JP6782978B2 - 蛍光色素を用いた歯周病の簡易検査 - Google Patents
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Description
[1]
式I:
[式中、
R1、R2、R3、およびR4は水素、シアノ、ヒドロキシ、ニトロ、置換されていてもよいアミノ、置換されていてもよいアルキル、置換されていてもよいシクロアルキル、置換されていてもよいヘテロシクロアルキル、置換されていてもよいアルコキシ、置換されていてもよいアリール、および置換されていてもよいヘテロアリールからなる群からそれぞれ独立して選択され;
R5は置換されていてもよいアルケニルであり;
XはOまたはSである]
で示される化合物、もしくはその異性体、またはその医薬的に許容される塩、水和物、もしくは溶媒和物を含む、被験者における口腔内のメチルメルカプタン濃度の上昇をもたらす疾患の検査のための診断薬;
[2]
XがOである、上記[1]に記載の診断薬;
[3]
R1、R2、R3、およびR4が水素、シアノ、置換されていてもよいC1−C6アルキル、置換されていてもよいC1−C6アルコキシ、および置換されていてもよい6〜10員の単環式または二環式アリールからなる群からそれぞれ独立して選択される、上記[1]または[2]に記載の診断薬;
[4]
R1、R2、R3、およびR4が水素である、上記[1]〜[3]のいずれか1つに記載の診断薬;
[5]
R5が置換されていてもよいC2−C12アルケニルである、上記[1]〜[4]のいずれか1つに記載の診断薬;
[6]
R5が下記式:
の構造によって示される、上記[1]〜[5]のいずれか1つに記載の診断薬;
[7]
化合物が下記式:
[8]
疾患が歯周病、う蝕、口臭、口内炎、口腔癌、血液疾患、心血管疾患、代謝障害、呼吸器疾患、骨粗しょう症、および壊死性軟組織疾患からなる群から選択される、上記[1]〜[7]のいずれか1つに記載の診断薬;
[9]
疾患が歯周病および口臭からなる群から選択される、上記[1]〜[8]のいずれか1つに記載の診断薬;
[10]
メチルメルカプタンの濃度が20ppb以下である、上記[1]〜[9]のいずれか1つに記載の診断薬;
[11]
上記[1]〜[10]のいずれか1つに記載の診断薬;
被験試料を吸収するかまたは被験試料と接触することができる媒質;
使用説明書;
適宜塩基;および
適宜医薬的に許容される添加剤
を含むキット;
[12]
被験試料が息または口腔液である、上記[11]に記載のキット;
[13]
媒質が緩衝溶液、大気、活性炭、または固体フィルムである、上記[11]または[12]に記載のキット;ならびに
[14]
(i) 上記[1]〜[10]のいずれか1つに記載の診断薬と被験試料を適宜塩基の存在下で接触させる工程;および
(ii)UV機器を用いて紫外線を照射し、蛍光色の変化の度合いを調べることによって、被験試料中のメチルメルカプタンを検査する工程
を含む、被験者における口腔内のメチルメルカプタン濃度の上昇をもたらす疾患の診断方法。
[15]
さらに塩基を含む、上記[1]〜[10]のいずれか1つに記載の診断薬;
[16]
塩基がグアニジン型有機塩基である、上記[11]〜[13]のいずれか1つに記載のキット、または上記[15]に記載の診断薬
に関する。
[17]
被験者における口腔内のメチルメルカプタン濃度の上昇をもたらす疾患の検査に使用するための、上記式Iで示される化合物、もしくはその異性体、またはその医薬的に許容される塩、水和物、もしくは溶媒和物;ならびに
[18]
被験者における口腔内のメチルメルカプタン濃度の上昇をもたらす疾患の検査のための診断薬の製造における、上記式Iで示される化合物、もしくはその異性体、またはその医薬的に許容される塩、水和物、もしくは溶媒和物の使用
に関する。
本明細書で用いられている、歯周病等の疾患の検査のための本発明の診断薬の有効性成分は、下記式I:
[式中、
R1、R2、R3、およびR4は水素、シアノ、ヒドロキシ、ニトロ、置換されていてもよいアミノ、置換されていてもよいアルキル、置換されていてもよいシクロアルキル、置換されていてもよいヘテロシクロアルキル、置換されていてもよいアルコキシ、置換されていてもよいアリール、および置換されていてもよいヘテロアリールからなる群からそれぞれ独立して選択され;
R5は置換されていてもよいアルケニルであり;
XはOまたはSである]
で示される化合物、もしくはその異性体、またはその医薬的に許容される塩、水和物、もしくは溶媒和物、である。
式:
水酸化カリウムで処理した活性炭;
使用説明書;
適宜、グアニジン型有機塩基(例えば、テトラメチルグアニジン);および
適宜医薬的に許容される添加剤
を含むキット。
CDCl3=重水素化クロロホルム
conv.=変換収率
DMAP =ジメチルアミノピリジン
DMF =ジメチルホルムアミド
