BR112016011091B1 - Sequência de endolisina kz144 modificada - Google Patents
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Abstract
sequência de endolisina kz144 modificada. a presente invenção refere-se a polipeptídios compreendendo uma sequência de aminoácidos apresentando identidade de sequência de pelo menos aproximadamente 90% com a sequência da seq id no: 1. os referidos polipeptídios de preferência degradam o peptidoglicano de bactérias gram-negativas, em particular de bactérias pseudomonas e/ou campylobacter. além disso, a presente invenção refere-se a ácidos nucléicos codificando tais polipeptídios, vetores compreendendo tais ácidos nucléicos, e células hospedeiras correspondentes. por fim, a presente invenção refere-se a composições compreendendo tais polipeptídios, ácidos nucléicos, vetores e/ou células hospedeiras de acordo com a presente invenção.
Description
[001] A presente invenção refere-se a polipeptídios compreendendo uma sequência de aminoácidos apresentando identidade de sequência de pelo menos aproximadamente 90% com a sequência da SEQ ID NO: 1. Os referidos polipeptídios de preferência degradam o peptidoglicano de bactérias Gram- negativas, em particular de bactérias Pseudomonas e/ou Campylobacter. Além disso, a presente invenção refere-se a ácidos nucléicos que codificam tais polipeptídios, vetores compreendendo tais ácidos nucléicos, e células hospedeiras correspondentes. Por fim, a presente invenção refere-se a composições compreendendo tais polipeptídios, ácidos nucléicos, vetores e/ou células hospedeiras de acordo com a presente invenção.
[002] O bacteriófago gigante lítico Myoviridae ΦKZ (280 334 bp) infecta a Pseudomonas aeruginosa, um importante patógeno nosocomial oportunista resistente a muitos antibióticos geralmente utilizados, e, portanto, constitui a causa de preocupação considerável em ambientais hospitalares. Em 2007, Briers et al. (Molecular Microbiology (2007) 65(5), 1334-1344) sequenciaram o genoma do referido bacteriófago e identificaram a endolisina KZ144, uma hidrolase do peptidoglicano altamente lítica. Na patente WO 2010/149792, uma proteína de fusão compreendendo a sequência da referida endolisina como um elemento enzimático foi proposta para uso na degradação da parede celular de bactérias Gram-negativas.
[003] Embora a referida endolisina e as proteínas de fusão sejam eficazes em geral, constatou-se que, para algumas aplicações técnicas, o polipeptídio da endolisina apresenta características abaixo do ideal, particularmente em termos de estabilidade e processamento. Portanto, existe na técnica a necessidade de uma enzima endolisina adicional, que, de preferência, apresente características aperfeiçoadas sob esse aspecto. O problema da presente invenção, portanto, consiste em proporcionar tal polipeptídio.
[004] O problema é resolvido pela presente matéria, conforme estabelecida nas reivindicações anexas.
[005] No que se segue, será apresentada uma breve descrição das figuras anexas. As figuras pretendem ilustrar a presente invenção em mais detalhes. No entanto, elas não pretendem limitar a matéria da invenção em qualquer extensão.
[006] A Fig. 1: Ilustra:
[007] SEQ ID NO: 1,
[008] SEQ ID NO: 2 endolisina KZ144 sem metionina N-terminal,
[009] SEQ ID NO: 3 endolisina KZ144 sem metionina N-terminal e com resíduos de selenometionina em vez de resíduos de metionina,
[010] SEQ ID NO: 4 endolisina KZ144 com mutação E115A sem metionina N-terminal, e
[011] SEQ ID NO: 5 endolisina KZ144.
[012] A Fig. 2: ilustra:
[013] SEQ ID NO: 136 Proteína de fusão do SMAP-29 (sublinhado com linha sólida; SEQ ID NO: 76), KZ144 modificada sem metionina N-terminal e com C14S e C50S (sublinhado com linha semi-pontilhada/semi-sólida; SEQ ID NO: 28) e marca His (sublinhado com linha pontilhada; SEQ ID NO: 135).
[014] SEQ ID NO: 137 Proteína de fusão do SMAP-29 (sublinhado com linha sólida; SEQ ID NO: 76), KZ144 modificada sem metionina N-terminal e com T82I, A206V e S232T (sublinhado com linha semi-pontilhada/semi-sólida; SEQ ID NO: 29) e marca His (sublinhado com linha pontilhada; SEQ ID NO: 135).
[015] SEQ ID NO: 138 Proteína de fusão do SMAP-29 (sublinhado com linha sólida; SEQ ID NO: 76), KZ144 modificada sem metionina N-terminal e com T82I, A206V, S232T, I122M; e A160T (sublinhado com linha semi- pontilhada/semi-sólida; SEQ ID NO: 30) e marca His (sublinhado com linha pontilhada; SEQ ID NO: 135).
[016] SEQ ID NO: 139 Proteína de fusão do SMAP-29 (sublinhado com linha sólida; SEQ ID NO: 76), KZ144 modificada sem metionina N-terminal e com C14S, C50S, I122M; e A160T (sublinhado com linha semi-pontilhada/semi- sólida; SEQ ID NO: 31) e marca His (sublinhado com linha pontilhada; SEQ ID NO: 135).
[017] SEQ ID NO: 140 Proteína de fusão do SMAP-29 (sublinhado com linha sólida; SEQ ID NO: 76), KZ144 modificada sem metionina N-terminal e com C14S, C23S e C50S (sublinhado com linha semi-pontilhada/semi-sólida; SEQ ID NO: 32) e marca His (sublinhado com linha pontilhada; SEQ ID NO: 135).
[018] SEQ ID NO: 141 Proteína de fusão do SMAP-29 (sublinhado com linha sólida; SEQ ID NO: 76), KZ144 modificada sem metionina N-terminal e com T82I, A206N, S232T, I122M; A160T, C14S e C50S (sublinhado com linha semi-pontilhada/semi-sólida; SEQ ID NO: 33) e marca His (sublinhado com linha pontilhada; SEQ ID NO: 135).
[019] SEQ ID NO: 142 Proteína de fusão do SMAP-29 (sublinhado com linha sólida; SEQ ID NO: 76), KZ144 modificada sem metionina N-terminal e com T82I, A206N, S232T, I122M; A160T, C14S e C50S (sublinhado com linha semi-pontilhada/semi-sólida; SEQ ID NO: 49) e marca His (sublinhado com linha pontilhada; SEQ ID NO: 135).
[020] SEQ ID NO: 151 Proteína de fusão do SMAP-29 (sublinhado com linha sólida; SEQ ID NO: 76), KZ144 sem metionina N-terminal (sublinhado com linha semi- pontilhada/semi-sólida; SEQ ID NO: 2) e marca His (sublinhado com linha pontilhada; SEQ ID NO: 135).
[021] Em um primeiro aspecto, a presente invenção refere- se a um polipeptídio compreendendo uma sequência de aminoácidos apresentando identidade de sequência de pelo menos aproximadamente 90% com a sequência da SEQ ID NO: 1, em que a SEQ ID NO: 1 é caracterizada por
[022] X1 pode estar ausente ou ser qualquer aminoácido, em particular M,
[023] X14 pode ser qualquer aminoácido, de preferência S, R
[024] ou N, mais preferivelmente, X23 pode ser qualquer S ou R aminoácido, de preferência S, R
[025] ou N, mais preferivelmente X50 pode ser qualquer S aminoácido, de preferência S, R
[026] ou N, mais preferivelmente, X82 pode ser qualquer S ou N aminoácido, de preferência T ou
[027] I X122 pode ser qualquer aminoácido, de preferência I ou
[028] M X149 pode ser qualquer aminoácido, de preferência M ou P
[029] X154 pode ser qualquer aminoácido, de preferência L ou T
[030] X160 pode ser qualquer aminoácido, de preferência A ou T
[031] X167 pode ser qualquer aminoácido, de preferência I ou L
[032] X179 pode ser qualquer aminoácido, de preferência N ou F
[033] X180 pode ser qualquer aminoácido, de preferência M ou E
[034] X186 pode ser qualquer aminoácido, de preferência V ou Y
[035] X206 pode ser qualquer aminoácido, de preferência A, N ou V
[036] X212 pode ser qualquer aminoácido, de preferência T ou N
[037] X224 pode ser qualquer aminoácido, de preferência P ou Q
[038] X230 pode ser qualquer aminoácido, de preferência N ou Y
[039] X232 pode ser qualquer aminoácido, de preferência S ou T;
[040] e em que o polipeptídio não compreende nem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, nem da SEQ ID NO: 3, nem da SEQ ID NO: 4.
