JP6691371B2

JP6691371B2 - 細胞支持複合体および細胞支持複合体の製造方法

Info

Publication number: JP6691371B2
Application number: JP2015220404A
Authority: JP
Inventors: 文彦北川
Original assignee: Nikkiso Co Ltd
Current assignee: Nikkiso Co Ltd
Priority date: 2015-11-10
Filing date: 2015-11-10
Publication date: 2020-04-28
Anticipated expiration: 2035-11-10
Also published as: JP2017086479A; WO2017082024A1

Description

本発明は、細胞支持複合体、特に、尿細管上皮細胞を用いた細胞支持複合体に関する。

近年、急性及び、慢性腎不全患者の腎機能を代替するバイオ人工腎臓として、中空糸膜等のポリマー膜と尿細管上皮細胞をハイブリッド化したモジュールの開発が進められている。特に、バイオ人工腎臓の製造や供給、使用を考慮すると、数週間以上にわたって腎機能を維持できるバイオ人工腎臓が必要になる。

しかし、腎臓から酵素処理により分離された尿細管上皮細胞は、生体内環境の消失やシャーレ上における培養による細胞の特徴の変化などから、本来の円柱状の細胞構造を維持できない。具体的には、尿細管上皮細胞をシャーレや人工膜上に播種すると、単層上皮構造を消失して細胞間に隙間が生じたり、細胞が重層化することが知られている。このような現象が生じることで、バイオ人工腎臓の血漿中の有用成分の再吸収機能が劣化する。

尿細管上皮細胞の重層化や接触阻害を回避する手法として、特許文献１に開示されたバイオ人工尿細管が知られている。これは、ＭＥＫ阻害剤の適用により、尿細管上皮細胞の接触阻害や重層化を抑制し、コンフルエント（細胞が容器いっぱいに隙間なく増殖した状態）な単層を、人工膜内面に持続的に形成させる技術である（特許文献１）。

国際公開第２００８／０４７７６０号

しかし、特許文献１の手法では、尿細管上皮細胞を人工膜上に播種後、コンフルエントに達するまで顕微鏡観察して確認した後に、ＭＥＫ阻害剤を作用させる必要がある。ところが特許文献１で使用される中空糸膜等の人工膜は、光を透過しない材質が多い。また、たとえ顕微鏡観察可能な中空糸膜を用いた場合でも、バイオ人工尿細管は中空糸膜を束ねてモジュール化した構造を有するため、顕微鏡観察で中空糸膜内腔に細胞がコンフルエントな状態にて接着していることを確認することは難しい。よって、特許文献１の手法では、人工膜上で尿細管上皮細胞がコンフルエントに達する時期が不明確のまま、最適ではないタイミングにてＭＥＫ阻害剤を投与することになる。そのため、尿細管上皮細胞間に隙間が生じている状態や、重層化している状態でＭＥＫ阻害剤を作用させる場合があった。その結果、性能のよいバイオ人工腎臓を得られないという問題点があった。

本発明はこうした課題に鑑みてなされたものであり、細胞が形成する単層上皮構造の安定性が向上した細胞支持複合体を提供することを目的とする。

上記課題を解決するために、本発明のある態様の細胞支持複合体は、人工材料で形成された基材と、マウス肉腫から抽出された細胞外マトリックスタンパク質の混合物であって、基材の少なくとも一部に接着する基底膜マトリックス混合物もしくはその断片と、基底膜マトリックス混合物を介して基材に付着した培養細胞と、を有する。

この態様によると、顕微鏡観察をすることなく、基材上に培養細胞のコンフルエントな単層上皮構造を形成させることができる。その結果、単層上皮構造の安定性が向上した細胞支持複合体を提供することができる。また、細胞支持複合体の単層上皮構造に孔が形成されることを防止することができる。

培養細胞は、実質的に重層化することなくコンフルエントな単層を形成していてもよい。なお、「実質的に」とは、重層化による物質の移動効率の低下が問題とならない程度に単層構造が維持されていることを意味し、必ずしも重層化が全く生じていないことを意味しない。

基底膜マトリックス混合物は、ラミニンと、コラーゲンＩＶと、エンタクチンとを主な構成分子とし、成長因子を含む基底膜マトリックス混合物、成長因子を含む基底膜マトリックス混合物と比べて成長因子が低減された基底膜マトリックス混合物、ラミニンと、コラーゲンＩＶと、エンタクチンとが、５６〜６１：３０〜３１：７〜８の質量比にて混合された基底膜マトリックス混合物、もしくはこれらの断片、のうち１つ以上から選択されてもよい。

基底膜マトリックス混合物は、基材に対する接着量が０μｇ／ｃｍ^２超３４．８５μｇ／ｃｍ^２以下の成長因子を含む基底膜マトリックス混合物、基材に対する接着量が１．３６μｇ／ｃｍ^２超３０．６μｇ／ｃｍ^２以下の成長因子が低減された基底膜マトリックス混合物もしくはこれらの断片のうちのいずれか１つから選択されてもよい。

