JP6745720B2 - 改変されたkz144エンドリシン配列 - Google Patents
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Description
[本発明1001]
SEQ ID NO: 1の配列と少なくとも約90%の配列同一性を呈するアミノ酸配列を含み、SEQ ID NO: 1が、
X1が存在していないか、または任意のアミノ酸、とりわけMであり得、
X14が任意のアミノ酸、好ましくはS、R、またはN、より好ましくはSまたはRであり得、
X23が任意のアミノ酸、好ましくはS、R、またはN、より好ましくはSであり得、
X50が任意のアミノ酸、好ましくはS、R、またはN、より好ましくはSまたはNであり得、
X82が任意のアミノ酸、好ましくはTまたはIであり得、
X122が任意のアミノ酸、好ましくはIまたはMであり得、
X149が任意のアミノ酸、好ましくはMまたはPであり得、
X154が任意のアミノ酸、好ましくはLまたはTであり得、
X160が任意のアミノ酸、好ましくはAまたはTであり得、
X167が任意のアミノ酸、好ましくはIまたはLであり得、
X179が任意のアミノ酸、好ましくはNまたはFであり得、
X180が任意のアミノ酸、好ましくはMまたはEであり得、
X186が任意のアミノ酸、好ましくはVまたはYであり得、
X206が任意のアミノ酸、好ましくはA、N、またはVであり得、
X212が任意のアミノ酸、好ましくはTまたはNであり得、
X224が任意のアミノ酸、好ましくはPまたはQであり得、
X230が任意のアミノ酸、好ましくはNまたはYであり得、
X232が任意のアミノ酸、好ましくはSまたはTであり得る;
ことを特徴とするポリペプチドであって、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4のアミノ酸配列のいずれも含まない、ポリペプチド。
[本発明1002]
SEQ ID NO: 1の配列と少なくとも約90%の配列同一性を呈するアミノ酸配列において、
X14がCではない、
X23がCではない、
X50がCではない、
X82がIである、
X122がMである、
X149がPである、
X154がTである、
X160がTである、
X167がLである、
X179がFである、
X180がEである、
X186がYである、
X206がNもしくはVである、
X212がNである、
X224がQである、
X230がYである、および/または
X232がTである、
ことのうちの少なくとも1つを呈する、本発明1001のポリペプチド。
[本発明1003]
X14がS、R、またはN、より好ましくはSまたはRであり、
X23がS、R、またはN、より好ましくはSであり、
X50がS、R、またはN、より好ましくはSまたはNであり、
X82がTまたはIであり、
X122がIまたはMであり、
X149がMまたはPであり、
X154がLまたはTであり、
X160がAまたはTであり、
X167がIまたはLであり、
X179がNまたはFであり、
X180がMまたはEであり、
X186がVまたはYであり、
X206がA、N、またはVであり、
X212がTまたはNであり、
X224がPまたはQであり、
X230がNまたはYであり、
X232がSまたはTである、
本発明1001または1002のポリペプチド。
[本発明1004]
SEQ ID NO: 1の配列と少なくとも約90%の配列同一性を呈する配列が、X1、X14、X23、X50、X82、X122、X149、X154、X160、X167、X179、X180、X186、X206、X212、X224、X230、および/またはX232から選択される1つまたは複数の残基でのみ、本発明1002〜1003において定義されるようにSEQ ID NO: 1の配列から逸脱している、前記本発明1002〜1003のいずれかのポリペプチド。
[本発明1005]
SEQ ID NO: 1の配列と少なくとも約90%の配列同一性を呈するアミノ酸配列において、115位にグルタミン酸残基を呈する、前記本発明のいずれかのポリペプチド。
[本発明1006]
SEQ ID NO: 1の配列と少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%、少なくとも約99.5%、またはさらに100%の配列同一性を呈する、前記本発明のいずれかのポリペプチド。
[本発明1007]
SEQ ID NO: 1の配列を含む、前記本発明のいずれかのポリペプチド。
