JP6805304B2 - 心肥大の治療および診断のためのlncRNA - Google Patents
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Description
実施例1 - 肥大促進性lncRNA Gm11641
1.1 lncRNAのプロファイリングおよび検証
TAC(横行大動脈狭窄)の6週間後に全心臓サンプルにおいて調節解除されるlncRNA候補を特定するために、Arraystarにより提供される一般的なlncRNAプロファイリングを行った(Arraystar Mouse LncRNAマイクロアレイV2.0)。このプラットフォームから、lncRNA Gm11641(ENSMUST00000130556)を候補として特定した(表1)。
種々の器官におけるlncRNA Gm11641の存在量および組織特異的発現を決定するために(図3)、その発現を、心臓、大動脈、血漿、骨髄、骨格筋、肺、肝臓、脾臓、腎臓、脳、リンパ節、胸腺、胆嚢および皮膚を含む14個の異なる組織サンプルにおいて測定した。
心臓の3つの主要細胞型、すなわち、心筋細胞、心臓線維芽細胞および内皮細胞において、lncRNA Gm11641の発現プロファイルを調べた(図4)。したがって、成体マウス心臓細胞を、逆行灌流および酵素解離法を用いて、幾つかの個々の心臓から単離し、各画分におけるlncRNA候補のレベルを決定した。
lncRNA Gm11641は全ての心臓細胞において発現されるため、全心臓サンプルにおいて観察されるlncRNA Gm11641の肥大誘発性アップレギュレーションに寄与する特定の細胞型を同定することにした(図2)。偽およびTAC術後(手術の6週間後)の心臓を使用する細胞分画実験は、lncRNA Gm11641のこのアップレギュレーションが心筋細胞においては特異的に認められるが、心筋線維芽細胞または内皮細胞において認められないことを示した(図5)。これは心筋細胞肥大におけるlncRNA Gm11641の潜在的役割を示している。
lncRNAの生物学的機能はそれらの細胞内局在によって大きく左右される。したがって、HL-1細胞(心筋細胞系)由来の全RNAの、細胞質、核可溶性およびクロマチン関連画分への生化学的分離を行った(Cabiancaら, Cell 11; 149(4):819-31に従った)。種々の画分におけるlncRNA Gm11641の相対存在量をRT-PCRにより測定した。公知ハウスキーピング遺伝子であるGAPDHおよびβ-アクチンならびにlncRNA XistおよびNeat1を、それぞれ、細胞質局在またはクロマチン結合富化に関する対照として使用した(図6)。
lncRNA Gm11641を安定に過剰発現させるために、対応データベース由来の完全長転写産物(表1を参照されたい)をレンチウイルス過剰発現ベクター(Institute of Experimental Hematology, MHHのA. Schambach氏により快く提供していただいた)のマルチクローニングサイト(MCS)内にクローニングした。指標遺伝子GFP(緑色蛍光タンパク質)および選択カセットから物理的に分離しているが、同じ遺伝子調節要素からのものであるlncRNA転写産物の産生を可能にする双方向性プロモーターを、このプラスミドは含有する。レンチウイルス形質導入により、該構築物をHL-1心筋細胞内に導入した(図7を参照されたい)。
lncRNA Gm11641をダウンレギュレートするために、GapmeRアンチセンスオリゴヌクレオチドを適用した。LNATMGapmeR(Exigon)は、修飾ヌクレオチド(LNA; ロックト核酸)のブロックに隣接するDNAモノマーの中央伸長を含有する。DNAギャップは、標的RNAのRNAse H媒介性分解を活性化し、核内で直接的に転写産物を標的化するのにも適している。この技術により、lncRNA Gm11641は心筋細胞系HL-1において成功裏にダウンレギュレートされた(図9)。
1.8.1 Gm11641レベルに対する肥大心筋細胞のインビトロ効果