本発明の別の態様は、細胞支持複合体の製造方法である。この細胞支持複合体の製造方法は、人工材料で形成された基材の少なくとも一部に、マウス肉腫から抽出された細胞外マトリックスタンパク質の混合物である基底膜マトリックス混合物もしくはその断片をコーティングするステップと、基底膜マトリックス混合物もしくはその断片に対して培養細胞を播種するステップと、培養細胞を培養することにより、培養細胞の単層構造を形成するステップと、を含む。

この細胞支持複合体の製造方法において、基底膜マトリックス混合物は、ラミニンと、コラーゲンＩＶと、エンタクチンとを主な構成分子とし、成長因子を含む基底膜マトリックス混合物、成長因子を含む基底膜マトリックス混合物と比べて成長因子が低減された基底膜マトリックス混合物、ラミニンと、コラーゲンＩＶと、エンタクチンとが、５６〜６１：３０〜３１：７〜８の質量比にて混合された基底膜マトリックス混合物、もしくはこれらの断片、のうち１つ以上から選択されてもよい。

基底膜マトリックス混合物をコーティングするステップは、成長因子を含む基底膜マトリックス混合物を０μｇ／ｍｌ超３０００μｇ／ｍｌ以下の濃度でコーティングして０μｇ／ｃｍ^２超３４．８５μｇ／ｃｍ^２以下の濃度の接着量とすること、成長因子が低減された基底膜マトリックス混合物を２０μｇ／ｍｌ超１０００μｇ／ｍｌ以下の濃度でコーティングして１．３６μｇ／ｃｍ^２超３０．６μｇ／ｃｍ^２以下の濃度の接着量とすることのいずれか１つを含んでもよい。

本発明によれば、細胞が形成する単層上皮構造の安定性が向上した細胞支持複合体を提供することができる。

従来技術の細胞支持複合体の構成を模式的に示す図である。図１（Ａ）は、一般的なコーティング剤を用いた従来の細胞支持複合体を示す図である。図１（Ｂ）は、コーティング剤を用いない従来の細胞支持複合体を示す図である。実施の形態に係る細胞支持複合体の構成を模式的に示す図である。図２（Ａ）は、基材が水透過性を有する実施の形態に係る細胞支持複合体の構成を示す図である。図２（Ｂ）は、基材が水透過性を有さない実施の形態に係る細胞支持複合体において、短時間培養した場合を示す図である。図２（Ｃ）は、基材が水透過性を有さない実施の形態に係る細胞支持複合体において、長時間培養した場合を示す図である。図３（Ａ）〜図３（Ｃ）は、実施の形態に係る細胞支持複合体を用いた装置の構造の一部を示す図である。図３（Ａ）は、基材としてＴｒａｎｓｗｅｌｌを用いた透析装置の構造の一部を示す図である。図３（Ｂ）は、基材として中空糸膜を用いた透析装置の構造の一部を示す図である。図３（Ｃ）は、基材としてシャーレ、ウェルプレート、微細流路、マイクロキャリア、または中空糸膜を用いた装置の構造の一部を示す図である。シャーレに対してコーティングする接着分子を変えた場合における細胞の増殖状態を経時的に示す図である。シャーレに対してコーティングするＭａｔｒｉｇｅｌの濃度を変えた場合における細胞の増殖状態を経時的に示す図である。図６（Ａ）〜図６（Ｄ）は、シャーレに対してコーティングする接着分子の濃度を変えた場合における細胞の増殖状態を経時的に示す図である。図６（Ａ）は、比較例としてＳｙｎｔｈｅｍａｘを用いた結果を示す図である。図６（Ｂ）は、比較例としてＰｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅを用いた結果を示す図である。図６（Ｃ）は、成長因子を含むＭａｔｒｉｇｅｌを用いた結果を示す図である。図６（Ｄ）は、成長因子が低減されたＭａｔｒｉｇｅｌを用いた結果を示す図である。基材としてＰＥＰＡ中空糸膜ミニモジュールを用いた場合におけるＭａｔｒｉｇｅｌを用いた実施例およびゼラチンを用いた比較例に係るＨＥ染色した細胞の顕微鏡画像である。

以下、図面を参照しながら、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。なお、説明において同一の要素には同一の符号を付し、重複する説明を適宜省略する。

図１は、従来技術の細胞支持複合体の構成を模式的に示す図である。図１（Ａ）は、一般的なコーティング剤を用いた従来の細胞支持複合体を示す図である。図１（Ｂ）は、コーティング剤を用いない従来の細胞支持複合体を示す図である。たとえば図１に示すように、尿細管上皮細胞および一般的なコーティング剤を用いた従来の細胞支持複合体では、尿細管上皮細胞が重層化したり、逆に細胞間に隙間が空いてしまうことがあった。その結果、重層化した領域では、細胞頂端膜側から細胞基底膜側へのトランスポーターを介した有用物質の移動が効率よく行われないという問題があった（矢印Ｐ）。一方、細胞間に空いた隙間からは、人工膜を介して、濃度依存的な物質移動が生じるという問題があった（矢印Ｑ）。この点、図１（Ｂ）に示すコーティング剤を用いない従来の細胞支持複合体でも同様の問題があった。

