JP6811455B2 - Ｎａｔ活性化剤 - Google Patents

Description

本発明は、ＮＡＴ（セロトニン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ）活性化剤に関する。

科学技術の高度化・複雑化に加えて社会情勢のめまぐるしい変化により、生活習慣が不規則になることが多い。４〜５人に１人が睡眠に問題を抱えており、９人に１人が睡眠導入剤を常用しているとの報告もあり、認知症やうつ病などの精神疾患と不眠などの睡眠障害が密接に関係することも明らかになってきている。不規則な生活習慣により、睡眠異常等の概日リズム障害や、その要因の１つとして考えられるメラトニン分泌リズムの異常が問題となっている。

特許文献１には、米糠又は米由来のタンパク質加水分解物を有効成分として含有する内因性グルタチオン増強剤について記載されており、生体内におけるグルタチオン量を増強させることができるとされている。また、この内因性グルタチオン増強剤をＮＡＴ（セロトニン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ）活性剤として用いることができるとされている。しかしながら、特許文献１には、ＮＡＴ活性を上昇させるペプチドについての具体的な記載はなく、少ない使用量でＮＡＴ活性効果が得られることについての記載もなかった。

特開２０１５−１６６３２７号公報

本発明は上記課題を解決するためになされたものであり、少ない使用量でもＮＡＴ活性効果に優れ、睡眠障害や入眠潜時障害等の各種症状を予防又は改善することが期待できるＮＡＴ活性化剤を提供することを目的とするものである。

上記課題は、下記式（１）又は（２）で示されるアミノ酸配列からなるペプチドを有効成分として含有するＮＡＴ（セロトニン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ）活性化剤を提供することによって解決される。
式（１）：Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ（配列番号１）
式（２）：Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ（配列番号２）

このとき、ペプチド濃度が０．１〜８０μｇ／ｍＬであることが好適であり、概日リズム改善剤であることが本発明の好適な実施態様である。

本発明により、少ない使用量でもＮＡＴ活性効果に優れたＮＡＴ活性化剤を提供することができる。したがって、睡眠障害や入眠潜時障害等の各種症状を予防又は改善することが可能となる。

実施例１において、各フラクションのＮＡＴ活性効果を示した図である。 実施例１において、各フラクションのクロマトグラムを示した図である。 実施例１において、各ペプチドによるＮＡＴ活性効果を示した図である。 実施例２において、各ペプチドによるＮＡＴ活性効果を示した図である。

本発明のＮＡＴ（セロトニン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ）活性化剤は、下記式（１）又は（２）で示されるアミノ酸配列からなるペプチドを有効成分として含有することを特徴とする。
式（１）：Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ（配列番号１）
式（２）：Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ（配列番号２）

後述する実施例からも分かるように、式（１）又は（２）で示されるアミノ酸配列からなるペプチドを有効成分として含有することにより、少ない使用量でもＮＡＴ活性効果に優れていることが明らかとなった。本発明者らは、分画して得られたフラクションから配列番号１〜３で示されるペプチド配列を同定したところ、配列番号３のペプチド１についてはＮＡＴ活性効果が認められなかった。これに対し、配列番号１の式（１）で示されるペプチド３と配列番号２の式（２）で示されるペプチド２については、有意にＮＡＴ活性を上昇させることが明らかとなった。したがって、式（１）又は（２）で示されるアミノ酸配列からなるペプチドを有効成分として含有することの意義が大きい。

本発明のＮＡＴ活性化剤は、有意にＮＡＴ活性を上昇させることができるため、睡眠障害や入眠潜時障害等の各種症状を予防又は改善することが可能となる。かかる観点から、概日リズム改善剤であることが本発明の好適な実施態様である。

本発明のＮＡＴ活性化剤に含まれる、式（１）又は（２）で示されるアミノ酸配列からなるペプチドの含有量としては特に限定されないが、ペプチド濃度が０．１〜８０μｇ／ｍＬとなるように添加されることが好ましい。ペプチド濃度が０．１μｇ／ｍＬ未満の場合、ＮＡＴ活性効果が得られないおそれがあり、０．５μｇ／ｍＬ以上であることがより好ましく、２μｇ／ｍＬ以上であることが更に好ましく、１５μｇ／ｍＬ以上であることが特に好ましい。一方、ペプチド濃度が８０μｇ／ｍＬを超える場合、コスト高となるおそれがあり、７５μｇ／ｍＬ以下であることがより好ましく、７０μｇ／ｍＬ以下であることが更に好ましい。