EDCI =1−エチル−3−(3’−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド
equiv=当量
Me =メチル
MeOH =メタノール
MeSH =メチルメルカプタン
NMR =核磁気共鳴
rt =室温
TEA =トリエチルアミン
Tf =トリフルオロメチルスルホニル
THF =テトラヒドロフラン
TLC =薄層クロマトグラフィー
TMG =テトラメチルグアニジン
実施例1
1,3a,6a−トリアザペンタレン−ビニルケトン体(R5=2−メチル−1−プロペニル)(TAP−VK1)の製造
(1)中間体Iの製造
1H−NMR(400MHz,CDCl3):δ7.64(1H,d,J=1.2Hz),δ7.45(1H,d,J=1.2Hz),7.19(1H,d,J=2.8Hz),δ6.96(1H,t,J=1.2Hz),δ6.74(1H,t,J=2.8Hz),δ2.30(3H,d,J=0.8Hz),δ2.04(3H,d,J=1.2Hz)
LRMS:[M+H]+190.3
1,3a,6a−トリアザペンタレン−ビニルケトン体(R5=3−ブテニル)の製造
上記実施例1における(3)の反応と同様に、上記実施例1で得られた中間体I(50mg、0.303mmol)と、ビニルマグネシウムブロミド(363μL、0.363mmol)とを反応させ、同様に反応処理することにより、所望する目的生成物を得た(12.5mg、66.1μmol、収率:22%)。
1H−NMR(400MHz,CDCl3):δ7.62(1H,d,J=1.2Hz),δ7.45(1H,br−d,J=2.0Hz),7.20(1H,d,J=2.0Hz),δ6.76(1H,t,J=2.8Hz),δ5.90(1H,m),δ5.10(1H,dd,J=17.2,1.6Hz),δ5.01(1H,dd,J=10.0,1.6Hz),δ3.11(2H,t,J=7.2Hz),δ2.51(2H,br−q,J=6.8)
1,3a,6a−トリアザペンタレン−ビニルケトン体(R5=2,2−ジメチル−4−メチル−3−ペンテニル)の製造
上記実施例1における(3)の反応と同様に、上記実施例1で得られた中間体I(20mg、0.121mmol)と、イソブテニルマグネシウムブロミド(291μL、0.145mmol)とを反応させ、同様に反応処理することにより、所望する目的生成物を得た(7.8mg、31.8μmol、収率:27%)。
1H−NMR(400MHz,CDCl3):δ7.58(1H,d,J=1.2Hz),δ7.40(1H,br−d,J=2.8Hz),7.18(1H,d,J=2.8Hz),δ6.75(1H,t,J=2.8Hz),δ5.31(1H,t,J=1.2Hz),δ3.12(2H,s),δ1.74(1H,d,J=1.2Hz),δ1.65(1H,d,J=1.2Hz),δ1.27(6H,s)
TAP−VK1の蛍光特性
蛍光特性は以下の機器および方法を用いて測定した。
使用機器
吸光度測定:V−630分光光度計(JAS.CO社製)
蛍光測定:FP−8200蛍光光度計(JAS.CO社製)
測定方法
蛍光測定を行うサンプル(1〜2mg)をジクロロメタン(10mL)に溶解させた。この溶液をホールピペットで1mL取り、メスフラスコを用いて10mLまで調整した。この溶液を石英セルに移し、アルゴンを30分間バブリングして脱気した。同様の手法により、基準物質として9,10−ジフェニルアントラセン(9,10−DPA、ΦF=0.91(シクロヘキサン中))を調製した。吸光スペクトルはV−630分光光度計を用い、750〜250nmの範囲を測定した。蛍光スペクトルは、370nmの光を励起波長として照射し、380〜750nmの範囲で測定を行った。
TAP−VK1とメチルメルカプタンとの反応
TAP−VK1のメチルメルカプタン付加体の蛍光特性
メスフラスコを用いてTAP−VK1のメチルメルカプタン付加体(1.71mg、7.205μmol)をジクロロメタン10mLに溶解した。この溶液をホールピペットで1mL取り、再度メスフラスコを用いて10mLまで調整した。この溶液(7.205×10−5M)に30分間アルゴンバブリングを行った。その他の操作は実施例4と同様にして行い、吸光スペクトルおよび蛍光スペクトル測定に用いた。
固体状態のTAP−VK1とメチルメルカプタンの反応
TAP−VK1(20mg、105.70μmol)にテトラメチルグアニジン(132.6μL、1.057mmol)を加え、撹拌した。30分後に、減圧濃縮した。得られた固体にメチルメルカプタンガス(20mL)を加えて、室温で24時間静置した。この残渣にCDCl3を加えてNMRを測定することで、50%conv.にて目的のメチルメルカプタン付加体が生成していることを確認した。この溶液にUV照射すると、メチルメルカプタン付加体の生成を示す緑色の蛍光が観察された。
TAP−VK1のメチルメルカプタン付加体の希釈条件での蛍光強度