［実施の形態］
図２は、実施の形態に係る細胞支持複合体１０の構成を模式的に示す図である。図２（Ａ）は、基材が水透過性を有する実施の形態に係る細胞支持複合体の構成を示す図である。図２（Ｂ）は、基材が水透過性を有さない実施の形態に係る細胞支持複合体において、短時間培養した場合を示す図である。図２（Ｃ）は、基材が水透過性を有さない実施の形態に係る細胞支持複合体において、長時間培養した場合を示す図である。

図２（Ａ）に示すように、細胞支持複合体１０は、人工材料で形成された基材２０と、マウス肉腫から抽出された細胞外マトリックスタンパク質の混合物であって、基材の少なくとも一部に接着する基底膜マトリックス混合物もしくはその断片と、基底膜マトリックス混合物３０を介して基材２０に付着した培養細胞４０と、を有する。ここでいう「基材２０の少なくとも一部」とは、たとえば「平面または曲面を有する基材２０の少なくとも１つの面」をいう。基材２０が平板状構造の場合には、その少なくとも一方の面をいう。基材２０が円筒構造を有する場合には、その内側面または外側面の少なくとも一方をいう。培養細胞は、実質的に重層化することなくコンフルエントな単層を形成していることが好ましい。

（基材２０）
基材２０は、尿細管上皮細胞の培養に用いられるモジュールである。図２（Ａ）には、基材２０が水や各種イオンの透過性を有する場合を示す。この場合、基材２０は、糖や低分子タンパク質の透過性も有することが好ましい。そのため、基材２０には、孔が形成されている。基材２０の平均孔径は、５μｍ以下である。このような基材２０として、たとえば、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社：平均孔径０．４または３．０μｍ）を用いることができる。平均孔径が５μｍ以上の場合には、基材２０を細胞が通過してしまう場合があるため好ましくない。

基材２０の形状は特に限定されないが、たとえば中空糸膜、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ、平膜等の人工膜や、微細流路チップ、中実粒子、中空粒子であることが好ましい。これらの一例を、図３を用いて後述する。図２（Ｂ）および（Ｃ）に示すように、接着分子の種類や濃度を検討したり、培養細胞４０による薬物の取込量を評価する際には、基材は必ずしも水透過性を有していなくともよい。この場合には、基材２０として水透過性を有さないシャーレやウェルプレートなどの上に基底膜マトリックス混合物３０をコーティングし、その上で培養細胞４０を培養してもよい。短時間培養した場合には、培養細胞４０は有用物質５０を内部に取り込む（図２（Ｂ））。一方、長時間培養した場合には、取り込んだ有用物質５０を細胞基底膜側のトランスポーター４４から放出することなどによって、細胞層が浮き上がり、ドームを形成する現象が見られる（図２（Ｃ））。

基材２０の素材は特に限定されないが、たとえばポリスチレン、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリエステル（ＰＥＴ）、ポリエステル系ポリマーアロイ（ＰＥＰＡ）、エチレン−ビニルアルコール共重合体（ＥＶＡＬ）、ポリエチレン、ポリスルホン（ＰＳｆ）、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）であることが好ましい。

（基底膜マトリックス混合物３０）
基底膜マトリックス混合物３０は、基材の少なくとも一部にコーティングされる接着分子であって、マウス肉腫から抽出された細胞外マトリックスタンパク質の混合物である。基底膜マトリックス混合物３０は、ラミニンと、コラーゲンＩＶと、エンタクチンとを主な構成分子として含む。基底膜マトリックス混合物３０として、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標：Ｃｏｒｎｉｎｇ社）を好適に使用することができる。Ｍａｔｒｉｇｅｌとは、細胞外マトリックスタンパク質を豊富に含むＥｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍ（ＥＨＳ）マウス肉腫から抽出された可溶性の基底膜マトリックスをいう。本実施の形態では、Ｍａｔｒｉｇｅｌは、成長因子を含む通常のＭａｔｒｉｇｅｌに加えて、成長因子を含むＭａｔｒｉｇｅｌと比べて成長因子が低減されたＭａｔｒｉｇｅｌ（ＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒＲｅｄｕｃｅｄＭａｔｒｉｇｅｌＭａｔｒｉｘ）も含む。成長因子を含む通常のＭａｔｒｉｇｅｌおよびＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒＲｅｄｕｃｅｄＭａｔｒｉｇｅｌＭａｔｒｉｘは、たとえばＣｏｒｎｉｎｇ社から入手することができる。通常のＭａｔｒｉｇｅｌは、ラミニンを約５６％、コラーゲンＩＶを約３１％、エンタクチンを約８％含む。一方、ＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒＲｅｄｕｃｅｄＭａｔｒｉｇｅｌＭａｔｒｉｘは、ラミニンを約６１％、コラーゲンＩＶを約３０％、エンタクチンを約７％含む。または、基底膜マトリックス混合物３０として、ラミニンと、コラーゲンＩＶと、エンタクチンとが、約５６〜約６１：約３０〜約３１：約７〜約８の質量比にて混合された混合物を用いてもよい。