[041] O termo “polipeptídio”, como usado aqui, refere-se em particular a um polímero de resíduos de aminoácido ligados por ligações peptídicas em uma sequência específica. Os resíduos de aminoácido de um polipeptídio podem ser modificados, por exemplo, por ligações covalentes de vários grupos, como carboidratos e fosfato. Outras substâncias podem ser mais fracamente associadas ao polipeptídio, tal como heme ou lipídio, dando origem a polipeptídios conjugados que também são compreendidos pelo termo “polipeptídio”, como usado aqui. O termo conforme utilizado aqui também pretende englobar proteínas. Assim, o termo “polipeptídio” também abrange, por exemplo, complexos de duas ou mais cadeias poliméricas de aminoácidos. O termo “polipeptídio” abrange modalidades de polipeptídios que opcionalmente apresentam modificações tipicamente utilizadas na técnica, por exemplo, biotinilação, acetilação, peguilação, alterações químicas dos grupos amino, SH ou carboxila (por exemplo, grupos protetores) etc. Como se tornará aparente por meio da descrição a seguir, o polipeptídio de acordo com a presente invenção também pode ser uma proteína de fusão, isto é, a ligação de pelo menos duas sequências de aminoácidos que não ocorrem nesta combinação na natureza. O termo “polipeptídio”, como usado aqui, não se limita a um comprimento específico da cadeia polimérica de aminoácidos, mas, tipicamente, o polipeptídio irá apresentar um comprimento de mais de aproximadamente 50 aminoácidos, mais de aproximadamente 100 aminoácidos ou até mesmo mais do que aproximadamente 150 aminoácidos. Geralmente, mas não necessariamente, um típico polipeptídio da presente invenção não irá ultrapassar aproximadamente 750 aminoácidos de comprimento.
[042] Conforme utilizado aqui, o termo “percentual de identidade de sequência” deve ser entendido da seguinte forma: Duas sequências a serem comparadas são alinhadas para fornecer uma correlação máxima entre as sequências. Isto pode incluir a inserção de “lacuna” em uma ou em ambas as sequências, para aumentar o grau de alinhamento. Um percentual de identidade pode então ser determinado ao longo de todo o comprimento de cada uma das sequências sendo comparadas (conhecido como alinhamento global), que é particularmente adequado para sequências de comprimento igual ou similar, ou ao longo de comprimentos mais curtos, definidos (conhecido como alinhamento local), que seja mais apropriado para sequências de comprimento desigual. No contexto acima, uma sequência de aminoácidos tendo uma “identidade de sequência” de pelo menos, por exemplo, 95% com uma sequência de aminoácidos de consulta (query), pretende indicar que a sequência da sequência de aminoácidos alvo (subject) é idêntica à sequência de consulta, exceto que a sequência de aminoácidos alvo pode incluir até cinco alterações de aminoácidos por cada 100 aminoácidos da sequência de aminoácidos de consulta. Em outras palavras, para obter uma sequência de aminoácidos contendo uma sequência pelo menos 95% idêntica a uma sequência de aminoácidos de consulta, até 5% (5 de 100) dos resíduos de aminoácidos na sequência-alvo podem ser inseridos ou substituídos por outro aminoácido ou deletados. Métodos para comparar a identidade e a homologia de duas ou mais sequências são bem conhecidos na técnica. A porcentagem até qual duas sequências são idênticas pode, por exemplo, ser determinada usando um algoritmo matemático. Um exemplo preferido, mas não limitante, de um algoritmo matemático que pode ser empregado é o algoritmo de Karlin et al (1993), PNAS USA, 90:5873-5877. Tal algoritmo é integrado na família BLAST de programas, por exemplo, programa BLAST ou NBLAST (vide também Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215, 403-410 ou Altschul et al. (1997), Nucleic Acids Res, 25:3389-3402), acessível através da página da Internet da NCBI no site ncbi.nlm.nih.gov) e FASTA (Pearson (1990), Methods Enzymol. 83, 63-98; Pearson and Lipman (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 85, 24442448.). As sequências que são idênticas a outras sequências em certo grau podem ser identificadas por esses programas. Ademais, os programas disponíveis no Wisconsin Sequence Analysis Package, versão 9.1 (Devereux et al, 1984, Nucleic Acids Res., 387-395), por exemplo, os programas BESTFIT e GAP, podem ser utilizados para determinar o percentual de identidade entre duas sequências de polipeptídios. O BESTFIT usa o algoritmo de "homologia local" de (Smith and Waterman (1981), J. Mol. Biol. 147, 195-197.) e encontra a melhor região única de similaridade entre duas sequências. Caso seja feita referência na presente invenção a uma sequência de aminoácidos compartilhando um determinado grau de identidade de sequência com uma sequência de referência, então a dita diferença na sequência se dá preferivelmente a substituições de aminoácidos conservadoras. De preferência, tal sequência retém a atividade da sequência de referência, por exemplo, embora possa ser a uma taxa inferior. Além disso, caso seja feita referência aqui a uma sequência compartilhando “pelo menos” certa porcentagem de identidade de sequência, então 100% de identidade de sequência preferivelmente não estão incluídos.
[043] O termo "Substituições de aminoácidos conservadoras", como usado aqui, pode ocorrer dentro de um grupo de aminoácidos que possuem propriedades físico- químicas suficientemente similares, de modo que uma substituição entre os membros do grupo preserve a atividade biológica da molécula (vide, por exemplo, Grantham, R. (1974), Science 185, 862-864). Particularmente, as substituições de aminoácidos conservadoras são, de preferência, substituições nas quais os aminoácidos se originam da mesma classe de aminoácidos (por exemplo, aminoácidos básicos, aminoácidos ácidos, aminoácidos polares, aminoácidos com cadeias laterais alifáticas, aminoácidos com cadeias laterais positivamente ou negativamente carregadas, aminoácidos com grupos aromáticos nas cadeias laterais, aminoácidos cujas cadeias laterais podem entrar nas pontes de hidrogênio, por exemplo, cadeias laterais que possuem uma função hidroxila, etc.). As substituições conservadoras estão, no presente caso, por exemplo, substituindo um resíduo de aminoácido básico (Lis, Arg, His) por outro resíduo de aminoácido básico (Lyis, Arg, His), substituindo um resíduo de aminoácido alifático (Gli, Ala, Val, Leu, lie) por outro resíduo de aminoácido alifático, substituindo um resíduo de aminoácido aromático (Fen, Tir, Trp) por outro resíduo de aminoácido aromático, substituindo treonina por serina ou leucina por isoleucina. Trocas de aminoácido conservadoras adicionais serão conhecidas pelos versados na técnica.
[044] O termo “deleção”, conforme utilizado aqui, refere- se preferivelmente à ausência de 1, 2, 3, 4, 5 (ou até mesmo mais de 5) resíduos de aminoácidos contínuos na sequência derivada em comparação com a respectiva sequência de referência, seja intra-sequencialmente ou no N- ou C- terminal.
[045] O termo “inserção”, conforme utilizado aqui, refere-se preferivelmente à presença intra-sequencial de 1, 2, 3, 4, 5 (ou até mesmo mais de 5) resíduos de aminoácidos contínuos na sequência derivada em comparação com a respectiva sequência de referência.
[046] O termo “adição”, conforme utilizado aqui, refere- se preferivelmente à presença adicional de 1, 2, 3, 4, 5 (ou até mesmo mais de 5) resíduos de aminoácidos contínuos na sequência derivada N- e/ou C-terminal em comparação com a respectiva sequência de referência.
