CN112494651A - lncRNA H19作为分子靶点在动脉粥样硬化治疗中的应用 - Google Patents

lncRNA H19作为分子靶点在动脉粥样硬化治疗中的应用 Download PDF

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    • C12N2740/15043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Abstract

本发明涉及lncRNA H19应用技术领域，具体涉及一种lncRNA H19作为分子靶点在动脉粥样硬化治疗中的应用，通过构建lncRNA H19的慢病毒过表达载体pLVX‑IRES‑Neo‑H19及设计lncRNA H19的小干扰siRNA，对HA‑VSMCs增殖、迁移进行干扰，实现了利用lncRNA H19治疗动脉粥样硬化。本发明为lncRNA H19的生物学功能提供了重要的补充，为动脉粥样硬化提供了有效的治疗手段，同时也为lncRNA H19作为分子靶点在治疗动脉粥样硬化中的应用提供了理论基础。

Description

lncRNA H19作为分子靶点在动脉粥样硬化治疗中的应用
技术领域
本发明涉及lncRNA H19应用技术领域，具体涉及一种lncRNA H19作为分子靶点在动脉粥样硬化治疗中的应用。
背景技术
动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是冠心病、心肌梗死和脑梗死等心脑血管疾病发病的重要病理基础之一。AS及其并发症严重威胁着人类的健康，近年来随着人口老龄化的加速以及城乡居民饮食结构的改变，在我国的致死性疾病中，心脑血管疾病已经占据重要的地位。对于AS发病机制及治疗靶点的研究，一直是国内外学者关注的热点。血管平滑肌细胞(vascular smoothmuscle cells,VSMCs)的增殖、迁移是AS发生发展的核心因素，如何抑制VSMCs的增殖、迁移是干预AS进展的一个重要切入点。
人类基因组中约有90％的基因序列可产生转录本，但其中只有2％被翻译为蛋白质。在很长的一段时间内基因组中的非编码转录本被认为是没有功能的“转录噪声”。随着新一代测序技术的发展以及基因组研究的深入，人们逐渐意识到部分非编码转录本可以通过特定的机制发挥重要的调控作用。非编码基因转录产生的非编码RNA(noncoding RNA,ncRNA)可能蕴藏着与机体复杂功能密切相关的信息。根据ncRNA的长度，可以将ncRNA分为微小RNA(microRNA,miRNA)和长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)，其中长度大于200bp的ncRNA被称为lncRNA，是当今生命科学领域的研究热点。
LncRNAH19在人类染色体中定位于11p15.5的端粒区，在鼠染色体中定位于7号染色体末端，是最先被报道的lncRNAs之一，同时也为最早被鉴定的人类已发现的为数不多印迹基因之一。近年来越来越多的证据显示，lncRNAH19与心血管疾病的发生发展密切相关，因此如何利用lncRNAH19治疗动脉粥样硬化是亟需解决的问题。
发明内容
本发明目的是为了弥补已有技术缺陷，提供一种lncRNAH19作为分子靶点在动脉粥样硬化治疗中的应用，通过构建lncRNAH19的慢病毒过表达载体pLVX-IRES-Neo-H19及设计lncRNA H19的小干扰siRNA，对HA-VSMCs增殖、迁移进行干扰，实现了利用lncRNAH19治疗动脉粥样硬化。
为实现上述目的，本发明通过以下方案予以实现：
本发明提供了一种lncRNA H19作为分子靶点在动脉粥样硬化治疗中的应用，通过构建lncRNA H19的慢病毒过表达载体pLVX-IRES-Neo-H19及设计lncRNA H19的小干扰siRNA，对HA-VSMCs增殖、迁移进行干扰；
所述siRNA包括lncRNAH19 siRNA1和lncRNAH19 siRNA2，其序列信息分别为：