基底膜マトリックス混合物３０の濃度は、細胞支持複合体１０が実用に耐える期間、性能を維持できるように適宜調整する。また、このような期間は、培養開始から２週間以上であることが好ましく、３週間以上であることがさらに好ましく、４週間以上であることが最も好ましい。基底膜マトリックス混合物３０の濃度は、製造方法において後述する。

基底膜マトリックス混合物３０として成長因子を含む通常のＭａｔｒｉｇｅｌが使用される場合、０μｇ／ｍｌ超３０００μｇ／ｍｌ以下の濃度でコーティングして０μｇ／ｃｍ^２超約３４．８５μｇ／ｃｍ^２以下の濃度の接着量とすることが好ましい。５．０μｇ／ｍｌ以上２０００μｇ／ｍｌ以下の濃度でコーティングして約０．５μｇ／ｃｍ^２以上約２５μｇ／ｃｍ^２以下の濃度の接着量とすることがより好ましい。５．０μｇ／ｍｌ以上１０００μｇ／ｍｌ以下の濃度でコーティングして約０．５μｇ／ｃｍ^２以上約１６．０４μｇ／ｃｍ^２以下の濃度の接着量とすることがさらに好ましい。これにより、２８日以上培養細胞の単層構造を維持することができる。３０００μｇ／ｍｌを超える高濃度ではＭａｔｒｉｇｅｌがゲル化して細胞が凝集化する場合があるためである。

基底膜マトリックス混合物３０として成長因子が低減されたＭａｔｒｉｇｅｌが使用される場合、２０μｇ／ｍｌ超１０００μｇ／ｍｌ以下の濃度でコーティングして１．３６μｇ／ｃｍ^２超３０．６μｇ／ｃｍ^２以下の濃度の接着量とすることが好ましい。４０μｇ／ｍｌ以上１０００μｇ／ｍｌ以下の濃度でコーティングして３．１５μｇ／ｃｍ^２以上３０．６μｇ／ｃｍ^２以下の濃度の接着量とすることがさらに好ましい。これにより、２８日以上培養細胞の単層構造を維持することができる。２０μｇ／ｍｌ以下ではＭａｔｒｉｇｅｌの機能が発揮できない可能性があるため、および１０００μｇ／ｍｌを超える高濃度ではＭａｔｒｉｇｅｌがゲル化して細胞が凝集化する場合があるためである。

なお、基底膜マトリックス混合物３０は、その断片が使用されてもよいし、成長因子を含む通常のＭａｔｒｉｇｅｌと成長因子が低減されたＭａｔｒｉｇｅｌが混合されて、または混合されずに基材２０に対して順にコーティングされることによって使用されてもよい。基底膜マトリックス混合物３０の断片が使用される場合には、基底膜マトリックス混合物３０の量は、上述した完全長の基底膜マトリックス混合物３０の分子量に相当する量であってもよい。

（培養細胞４０）
培養細胞４０は、基底膜マトリックス混合物３０を介して基材２０に付着する。細胞支持複合体１０に使用されるためには、培養細胞４０は、基底膜マトリックス混合物３０を介して基材２０に固定された場合に、細胞頂端膜側のトランスポーター４２と、細胞基底膜側のトランスポーター４４とを発現する必要がある（図２）。

培養細胞４０の種類は特に限定されないが、たとえばヒト尿細管上皮細胞、またはヒトｉＰＳ細胞もしくはＥＳ細胞由来の尿細管上皮様細胞であることが好ましい。具体的には、腎臓から採取・分離可能な尿細管上皮細胞、およびｉＰＳ細胞もしくはＥＳ細胞より分化誘導および遺伝子導入した尿細管上皮様細胞が想定される。尿細管上皮様細胞として、近位尿細管の細胞が主に想定されるが、近位尿細管の細胞だけではなく、遠位尿細管の上皮細胞や、集合管の上皮細胞であってもよい。または、尿細管上皮細胞の代わりに、尿細管細胞の不死化、および株化細胞（ＭＤＣＫ細胞、ＬＬＣ−ＰＫ１細胞、ＪＴＣ−１２細胞、ＨＫ−２細胞）または特定のトランスポーター等のタンパク質を発現させるために、これらの細胞に遺伝子導入した細胞を用いてもよい。または、ヒト尿細管上皮細胞の代わりに、他動物種由来尿細管細胞を用いてもよい。

（培地など）
培養細胞４０の培養用の培地として、ＲＥＧＭ（Ｌｏｎｚａ社）を好適に使用することができる。これに代えて、ＥｐｉＣＭ（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ社）やＫｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅＳＦＭ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社））等、尿細管細胞培養培地を用いこともできる。その他の材料についても、従来の細胞支持複合体に用いられていた材料を好適に使用することができる。

（製造方法）
次に、細胞支持複合体１０の製造方法について説明する。細胞支持複合体１０の製造方法は、人工材料で形成された基材２０の少なくとも一部に、基底膜マトリックス混合物３０もしくはその断片をコーティングするステップ１と、基材２０に接着した基底膜マトリックス混合物３０もしくはその断片に対して培養細胞４０を播種するステップ２と、培養細胞４０を培養することにより、培養細胞４０の単層構造を形成するステップ３と、を含む。ここでいう「基材２０の少なくとも一部」は、上述のとおりである。