[047] O termo “substituição”, como usado aqui, refere-se à presença de um resíduo de aminoácido em uma certa posição da sequência derivada que é diferente do resíduo de aminoácido que está presente ou ausente na posição correspondente na sequência de referência. Como mencionado acima, de preferência, tais substituições são substituições conservadoras.
[048] O termo “parede celular”, como usado aqui, refere- se a todos os componentes que formam o envoltório celular externo das bactérias Gram-negativas, garantindo assim sua integridade. Em particular, o termo “parede celular”, como usado aqui, refere-se ao peptidoglicano, à membrana externa das bactérias Gram-negativas com o lipopolissacarídeo, à membrana celular bacteriana, mas também a camadas adicionais depositadas no peptidoglicano, como por exemplo, cápsulas, camadas de proteína externas ou slimes.
[049] O termo “segmento de sequência de aminoácidos”, conforme utilizado aqui, refere-se a um segmento específico de uma sequência de aminoácidos na sequência de aminoácidos do polipeptídio da invenção. A referida sequência refere-se a uma sequência de um peptídio catiônico, um peptídio policatiônico, um peptídio anfifático, um peptídio hidrófobo, um peptídio sushi e/ou um peptídio antimicrobiano. O termo não se refere a marcas convencionais como marcas His, tais como marcas His5, marcas His6, marcas His7, marcas His8, marcas His9, marcas His10, marcas His11, marcas His12, marcas His16 e marcas His20, marcas Strep, marcas Avi, marcas Myc, marcas Gst, marcas JS, marcas cisteína, marcas FLAG ou outras marcas conhecidas na técnica, tioredoxina ou proteínas de ligação à maltose (MBP). De preferência, um segmento de sequência de aminoácidos conforme usado aqui tem um comprimento de aproximadamente 6 a aproximadamente 39 resíduos de aminoácidos.
[050] Como usado aqui, o termo “peptídio catiônico” refere-se preferivelmente a um peptídio contendo resíduos de aminoácido positivamente carregados. De preferência, um peptídio catiônico tem um valor pKa de 9,0 ou mais. Tipicamente, pelo menos quatro dos resíduos de aminoácido do peptídio catiônico podem ser positivamente carregados, por exemplo, lisina ou arginina. “Positivamente carregado” refere-se às cadeias laterais dos resíduos de aminoácido que possuem uma carga líquida positiva em condições próximas à fisiológica. O termo “peptídio catiônico”, conforme usado aqui, também se refere a peptídios policatiônicos, mas também inclui peptídios catiônicos que compreendem, por exemplo, menos de 20%, de preferência menos de 10% de resíduos de aminoácidos positivamente carregados.
[051] O termo “peptídio policatiônico”, como usado aqui, refere-se preferivelmente a um peptídio composto de resíduos de aminoácidos em sua maioria positivamente carregados, em particular, resíduos lisina e/ou arginina. Um peptídio é composto principalmente de resíduos de aminoácidos carregados positivamente de pelo menos cerca de 20, 30, 40, 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ou cerca de 100 % dos resíduos de aminoácidos são resíduos de aminoácido positivamente carregados, em particular, resíduos lisina e/ou arginina. Os resíduos de aminoácido sendo resíduos de aminoácidos não-positivamente carregados podem ser resíduos de aminoácidos neutramente carregados e/ou resíduos de aminoácido negativamente carregados e/ou resíduos de aminoácidos hidrófobos. De preferência, os resíduos de aminoácidos sendo resíduos de aminoácidos não-positivamente carregados são resíduos de aminoácidos carregados neutramente, em particular, serina e/ou glicina.
[052] O termo “peptídio antimicrobiano” (AMP), como usado aqui, refere-se preferivelmente a qualquer peptídio de ocorrência natural que tenha atividade microbicida e/ou microbistática em, por exemplo, bactérias, vírus, fungos, leveduras, micoplasma e protozoários. Assim, o termo “peptídio antimicrobiano”, como usado aqui, refere-se em particular a qualquer peptídio com propriedades antibacterianas, antifúngicas, antimicóticas, antiparasíticas, antiprotozoários, antivirais, antiinfecciosas, antiinfecciosas e/ou germicidas, algicidas, amebicidas, microbicidas, bactericidas, fundicias, parasiticidas, protozoacidas, protozoicidas. Preferem-se peptídios antibacterianos. O peptídio antimicrobiano pode ser um membro da superfamília RNAse A, uma defensina, catelicidina, granulisina, histatina, psoriasina, demmicidina ou hepcidina. O peptídio antimicrobiano pode ocorrer naturalmente em insertos, peixes, plantas, aracnídeos, vertebrados ou mamíferos. De preferência, o peptídio antimicrobiano pode ocorrer naturalmente em insertos, peixes, plantas, aracnídeos, vertebrados ou mamíferos. De preferência, o peptídio antimicrobiano pode ocorrer naturalmente em rábano, bicho- da-seda, licosa, rã, de preferência em Xenopus laevis, rãs Rana, mais preferencialmente em Rana catesbeiana, sapo, de preferência o sapo asiático Bufo gargarizans, moscas, de preferência em Drosophila, mais preferencialmente em Drosophila melanogaster, em Aedes aegypti, em abelha de mel, abelhão, de preferência em Bombus pascuorum, mosca da carne, de preferêencia em Sarcophaga peregrine, escorpião, límulo, peixe-gato, de preferência em Parasilurus asotus, vacas, porcos, ovelhas, suínos, bovinos, macacos e humanos. Conforme usado aqui, um “peptídio mantimicrobiano” (AMP) pode, em particular, ser um peptídio que não é um peptídio catiônico, um peptídio policatiônico, um peptídio anfifático, um peptídio sushi, defensinas, e um peptídio hidrófobo, mas, contudo, apresenta atividade antimicrobiana.
[053] O termo “peptídio sushi” como usado aqui, refere-se a proteínas de controle de complemento (CCP) contendo repetições de consenso curtas. O módulo sushi dos peptídios sushi funciona como um domínio de interação proteína- proteína em muitas proteínas diferentes. Os peptídios contendo um domínio Sushi demonstraram ter atividades antimicrobianas. De preferência, os peptídios sushi são peptídios de ocorrência natural.
[054] O termo “peptídio anfifático”, como usado aqui, refere-se a peptídios sintéticos contendo tanto grupos funcionais hidrófilos quanto hidrófobos. De preferência, o termo “peptídio anfifático”, como usado aqui, refere-se a um peptídio contendo uma disposição definida de grupos hidrófilos e hidrófobos, por exemplo, peptídios anfifáticos podem ser, por exemplo, alfa helicoidais, contendo cadeias laterais predominantemente apolares ao longo de um lado da hélice e resíduos polares ao longo do resto de sua superfície.
[055] O termo “grupo hidrófobo”, como usado aqui, refere- se preferivelmente a grupos químicos, como cadeias laterais de aminoácidos que são substancialmente insolúveis em água, mas solúveis em uma fase óleo, com a solubilidade na fase óleo sendo maior do que na fase água ou aquosa. Na água, os resíduos de aminoácido contendo uma cadeia lateral hidrófoba interagem uns com os outros para gerar um ambiente não-aquoso. Exemplos de resíduos de aminoácido com cadeias laterais hidrófobas incluem resíduos valina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, triptofano, cisteína, alanina, tirosina e prolina.
[056] O termo “peptídio hidrófobo”, conforme usado aqui, refere-se a um peptídio hidrófobo, que é preferivelmente composto majoritariamente de resíduos de aminoácidos com grupos hidrófobos. Tal peptídio é, de preferência, composto majoritoriamente de resíduos de aminoácidos hidrófobos, isto é, pelo menos aproximadamente 20, 30, 40, 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ou pelo menos aproximadamente 100 % dos resíduos de aminoácidos são resíduos de aminoácidos hidrófobos. Os resíduos de aminoácidos não sendo hidrófobos são preferivelmente neutros e preferivelmente não hidrófilos.