lncRNAH19 siRNA15'CCTCTAGCTTGGAAATGAA3'，
lncRNAH19 siRNA25'GACGTGAGAAGCAGGACAT3'。
进一步优选地，lncRNAH19作为分子靶点在动脉粥样硬化治疗中的应用，具体包括以下步骤：
(1)载体构建：将lncRNAH19的cDNA克隆入pLVX-IRES-Neo真核表达载体中；
(2)siRNA合成：从靶mRNA中选择合适的靶序列或者设计siRNA序列；
(3)细胞转染：a、lncRNAH19过表达载体的转染；b、lncRNAH19siRNA的转染。
进一步优选地，载体构建具体步骤如下：
(1)PCR扩增；
(2)PCR产物回收；
(3)PCR回收产物及载体双酶切；
(4)酶切产物回收；
(5)目的片段与载体的连接；
(6)连接产物的转化；
(7)质粒酶切鉴定阳性克隆；
(8)测序鉴定。
进一步优选地，扩增引物序列具体信息如下：
上游引物(H19 EcoRI F)：
5'ccggaattcAGTTAGAAAAAGCCCGGGCTAGGAC3'，
其中CCG为保护碱基，GAATTC为EcoRI酶切位点，剩余序列为扩增序列；
下游引物(H19 BamHI R)：
5'cgcggatccTTGCTGTAACAGTGTTTATTGATG3'，
其中CGC为保护碱基，GGATCC为BamHI酶切位点，剩余序列为扩增序列。
进一步优选地，lncRNAH19过表达载体的转染具体步骤如下：
(1)转染前一天对HA-VSMCs进行传代，使细胞汇合度为70％～80％；
(2)制备转染复合物：以24孔板为例，每孔加入1μg质粒，稀释到100μl Opti-MEM培养基为A液，取1μl LipofectamineTM 2000溶解于Opti-MEM培养基为B液，B液混合5min后，A液和B液混合，静置20min后加入到细胞培养板中；
(3)37℃含5％CO2培养箱孵育4～6h后，更换为原细胞生长培养基。
进一步优选地，lncRNAH19 siRNA的转染具体步骤如下：
(1)转染前一天对HA-VSMCs进行传代，使细胞汇合度为30％～50％；
(2)制备转染复合物：以24孔板为例，每孔加入1.25μl siRNA母液(20μM)，稀释到100μl Opti-MEM培养基为A液，取1μl LipofectamineTM RNAi MAX溶解于Opti-MEM培养基为B液，B液混合5min后，A液和B液混合，静置20min后加入到细胞培养板中；
(3)37℃含5％CO2培养箱孵育4～6h后，更换为原细胞生长培养基。
本发明的有益效果是：
本发明通过构建lncRNA H19的慢病毒过表达载体pLVX-IRES-Neo-H19及设计lncRNA H19的小干扰siRNA，对HA-VSMCs增殖、迁移进行干扰，为lncRNAH19的生物学功能提供了重要的补充，为动脉粥样硬化提供了有效的治疗手段，同时也为lncRNA H19作为分子靶点在治疗动脉粥样硬化中的应用提供了理论基础。
附图说明
图1为本发明实施例质粒酶切产物电泳结果；
图2为本发明实施例pLVX-IRES-Neo-H19基因测序的部分结果序列；
图3为本发明实施例过表达载体转染HA-VSMCs后lncRNAH19的相对表达量；
图4为本发明实施例siRNA转染HA-VSMCs后lncRNAH19的相对表达量；
图5为本发明实施例过表达lncRNAH19对HA-VSMCs增殖的影响；
图6为本发明实施例过表达lncRNAH19对HA-VSMCs迁移的影响。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例
本发明提供了一种lncRNA H19作为分子靶点在动脉粥样硬化治疗中的应用，通过构建lncRNA H19的慢病毒过表达载体pLVX-IRES-Neo-H19及设计lncRNA H19的小干扰siRNA，对HA-VSMCs增殖、迁移进行干扰；具体包括以下步骤：
1、载体构建：将lncRNA H19的cDNA克隆入pLVX-IRES-Neo真核表达载体中，具体步骤如下：
(1)PCR扩增
1)扩增引物序列具体信息如下：