ステップ１においてコーティングされる基底膜マトリックス混合物３０は、成長因子を含む通常のＭａｔｒｉｇｅｌ、成長因子が低減されたＭａｔｒｉｇｅｌ、これらの断片、またはこれらのうち２つ以上から選択されることが好ましい。これらの基底膜マトリックス混合物３０の好ましい濃度は、上述のとおりである。

ステップ２では、通常の方法にて細胞を播種する。播種する細胞密度は、約１．０×１０^５〜約１．０×１０^８個／ｍｌであることが好ましい。基底膜マトリックス混合物３０を適切に選択すると、培養細胞４０はコンフルエントになるまで増殖したあとコンフルエントな状態を維持する。そのため、細胞支持複合体１０の製造において、播種する細胞数は大きな制約とはならない。

ステップ３における培養条件は、たとえば培地としてＲＥＧＭ（Ｌｏｎｚａ社）を用いて３７℃、５％ＣＯ_２である。培養細胞４０がコンフルエントになるまでに、培養細胞４０を約５日以上培養することが好ましい。なお、培地は定期的に交換することが好ましい。たとえば２日毎に交換する。

（作用）
尿細管細胞として機能する培養細胞４０が単層上皮構造をとると、細胞頂端膜側のトランスポーター４２と細胞基底膜側のトランスポーター４４とを介した有用物質５０の移動がおこり、基材２０を介して有用物質５０の再吸収が促進される（図２）。

（装置）
図３（Ａ）〜図３（Ｃ）は、実施の形態に係る細胞支持複合体を用いた装置の構造の一部を示す図である。図３（Ａ）は、基材としてＴｒａｎｓｗｅｌｌを用いた装置の構造の一部を示す図である。図３（Ｂ）は、基材として中空糸膜を用いた透析装置の構造の一部を示す図である。図３（Ｃ）は、基材としてシャーレ、ウェルプレート、微細流路、マイクロキャリア、または中空糸膜を用いた装置の構造の一部を示す図である。

図３（Ａ）のＴｒａｎｓｗｅｌｌを用いた装置では、培養細胞４０が配置された側に液体を流すことによって、図２に示したメカニズムを用いて、この液体中にある有用物質５０を人工膜の反対側に移動させる。この透析装置は、細胞の機能や、薬物の取込・排出を微量液量で調べる薬物評価モジュールとして使用可能である。

図３（Ｂ）の中空糸膜を用いた透析装置では、中空糸膜の管腔内に液体を流すことによって、図２に示したメカニズムを用いて、この液体中にある有用物質５０を管腔外へと移動させる。この透析装置は、血液濾過器で濾過した血漿成分中から、有用物質を回収するバイオ人工腎臓モジュールとして使用可能である。

図３（Ｃ）のシャーレ、ウェルプレート、微細流路、マイクロキャリア、中空粒子を用いた装置では、培養細胞４０が配置された側に微量の液体を流すことによって、細胞の有用物質５０の取り込みを確認できる。この装置は、細胞の機能や、薬物の取込・排出を微量液量で調べる薬物動態・薬効評価モジュールとして利用可能である。

装置は、これらの構造の１つ以上に加えて、これらを内部に収めるカートリッジを含む。カートリッジの材質は、従来の血漿濾過器等のカートリッジと同じ材料で作製されてよい。カートリッジの形状は、用途に応じて好適な形態をとることが好ましい。透析を目的に使用する場合は、カートリッジの形状はダイアライザの形状であることが好ましく、薬物評価モジュールとして使用する場合は、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ形状や微細流路形状であることが好ましい。

本実施の形態によれば、顕微鏡観察をすることなく、基材上に培養細胞のコンフルエントな単層上皮構造を形成させることができる。その結果、単層上皮構造の安定性が向上した細胞支持複合体を提供することができる。また、細胞支持複合体の単層上皮構造に孔が形成されることを防止することができる。

［実施例］
（基材がＴｒａｎｓｗｅｌｌの場合：Ｍａｔｒｉｇｅｌの性能評価）
図３（Ａ）に例示したＴｒａｎｓｗｅｌｌセルカルチャーインサート（ＰＥＴ；ポアサイズ０．４μｍ）（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）を付属の２４ウェルプレートに設置し、インサート下部にＰＢＳ（ナカライテスク株式会社）を７００μｌ、インサート上部に１ｍｇ／ｍｌに調整したＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒＲｅｄｕｃｅｄＭａｔｒｉｇｅｌＭａｔｒｉｘ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）を３００μｌ加え、４℃にて一晩静置（ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ）した。比較例として、２５μｇ／ｍｌに調整したＳｙｎｔｈｅｍａｘ（シンセマックス）（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）、１μｇ／ｍｌに希釈したＶｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ（ビトロネクチン）（Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、１０μｇ／ｍｌに調整したＰｏｌｙ−Ｌ−Ｌｙｓｉｎｅ（ポリ−Ｌ−リシン）（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ社）、０．２％に調整したＧｅｌａｔｉｎ（ゼラチン）溶液（コスモ・バイオ株式会社）を用いた。次に、１．０×１０^５個／ｍｌのヒト近位尿細管上皮細胞（Ｌｏｎｚａ社）１００μｌ（１．０×１０^４個）をｔｒａｎｓｗｅｌｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）をＭａｔｒｉｇｅｌでコーティングした基材に播種し、培地であるＲＥＧＭ（Ｌｏｎｚａ社）を用いて３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で２１日間培養した。培地は２日毎に交換した。播種５、２１日経過後の顕微鏡像（×１０）を図４に示す。