[本発明1008]
X14がCではない、前記本発明のいずれかのポリペプチド。
[本発明1009]
X23がCではない、前記本発明のいずれかのポリペプチド。
[本発明1010]
X50がCではない、前記本発明のいずれかのポリペプチド。
[本発明1011]
X14およびX23がCではない、前記本発明のいずれかのポリペプチド。
[本発明1012]
X14およびX50がCではない、前記本発明のいずれかのポリペプチド。
[本発明1013]
X23およびX50がCではない、前記本発明のいずれかのポリペプチド。
[本発明1014]
X14もX23もX50もいずれもCではない、前記本発明のいずれかのポリペプチド。
[本発明1015]
X14がSである、前記本発明のいずれかのポリペプチド。
[本発明1016]
X14がRである、前記本発明1001〜1014のいずれかのポリペプチド。
[本発明1017]
X23がSである、前記本発明のいずれかのポリペプチド。
[本発明1018]
X50がSである、前記本発明のいずれかのポリペプチド。
[本発明1019]
X50がNである、前記本発明1001〜1017のいずれかのポリペプチド。
[本発明1020]
X14およびX23がSである、前記本発明1001〜1015および1017〜1019のいずれかのポリペプチド。
[本発明1021]
X14およびX50がSである、前記本発明1001〜1015、1017、および1018のいずれかのポリペプチド。
[本発明1022]
X23およびX50がSである、前記本発明1001〜1018のいずれかのポリペプチド。
[本発明1023]
X14、X23、およびX50がSである、前記本発明1001〜1015、1017、および1018のいずれかのポリペプチド。
[本発明1024]
X14がRであり、かつX50がSである、本発明1016のポリペプチド。
[本発明1025]
X14がSであり、かつX50がNである、本発明1015のポリペプチド。
[本発明1026]
X14がRであり、かつX50がNである、本発明1016のポリペプチド。
[本発明1027]
X149がPである、本発明1016のポリペプチド。
[本発明1028]
X160がTである、本発明1027のポリペプチド。
[本発明1029]
X82がIである、前記本発明のいずれかのポリペプチド。
[本発明1030]
X122がMである、前記本発明のいずれかのポリペプチド。
[本発明1031]
X149がPである、前記本発明のいずれかのポリペプチド。
[本発明1032]
X154がTである、前記本発明のいずれかのポリペプチド。
[本発明1033]
X160がTである、前記本発明のいずれかのポリペプチド。
[本発明1034]
X167がLである、前記本発明のいずれかのポリペプチド。
[本発明1035]
X179がFである、前記本発明のいずれかのポリペプチド。
[本発明1036]
X180がEである、前記本発明のいずれかのポリペプチド。
[本発明1037]
X186がYである、前記本発明のいずれかのポリペプチド。
[本発明1038]
X206がVである、前記本発明のいずれかのポリペプチド。
[本発明1039]
X206がNである、前記本発明のいずれかのポリペプチド。
[本発明1040]
X212がNである、前記本発明のいずれかのポリペプチド。
[本発明1041]
X224がQである、前記本発明のいずれかのポリペプチド。
[本発明1042]
X230がYである、前記本発明のいずれかのポリペプチド。
[本発明1043]
X232がTである、前記本発明のいずれかのポリペプチド。
[本発明1044]
X122がMであり、かつX160がTである、前記本発明のいずれかのポリペプチド。
[本発明1045]
X82がIであり、X206がVであり、かつX232がTである、前記本発明のいずれかのポリペプチド。
[本発明1046]
X160がAである、本発明1027のポリペプチド。
[本発明1047]
X122がMであり、かつX160がTである、本発明1045のポリペプチド。
[本発明1048]
X122がMである、本発明1045のポリペプチド。
[本発明1049]
X122がMであり、かつX160がTである、本発明1021のポリペプチド。
[本発明1050]
X14がSであり、かつX50がSである、本発明1047のポリペプチド。
[本発明1051]
X82がIであり、X206がNであり、かつX232がTである、本発明1049のポリペプチド。
[本発明1052]