[057] Como usado aqui, o termo “marca” refere-se a uma sequência de aminoácidos, que geralmente na técnica é fusionada a ou incluída em outra sequência de aminoácidos para a) melhorar a expressão da sequência de aminoácidos em geral ou polipeptídio, b) facilitar a purificação da sequência de aminoácidos em geral ou polipeptídio, c) facilitar a imobilização da sequência de aminoácidos em geral ou polipeptídio, e/ou d) facilitar a detecção da sequência de aminoácidos em geral ou polipeptídio. Exemplos de marcas incluem marcas His, tais como marcas His5, marcas His6, marcas His7, marcas His8, marcas His9, marcas His10, marcas His11, marcas His12, marcas His16 e marcas His20, marcas Strep, marcas Avi, marcas Myc, marcas GST, marcas JS, marcas cisteína, marcas FLAG, marcas HÁ, tioredoxina, ou proteínas de ligação à maltose (MBP), CAT, GFP, YFP, etc. Os indivíduos versados na técnica saberão um vasto número de marcas adequadas para diferentes aplicações técnicas. A marca pode, por exemplo, tornar tal polipeptídio marcado adequado, por exemplo, para ligação a anticorpos em diferentes formatos de ensaio ELISA ou em outras aplicações técnicas.
[058] O termo “compreendendo”, conforme utilizado aqui, não deverá ser interpretado como sendo limitado ao significado “consistindo em” (isto é, excluindo a presença de outra matéria adicional). Em vez disso, “compreendendo” implica que uma matéria opcionalmente adicional pode estar presente. O termo “compreendendo” abrange, como modalidades particularmente previstas que se enquadram dentro do seu escopo, “consistindo de” (isto é, excluindo a presença de outra matéria adicional) e “compreendendo mas não consistindo de” (isto é, exigindo a presença de outra matéria adicional), com o primeiro sendo mais preferido.
[059] O polipeptídio de acordo com a presente invenção pode apresentar, na sequência de aminoácidos apresentando pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência da SEQ ID NO: 1, pelo menos um (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 ou até mesmo todos os 17) dos seguintes: X14 não é C; X23 não é C; X50 não é C; X82 é I; X122 é M; X149 é P; X154 é T, X160 é T; X167 é L; X179 é F; X180 é E; X186 é Y; X206 é N ou V, X212 é N; X224 é Q; X230 é Y e/ou X232 é T. Entende-se que o número indicando a posição do respectivo resíduo de aminoácido indica a posição relativa na sequência correspondendo à SEQ ID NO: 1, e não à sequência de aminoácidos geral do polipeptídio de acordo com a presente invenção, que pode ser maior.
[060] O polipeptídio inventivo apresenta a dita identidade de sequência de pelo menos 90%. O polipeptídio inventivo pode, dessa forma, por exemplo, apresentar um nível maior de identidade de sequência, por exemplo, pode apresentar identidade de sequência de pelo menos aproximadamente 95%, pelo menos aproximadamente 96%, pelo menos aproximadamente 97%, pelo menos aproximadamente 98%, pelo menos aproximadamente 98,5%, pelo menos aproximadamente 99% (por exemplo, desvio de menos de 3 aminoácidos), pelo menos aproximadamente 99.3% (por exemplo, desvio de menos de 2 aminoácidos), pelo menos aproximadamente 99.5%, pelo menos aproximadamente 99.6% ou ate mesmo 100% com a sequência da SEQ ID NO: 1.
[061] Um polipeptídio inventivo compreendendo uma sequência compartilhando um dado nível de identidade de sequência com a sequência da SEQ ID NO: 1 (ou sequências mais específicas da mesma, vide abaixo) pode, por exemplo, se desviar da sequência de referência pela adição, substituição, inserção ou deleção de um ou mais resíduos de aminoácidos e todas as possíveis combinações dos mesmos. Apenas para fins de clareza, observa-se que tais combinações referem-se a posições distintas na sequência. Uma “deleção” seguida pela “adição” ou “adição” seguida pela “deleção”, de um ou mais aminoácidos, na mesma posição relativa, não é uma combinação de uma “adição” e “deleção” (ou vice versa), mas se enquadra no termo “substituição”. De preferência, os desvios na sequência em relação à sequência da SEQ ID NO: 1 (uma ou mais sequências específicas da mesma, vide abaixo), serão de natureza conservadora, por exemplo, substituições conservadoras. Ainda mais preferivelmente, o desvio na sequência limita-se às posições na SEQ ID NO: 1 (ou sequências mais específicas da mesma, vide abaixo), que foram identificadas como não sendo críticas para a atividade enzimática, isto é, X1, X14, X23, X50, X82, X122, X149; X160, X167, X179, X180, X186; X206; X212; X224; X230 e/ou X232.
[062] De preferência, o polipeptídio de acordo com a presente invenção apresenta, na sequência de aminoácidos apresentando identidade de sequência de pelo menos aproximadamente 90% com a sequência da SEQ ID NO: 1, um resíduo de ácido glutâmico na posição 115. Como ilustrado na publicação Briers et al. (Molecular Microbiology (2007) 65(5), 1334-1344), a mutação E115A levou a uma perda na atividade de aproximadamente 70% da enzima. Assim, embora um polipeptídio inventivo compreendendo a referida mutação não seja a perda de um polipeptídio de função e ainda possa servir para várias finalidades técnicas, ele é certamente preferido se tal mutação não estiver presente no segmento de sequência correspondendo à SEQ ID NO: 1 dentro do polipeptídio inventivo.
[063] Em uma modalidade particular preferida de acordo com a presente invenção, o polipeptídio da presente invenção compreende a sequência da SEQ ID NO: 1.
[064] Os inventores da presente invenção descobriram que três resíduos cisteína na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 5 (sequência da endolisina KZ144) não são essenciais para a atividade enzimática. Assim, na sequência correspondendo à SEQ ID NO: 1 (sequência consenso da presente invenção) do polipeptídio inventivo (ou compartilhando pelo menos 90% de identidade de sequência como mesmo), em algumas modalidades, X14 não é C, X23 não é C, ou X50 não é C. Combinações são possíveis, por exemplo, X14 e X23 não são C, X14 e X50 não são C, ou X23 e X50 não são C. De modo similar, também é possível que X14 , X23 e X50 não são C. Em princípio, os referidos resíduos de aminoácidos podem ser deletados ou substituídos por qualquer outro aminoácido. Exemplos para tais outros aminoácidos incluem S, R e N. Assim, X14 pode, por exemplo, ser S, N ou R; mais preferivelmente, S ou R; mais preferivelmente R; X23 pode, por exemplo, ser S, N, ou R, mais preferivelmente S; e X50 pode, por exemplo, ser S, N, ou R, mais preferivelmente S ou N; mais preferivelmente N. X14, X23 e X50 podem, evidentemente, apresentar diferentes substituições de aminoácidos, por exemplo, X14 pode ser R enquanto que X23 e X50 são S; ou X14 e X23 são S, enquanto que X50 é N; X14 pode ser R enquanto que X23 é S e X50 é N etc. Qualquer outra combinação concebível também é contemplada pela presente invenção. Substituições de aminoácidos conservadoras são preferidas. Particularmente preferido é um substituinte de um resíduo serina para o resíduo cisteína. Assim, nos exemplos particularmente preferidos da presente invenção, X14 é S, X23 é S ou X50 é S. Evidentemente, também é possível que X14 e X23 sejam S, ou que X14 e X50 sejam S, ou que X23 e X50 sejam S. Todos dentre X14, X23 e X50 também podem ser S. A ausência de um ou mais ou até mesmo de todos esses resíduos cisteína tem a vantagem de que o risco de agregação do polipeptídio de acordo com a presente invenção, por exemplo, pela formação indesejada de pontes dissulfeto, é reduzido, e, portanto, é uma modalidade preferida da presente invenção.