上游引物(H19 EcoRIF)：
5'ccggaattcAGTTAGAAAAAGCCCGGGCTAGGAC3'，
其中CCG为保护碱基，GAATTC为EcoRI酶切位点，
剩余序列为扩增序列；
下游引物(H19 BamHI R)：
5'cgcggatccTTGCTGTAACAGTGTTTATTGATG3'，
其中CGC为保护碱基，GGATCC为BamHI酶切位点，
剩余序列为扩增序列。
2)PCR反应体系
Figure BDA0002713670790000051
Figure BDA0002713670790000061
2)PCR反应条件
Figure BDA0002713670790000062
(2)PCR产物回收
1)PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳后，在紫外灯下切取含有目的基因片段的凝胶条带至1.5ml EP管中，称重后，按100mg凝胶对应100μl溶液BD的比例向离心管中加入溶液BD。
2)60℃水浴10min至凝胶完全溶化，水浴期间振荡混合3次。
3)将溶液转移至DNA纯化柱中，静置2min，室温下12000rpm离心1min，弃滤液。
4)向纯化柱中加入500μl溶液PE，室温下12000rpm离心1min，弃滤液；重复此操作一次。
5)室温下12000rpm离心1min以彻底去除纯化柱中残留的液体。
6)将纯化柱置于新的1.5ml EP管上，向柱中央加入30μl 60℃预热的无菌水，13400g离心1min以洗脱出DNA。
(3)PCR回收产物及载体双酶切：在2个0.2ml EP管中，分别加入lncRNAH19 PCR回收产物和pLVX-IRES-Neo载体各15μl，并分别加入限制性内切酶EcoRI/BamHI，混匀后37℃条件下反应3h左右，酶切反应体系如下：
Figure BDA0002713670790000063
Figure BDA0002713670790000071
(4)酶切产物回收：具体步骤同上述PCR产物的回收。
(5)目的片段与载体的连接：向0.2ml EP管中加入以下试剂，16℃条件下连接1h。
Figure BDA0002713670790000072
(6)连接产物的转化
1)将5μl连接产物加入至50μl DH5α感受态细菌中，轻轻旋转混匀，冰浴30min。
2)42℃水浴热休克90s，随即快速转移至冰中，冰浴2min。
3)加入200μl LB培养基，37℃条件下200rpm振荡培养1h。
4)将菌液均匀涂布于含Amp的LB培养板上，正面朝上，室温下放置至液体吸收。
5)倒置培养板，37℃条件下过夜培养。
(7)质粒酶切鉴定阳性克隆
1)从LB培养板上挑取若干单克隆于3ml LB管中摇床过夜培养。
2)质粒提取
①用1.5ml EP管收集3μl菌液，12000rpm离心1min，弃上清液。
②加入250μl溶液I/RNaseA混合液，重悬菌体。
③加入250μl溶液II，温和反复颠倒混匀6次，室温放置2min。
④加入350μl溶液III，温和反复颠倒混匀6次。
⑤12000rpm离心10min，小心吸去上清至DNA纯化柱中，静置2min。
⑥12000rpm离心1min，弃滤液。
⑧加入500μl溶液PB至柱中，12000rpm离心1min，弃滤液。
⑨加入500μl溶液W至柱中，12000rpm离心1min，弃滤液；重复此操作一次。
⑩12000rpm离心3min，将柱取出置于新的EP管中，加入50μl无菌水(60℃预热)，静置2min，13400rpm离心1min以洗脱出质粒。
3)酶切鉴定所提取质粒
①37℃条件下反应2h，酶切反应体系如下：
Figure BDA0002713670790000081
②酶切产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离后，凝胶成像鉴定lncRNA H19阳性质粒。
(8)测序鉴定：将lncRNAH19阳性质粒测序。
2.siRNA合成