図４は、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌセルカルチャーインサートに対してコーティングする接着分子を変えた場合における細胞の増殖状態を経時的に示す図である。この結果、Ｓｙｎｔｈｅｍａｘ、Ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ、Ｐｏｌｙ−Ｌ−Ｌｙｓｉｎｅ、ゼラチンをコーティングしたＰＥＴ膜にヒト近位尿細管上皮細胞を播種後、長期間培養すると、細胞が重層化することが確認された。一方、マトリゲルをコーティングしたＰＥＴ膜にヒト近位尿細管上皮細胞を播種後、長期間培養しても、細胞の単層構造が維持されることが確認された。

（コーティング濃度の検討１）
９６ウェルプレート（ポリスチレン製：ＣＥＬＬＳＴＡＲ、ＧｒｅｉｎｅｒＢｉｏ−ｏｎｅ社）を１０、４、１、０．２５、０．１、０．０１ｍｇ／ｍｌに調整したＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒＲｅｄｕｃｅｄＭａｔｒｉｇｅｌＭａｔｒｉｘ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）でコーティングし、４℃にて一晩静置した。ここに、１．０×１０^５個／ｍｌのヒト近位尿細管細胞（Ｌｏｎｚａ社）１００μｌ（１．０×１０^４個）を播種して、培地であるＲＥＧＭ（Ｌｏｎｚａ社）を用いて３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で培養した。培地は２日毎に交換した。播種１、１２日経過後の顕微鏡像（×１０）を図５に示す。

図５は、シャーレに対してコーティングするＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒＲｅｄｕｃｅｄＭａｔｒｉｇｅｌＭａｔｒｉｘの濃度を変えた場合における細胞の増殖状態を経時的に示す図である。この結果、４〜１０ｍｇ／ｍｌのマトリゲル溶液でウェルプレートをコーティングした場合、播種直後に細胞凝集塊が形成され、０．０１ｍｇ／ｍｌ以下のマトリゲル溶液でコーティングした場合、長期間培養後に、一部の細胞が重層化していることが確認された。一方、０．１〜１ｍｇ／ｍｌのマトリゲル溶液でウェルプレートをコーティングした場合、ヒト近位尿細管細胞は、長期間、単層構造が維持されることが確認された。

（基材がシャーレ（ウェルプレート）の場合：コーティング濃度の検討２）
２４ウェルプレート（ポリスチレン製：ＣＥＬＬＳＴＡＲ、ＧｒｅｉｎｅｒＢｉｏ−ｏｎｅ社）をＭａｔｒｉｇｅｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）またはＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒＲｅｄｕｃｅｄＭａｔｒｉｇｅｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）にてコーティングした。コーティングは、１０００００、５０００、３０００、２０００、１０００、５００、１００、７５、５０、２５、１０、５μｇ／ｍｌにＲＥＧＭで希釈した各Ｍａｔｒｉｇｅｌ溶液をウェルに添加し、４℃にて一晩静置して実施した。細胞播種前に、Ｍａｔｒｉｇｅｌ溶液を吸引し、ヒト近位尿細管細胞（Ｌｏｎｚａ社）を１．０×１０^５個播種して、ＲＥＧＭ（Ｌｏｎｚａ社）を用いて３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で培養した。培地は２日毎に交換した。播種１、５、７、９、１２、１５、１８、２４、２８日経過後の結果を図６に示す。

接着分子のコーティングは、接着分子を含むコーティング溶液を４℃で一晩静置してコーティングする方法（一晩静置（ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ）：接着分子の一部がコーティング）と、接着分子を含むコーティング溶液を４℃で溶液が完全に乾燥するまで静置する方法（風乾：接着分子全量がコーティング）で実施した。

比較例として、２４ウェルプレート（ポリスチレン製）をＳｙｎｔｈｅｍａｘ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）にてコーティングした。１０００００、５０００、３０００、２０００、１０００、５００、１００、７５、５０、２５、１０、５μｇ／ｍｌにＲＥＧＭで希釈した各Ｓｙｎｔｈｅｍａｘ溶液をウェルに添加し、室温で静置した。２時間経過後、Ｓｙｎｔｈｅｍａｘ溶液を吸引し、室温で２時間乾燥させた。ここに、ヒト近位尿細管細胞（Ｌｏｎｚａ社）を１．０×１０^５個播種して、ＲＥＧＭ（Ｌｏｎｚａ社）を用いて３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で培養した。培地は２日毎に交換した。播種１、５、７、９、１２、１５、１８、２４、２８日経過後の結果を図６に示す。