[065] À parte da dispensabilidade dos resíduos cisteína mencionados anteriormente, os inventores da presente invenção também elucidaram que vários outros resíduos na sequência da SEQ ID NO: 5 também não são essenciais, e, além do mais, podem ser substituídos por outros resíduos, desse modo aumentando, por exemplo, a estabilidade de temperatura do polipeptídio inventivo. Exemplos para tais substituições incluem X82I, X122M, X149P; X154T, X160T, X167L, X179F, X180E, X186Y, X206V, X206N, X212N, X230Y e X232T. Essas substituições podem estar presentes separadamente ou em qualquer combinação. Uma combinação típica é a combinação de X122M e X160T. Outros exemplos de combinações incluem, sem a estes se limitar, X82I, X206V mais X232T; X82I, X122M, X160T, X206V, mais X232T; X82I, X122M, X160T, X206N, mais X232T; X82I, X122M, X206V, mais X232T; X82I, X122M, X149P, X160T, X206V, mais X232T; X82I, X122M, X160T, X180E, X206V, mais X232T; X82I, X122M, X160T, X186Y, X206V, mais X232T; X82I, X122M, X160T, X206V, X230Y, mais X232T; X82I, X122M, X149P, X206V, mais X232T; X82I, X122M, X149P, X160T, X206V, mais X232T; X82I, X122M, X149P, X206V, mais X232T; X82I, X122M, X149P, X167L, X206V, mais X232T; X82I, X122M, X149P, X179F, X206V, mais X232T; X82I, X122M, X149P, X206V, X212N mais X232T; X82I, X122M, X149P, X206V, X224Q mais X232T; X82I, X122M, X149P, X154T, X206V, mais X232T etc.. Evidentemente, este segundo tipo de modificação de aminoácido pode ser combinado com as substituições por cisteína mencionadas acima em qualquer tipo de combinação concebível. Exemplos de tais combinações incluem, sem se restringir a isto, X14S, X50S, X 122M e X160T; X14S, X50S, X82I , X122M, X16 0T, X2 06V, e X232T; X14S, X50S, X82I, X122M, X160T, X206N, e X232T; X14S , X50S, X82I, X122M, X206V, e X232T; X14S, X50S, X82I, X122M, X149P, X160T, X206V, e X232T; X14S, X50S, X82I, X122M, X160T, X180E, X206V, e X232T; X14S, X50S, X82I, X122M, X160T, X186Y, X206V, e X232T; X14S, X50S, X82I, X122M, X160T, X206V, X230Y, e X232T; X14R, X50S, X82I, X122M, X160T, X206V, e X232T; X14S, X50N, X82I, X122M, X160T, X206V, e X232T; X14R, X50S, X82I, X122M, X149P, X206V, e X232T; X14R, X50S, X82I, X122M, X149P, X160T, X206V, e X232T; X14R, X50N, X82I, X122M, X149P, X206V, e X232T; X14R, X50N, X82I, X122M, X149P , X167L, X206V, e X232T; X14R, X50N, X82I, X122M, X149P , X179F, X206V, e X232T; X14R, X50N, X82I, X122M, X149P , X206V, X212N, e X232T; X14R, X50N, X82I, X122M, X149P, X206V, X224Q e X232T; X14R, X50N, X82I, X122M, X149P, X154T, X206V, e X232T; etc.
[066] Na SEQ ID NO: 1 (sequência consenso da presente invenção), o primeiro resíduo de aminoácido é indicado ou como estando ausente ou como qualquer aminoácido, em particular M. Os resultados dos inventores, e do trabalho anterior (vide a WO 2010/149792) mostram que a metionina N- terminal de KZ144 é dispensável. Assim, em algumas modalidades da presente invenção, a posição de X1 na sequência correspondendo à SEQ ID NO: 1 no polipeptídio inventivo não é M. Se o polipeptídio da presente invenção apresentar, por exemplo, N-terminalmente da sequência correspondendo à SEQ ID NO: 1, elementos de sequência adicionais, ele pode, por exemplo, para a finalidade de expressão efetiva em uma célula hospedeira, ser útil, se a metionina na posição 1 da SEQ ID NO: 1 for eliminada ou substituída por outro aminoácido de modo a evitar um códon de início na sequência de ácido nucléico correspondendo, potencialmente levando à expressão paralela de um polipeptídio desprovido dos elementos de sequência adicionais mais N-terminalmente. Por outro lado, se não houver nenhum elemento de sequência N-terminal adicional no polipeptídio inventivo, X1 é, sem dúvidas, preferivelmente metionina (por exemplo, para fins de expressão). Para a atividade enzimática, entretanto, X1 nunca é necessário.
[067] As sequências que se encaixam na definição da SEQ ID NO: 1, que foram particularmente testadas pelos inventores, incluem, por exemplo, as SEQ ID NOs: 6-27 (e as sequências correspondentes sem metionina N-terminal, SEQ ID NOs: 28-49).
[068] Entende-se que tudo que foi apresentado até agora em termos da sequência genérica SEQ ID NO: 1 aplica-se de maneira similar também a sequências mais específicas. Assim, e somente para fins de clareza, observa-se que um polipeptídio de acordo com a presente invenção, compreendendo uma sequência apresentando pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência genérica da SEQ ID NO: 1 conforme exposto acima, pode, nas modalidades preferidas, certamente apresentar de maneira análoga pelo menos 90% de identidade de sequência com sequências mais específicas da SEQ ID NO: 1 descrita ou até mesmo particularmente reveladas aqui. Assim, nas modalidades preferidas da presente invenção, o polipeptídio da presente invenção pode, por exemplo, compreender uma sequência apresentando pelo menos 90% de identidade de sequência com uma sequência selecionada dentre qualquer uma das SEQ ID NOs: 6 a 49, em que o polipeptídio não compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, nem a da SEQ ID NO: 3, nem a da SEQ ID NO: 4.
[069] O polipeptídio de acordo com a presente invenção pode compreender, à parte da sequência de aminoácidos enzimática, por exemplo, a sequência apresentando pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência da SEQ ID NO: 1 (ou outras sequências que se encaixem nessa definição), segmentos de sequências de aminoácidos adicionais, por exemplo, como já revelado de forma similar na patente WO 2010/149792. O polipeptídio de acordo com a presente invenção pode, por exemplo, adicionalmente compreender pelo menos um segmento de sequência de aminoácido selecionado dentre o grupo que consiste de peptídio anfifático, peptídio catiônico, peptídio policatiônico, peptídio hidrófobo, ou peptídio antimicrobiano de ocorrência natural, tal como peptídio sushi e defensina. Tais segmentos de sequência de aminoácidos adicionais podem aperfeiçoar as propriedades antibacterianas do polipeptídio inventivo. Em algumas modalidades, o polipeptídio inventivo pode compreender pelo menos dois segmentos de sequência de aminoácido distintos selecionados dentre o grupo que consiste de peptídio anfifático, peptídio catiônico, peptídio policatiônico, peptídio hidrófobo, ou peptídio antimicrobiano de ocorrência natural, tal como peptídio sushi e defensina.
[070] Esses um ou mais segmentos de sequências de aminoácidos adicionais podem estar presentes N- terminalmente ou C-terminalmente da sequência apresentando pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência da SEQ ID NO: 1. Eles podem, por exemplo, estar localizados no terminal N ou C do polipeptídio inventivo. Exemplos preferidos de tais segmentos de sequência de aminoácidos adicionais (sem se limitar aos mesmos) incluem a sequência KRK e as SEQ ID NOs: 50-120, como apresentado em mais detalhes abaixo. O polipeptídio de acordo com a presente invenção pode compreender pelo menos um segmento de sequência de aminoácidos adicional selecionado a partir deste grupo. Para orientação adicional, em particular com respeito à natureza genérica e específica de possíveis segmentos de sequência de aminoácidos adicionais, consulte também, por exemplo, a WO 2010/023207, WO 2010/149792, WO 2010/149795 e a WO 2012/085259.