X149がPである、本発明1051のポリペプチド。
[本発明1053]
M180がEである、本発明1051のポリペプチド。
[本発明1054]
X186がYである、本発明1051のポリペプチド。
[本発明1055]
X230がYである、本発明1051のポリペプチド。
[本発明1056]
X82がIであり、X122がMであり、X206がVであり、かつX232がTである、本発明1024のポリペプチド。
[本発明1057]
X160がTである、本発明1056のポリペプチド。
[本発明1058]
X149がPである、本発明1056または1057のポリペプチド。
[本発明1059]
X82がIであり、X122がMであり、X160がTであり、X206がVであり、かつX232がTである、本発明1024のポリペプチド。
[本発明1060]
X82がIであり、X122がMであり、X160がTであり、X206がVであり、かつX232がTである、本発明1025のポリペプチド。
[本発明1061]
X82がIであり、X122がMであり、X149がPであり、X206がVであり、かつX232がTである、本発明1026のポリペプチド。
[本発明1062]
X167がLである、本発明1061のポリペプチド。
[本発明1063]
X179がFである、本発明1061のポリペプチド。
[本発明1064]
X212がNである、本発明1061のポリペプチド。
[本発明1065]
X224がQである、本発明1061のポリペプチド。
[本発明1066]
X154がTである、本発明1061のポリペプチド。
[本発明1067]
X1がMではない、前記本発明のいずれかのポリペプチド。
[本発明1068]
SEQ ID NO: 1が、SEQ ID NO: 6〜49からなる群より選択される配列である、前記本発明のいずれかのポリペプチド。
[本発明1069]
SEQ ID NO: 6〜49からなる群より選択される配列を含む、前記本発明のいずれかのポリペプチド。
[本発明1070]
両親媒性ペプチド、カチオン性ペプチド、ポリカチオン性ペプチド、疎水性ペプチド、天然に存在する抗微生物ペプチド、スシ(sushi)ペプチド、およびデフェンシンからなる群より選択される、少なくとも1つのアミノ酸配列ストレッチを追加的に含む、前記本発明のいずれかのポリペプチド。
[本発明1071]
両親媒性ペプチド、カチオン性ペプチド、ポリカチオン性ペプチド、疎水性ペプチド、天然に存在する抗微生物ペプチド、スシペプチド、およびデフェンシンの群より選択される、少なくとも2つの別個のアミノ酸配列ストレッチを含む、前記本発明のいずれかのポリペプチド。
[本発明1072]
少なくとも1つのアミノ酸配列ストレッチが、ポリペプチドのN末端またはC末端に存在している、本発明1070〜1071のいずれかのポリペプチド。
[本発明1073]
KRKおよびSEQ ID NO: 50〜120からなる群より選択される少なくとも1つの追加的なアミノ酸配列ストレッチを含む、前記本発明1070〜1072のいずれかのポリペプチド。
[本発明1074]
SMAP-29、SEQ ID NO: 76のアミノ酸配列を有する少なくとも1つの追加的なアミノ酸配列ストレッチを含む、前記本発明1070〜1073のいずれかのポリペプチド。
[本発明1075]
SMAP-29、SEQ ID NO: 76の配列が、ポリペプチドにおいて、配列SEQ ID NO: 1と少なくとも約90%の配列同一性を呈する配列のN末端に位置している、本発明1074のポリペプチド。
[本発明1076]
SEQ ID NO: 121〜134のいずれかから選択されるアミノ酸配列と少なくとも91.5%の配列同一性を呈するアミノ酸を含み、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4のアミノ酸配列のいずれも含まない、本発明1070〜1075のいずれかのポリペプチド。
[本発明1077]
SEQ ID NO: 121〜134のいずれかから選択されるアミノ酸配列と少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約98.5%、少なくとも約98.75%、少なくとも約99%、または少なくとも約99.5%の配列同一性を呈するアミノ酸配列を含む、本発明1076のポリペプチド。
[本発明1078]
SEQ ID NO: 121〜134からなる群より選択される配列を含む、前記本発明のいずれかのポリペプチド。
[本発明1079]