比較例として、２４ウェルプレート（ポリスチレン製）をＰｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ社）にてコーティングした。コーティングは、１０００００、５０００、３０００、２０００、１０００、５００、１００、７５、５０、２５、１０、５μｇ／ｍｌにＰＢＳ（−）で希釈した各Ｐｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ溶液をウェルに添加し、室温で静置して実施した。２時間経過後、Ｐｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ溶液を吸引し、室温で２時間乾燥させた。ここに、ヒト近位尿細管細胞（Ｌｏｎｚａ社）を１．０×１０^５個播種して、ＲＥＧＭ（Ｌｏｎｚａ社）にて３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で培養した。培地は２日毎に交換した。播種１、５、７、９、１２、１５、１８、２４、２８日経過後の結果を図６に示す。

（接着分子の質量測定）
上述した手法でシャーレに接着分子をコーティング後、ＰＢＳ（−）で１回洗浄した。ここにタンパク質可溶化剤であるＭ−ＰＥＲＭａｍｍａｌｉａｎＰｒｏｔｅｉｎＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＲｅａｇｅｎｔ（ＴｈｅｒｍｏＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）を添加後、ピペッティングして接着分子をシャーレ表面より剥離、回収した。これを２−ＤＱｕａｎｔＫｉｔ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）または、ＦｌｕｏＲｅｐｏｒｔｅｒＦＩＴＣｐｒｏｔｅｉｎＬａｂｅｌｉｎｇＫｉｔ（ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ）にて接着分子をＦＩＴＣ標識して、後述する「最大接着量（風乾）」と「接着量（ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ）」をそれぞれ定量した。

図６（Ａ）〜図６（Ｄ）は、シャーレに対してコーティングする接着分子の濃度を変えた場合における細胞の増殖状態を経時的に示す図である。図６（Ａ）は、比較例であるＳｙｎｔｈｅｍａｘを用いた結果を示す図である。図６（Ｂ）は、比較例であるＰｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅを用いた結果を示す図である。図６（Ｃ）は、成長因子を含むＭａｔｒｉｇｅｌを用いた結果を示す図である。図６（Ｄ）は、成長因子が低減されたＭａｔｒｉｇｅｌを用いた結果を示す図である。

なお、表中で「最大接着量（風乾）」とは、コーティング溶液が完全に蒸発することによってＭａｔｒｉｇｅｌが基材にコーティングされるまで、コーティング溶液を４℃に静置した後に、測定したＭａｔｒｉｇｅｌの接着分子量を示す。この場合、コーティング溶液に含まれるＭａｔｒｉｇｅｌがすべて基材にコーティングされるため、接着分子量は乾燥前にコーティング溶液に含まれたＭａｔｒｉｇｅｌの全量に等しい。一方、「接着量（ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ）」は、接着分子を含むコーティング溶液を４℃にて一晩静置することによってコーティングした後の接着分子量を示す。この場合、接着分子のうち実際にコーティングされた一部のＭａｔｒｉｇｅｌに相当する接着分子量が測定される。また、「○」は、細胞の増殖によって細胞支持複合体の単層上皮構造の孔が塞がり、かつ細胞の単層上皮構造が維持されたことを示す。「△」の「凝集化傾向あり」とは、孔は生じていないが、一部分で細胞が積層してきた場合を示す。

図６（Ａ）より、Ｓｙｎｔｈｅｍａｘでは濃度をどのように調節しても、７日を超えて培養細胞の単層構造が維持できなかった。同様に、図６（Ｂ）より、Ｐｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅでは濃度をどのように調節しても、７日を超えて培養細胞の単層構造が維持できなかった。

図６（Ｃ）より、成長因子を含む通常のＭａｔｒｉｇｅｌの場合、０μｇ／ｍｌ超３０００μｇ／ｍｌ以下の濃度でコーティングして０μｇ／ｃｍ^２超約３４．８５μｇ／ｃｍ^２以下の濃度の接着量とすれば、２８日以上培養細胞の単層構造が維持できた。３０００μｇ／ｍｌを超える高濃度ではＭａｔｒｉｇｅｌがゲル化して細胞が凝集化する場合がある。

図６（Ｄ）より、成長因子が低減されたＭａｔｒｉｇｅｌの場合、２０μｇ／ｍｌ超１０００μｇ／ｍｌ以下の濃度でコーティングして１．３６μｇ／ｃｍ^２超３０．６μｇ／ｃｍ^２以下の濃度の接着量とすれば、２８日以上培養細胞の単層構造が維持できた。２０μｇ／ｍｌ以下ではＭａｔｒｉｇｅｌの機能が発揮できない可能性がある。また、１０００μｇ／ｍｌを超える高濃度では、Ｍａｔｒｉｇｅｌがゲル化して細胞が凝集化する場合がある。