[071] Exemplos de segmentos de sequência de aminoácidos catiônicos e policatiônicos são listados na tabela a seguir: Tabela 1:
[072] Exemplos de sequências de aminoácidos antimicrobianas que podem ser usadas para realizar a presente invenção são listados na tabela a seguir. Tabela 2:
[073] O pelo menos um segmento de sequência de aminoácidos adicional pode ser um peptídio sushi que é descrito por Ding JL, Li P, Ho B Cell Mol Life Sci. 2008 Apr;65(7-8):1202-19. The Sushi peptides: structural characterization and mode of action against Gram-negative bacteria. Especialmente preferido é o peptídio sushi 1 de acordo com a SEQ ID NO: 115. Outros peptídios sushi preferidos são os peptídios sushi S1 e S3 e os múltiplos dos mesmos; FASEB J. 2000 Sep;14(12):1801-13.
[074] Peptídios hidrófobos preferidos são o Walmagh1 contendo a sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 116 e o peptídio hidrófobo contendo a sequência de aminoácidos Phe-Phe-Val-Ala-Pro (SEQ ID NO: 117).
[075] Os peptídeos anfifáticos preferidos são a hélice α4 da lisozima T4 de acordo com a SEQ ID NO: 118 e a Variante WLBU2 com a sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 119 e Walmagh 2 de acordo com a SEQ ID NO: 120.
[076] Como mencionado anteriormente, um polipeptídio de acordo com a presente invenção pode compreender pelo menos um segmento de sequência de aminoácidos adicional selecionado dentre o grupo consistindo de: KRK e SEQ ID NOs: 50-120. Exemplos correspondentes incluem, por exemplo, polipeptídios compreendendo uma sequência selecionada dentre o grupo que consiste das SEQ ID NOs: 121-127 (e as sequencias correspondentes sem metionina N-terminal, SEQ ID NOs: 128-134.).
[077] Um polipeptídio de acordo com a presente invenção compreende uma sequência de aminoácidos apresentando identidade de sequência de pelo menos aproximadamente 90% com a sequência da SEQ ID NO: 1, em que o polipeptídio não compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, nem da SEQ ID NO: 3, nem da SEQ ID NO: 4. Assim, um polipeptídio da presente invenção também pode compreender uma sequência apresentando pelo menos 91,5 % de identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos selecionada dentre qualquer uma das SEQ ID NOs: 121 - 134, em que o polipeptídio não compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, nem a da SEQ ID NO: 3, nem a da SEQ ID NO: 4.
[078] Dessa forma, tal polipeptídio inventivo pode compreender, por exemplo, uma sequência apresentando um nível maior de identidade de sequência do que 91,5% com uma sequência de aminoácidos selecionada dentre quaisquer das SEQ ID NOs: 121 - 134, por exemplo, pode apresentar pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 98,5%, pelo menos cerca de 98,75%, pelo menos cerca de 99% (por exemplo, desvio de menos de 3 aminoácidos) , pelo menos cerca de 99,5% (por exemplo, desvio de menos de 2 aminoácidos), pelo menos cerca de 99,6% ou até mesmo 100% de identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos selecionada dentre qualquer uma das SEQ ID NOs: 121 - 134.
[079] Além disso, e independente de se um ou mais segmentos de sequência de aminoácidos adicionais, conforme apresentado acima, estão ou não presentes no polipeptídio inventivo, o polipeptídio pode adicionalmente compreender uma ou mais sequências de marcas. Tal sequência de marcas pode estar presente N-terminalmente ou C-terminalmente da sequência apresentando pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência da SEQ ID NO: 1. Eles podem, por exemplo, estar localizados no terminal N ou C do polipeptídio inventivo. Em uma modalidade preferida, a uma ou mais sequências de marcas estão localizadas C- terminalmente da sequência de aminoácidos apresentando identidade de sequência de pelo menos 90% com a sequência da SEQ ID NO: 1.
[080] Uma ou mais sequências de marcas podem, pode exemplo, ser ligadas à sequência de aminoácidos apresentando identidade de sequência de pelo menos 90% com a sequência da SEQ ID NO: 1 diretamente ou por meio de um conector curto de 1 a 10 resíduos de aminoácidos, de preferência 1 a 5 resíduos de aminoácidos, ainda mais preferivelmente 1 a 2 aminoácidos. As sequências conectoras são, de preferência, sequências flexíveis, compreendendo um ou mais resíduos glicina. Muitos exemplos de marcas são conhecidos na técnica, alguns dos quais já foram mencionados acima. No contexto da presente invenção, uma sequência de marcas particularmente preferida é uma marca His, de preferência uma marca His de acordo com a SEQ ID NO: 135.
[081] O comprimento do polipeptídio de acordo com a presente invenção, em princípio, não é limitado, mas de preferência, o comprimento não será excessivamente grande. De preferência, um polipeptídio de acordo com a presente invenção tem um comprimento geral que não excede cerca de 320 aminoácidos, de preferência não excedendo cerca de 310 aminoácidos.
[082] Exemplos específicos de polipeptídios de acordo com a presente invenção podem ser selecionados dentre o grupo que consiste das SEQ ID NOs: 136-142 (e as sequencias correspondentes sem metionina N-terminal, SEQ ID NOs: 143149).
[083] Um polipeptídio de acordo com a presente invenção compreende uma sequência de aminoácidos apresentando identidade de sequência de pelo menos aproximadamente 90% com a sequência da SEQ ID NO: 1, em que o polipeptídio não compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, nem da SEQ ID NO: 3, nem da SEQ ID NO: 4. Assim, um polipeptídio da presente invenção também pode compreender uma sequência apresentando pelo menos 91,5 % de identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos selecionada dentre qualquer uma das SEQ ID NOs: 136 - 149, em que o polipeptídio não compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, nem a da SEQ ID NO: 3, nem a da SEQ ID NO: 4.
[084] Dessa forma, tal polipeptídio inventivo pode compreender, por exemplo, uma sequência apresentando um nível maior de identidade de sequência do que 91,5% com uma sequência de aminoácidos selecionada dentre quaisquer das SEQ ID NOs: 136 - 149, por exemplo, pode apresentar pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 98,5%, pelo menos cerca de 99%, pelo menos cerca de 99,25% (por exemplo, desvio de menos de 3 aminoácidos), pelo menos cerca de 99,5% (por exemplo, desvio de menos de 2 aminoácidos), pelo menos cerca de 99,6% ou até mesmo 100% de identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos selecionada dentre qualquer uma das SEQ ID NOs: 136 - 149. Desvios a partir das SEQ ID NOs: 136 - 149 podem, em particular, ocorrer nas duas sequências ligando os componentes peptídio SMAP29, endolisina KZ144 modificada e marca His.
[085] Um polipeptídio de acordo com a presente invenção é preferivelmente caracterizado pela capacidade de degradar o peptidoglicano de bactérias Gram-negativas, em particular de bactérias Pseudomonas e/ou Campylobacter. Em particular, o polipeptídio de acordo com a presente invenção é preferivelmente capaz de degradar o peptidoglicano de Pseudomonas aeroginosa, em particular Pseudomonas aeroginosa PAO1, Campylobacter jejuni e/ou Campylobacter coli.
[086] A atividade de degradação do peptidoglicano em bactérias gram-negativas pode ser medida por ensaios bem conhecidos no estado da técnica, por exemplo, por ensaios muralíticos nos quais a membrana externa de bactérias gram- negativas é permeabilizada ou removida (por exemplo, com clorofórmio) para permitir o acesso da enzima putativa à camada de peptidoglicano. Se a enzima estiver ativa, a degradação do peptidoglicano levará a uma queda da turvação, que pode ser medida fotometricamente (vide, por exemplo, Briers et al., J. Biochem. Biophys Methods 70: 531-533, (2007).
[087] Em um aspecto adicional, a presente invenção refere-se a um ácido nucléico codificando um polipeptídio de acordo com a presente invenção. Uma pessoa versada na técnica, tendo em mente a degeneração do código genético, estará ciente de meios para gerar tal ácido nucléico.
[088] Em um aspecto adicional, a presente invenção refere-se a um vetor, tal como um vetor de expressão ou clonagem, que compreende um ácido nucléico de acordo com a presente invenção.