タグ配列を追加的に含む、前記本発明のいずれかのポリペプチド。
[本発明1080]
タグが、SEQ ID NO: 1の配列と少なくとも90%の配列同一性を呈するアミノ酸配列のC末端に位置している、本発明1079のポリペプチド。
[本発明1081]
タグが、SEQ ID NO: 1の配列と少なくとも90%の配列同一性を呈するアミノ酸配列に、直接、または、1〜10アミノ酸残基、好ましくは1〜5アミノ酸残基、さらにより好ましくは1〜2アミノ酸の短いリンカーを介して連結されている、本発明1079〜1080のいずれかのポリペプチド。
[本発明1082]
His-タグ、好ましくはSEQ ID NO: 135のHisタグを含む、本発明1079〜1081のいずれかのポリペプチド。
[本発明1083]
SEQ ID NO: 136〜149のいずれかから選択されるアミノ酸配列と少なくとも91.5%の配列同一性を呈するアミノ酸配列を含み、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3のアミノ酸配列のいずれも含まない、本発明1079〜1082のいずれかのポリペプチド。
[本発明1084]
SEQ ID NO: 136〜149のいずれかから選択されるアミノ酸配列と少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約98.5%、少なくとも約98.75%、少なくとも約99%、または少なくとも約99.5%の配列同一性を呈するアミノ酸配列を含む、本発明1083のポリペプチド。
[本発明1085]
約320アミノ酸を超えない、好ましくは約310アミノ酸を超えない全体の長さを有する、前記本発明のいずれかのポリペプチド。
[本発明1086]
SEQ ID NO: 136〜149からなる群より選択される配列を含む、前記本発明のいずれかのポリペプチド。
[本発明1087]
グラム陰性細菌、とりわけシュードモナス属(Pseudomonas)細菌および/またはカンピロバクター属(Campylobacter)細菌のペプチドグリカンを分解する、前記本発明のいずれかのポリペプチド。
[本発明1088]
本発明1001〜1087のいずれかのポリペプチドをコードする、核酸。
[本発明1089]
本発明1088の核酸を含む、ベクター。
[本発明1090]
本発明1001〜1087のいずれかのポリペプチド、本発明1088の核酸、および/または本発明1089のベクターを含む、宿主細胞。
[本発明1091]
本発明1001〜1087のいずれかのポリペプチド、本発明1088の核酸、本発明1089のベクター、および/または本発明1090の宿主細胞を含む、組成物。
[本発明1092]
薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、または担体を含む薬学的組成物である、本発明1091の組成物。
X1が存在していないか、または任意のアミノ酸、とりわけMであり得、
X14が任意のアミノ酸、好ましくはS、R、またはN、より好ましくはSまたはRであり得、
X23が任意のアミノ酸、好ましくはS、R、またはN、より好ましくはSであり得、
X50が任意のアミノ酸、好ましくはS、R、またはN、より好ましくはSまたはNであり得、
X82が任意のアミノ酸、好ましくはTまたはIであり得、
X122が任意のアミノ酸、好ましくはIまたはMであり得、
X149が任意のアミノ酸、好ましくはMまたはPであり得、
X154が任意のアミノ酸、好ましくはLまたはTであり得、
X160が任意のアミノ酸、好ましくはAまたはTであり得、
X167が任意のアミノ酸、好ましくはIまたはLであり得、
X179が任意のアミノ酸、好ましくはNまたはFであり得、
X180が任意のアミノ酸、好ましくはMまたはEであり得、
X186が任意のアミノ酸、好ましくはVまたはYであり得、
X206が任意のアミノ酸、好ましくはA、N、またはVであり得、
X212が任意のアミノ酸、好ましくはTまたはNであり得、
X224が任意のアミノ酸、好ましくはPまたはQであり得、
X230が任意のアミノ酸、好ましくはNまたはYであり得、
X232が任意のアミノ酸、好ましくはSまたはTであり得る;
ことを特徴とするポリペプチドであって、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4のアミノ酸配列のいずれも含まない、ポリペプチドに関連する。