本発明の診断薬が実際に呼気中に含まれる低濃度のメチルメルカプタン(≦20ppb)でも検出可能であることを立証するために、希釈条件でTAP−VK1とそのメチルメルカプタン付加体の混合比率を変え、蛍光観測を行った。
TAP−VK1溶液(溶液A)の調製
(1)TAP−VK1(分子量:189.21)を3mg(15.9μmol)秤量した。
(2)メスフラスコを使用し、ジクロロメタン10mLに溶解した(終濃度:1.59×10−3M)。
(3)ホールピペットを用いて1mL量り取り、メスフラスコで10mLまで調整した(終濃度:1.59×10−4M)。
メチルメルカプタン付加体溶液(溶液B)の調製
(1)付加体(分子量:237.32)を3.8mg(16.0μmol)秤量した。
(2)メスフラスコを使用し、ジクロロメタン10mLに溶解した(終濃度:1.60×10−3M)。
(3)ホールピペットを用いて1mL量り取り、メスフラスコで10mLまで調整した(終濃度:1.60×10−4M)。
1.60×10 −6 Mの希釈液
上記の希釈溶液をそれぞれ250μLずつ取り、ジクロロメタン2.25mLで希釈し、1.60×10−6Mのメチルメルカプタン付加体の0%、5%、10%、20%、および30%溶液を製造した。
1.60×10 −7 Mの希釈液
上記の希釈溶液をそれぞれ25μLずつ取り、ジクロロメタン2.475mLで希釈し、1.60×10−7Mのメチルメルカプタン付加体の0%、5%、10%、20%、および30%溶液を製造した。
媒質による空気中のメチルメルカプタンの捕捉とTAP−VK1による検出
空気中のメチルメルカプタンを媒質によって捕捉し、TAP−VK1と反応させることによって検出可能であることを立証するために、以下の実験を行った。
(2)パーミエーター(ガス発生装置)を用いて、600ppbのメチルメルカプタンガス(重症の歯周病患者の呼気中の濃度に相当)を発生させた。次いで、パーミエーターから発生するガスをホースでパスツールピペットに繋ぎ、10分間通気(2Lの呼気に相当)させた。
(3)パスツールピペットの下側に予めTAP−VK1(1.89μg、0.01μmol)を入れたミクロチューブを置き、パスツールピペットの上側からDMFを100μL流した。ミクロチューブでDMFを回収し、ミクロチューブに蓋をしてから激しく攪拌した。
(4)ミクロチューブにUVランプを当て、蛍光の様子を観察した。なお、反応の進行はHPLC解析によって確認した。
Claims (12)
- 式I:
[式中、
R1、R2、R3、およびR4は水素、シアノ、ヒドロキシ、ニトロ、置換されていてもよいアミノ、置換されていてもよいアルキル、置換されていてもよいシクロアルキル、置換されていてもよいヘテロシクロアルキル、置換されていてもよいアルコキシ、置換されていてもよいアリール、および置換されていてもよいヘテロアリールからなる群からそれぞれ独立して選択され;
R5は置換されていてもよいアルケニルであり;
XはOまたはSである]
で示される化合物、もしくはその異性体、またはその医薬的に許容される塩、水和物、もしくは溶媒和物を含む、被験者における口腔内のメチルメルカプタン濃度の上昇をもたらす疾患の検査のための診断薬であって、疾患が歯周病であり、被験者の呼気中に含まれるメチルメルカプタンを検出するための診断薬。 - XがOである、請求項1に記載の診断薬。
- R1、R2、R3、およびR4が水素、シアノ、置換されていてもよいC1−C6アルキル、置換されていてもよいC1−C6アルコキシ、および置換されていてもよい6〜10員の単環式または二環式アリールからなる群からそれぞれ独立して選択される、請求項1または2に記載の診断薬。
- R1、R2、R3、およびR4が水素である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の診断薬。
- R5が置換されていてもよいC2−C12アルケニルである、請求項1〜4のいずれか1項に記載の診断薬。
- メチルメルカプタンの濃度が20ppb以下である、請求項1〜7のいずれか1項に記載の診断薬。
- 請求項1〜8のいずれか1項に記載の診断薬;
呼気を吸収するかまたは呼気と接触することができる媒質;
使用説明書;
適宜塩基;および
適宜医薬的に許容される添加剤
を含むキット。 - 媒質が緩衝溶液、大気、活性炭、または固体フィルムである、請求項9に記載のキット。
- (i) 請求項1〜8のいずれか1項に記載の診断薬と呼気を適宜塩基の存在下で接触させる工程;および
(ii)UV機器を用いて紫外線を照射し、蛍光色の変化の度合いを調べることによって、呼気中のメチルメルカプタンを検査する工程
を含む、被験者における口腔内のメチルメルカプタン濃度の上昇をもたらす疾患の診断のために用いる方法であって、疾患が歯周病である、方法。
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