[089] Em um aspecto adicional, a presente invenção refere-se a uma célula hospedeira compreendendo um polipeptídio de acordo com a presente invenção, um ácido nucléico de acordo com a presente invenção e/ou um vetor de acordo com a presente invenção.
[090] Em um aspecto adicional, a presente invenção refere-se a uma composição compreendendo um polipeptídio de acordo com a presente invenção, um ácido nucléico de acordo com a presente invenção, um vetor de acordo com a presente invenção e/ou uma célula hospedeira de acordo com a presente invenção. De preferência, a referida composição é uma composição farmacêutica compreendendo um diluente, excipiente ou veículo farmacêutico aceitável.
[091] Como estabelecido anteriormente, um polipeptídio de acordo com a presente invenção compreende uma sequência de aminoácidos apresentando identidade de sequência de pelo menos aproximadamente 90% com a sequência da SEQ ID NO: 1, em que o polipeptídio não compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, nem da SEQ ID NO: 3, nem da SEQ ID NO: 4. Entretanto, em um aspecto adicional, e ligeiramente distinto dos polipeptídios mencionados anteriormente da invenção, a presente invenção também se refere adicionalmente a um polipeptídio compreendendo uma sequência de aminoácidos apresentando identidade de sequência de pelo menos aproximadamente 90% com a sequência da SEQ ID NO: 1, em que o polipeptídio não compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, nem da SEQ ID NO: 152, nem da SEQ ID NO: 4. Opcionalmente, o referido polipeptídio deste aspecto adicional também não compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3. Todas as modalidades e combinações reveladas acima, nos exemplos ou nas reivindicações para o polipeptídio da invenção, e os respectivos ácidos nucléicos, vetores, células hospedeiras e composições, também são especificamente contemplados para este aspecto adicional.
[092] Exemplos
[093] No que se segue, exemplos específicos ilustrando várias modalidades e aspectos da invenção são apresentados. Entretanto, a presente invenção não deve ter seu âmbito limitado às reivindicações específicas descritas aqui. De fato, várias modificações da invenção, além das descritas aqui, se tornarão prontamente aparentes aos versados na técnica à luz da descrição precedente, das figuras concomitantes e dos exemplos adiante. Todas tais modificações se enquadram no âmbito das reivindicações apensas.
[094] Exemplo 1: Identificação de mutações estabilizando a endolisina KZ144
[095] Para a identificação de sítios de modificação vantajosos na endolisina KZ144 (SEQ ID NO: 5), os inventores utilizaram, em uma primeira etapa, a desestabilização direcionada da proteína-alvo. Para este fim, uma KZ144 truncada N-terminalmente foi gerada (SEQ ID NO: 150), na qual mutações de sequência foram introduzidas por meio de mutagênese aleatória (PCR propensa a erros) seguido de fusão e seleção subsequentes com um ensaio de cloramfenicol (ensaio CAT).
[096] A temperatura de fusão de proteína dos candidatos promissores foi determinada por dicroísmo circular (CD). As alterações da elipticidade para as proteínas foram registradas a 220nm em função da temperatura usando um espectrômetro Jasco J-815 CD e ajustadas para um modelo de desdobramento sigmóide simples usando o software de análise JASCO. As temperaturas de fusão de proteína (Tmelt) foram determinadas como o ponto central da transição de desdobramento. Os espectros foram registrados a concentrações de proteína de 5,0-5,8μM com uma taxa de aquecimento de 1°C/min e um tempo de incubação de 3s em volume de 410μl em uma cubeta de quartzo Hellma de caminho de luz de 1mm. As medições foram realizadas em tampão de NaPh 50mM, 300mM de NaCl ao pH de 7.4, 7.0, 6.2 e 5.7.
[097] Alguns dos candidatos mais promissores identificados são ilustrados na tabela a seguir: Tabela 3
[098] Queira observar que a posição indicada refere-se à posição na sequência da sequência KZ144, SEQ ID NO: 5, e não à posição na SEQ ID NO: 150.
[099] As mutações estabilizadoras assim identificadas podem e foram subsequentemente introduzidas em outras sequências, tais como sequências de comprimento inteiro, aumentando a estabilidade nelas também.
[100] Em uma etapa adicional, utilizou-se serina em algumas construções para substituição dos resíduos cisteína C14, C23 e/ou C50 (posição indicada com relação à SEQ ID NO: 5; substituições conservadoras). Outros substituintes nas referidas posições testadas foram N e R.
[101] Em uma sessão adicional de experimentos, várias combinações das mutações foram testadas no contexto da endolisina de comprimento inteiro KZ144 (SEQ ID NO: 5): Tabela 4
[102] Δ TM vs. SEQ ID NO: 5
[103] Exemplo 2: Temperatura de fusão de alguns polipeptídios de acordo coma presente invenção e MIC para linhagens bacterianas selecionadas
[104] Para a construção dos polipeptídios de acordo com a SEQ ID NO: 151 (sem mutações) e as SEQ ID NOs: 136-142, a enzima lítica (gp144) do fago KZ de Pseudomonas aeruginosa foi utilizada. Como um parceiro de fusão peptídico, escolheu-se SMAP-29. SMAP-29 foi encontrado em leucócitos de ovelha e consiste de 29 aminoácidos (RGLRRLGRKIAHGVKKYGPTVLRIIRIAG; peso molecular: 3.3 kDa, SEQ ID NO: 76). Ele é composto de dois sítios de ligação a LPS que são conectados por uma dobradiça (hinge) central.
[105] As moléculas de ácido nucléico codificando o respectivo peptídio e endolisina foram construídas com um sítio de restrição NdeI (5'-CAT ATG-3') na extremidade 5' da molécula de ácido nucléico e um sítio de restrição XhoI (5'-CTC GAG-3') na extremidade 3' da molécula de ácido nucléico. O peptídio e a endolisina são conectados por meio de um BamHI (5'-GGA TCC-3').
[106] As proteínas de fusão foram construídas pela ligação de pelo menos duas sequências de ácido nucléico usando técnicas de clonagem convencionais, como descrito, por exemplo, por Sambrook et al. 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Portanto, a molécula de ácido nucléico codificando o segmento de peptídio foi clivada em um digesto com as respectivas enzimas de restrição NdeI e BamHI. Subsequentemente, os ácidos nucléicos clivados codificando o segmento de peptídio foram ligados no pET21 pelo vetor de expressão (Noagen, Darmstadt, Alemanha), que também foi clivado em um digesto com as respectivas enzimas de restrição NdeI e BamHI anteriormente. Em seguida, a molécula de ácido nucléico codificando a endolisina foi clivada em um digesto com a enzima de restrição BamHI e XhoI, de modo que a endolisina pudesse ser ligada no vetor de expressão pET21b (Novagen, Darmstadt, Alemanha), que também foi clivado em um digesto com as respectivas enzimas de restrição BamHI e XhoI anteriormente.
[107] A sequência das fusões peptídio-endolisina foi controlada por seqüenciamento de DNA e os clones corretos foram transformados em BL21(DE3)pLysS de E.coli (Novagen, Darmstadt, Alemanha) para expressão protéica.
[108] A expressão recombinante das proteínas de fusão foi feita em células BL21(DE3)pLysS de E. coli (Novagen, Darmstadt, Alemanha). As células foram cultivadas até que uma densidade óptica de OD600nm = 0,5-0,8 fosse alcançada. Então, a expressão da proteína de fusão foi induzida com 0,5 mM de IPTG (isopropiltiogalactosíeo) e a expressão foi realizada a 37°C por 4 h.
[109] As células foram coletadas por centrifugação por 20 min a 6000g e rompidas por sonicação em gelo. Frações solúveis e insolúveis do extrato bruto de E.coli foram separadas por centrifugação (Sorvall, SS34, 30 min, 15 000 rpm). Todas as proteínas foram purificadas por cromatografia de afinidade por Ni2+ (Ãkta FPLC, GE Healthcare) usando a marca His6 C-terminal, codificada pelo vetor pET21b. As amostras foram microfiltradas (0,2 μm) antes de cada tapa cromatográfica.