RNA干扰(RNAi)技术是利用内源性小片段双螺旋RNA和核酸酶的复合物降解靶mRNA的方法，小片段双螺旋RNA被称为小干扰RNA(small interference RNA,siRNA)。为避免脱靶效应、蛋白质干扰并获得最佳的沉默效率，从靶mRNA中选择合适的靶序列或者设计siRNA序列是需要考虑的重要因素。
本实验lncRNAH19的特异性小干扰siRNA序列信息为：
lncRNAH19 siRNA15'CCTCTAGCTTGGAAATGAA3'；
lncRNAH19 siRNA25'GACGTGAGAAGCAGGACAT3'。
3.细胞转染
(1)lncRNAH19过表达载体的转染
阳离子脂质体可以中和质粒表面的负电、减小质粒的体积，从而减少质粒与细胞膜之间的静电斥力，将lncRNAH19过表达载体与脂质体混合，有利于载体跨膜进入细胞，表达目的基因、发挥作用，具体步骤如下：
1)转染前一天对HA-VSMCs进行传代，使细胞汇合度为70％～80％。
2)制备转染复合物：以24孔板为例，每孔加入1μg质粒，稀释到100μl Opti-MEM培养基为A液，取1μl LipofectamineTM 2000溶解于Opti-MEM培养基为B液，B液混合5min后，A液和B液混合，静置20min后加入到细胞培养板中。
3)37℃含5％CO2培养箱孵育4～6h后，更换为原细胞生长培养基。
(2)lncRNAH19 siRNA的转染
1)转染前一天对HA-VSMCs进行传代，使细胞汇合度为30％～50％。
2)制备转染复合物：以24孔板为例，每孔加入1.25μl siRNA母液(20μM)，稀释到100μl Opti-MEM培养基为A液，取1μl LipofectamineTM RNAi MAX溶解于Opti-MEM培养基为B液，B液混合5min后，A液和B液混合，静置20min后加入到细胞培养板中。
3)37℃含5％CO2培养箱孵育4～6h后，更换为原细胞生长培养基。
检测与结果
1、pLVX-IRES-Neo-H19载体的鉴定
(1)质粒酶切产物大小的鉴定
在LB培养板上挑取重组克隆，经质粒提取、酶切及琼脂糖凝胶电泳，所得条带的大小与理论预期值一致(扩增条带处于Marker2000bp偏上的位置)，证明已筛选到阳性克隆，如图1所示，泳道M1：DL 2000DNA Marker，泳道1-2：重组质粒及消化产物，泳道M2：1kb DNAMarker，箭头指明目的条带位于预期位置。
(2)测序结果
将pLVX-IRES-Neo-H19的测序结果与NCBI上的已知序列进行BLAST比对，结果显示碱基序列完全一致，lncRNAH19已成功克隆至pLVX-IRES-Neo载体中，重组载体可用于后续实验，下图为pLVX-IRES-Neo-H19基因测序的部分结果序列，如图2所示。
2、转染效率评价
我们构建了lncRNAH19的过表达质粒并设计了lncRNAH19的两条小干扰RNA(siRNA)，转染至HA-VSMCs 36h后，qPCR分析lncRNA H19的表达量。
与空载质粒(pLVX-CON)相比，转染lncRNA H19过表达质粒(pLVX-H19)后，lncRNAH19的表达显著倍增，如图3所示：QPCR结果表明，与空载质粒组相比，转染pLVX-H19后lncRNAH19表达上调；其中Blank：空白对照组，pLVX-CON：空载质粒组，pLVX-H19：pLVX-IRES-Neo-H19转染组。数据以均值±标准差表示。P<0.001vs.pLVX-CON。
与si-NC相比，两条siRNAs的干扰效率分别为81.24％和83.95％，确定这两条siRNAs对lncRNAH19具有靶向抑制作用，且转染有效，如图4所示：QPCR结果表明，与转染si-NC组相比，转染si-H19后lncRNAH19表达下调；Si-NC，小干扰对照组，Si-H19-1和Si-H19-2，两条si-H19分别转染组；数据以均值±标准差表示。P<0.001vs.si-NC。
3、lncRNAH19对HA-VSMCs增殖、迁移的影响
(1)lncRNAH19对HA-VSMCs增殖的影响。