本発明のＮＡＴ活性化剤は、例えば経口的に投与して、生体内におけるＮＡＴ活性を増強させることができる。経口投与に用いる本発明のＮＡＴ活性化剤の剤形は、錠剤、カプセル剤、細粒剤、散剤、タブレット剤、トローチ剤、舌下剤、液剤などが可能である。また、本発明のＮＡＴ活性化剤は、各種食品、各種飲料に添加して用いることもできるし、サプリメントとして用いてもよい。

本発明のＮＡＴ活性化剤は、式（１）又は（２）で示されるアミノ酸配列からなるペプチドを有効成分として含有するものであるが、前記ペプチドとしては白米由来のペプチドであることが好適である。このことにより、安全性が高く、数々の医薬品、特定用保健食品、機能性食品等への利用が可能となる利点があり、睡眠障害や入眠潜時障害等の各種症状を予防又は改善することが可能となる。

以下、実施例を用いて本発明を更に具体的に説明する。

実施例１
（１）ＣＯＳ／ＮＡＴ細胞の作成
動物細胞用発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）（ライフテクノロジーズ社製）に、ヒト由来セロトニン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ（ＮＡＴ）遺伝子を、Ｃ末端にｍｙｃタグが付加するように組み込んだものを作成した。このベクターを、Journal of Biological Chemistry, 276(26), 24097-24107(2001)に記載された方法と同様にして、アフリカミドリザル腎臓由来ＣＯＳ−７細胞にリポフェクトアミン２０００試薬（ライフテクノロジーズ社製）を用いて形質転換し、ＮＡＴ発現細胞（ＣＯＳ／ＮＡＴ細胞）を得た。

（２）ＮＡＴ活性の測定
Journal of Biological Chemistry, 277(46), 44229-44235(2002)に記載された方法に準じてＮＡＴ活性の測定を以下のようにして行った。ＣＯＳ／ＮＡＴ細胞を、１．５×１０^５ｃｅｌｌ／ｍＬの濃度で６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに播種し、１０％ＦＢＳ入りのＤＭＥＭ培地で３７℃、５％ＣＯ_２で４８時間培養した。培地交換後、濃度を調製した被験物質を添加し、２４時間共培養した。その後培地を吸引し、１ｍＬのＰＢＳで一回洗浄後、細胞を回収した。回収したＣＯＳ／ＮＡＴ細胞を、終濃度１．５ｍＭアセチルＣｏ−Ａを含む０．２５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を０．５ｍＬ加えホモジナイズした。１５，０００ｒｐｍ、１５分、４℃で遠心し、上清を回収した。上清７５μＬに対し、６ｍＭアセチルＣｏ−Ａおよび８ｍＭトリプタミンを含む０．２５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を２５μＬ加え、３７℃、１５分間反応させた。その後、氷冷したトルエン／イソアミルアルコール／１Ｎ塩酸混液（９９：０．６６：０．３３）を１ｍＬ加えることによって、反応を停止させた。反応混合液を、３０秒間激しく振とう後、１５，０００ｒｐｍ、１５分、４℃で遠心した。遠心後、有機溶媒相を７５０μＬ回収し、溶媒を遠心エバポレーターで留去した。得られた乾燥物を、０．１ｍＬのＨＰＬＣ用移動相（５０ｍＭ酢酸アンモニウム，ｐＨ４．３，３５％メタノール）に溶解し、生成したＮ−アセチルトリプタミンをＨＰＬＣにより定量することにより、ＮＡＴ活性を測定した。ＨＰＬＣの分析には、カラムにＣＯＳＭＯＳＩＬ ５Ｃ_１８−ＭＳ−ＩＩ（４．６ｍｍ×１５０ｍｍ）を、ＨＰＬＣ用移動相に５０ｍＭ酢酸アンモニウム，ｐＨ４．３，３５％メタノール（流速１ｍＬ／分）を用いた。検出には、蛍光検出器（励起波長：２８５ｎｍ、蛍光波長：３６０ｎｍ）を用いた。