心筋細胞肥大は心臓における圧力または体積ストレスに対する細胞レベルの適応応答である。インビトロでの肥大成長は、フェニレフリン(PE)およびイソプロテレノール(ISO)を含む刺激により誘導されうる。したがって、HL-1細胞を両方の化合物で刺激し、Gm11641の発現に対する影響を調べた(図10)。
肥大心筋細胞の特徴は、非肥大細胞と比較した場合の細胞サイズの増加である。したがって、PEおよびISOで刺激した後、HL-1細胞の細胞サイズを調べ、前記の脱調節手段を適用してlncRNA Gm11641の発現の抑制および上昇を調べた。結果を図11に例示する。
肥大誘発心筋細胞成長は「胎児遺伝子プログラム」の再誘導を伴う。なぜなら、遺伝子発現パターンは、胚発生中に見られるものに似ているからである。候補lncRNA Gm11641に関して同じ条件(刺激および調節解除)を適用して、ANP、BNP(動脈および脳ナトリウム利尿ペプチド)、Mcip1.4(調節性カルシニューリン相互作用性タンパク質1、エクソン4アイソフォーム)、α-およびβ-MHC(ミオシン重鎖)を含む肥大関連遺伝子の発現レベルを測定した。図12はANPに関する結果を表しているが、その他の遺伝子の測定結果は示されていない。
Gm11641によりモジュレーションされる心臓関連遺伝子を特定するために、マウスHL-1心筋細胞系におけるGm11641(別名Chast)のレンチウィルス過剰発現またはGapmeR媒介性抑制に関して包括的(グローバル)マイクロアレイmRNA発現分析を行った。結果は、Gm11641のアップレギュレーションまたは抑制のいずれかがHL-1心筋細胞トランスクリプトームに強い影響を及ぼすことを示した。Axl、Pak3、Myo18B、Egr1、OgnおよびNos1apのような幾つかの心臓関連遺伝子(表2)はGm11641の過剰発現および抑制の後で相互的に調節される。これらの結果は、Gm11641発現の調節解除が転写mRNA発現プロファイルに影響を及ぼし、心筋細胞における肥大促進経路を活性化することを示している。
ヒトを含む他の種におけるlncRNA Gm11641のホモログを特定するために、一次DNA配列と配列データベースのライブラリーとの比較のためのアルゴリズムであるBLASTを適用した。このアライメントの結果は以下の結果をもたらす(表2)。
心筋細胞においては、肥大応答は、幾つかのシグナル伝達カスケード、特にカルシウム依存性シグナリングに影響を及ぼす増殖因子およびサイトカインにより調節される。転写因子NFAT(活性化T細胞の核因子)はこの経路における中心的調節因子であり、最終的に肥大促進プログラムの活性化をもたらす。
病的肥大は、ストレスまたは疾患、例えば高血圧、心筋の傷害、心臓弁狭窄症または神経ホルモンに対する応答である。これは心筋質量の増加をもたらし、最終的に心室壁、特に左心室の肥厚をもたらす。筋肉量は増加するが、心臓のポンプ能は増加しない。逆に、心臓の機能が妨げられ、最終的に完全な機能不全につながりうる。
結論としては、lncRNA Gm11641に関して試験した心肥大モデルにおける知見に基づけば、このlncRNAは心肥大に関する診断および治療に貴重である。
2.1 lncRNAのプロファイリングおよび検証
一般的なlncRNAプロファイリングを達成するために、Agilent/Life Technologies(NCodeTMマウス・ノンコーディングRNAマイクロアレイ)およびArraystar(Arraystar Mouse LncRNAマイクロアレイV2.0)により提供されるプラットフォームを適用して、マイクロアレイ分析を行った。候補転写産物は心臓組織において発現されていることが(DNAseIで処理された又は逆転写前でないRNAに由来するcDNAサンプルにおいて)PCRにより確認され、調節解除がリアルタイムPCRにより確認された。
種々の器官におけるlncRNAの発現特異性を決定するために(図16)、心臓、大動脈、血漿、骨髄、骨格筋、肺、肝臓、脾臓、腎臓、脳、リンパ節、胸腺、胆嚢および皮膚を含む14個の異なる組織サンプルにおいて候補転写産物の発現を測定した。ほとんどのlncRNAは幾つかの器官において豊富である。転写産物Gm8459、H19およびGm12224-1は、心臓を含む筋肉組織において最も特異的に豊富に存在するようである。
