-ZFNから脱離することが示された。
Claims (8)
- 配列番号6又は20で示される塩基配列からなる核酸アプタマー。
- FokIヌクレアーゼをDNA切断ドメインとして含む人工ヌクレアーゼを、請求項1に記載の核酸アプタマーを介してナノニードル表面に結合するステップと、人工ヌクレアーゼが結合したナノニードルを細胞に穿刺するステップとを含む、in vitroまたはex vivoにおける細胞への人工ヌクレアーゼの導入方法。
- 人工ヌクレアーゼがジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)または転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)である、請求項2記載の方法。
- 請求項1記載の核酸アプタマーを介して人工ヌクレアーゼを表面に結合させたナノニードル。
- 人工ヌクレアーゼがZFNまたはTALENである、請求項4記載のナノニードル。
- ナノニードル表面に結合可能な請求項1記載の核酸アプタマーと、ナノニードルとを含む、人工ヌクレアーゼの細胞導入用キット。
- 核酸アプタマーとナノニードル表面との結合が、直接もしくはリンカーを介した共有結合又は非共有結合である、請求項6記載のキット。
- 人工ヌクレアーゼがZFNまたはTALENである、請求項6または7記載のキット。
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