エンドリシンKZ144(SEQ ID NO: 5)における有利な改変の部位の特定のために、本発明者らは、第1段階で、標的タンパク質の標的不安定化を用いた。この目的で、N末端が切断されたKZ144を生成させ(SEQ ID NO: 150)、それにランダム変異誘発(エラープローンPCR)を介して配列変異を導入し、その後融合させて、クロラムフェニコールアッセイ(CATアッセイ)で選択した。
SEQ ID NO: 151(変異なし)およびSEQ ID NO: 136〜142記載のポリペプチドの構築のために、シュードモナス・エルギノーサファージKZの溶解酵素(gp144)を使用した。ペプチド融合パートナーとして、SMAP-29を選択した。SMAP-29は、ヒツジリンパ球において見出され、29アミノ酸からなる(RGLRRLGRKIAHGVKKYGPTVLRIIRIAG;分子量:3.3 kDa、SEQ ID NO: 76)。これは、中央のヒンジによって接続されている2つのLPS結合部位でできている。
それぞれのペプチドおよびエンドリシンをコードする核酸分子を、核酸分子の5'端のNdeI(5'-CAT ATG-3')制限酵素部位および核酸分子の3'端のXhoI(5'-CTC GAG-3')制限酵素部位とともに構築した。ペプチドおよびエンドリシンは、BamHI(5'-GGA TCC-3')を介して接続されている。
融合タンパク質の組み換え発現を、大腸菌BL21(DE3)pLysS細胞(Novagen, Darmstadt, Germany)において行った。細胞を、OD600nm=0.5〜0.8の光学密度に達するまで増殖させた。その後、融合タンパク質の発現を0.5 mM IPTG(イソプロピルチオガラクトシド)で誘導し、発現を37℃で4時間行った。
1.3〜5 ml/分の流速での、10カラム体積までの洗浄緩衝液(20mMイミダゾール、1 M NaCl、および20mM HEPES、pH7.4)を用いた、Histrap FF 5 mlカラム(GE Healthcare)の平衡化。
2.3〜5 ml/分の流速での、Histrap FF 5 mlカラムへの、望まれる標的タンパク質を含む全溶解物のローディング。
3.結合していないタンパク質を除去するための、10カラム体積までの洗浄緩衝液を用いたカラムの洗浄。
4.3〜5 ml/分の流速での、15カラム体積の溶出緩衝液(500mMイミダゾール、500mM NaCl、および20mM HEPES、pH7.4)の100%へ増加する直線勾配を用いた、結合した標的タンパク質のカラムからの溶出。
1.1〜2 ml/分の流速での、5カラム体積までの洗浄緩衝液(850mM硫酸アンモニウム、500mM NaCl、および20mM HEPES、pH7.4)を用いた、HiScreen Phenyl HP 5 mlカラム(GE Healthcare)の平衡化。
2.試料(Ni2+親和性段階由来のタンパク質プールの1 mlカラム体積当たり5mg)の調製は、Ni2+親和性段階由来の洗浄緩衝液のあらかじめ規定された量の添加によって、最初にタンパク質濃度を0.5mg/mlに設定することにより開始する。その後、およそ850mMの最終濃度まで、あらかじめ規定された量の硫酸アンモニウムストック溶液(3.8M)を段階的に添加することによる、硫酸アンモニウム濃度の調整が続く。
3.1〜2 ml/分の流速での、HiScreen Phenyl HP 5 mlカラムへの、調製した試料のローディング。
4.結合していないタンパク質を除去するための、5カラム体積の洗浄緩衝液を用いたカラムの洗浄。
5.1〜2 ml/分の流速での、40%溶出緩衝液(500mM NaCl、および20mM HEPES、pH7.4)の段階を用いた、標的タンパク質のカラムからの溶出。標的タンパク質は、この段階で幅広いピークで溶出される。
HIC段階の溶出プールを、4℃で保存緩衝液(500mM NaClおよび20mM HEPES; pH7.4)中で透析した(膜:MWCO:6000-8000Dを有する再生セルロース)。透析率は、160〜250である。
SEQ ID NO: 136〜142記載のポリペプチドの、上昇した温度での安定性を特徴づける融解温度を、上述のように円偏光二色性分光法(CD)によって決定した。
抗生物質についての「最小阻止濃度(MIC)」の決定と同様に、MICを、微量希釈試験として決定した。カンピロバクター種に対する試験は、完全に微好気性の条件および42℃で行う。