将生长良好的HA-VSMCs分为6组：空白对照组(CON组)、模型组(MOD组)、pLVX-CON组、lncRNAH19过表达组(pLVX-H19组)、si-NC组和lncRNAH19小干扰RNA组(si-H19组)。转染后各组HA-VSMCs以低血清培养基饥饿12h，更换正常血清培养基重悬细胞并接种到96孔板，待细胞贴壁后，除CON组外的其余组别均给予ox-LDL至终浓度为25μg/ml，CON组用等量的无血清培养基代替。收集各个时间点的细胞(0h，24h，48h，72h，96h)加入MTS溶液。
在24h时间点：si-H19组的细胞增殖能力较si-NC组增强，pLVX-H19组与pLVX-CON组之间无统计学差异；在48h、72h和96h时间点：过表达lncRNAH19(pLVX-H19组)的HA-VSMCs增殖能力较pLVX-CON组降低，敲减lncRNAH19后(si-H19组)，细胞增殖能力较si-NC组增强，表明lncRNAH19对HA-VSMCs增殖具有抑制作用。如图5所示各种光密度统计柱形图，其中CON：空白对照组，无ox-LDL诱导；MOD：25μg/ml ox-LDL；pLVX-CON：25μg/ml ox-LDL+pLVX-IRES-Neo control；pLVX-H19：25μg/ml ox-LDL+pLVX-IRES-Neo-H19；si-NC:25μg/ml ox-LDL+siRNA control；si-H19:25μg/ml ox-LDL+si-H19。OD，光密度。数据以均值±标准差表示；P<0.05vs.CON，P<0.01vs.CON，P<0.001vs.CON，P<0.05vs.pLVX-CON，P<0.01vs.pLVX-CON，P<0.05vs.si-NC，P<0.001vs.si-NC。
(2)lncRNAH19对HA-VSMCs迁移的影响
HA-VSMCs细胞分组同上，转染后将HA-VSMCs以100μl无血清培养基重悬细胞，计数并调整细胞浓度为1×105个/ml，加入Transwell细胞培养板的上室，在下室加入600μl完全培养基。放入37℃含5％CO2培养箱培养1h后，除CON组外的其余组别均加入ox-LDL至终浓度为25μg/ml，CON组用等量的无血清培养基代替。
结果如图6所示，其中A：CON组，B：MOD组，C：pLVX-CON组，D:pLVX-H19组，E:si-NC组,及si-H19组(F)各组细胞迁移情况，(G)各组细胞迁移数量柱形图。数据以均值±标准差表示，P<0.001vs.CON，P<0.01pLVX-CON，P<0.001vs.si-NC。
与pLVX-CON组相比，过表达lncRNAH19可抑制HA-VSMCs的迁移；下调lncRNAH19的HA-VSMCs迁移能力较si-NC组明显增强，表明lncRNAH19对HA-VSMCs的迁移具有负调控作用。
通过上述检测与结果可以看出，表达lncRNA H19可以明显降低HA-VSMCs的增殖和迁移能力，si-H19可以促进HA-VSMCs增殖、迁移，lncRNA H19可作为调控HA-VSMCs增殖和迁移的靶点，为AS的诊断和治疗提供新的分子标靶和干预策略。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。
SEQUENCE LISTING
<110> 吉林大学
<120> lncRNA H19作为分子靶点在动脉粥样硬化治疗中的应用
<160> 4
<210> 1
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> lncRNA H19 siRNA1
<400> 1
cctctagctt ggaaatgaa 19
<210> 2
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> lncRNA H19 siRNA2
<400> 2
gacgtgagaa gcaggacat 19
<210> 3
<211> 34