心臓の3つの主要細胞型、すなわち、心筋細胞、心臓線維芽細胞および内皮細胞において、候補lncRNAの発現プロファイルを調べた(図17)。したがって、成体マウス心臓細胞を、逆行灌流および酵素解離法を用いて、幾つかの個々の心臓から単離し、各画分におけるlncRNA候補のレベルを決定した。
候補lncRNAの作用メカニズムを更に解明するために、HL-1細胞(心筋細胞系)由来の全RNAを細胞質画分、核可溶性画分およびクロマチン関連画分へと生化学的に分離することにより、細胞内局在を分析した(Cabiancaら, Cell 11; 149(4):819-31に従った)。種々の画分における転写産物の相対存在量をRT-PCRにより測定した。既知遺伝子GAPDHおよびβ-アクチンならびにXistおよびNeat1を、それぞれ、細胞質局在化またはクロマチン結合富化に関する対照として使用した(図18)。
lncRNAを安定に過剰発現させるために、対応データベース由来の完全長転写産物をレンチウイルス過剰発現ベクター(Institute of Experimental Hematology, MHHのA. Schambach氏により快く提供していただいた)のマルチクローニングサイト(MCS)内にクローニングした。指標遺伝子GFP(緑色蛍光タンパク質)から物理的に分離しているが、同じ遺伝子調節要素からのものであるlncRNA転写産物の産生を可能にする双方向性プロモーターを、このプラスミドは含有する。レンチウイルス形質導入により、該構築物をHL-1細胞内に導入した(図19を参照されたい)。以下の結果はlncRNA候補Gm17499についての例示である。
lncRNA転写産物をダウンレギュレートするために、3つの異なるアンチセンス化学物質、すなわち、siRNA、esiRNAおよびGapmeRを適用した。siRNA(低分子干渉RNA)は、マイクロRNAと同様に、RNA干渉経路に関与する短い分子(20〜25ヌクレオチド)である。それらは相補的ヌクレオチド配列に結合し、細胞質局在化機構により、その分解を誘導する。EsiRNA(Eupheria Biotech / Sigma-Aldrich)は、長い二本鎖RNAの切断から生じる、エンドリボヌクレアーゼで調製されるsiRNAである。このアンチセンス種は、siRNAの場合のように1つの特定の配列だけでなく、標的全体にわたって幾つかの配列を標的とする。LNATM GapmeR(Exigon)は、修飾ヌクレオチド(LNA; ロックト核酸)のブロックに隣接するDNAモノマーの中央伸長を含有する。DNAギャップは、標的RNAの分解を活性化し、核内で直接的に転写産物を標的化するのに適している。
2.7.1 心筋細胞サイズに対する影響
心筋細胞肥大は心臓における圧力または体積ストレスに対する細胞レベルの適応応答である。インビトロでの肥大成長は、フェニレフリン(PE)およびイソプロテレノール(ISO)を含む刺激により誘導されうる。したがって、HL-1細胞を両方の化合物で刺激し、変化したmRNAレベルのもとで心筋細胞サイズを調べた。結果をlncRNA Gm17499に関して例示する(図22)。
肥大誘発心筋細胞成長は「胎児遺伝子プログラム」の再誘導を伴う。なぜなら、遺伝子発現パターンは、胚発生中に見られるものに似ているからである。候補lncRNA Gm17499に関して同じ条件(刺激および調節解除)を適用して、ANP、BNP(動脈および脳ナトリウム利尿ペプチド)、Mcip1.4(調節性カルシニューリン相互作用性タンパク質1、エクソン4アイソフォーム)、α-およびβ-MHC(ミオシン重鎖)を含む肥大関連遺伝子の発現レベルを測定した(図23)。
結論としては、前記の実験結果に基づけば、試験した心臓肥大モデル(左心室圧負荷)における調節解除lncRNAは心肥大の診断および治療において興味深い。 特に、以下のlncRNAが非常に重要である。
3.1. 4週および6週の偽/TACにおける差次的発現