上昇した融解温度が、それぞれの変異ポリペプチドの温度安定性に実際に影響を及ぼすことを例証するために、本発明者らは、例示的にSEQ ID NO: 139およびSEQ ID NO: 141の変異ポリペプチドを、天然の変異していない参照ポリペプチド(SEQ ID NO: 151)の融解温度を明らかに超える温度に曝露した。
Claims (10)
- SEQ ID NO: 1のアミノ酸配列を含み、SEQ ID NO: 1が、
X14がSであり、
X23が任意のアミノ酸、好ましくはS、R、またはN、より好ましくはSであり得、
X50がSであり、
X1が存在していないか、または任意のアミノ酸、とりわけMであり得、
X82が任意のアミノ酸、好ましくはTまたはIであり得、
X122が任意のアミノ酸、好ましくはIまたはMであり得、
X149が任意のアミノ酸、好ましくはMまたはPであり得、
X154が任意のアミノ酸、好ましくはLまたはTであり得、
X160が任意のアミノ酸、好ましくはAまたはTであり得、
X167が任意のアミノ酸、好ましくはIまたはLであり得、
X179が任意のアミノ酸、好ましくはNまたはFであり得、
X180が任意のアミノ酸、好ましくはMまたはEであり得、
X186が任意のアミノ酸、好ましくはVまたはYであり得、
X206が任意のアミノ酸、好ましくはA、N、またはVであり得、
X212が任意のアミノ酸、好ましくはTまたはNであり得、
X224が任意のアミノ酸、好ましくはPまたはQであり得、
X230が任意のアミノ酸、好ましくはNまたはYであり得、
X232が任意のアミノ酸、好ましくはSまたはTであり得る;
ことを特徴とするポリペプチドであって、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4のアミノ酸配列のいずれも含まない、前記ポリペプチド。 - X23がSである、
X82がIである、
X122がMである、
X149がPである、
X154がTである、
X160がTである、
X167がLである、
X179がFである、
X180がEである、
X186がYである、
X206がNもしくはVである、
X212がNである、
X224がQである、
X230がYである、および/または
X232がTである、
ことのうちの少なくとも1つを呈する、請求項1に記載のポリペプチド。 - X23がSである、請求項1または2に記載のポリペプチド。
- X82がTまたはIであり、
X122がIまたはMであり、
X149がMまたはPであり、
X154がLまたはTであり、
X160がAまたはTであり、
X167がIまたはLであり、
X179がNまたはFであり、
X180がMまたはEであり、
X186がVまたはYであり、
X206がA、N、またはVであり、
X212がTまたはNであり、
X224がPまたはQであり、
X230がNまたはYであり、
X232がSまたはTである、
請求項1〜3のいずれか一項に記載のポリペプチド。 - SEQ ID NO: 6、9〜28、および31〜49からなる群より選択される配列を含む、請求項1〜2のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- KRKおよびSEQ ID NO: 50〜120からなる群より選択される少なくとも1つの追加的なアミノ酸配列ストレッチを含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- SMAP-29、SEQ ID NO: 76のアミノ酸配列を有する少なくとも1つの追加的なアミノ酸配列ストレッチを含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- SEQ ID NO: 121〜134からなる群より選択される配列を含むか、またはSEQ ID NO: 136、139〜143、および146〜149からなる群より選択される配列を含む、請求項1〜2のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- グラム陰性細菌、とりわけシュードモナス属(Pseudomonas)細菌および/またはカンピロバクター属(Campylobacter)細菌のペプチドグリカンを分解する、請求項1〜8のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- SEQ ID NO: 140の配列を含む、請求項1〜9のいずれか一項に記載のポリペプチド。
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