（３）白米ペプチドの分画
オリザ油化株式会社製「オリザペプチド−Ｐ６０」を、逆相固相担体（日本ウォーターズ株式会社製「Ｓｅｐ−ＰａｋＣ１８」）に吸着させ、４０％メタノールで溶出することにより白米ペプチドの画分を得た。得られた画分について上記（２）ＮＡＴ活性の測定に従ってＮＡＴ活性を測定したところ、ＮＡＴを活性化させる因子が濃縮される画分であることが確認された。上記得られた画分に対して、ＨＰＬＣ−Ｃ１８カラム（Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−３，４．６ｍｍ×２５０ｍｍ，ＨＰＬＣ＃１）による分画を行い、上記（２）ＮＡＴ活性の測定に従ってＮＡＴ活性を測定したところ、ＮＡＴを活性化させる因子が濃縮される画分であることが確認された（Ｆｒ．２０）。次いで、得られた画分（Ｆｒ．２０）に対して、ＨＰＬＣ−Ｃ１８カラム（Ｓｙｎｍｍｅｔｒｙ Ｐｒｅｐ Ｃ１８ ７．８ｍｍ×１５０ｍｍ，ＨＰＬＣ＃２）による分画を行い、上記（２）ＮＡＴ活性の測定に従ってＮＡＴ活性を測定したところ、図１に示されるように、ＮＡＴを活性化させる因子が濃縮される画分であることが確認された（Ｆｒ．２０−１７）。さらに、得られた画分（Ｆｒ．２０−１７）に対して、ＨＰＬＣ−Ｃ１８カラム（Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−３，４．６ｍｍ×１５０ｍｍ，ＨＰＬＣ＃３）を用い、更なる分画を行い、Ｆｒ．２０−１７−３５とＦｒ．２０−１７−３８のフラクションを得た。

（４）ペプチド配列の同定
上記得られたＦｒ．２０−１７−３５とＦｒ．２０−１７−３８の各フラクションに対して、イオントラップ型ＬＣ−ＭＣ分析を行ってペプチド配列を同定したところ、以下に示されるように、Ｆｒ．２０−１７−３５からペプチド３のペプチド配列が明らかとなり、Ｆｒ．２０−１７−３８からペプチド１と２のペプチド配列が明らかとなった。
ペプチド３：Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ（配列番号１）
ペプチド２：Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ（配列番号２）
ペプチド１：Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｕ（配列番号３）

（５）ペプチドによるＮＡＴ活性効果の評価
上記アミノ酸配列からなるペプチド１〜３を株式会社グライナー・ジャパンのペプチド合成サービスにより人工合成し、各ペプチドの濃度をそれぞれ１０μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬに調製して上記（２）ＮＡＴ活性の測定に従ってＮＡＴ活性を測定した。その結果、ペプチド１によるＮＡＴ活性効果は認められなかったが、ペプチド２及び３については、有意にＮＡＴ活性を上昇させることが明らかとなった。得られた結果を図３に示す。

実施例２
上記アミノ酸配列からなるペプチド２の濃度をそれぞれ５μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、２０μｇ／ｍＬに調製し、ペプチド３の濃度をそれぞれ２．５μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬに調製して、上記（２）ＮＡＴ活性の測定に従ってＮＡＴ活性を測定した。その結果、ペプチド２については、２０μｇ／ｍＬで有意にＮＡＴ活性を上昇させることが明らかとなり、ペプチド３については、２．５μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ及び１０μｇ／ｍＬで有意にＮＡＴ活性を上昇させることが明らかとなった。得られた結果を図４に示す。

Claims (3)

1. 下記式（１）又は（２）で示されるアミノ酸配列からなる白米由来のペプチドを有効成分として含有するＮＡＴ（セロトニン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ）活性化剤。
   式（１）：Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ（配列番号１）
   式（２）：Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ（配列番号２）
2. ペプチド濃度が０．１〜８０μｇ／ｍＬである請求項１記載のＮＡＴ（セロトニン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ）活性化剤。
3. 概日リズム改善剤である請求項１又は２記載のＮＡＴ（セロトニン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ）活性化剤。