TAC(横行大動脈狭窄)の6週間後の全心臓サンプルにおいて又はTACの13週間後のマウス心臓からの心筋細胞において調節解除されたlncRNA候補を特定するために、Arraystarにより提供される一般的なlncRNAプロファイリングを行った(Arraystar Mouse LncRNAマイクロアレイV2.0)。このプラットフォームから、Gm17499およびGm11641に加えてlncRNA H19(NR 001592.1)が潜在的候補の1つとして特定された(表8および9)。
種々の器官におけるlncRNA H19の存在量および組織特異的発現を決定するために(図16)、その発現を、心臓、大動脈、血漿、骨髄、骨格筋、肺、肝臓、脾臓、腎臓、脳、リンパ節、胸腺、胆嚢および皮膚を含む14個の異なる組織サンプルにおいて測定した。H19は、心臓、骨格筋および膀胱を含む筋肉組織において強い富化を示す。
lncRNA H19の発現プロフィールを、心臓の3つの主要細胞型、すなわち、心筋細胞、心臓線維芽細胞および内皮細胞において調べた。したがって、成体マウス心臓細胞を、逆行灌流および酵素解離法を用いて、幾つかの個々の心臓から単離し、各画分におけるlncRNA候補のレベルを決定した。H19は全ての心臓細胞型において発現されることが判明した(図17)。
lncRNAの生物学的機能はそれらの細胞内局在によって大きく左右される。したがって、HL-1細胞(マウス心筋細胞系)由来の全RNAの、細胞質、核可溶性およびクロマチン関連画分への生化学的分離を行った(Cabiancaら, Cell 11; 149(4):819-31に従った)。種々の画分におけるlncRNA H19の相対存在量を定量的RT-PCRにより測定した。公知ハウスキーピング遺伝子であるGAPDHおよびβ-アクチンならびにlncRNA XistおよびNeat1を、それぞれ、細胞質局在またはクロマチン結合富化に関する対照として使用した。H19は全ての心筋細胞の細胞下画分、サイトゾル、核可溶性およびクロマチン関連区画において見出される(図18)。これは、H19が転写過程および転写後過程の両方をモジュレーションする可能性を有することを示している。
H19 lncRNAをダウンレギュレートするために、esiRNAと称されるアンチセンス化学を適用した。EsiRNA(Eupheria Biotech / Sigma-Aldrich)は、長い二本鎖RNAの切断から生じる、エンドリボヌクレアーゼで調製されるsiRNAである。このアンチセンス種は、siRNAの場合のように1つの特定の配列だけでなく、標的全体にわたって幾つかの配列を標的とする。
3.6.1 H19レベルに対する肥大心筋細胞のインビトロ効果
心筋細胞肥大は心臓における圧力または体積ストレスに対する細胞レベルの適応応答である。インビトロでの肥大成長は、フェニレフリン(PE)およびイソプロテレノール(ISO)またはアンジオテンシンII(ATII)を含む刺激により誘導されうる。したがって、HL-1細胞をこれらの化合物で刺激し、H19の発現に対するそれらの影響を調べた(図25)。
肥大心筋細胞の特徴は、非肥大細胞と比較した場合の細胞サイズの増加である。したがって、PEおよびISOまたはATIIで刺激する一方でesiRNAでH19を抑制した後、心筋細胞の細胞サイズを調べた。H19のノックダウンは、48時間後のラットH9C2細胞系における及び72時間後の新生ラット心筋細胞(NRCM)における心筋細胞サイズの有意な増加をもたらした(図28〜30)。この効果は、AT II処理後のNRCMにおいて及びラット心筋細胞系の両方においてPEおよびISOでの処理の後に観察された。HL-1細胞系においても同等の傾向が観察された(図27A)。
大動脈狭窄は大動脈弁の石灰化を意味し、これは血流を妨げる。その結果、心臓は高い圧力で血液を送出する必要があり、最終的に心筋の肥大成長を招く。22個の健常心臓組織および23個の肥大(大動脈狭窄)心臓組織においてH19の発現を測定し、肥大心臓においてはH19発現が大きく低下することを見出した(図31)。ヒト被験者からのこのデータは、マウスおよびラットのインビトロモデルにおける本明細書に記載されている知見を裏付けており、更に、H19が心肥大を予防するための真の治療標的であることを証明している。