[110] A cromatografia de afinidade por Ni2+ é realizada em 4 etapas subsequentes, todas à temperatura ambiente: 1. Equilibração da coluna de 5 mL Histrap FF (GE Healthcare) com até 10 volumes de coluna de Tampão de Lavagem (20mM imidazol, 1M NaCl e 20mM HEPES ao pH de 7.4) a uma vazão de 3 a 5 mL/min. 2. Carregamento do lisado total com a proteína-alo desejada na coluna de 5 mL Histrap HP a uma vazão de 3 a 5 mL/min. 3. Lavagem da coluna com até 10 volumes de coluna do Tampão de Lavagem para remover a proteína não- ligada. 4. Eluição da proteína-alvo ligada a partir da coluna com um gradiente linear crescente de 15 volumes de coluna do Tampão de Eluição (500mM imidazol, 500mM NaCl e 20mM HEPES ao pH de 7.4) até 100% a uma vazão de 3 a 5 mL/min.
[111] A Cromatografia de Interação Hidrofóbica (HIC) é realizada em 5 etapas subsequentes, todas à temperatura ambiente: 1. Equilibração da coluna de 5 mL HiScreen Phenyl HP (GE Healthcare) com até 5 volumes de coluna de Tampão de Lavagem (850mM sulfato de amônio, 500 mM NaCl e 20mM HEPES ao pH de 7.4) a uma vazão de 1 a 2 mL/min. 2. Preparação da amostra (5mg por volume de coluna de 1 mL do grupo de proteínas da etapa de afinidade por Ni2+) começa definindo-se primeiramente a concentração de proteínas em 0,5 mg/mL pela adição de uma quantidade predefinida de Tampão de Lavagem a partir da etapa de Afinidade por Ni2+. Seguido pelo ajuste da concentração de sulfato de amônio pela adição gradual de uma quantidade predefinida de solução estoque de sulfato de amônio (3.8M) até uma concentração final de aprox. 850 mM. 3. Carregamento da amostra preparada na coluna de 5 mL HiScreen Phenyl HP a uma vazão de 1 a 2 mL/min. 4. Lavagem da coluna com 5 volumes de coluna do Tampão de Lavagem para remover a proteína não- ligada. 5. Eluição da proteína-alvo a partir da coluna com uma etapa de Tampão de Eluição 40% (500mM NaCl e 20mM HEPES ao pH de 7.4) a uma vazão de 1 a 2 mL/min. A proteína-alvo é eluída em pico largo nesta etapa.
[112] O material eluído da etapa HIC é dialisado (membrana: celulose regenerada com MWCO: 6000-8000D) em tampão de conservação (500 mM NaCl e 20mM HEPES; pH7.4) à 4°C. O fator de diálise é de 160 - 250.
[113] As temperaturas de fusão caracterizando a estabilidade dos polipeptídios de acordo com as SEQ ID NOs: 136-142 a temperaturas elevadas foram determinadas por espectroscopia de dicroísmo circular (CD), como mencionado anteriormente.
[114] A atividade dos polipeptídios de acordo com as SEQ ID NOs: 136 a 142 em P. aeroginasa, C. jejuni e C. coli foi caracterizada pela determinação da concentração inibitória mínima (MIC) nas respectivas linhagens.
[115] Em analogia à determinaçao da “Concentração inibitória mínima (MIC)” para antibióticos, a MIC foi determinada como um teste de microdiluição. O teste na espécie Campylobacter é realizado inteiramente sob condições microaerofílicas e à 42°C.
[116] A configuração do experimento é a seguinte:
[117] A respectiva cultura à noite foi diluída por 1:10. Ps. aeruginosa foi incubado à 37°C a até OD600=0.6 (aprox. 109 células/mL). Campylobacter sp. foram incubados microaerofílicos a até OD600=0.08 (aprox. 2,5x108 células/mL). A cultura bacteriana foi diluída a uma concentração de 2x105 a 8x105 unidades formadoras de colônias por mL em caldo de Mueller-Hinton (não o caldo de Mueller-Hinton ajustado com cátions) e dividida na quantidade exigida de tubos.
[118] O polipeptídio de interesse foi adicionado em diferentes concentrações (determinadas como concentração final μg/ml no caldo de Mueller-Hinton) . No caso da Ps. aeruginosa, adicionou-se EDTA a uma concentração final de 2 mM. No caso da Campylobacter sp, não se utilizou EDTA.
[119] A mistura foi incubada durante a noite à 37°C para Ps. Aeruginosa e à 42°C para a espécie Campylobacter. O crescimento bacteriano foi determinado visivelmente pela turvação (em comparação com o controle negativo). A MIC foi definida como a concentração no tubo onde nenhum crescimento bacteriano foi observado. O controle positivo (sem o polipeptídio de interesse e/ou EDTA) e negativo (caldo de Mueller-Hinton sem bactérias) foram incluídos no experimento.
[120] Os resultados são resumidos na tabela a seguir: Tabela 5
[121] Temperaturas de fusão medidas por CD, tampão: 50mM NaPh, pH 7.45 300mM NaCl
[122] Novamente, deve ser observado que a posição indicada refere-se à posição na sequência da sequência KZ144, SEQ ID NO: 5, e não à posição na SEQ ID NO: indicada na tabela.
[123] Assim, as mutações introduzidas não somente aumentaram a temperatura de fusão dos polipeptídios das SEQ ID NOs: 136 -142 vs o polipeptídio da SEQ ID NO: 151, mas também não afetaram a atividade do polipeptídio, nem mesmo a mutação sétupla da SEQ ID NO: 141.
[124] Exemplo 3: Estabilidade de temperatura do polipeptídio de acordo com a SEQ ID NO: 139 e a SEQ ID NO: 141
[125] De modo a ilustrar que a temperatura de fusão aumentada de fato afeta a estabilidade de temperatura dos respectivos polipeptídios mutados, os inventores expuseram a título de exemplo os polipeptídios mutados da SEQ ID NO: 139 e da SEQ ID NO: 141 a temperaturas que excedem claramente a temperatura de fusão do polipeptídio de referência nativo, não-mutado (SEQ ID NO: 151).
[126] Para essa finalidade, ambos os polipeptídios foram submetidos ao aquecimento direto prolongado às temperaturas de 51°C e 52°C. Subsequentemente, um teste de atividade foi realizado na linhagem Pseudomonas aeruginosa como um sistema-modelo sob condições adaptadas.
[127] Os resultados são resumidos na tabela a seguir: Tabela 6
[128] Tampão protéico:50mM NaPh, pH 7.45 300mM NaCl
[129] Como anteriormente, a posição indicada refere-se à posição dentro da parte de sequência correspondendo à sequência KZ144, SEQ ID NO: 5, e não à posição dentro da sequência de comprimento total da SEQ ID NO: indicada na tabela.
Claims (6)
1. Polipeptídio, caracterizado pelo fato de que o polipeptídio compreende a sequência da SEQ ID NO: 1, em que a sequência da SEQ ID NO: 1 é uma sequência selecionada de um grupo consistindo em SEQ ID Nos: 6-22 ou SEQ ID nos 2844.
2. Polipeptídio, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o polipeptídio apresenta um resíduo de ácido glutâmico na posição 115 da SEQ ID NO: 1.
3. Polipeptídio, de acordo com uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o polipeptídio compreende uma sequência selecionada de um grupo consistindo em SEQ ID Nos: 6-22 ou SEQ ID Nos: 28-44.
4. Polipeptídio, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o polipeptídio compreende pelo menos um segmento de sequência de aminoácidos adicional contendo a sequência de aminoácidos de SMAP-29, SEQ ID NO: 76.
5. Polipeptídio, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o polipeptídio compreende uma sequência selecionada do grupo consistindo das SEQ ID NOs: 121-134 ou compreende uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 136-149.
6. Polipeptídio, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o polipeptídio degrada o peptidoglicano de bactérias Gram- negativas, em particular de bactérias Pseudomonas e/ou Campylobacter.
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