（基材がＰＥＰＡ中空糸膜ミニモジュールの場合）
ＰＥＰＡ中空糸膜ミニモジュール（日機装株式会社）の内腔を１００％エタノールで洗浄後、０．２５ｍｇ／ｍｌに調整したＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒＲｅｄｕｃｅｄＭａｔｒｉｇｅｌＭａｔｒｉｘ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）（比較例：０．１％に調整したゼラチン溶液（コスモ・バイオ株式会社））でコーティングし、４℃にて一晩静置した。ＰＢＳ洗浄後、１．０×１０^７個／ｍｌに調整したヒト近位尿細管細胞（Ｌｏｎｚａ社）を播種し、３７℃にて静置した。３時間経過後、ミニモジュールを上下反転し、再度、１．０×１０^７個／ｍｌに調整したヒト近位尿細管細胞（Ｌｏｎｚａ社）を播種し、３７℃で静置した。３時間経過後、ミニモジュールを、ＲＥＧＭ（Ｌｏｎｚａ社）で満たした容器内に浸漬し、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で培養した。培地は２日毎に交換した。

３週間培養後、ＰＢＳ（ナカライテスク株式会社）で洗浄後、４％パラホルムアルデヒド溶液（和光純薬工業株式会社）を用いて固定した。その後、エタノール（和光純薬工業株式会社）を７０、８０、９０、１００％の順で加えて脱水し、溶媒をキシレン（和光純薬工業株式会社）で置換した。そして、このミニモジュールから中空糸膜を切り出し、パラフィン（コスモ・バイオ株式会社）を用いて包埋処理した。この包埋したブロックから、ミクロトーム（大和光機工業株式会社）を用いて、横断面方向に厚さ５μｍの切片を切り出した。この切片を、スライドガラスに貼り付け、キシレン、１００、９０、８０、７０％エタノールの順で浸液させて脱パラフィン処理し、培養細胞がハイブリッドした人工膜の断面を染色できる状態にした。これに、細胞核染色試薬Ｍａｙｅｒ’ｓＨｅｍａｔｏｘｙｌｉｎＳｏｌｕｔｉｏｎ（和光純薬工業株式会社）、細胞質染色試薬ＥｏｓｉｎＹＳｏｌｕｔｉｏｎ（和光純薬工業株式会社）を反応させた。そして、エタノール、キシレンで脱水処理し、封入剤を用いて封入した。これらのＨＥ染色した細胞の顕微鏡画像を図７に示す。

図７は、基材としてＰＥＰＡ中空糸膜ミニモジュールを用いた場合におけるＭａｔｒｉｇｅｌを用いた実施例およびゼラチンを用いた比較例に係るＨＥ染色した細胞の顕微鏡画像である。この結果、ゼラチンコーティングしたＰＥＰＡ中空糸膜にヒト近位尿細管上皮細胞を播種すると、細胞が重層化することが確認された。一方、マトリゲルコーティングした中空糸膜にヒト近位尿細管上皮細胞を播種すると、長期間単層構造が維持されることが確認された。

以上、本発明を実施例にもとづいて説明した。本発明は上記実施の形態に限定されず、種々の設計変更が可能であり、様々な変形例が可能であること、またそうした変形例も本発明の範囲にあることは、当業者に理解されるところである。

１０…細胞支持複合体、２０…基材、３０…基底膜マトリックス混合物、４０…培養細胞。

Claims

人工材料で形成された基材と、
マウス肉腫から抽出された細胞外マトリックスタンパク質の混合物であって、前記基材の少なくとも一部に接着する基底膜マトリックス混合物もしくはその断片と、
前記基底膜マトリックス混合物もしくはその断片を介して前記基材に付着した培養細胞と、を有し、
前記基底膜マトリックス混合物もしくはその断片は、
前記基材に対する接着量が０．５μｇ／ｃｍ ^２以上３４．８５μｇ／ｃｍ ^２以下の、成長因子を含む基底膜マトリックス混合物もしくはその断片、および、
前記基材に対する接着量が３．１５μｇ／ｃｍ ^２以上３０．６μｇ／ｃｍ ^２以下の、前記成長因子を含む基底膜マトリックス混合物よりも成長因子が低減された基底膜マトリックス混合物もしくはその断片から選択されることを特徴とする細胞支持複合体。
前記培養細胞は、実質的に重層化することなくコンフルエントな単層を形成していることを特徴とする請求項１に記載の細胞支持複合体。
人工材料で形成された基材の少なくとも一部に、マウス肉腫から抽出された細胞外マトリックスタンパク質の混合物である基底膜マトリックス混合物もしくはその断片をコーティングするステップと、
前記基材に接着した前記基底膜マトリックス混合物もしくはその断片に対して培養細胞を播種するステップと、
前記培養細胞を培養することにより、前記培養細胞の単層構造を形成するステップと、を含み、
前記基底膜マトリックス混合物もしくはその断片をコーティングするステップは、
成長因子を含む基底膜マトリックス混合物もしくはその断片を５．０μｇ／ｍｌ以上３０００μｇ／ｍｌ以下の濃度でコーティングして０．５μｇ／ｃｍ ^２以上３４．８５μｇ／ｃｍ ^２以下の接着量とすること、および、
前記成長因子を含む基底膜マトリックス混合物よりも成長因子が低減された基底膜マトリックス混合物もしくはその断片を４０μｇ／ｍｌ以上１０００μｇ／ｍｌ以下の濃度でコーティングして３．１５μｇ／ｃｍ ^２以上３０．６μｇ／ｃｍ ^２以下の接着量とすること、
のいずれかを含むことを特徴とする細胞支持複合体の製造方法。