幾つかの研究は、H19配列およびH19のインプリンティングメカニズムがヒトおよびげっ歯類の間で高度に保存されていることを示している。これは、UCSCゲノムブラウザを適用することによっても示されうる(図32)。Dotplot分析による種々のH19配列のより詳細なアライメントはこれらの知見を明確に示しており(図33)、マウスおよびラット配列間ならびにマウスおよびヒト配列間の強い配列上の関係を示している。更なる比較は、ヒトH19がブタにおけるホモログを示しており、これは大きな動物モデルにおけるH19関連治療戦略の実施を可能にするものである。
インビボでの心臓リモデリングに対するH19の効果を研究するために、H19ノックアウトマウスを調べた。H19の欠失はH19の3kb転写単位全体およびプロモーターを置換したネオマイシン耐性カセットにより達成された(系統説明: 129S2/SvPasバックグラウンドにおけるH19tm1Lda)。
本発明は以下の実施形態を包含する。
[1] (i)配列番号12、8〜11および13から選択される1以上の長鎖ノンコーディングRNA(lncRNA)の発現および/または活性を促進する化合物、ならびに/または
(ii)配列番号1〜7、27および28から選択される1以上のlncRNAの発現および/または活性を抑制する化合物
を含む医薬組成物。
[2] 心肥大の治療または予防における使用のための、(i)配列番号12、8〜11および13から選択される1以上のlncRNAの発現および/または活性を促進する、ならびに/または(ii)配列番号1〜7、27および28から選択される1以上のlncRNAの発現および/または活性を抑制する化合物。
[3] 心肥大が心室肥大である、2記載の使用のための化合物。
[4] (ii)において定められている化合物が、
(a)配列番号1〜7、27および28から選択されるlncRNAの少なくとも12個の連続的ヌクレオチドに相補的なヌクレオチド配列を含む又はそれからなる核酸配列、
(b)配列番号1〜7、27および28から選択される1以上のlncRNAの相補鎖と少なくとも69%同一であるヌクレオチド配列を含む又はそれからなる核酸配列、
(c)UがTにより置換された(a)または(b)に記載のヌクレオチド配列を含む又はそれからなる核酸配列、
(d)(a)〜(c)のいずれか1つにおいて定められている核酸配列を発現する発現ベクターであって、好ましくは心臓特異的プロモーターの制御下にある発現ベクター、または (e)(d)の発現ベクターを含む宿主
である、1〜3のいずれか1項記載の医薬組成物、または使用のための化合物。
[5] (ii)において定められている化合物がアプタマー、リボザイム、抗体、タンパク質薬物または小分子インヒビターである、1〜3のいずれか1項記載の医薬組成物、または使用のための化合物。
[6] (i)において定められている化合物が、
(a)配列番号12、8〜11および13から選択される1以上のlncRNAの核酸配列またはそれに対して少なくとも69%同一である核酸配列を含む又はそれからなる核酸配列、
(b)(a)において定められている核酸配列を発現する発現ベクターであって、好ましくは心臓特異的プロモーターの制御下にある発現ベクター、または
(c)(b)の発現ベクターを含む宿主
である、1〜5のいずれか1項記載の医薬組成物、または使用のための化合物。
[7] (i)において定められている化合物が、
(a)配列番号12、8〜11および13から選択される1以上のlncRNAの発現を促進する転写因子、ならびに/または
(b)配列番号12、8〜11および13から選択される1以上のlncRNAの発現を増強する小分子
である、1〜5のいずれか1項記載の医薬組成物、または使用のための化合物。
[8] (a)患者から得たサンプルにおいて、配列番号12、1〜11、13、27および28から選択される1以上のlncRNAの発現レベルを検出し、
(b)前記の1以上のlncRNAの発現レベルを、健常被験者から得たサンプルにおけるこれらの1以上のlncRNAの発現レベルと比較することを含む、患者における心肥大を診断するための方法であって、
配列番号1〜7、27および28から選択される1以上のlncRNAの、2倍を超えるダウンレギュレーション、ならびに/または配列番号12、8〜11および13から選択される1以上のlncRNAの、2倍を超えるアップレギュレーションが、患者における心肥大を示す、方法。