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H19 EcoRI F
<400> 3
ccggaattca gttagaaaaa gcccgggcta ggac 34
<210> 4
<211> 33
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H19 BamHI R
<400> 4
cgcggatcct tgctgtaaca gtgtttattg atg 33

Claims (6)

1.lncRNAH19作为分子靶点在动脉粥样硬化治疗中的应用，其特征在于，通过构建lncRNA H19的慢病毒过表达载体pLVX-IRES-Neo-H19及设计lncRNA H19的小干扰siRNA，对HA-VSMCs增殖、迁移进行干扰；
所述siRNA包括lncRNA H19 siRNA1和lncRNA H19 siRNA2，其序列信息分别为：
lncRNA H19 siRNA1 5'CCTCTAGCTTGGAAATGAA3'，
lncRNA H19 siRNA2 5'GACGTGAGAAGCAGGACAT3'。
2.根据权利要求1所述的lncRNA H19作为分子靶点在动脉粥样硬化治疗中的应用，其特征在于，具体包括以下步骤：
(1)载体构建：将lncRNA H19的cDNA克隆入pLVX-IRES-Neo真核表达载体中；
(2)siRNA合成：从靶mRNA中选择合适的靶序列或者设计siRNA序列；
(3)细胞转染：a、lncRNA H19过表达载体的转染；b、lncRNA H19siRNA的转染。
3.根据权利要求2所述的lncRNA H19作为分子靶点在动脉粥样硬化治疗中的应用，其特征在于，所述载体构建具体步骤如下：
(1)PCR扩增；
(2)PCR产物回收；
(3)PCR回收产物及载体双酶切；
(4)酶切产物回收；
(5)目的片段与载体的连接；
(6)连接产物的转化；
(7)质粒酶切鉴定阳性克隆；
(8)测序鉴定。
4.根据权利要求3所述的lncRNA H19作为分子靶点在动脉粥样硬化治疗中的应用，其特征在于，所述PCR扩增中扩增引物序列具体信息如下：
上游引物(H19 EcoRI F)：
5'ccggaattcAGTTAGAAAAAGCCCGGGCTAGGAC3'，
其中CCG为保护碱基，GAATTC为EcoRI酶切位点，剩余序列为扩增序列；
下游引物(H19 BamHI R)：
5'cgcggatccTTGCTGTAACAGTGTTTATTGATG3'，
其中CGC为保护碱基，GGATCC为BamHI酶切位点，剩余序列为扩增序列。
5.根据权利要求2所述的lncRNA H19作为分子靶点在动脉粥样硬化治疗中的应用，其特征在于，所述lncRNA H19过表达载体的转染具体步骤如下：
(1)转染前一天对HA-VSMCs进行传代，使细胞汇合度为70％～80％；
(2)制备转染复合物：以24孔板为例，每孔加入1μg质粒，稀释到100μl Opti-MEM培养基为A液，取1μl LipofectamineTM2000溶解于Opti-MEM培养基为B液，B液混合5min后，A液和B液混合，静置20min后加入到细胞培养板中；
(3)37℃含5％CO2培养箱孵育4～6h后，更换为原细胞生长培养基。
6.根据权利要求2所述的lncRNA H19作为分子靶点在动脉粥样硬化治疗中的应用，其特征在于，所述lncRNA H19 siRNA的转染具体步骤如下：
(1)转染前一天对HA-VSMCs进行传代，使细胞汇合度为30％～50％；
(2)制备转染复合物：以24孔板为例，每孔加入1.25μl siRNA母液(20μM)，稀释到100μlOpti-MEM培养基为A液，取1μl LipofectamineTMRNAi MAX溶解于Opti-MEM培养基为B液，B液混合5min后，A液和B液混合，静置20min后加入到细胞培养板中；
(3)37℃含5％CO2培养箱孵育4～6h后，更换为原细胞生长培养基。
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