[9] サンプルが血液サンプルまたは血液由来サンプルである、8記載の方法。
[10] 該サンプルが心臓組織サンプルである、8記載の方法。
[11] 1以上のlncRNAの発現レベルの検出が、
(a)定量的PCR、好ましくは定量的リアルタイムPCR、または
(b)鋳型/RNA増幅方法、およびそれに続く、蛍光もしくは発光に基づく定量方法を用いる1以上のlncRNAの発現レベルの決定を含む、8〜10のいずれか1項記載の方法。
[12] 該方法が、長鎖ノンコーディングRNAの発現レベルの検出の前に、試験患者のサンプルおよび/または対照患者のサンプル中のRNAの予備増幅工程を含む、8〜11のいずれか1項記載の方法。
[13] 患者における心肥大を診断するためのキットであって、配列番号12、1〜11、13、27および28から選択される1以上のlncRNAの発現レベルの検出のための手段と、該キットの使用方法の説明とを含むキット。
[14] 該手段が、配列番号12、1〜11、13、27および28から選択される1以上のlncRNAの発現レベルの特異的検出に使用されるプライマーペアである、13記載のキット。
[15] 1以上のlncRNAが少なくとも3個のlncRNA、好ましくは少なくとも5個のlncRNAである、1〜14のいずれか1項記載の医薬組成物、使用のための化合物、方法またはキット。
Claims (11)
- 病的心肥大の治療用である医薬組成物であって、前記医薬組成物は、
(i)配列番号1の配列を有するlncRNAの発現及び/又は活性を阻害する化合物であって、
(a)配列番号1の配列の少なくとも12個の連続的ヌクレオチドと相補的であるヌクレオチド配列を含む又はそれからなる核酸、
(b)配列番号1のlncRNAの相補鎖配列に対して少なくとも90%同一である核酸配列を含む又はそれからなる核酸、又は
(c)前記(a)若しくは(b)においてUがTにより置き換えられているヌクレオチド配列を含む又はそれからなる核酸
である前記化合物、
(ii) (a)〜(c)のいずれかに定められている核酸を発現する発現ベクター、或いは
(iii) (ii)の発現ベクターを含む宿主
を含む、前記医薬組成物。 - 発現ベクターが、心臓特異的プロモーターの制御下にある、請求項1に記載の医薬組成物。
- 病的心肥大が心室病的肥大である、請求項1又は2に記載の医薬組成物。
- 患者における病的心肥大の診断を補助する方法であって、
(a)前記患者から得られたサンプルにおいて、配列番号1のlncRNAの発現レベルを検出すること、及び
(b)前記のlncRNAの前記発現レベルと、健常被験者から得られたサンプルにおける前記lncRNAの発現レベルとを比較することを含み、
配列番号1のlncRNAの、2倍を超えるダウンレギュレーションが、前記患者における病的心肥大を示すことを補助する、前記方法。 - サンプルが血液サンプルまたは血液由来サンプルである、請求項4に記載の方法。
- 該サンプルが心臓組織サンプルである、請求項4に記載の方法。
- 前記配列番号1のlncRNAの発現レベルの検出が、
(a)定量的PCR、または
(b)鋳型/RNA増幅方法、およびそれに続く、蛍光もしくは発光に基づく定量方法を用いる前記配列番号1のlncRNAの発現レベルの決定を含む、請求項4〜6のいずれか1項に記載の方法。 - 前記定量的PCRが定量的リアルタイムPCRである、請求項7に記載の方法。
- 該方法が、長鎖ノンコーディングRNAの発現レベルの検出の前に、試験患者のサンプルおよび/または対照患者のサンプル中のRNAの予備増幅工程を含む、請求項4〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 患者における病的心肥大を診断するためのキットであって、配列番号1のlncRNAの発現レベルの検出のための手段と、該キットの使用方法の説明とを含むキット。
- 該手段が、配列番号1のlncRNAの発現レベルの特異的検出に使用されるプライマーペアである、請求項10に記載のキット。
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