JP6680677B2 - 肝疾患の鑑別診断 - Google Patents

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Description

関連出願データ
本出願は、2014年12月10日に出願された米国特許出願番号第61/914,345号の35 U.S.C. §119(e)に基づく優先権の利益を主張し、その全内容は参照により本明細書に組み込まれる。
助成金情報
本発明は、国立衛生研究所(National Institutes of Health)により授与されたK23DK090303およびGM U54 069338の下、政府支援を得て成された。政府は本発明において一定の権利を有する。
発明の分野
本発明は、全般的には肝疾患の診断に関し、特に非アルコール性脂肪肝、非アルコール性脂肪性肝炎、および正常対照の間を鑑別する診断に関する。
非アルコール性脂肪肝疾患(NAFLD)は、アメリカ合衆国における慢性肝疾患の最も一般的な原因である。NAFLDは、肝硬変への進行リスクが最も小さいと考えられる非アルコール性脂肪肝(NAFL)と、肝硬変への進行リスクが増加していると考えられる非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)に大きく下位分類することができる。NAFLDを有する患者が、NAFLを有するかNASHを有するかを鑑別するための現在の診断上の至適基準は肝生検である。しかし、肝生検は侵襲的な手段であり、サンプリング変動性、費用によって制限され、また病的状態により複雑化し、稀に死亡する可能性もある。
NASHの検出のための正確で非侵襲的なバイオマーカーは、現在のところ利用することができない。実質的に非侵襲的な(例えば採血を除く)NASHの診断は、満たされていない主要な医療ニーズである。
先の研究は、脂肪毒性が、NASHの発症において重要な役割を果たすことを示した。最近のデータは、酸化した低密度リポタンパク質(oxLDL)ならびに他の脂質部分が、NAFLを有する患者と比較して、NASHを有する患者において増加するものとされていることを示唆している。
酸化した多価不飽和脂肪酸(PUFA)およびそれらの代謝物は、広範囲の炎症性疾患に関与しており、NAFLDにおいて自動酸化したリノール酸およびリノレン酸が報告されている。近年の、液体クロマトグラフィー-質量分析ベースのリピドミクス技術の発展により、何百もの脂肪酸、アシルエタノールアミンおよび炎症性エイコサノイド(各種のシクロオキシゲナーゼ、リポキシゲナーゼ、シトクロムP450、および、イソプロスタンを産生する非酵素的酸化から生じるそれらの多数の代謝物を含む)ならびにそれらの組み合わせのリピドミクス分析へのロバストで総合的なアプローチが開発されている。アラキドン酸(AA)および他のPUFAに由来するエイコサノイドおよび関連の酸化代謝物が特に注目されている。現在、150を超えるこのような代謝物を日常的に定量することができる。
NASHと診断された患者は、増加した肝硬変の発症リスクを有する。現在のところ、肝硬変には治療法が存在せず、患者は、疾患の進行を遅らせ、肝細胞への損傷を最小限にし、合併症を低減させることができる治療に制限される。NASHの早期診断は、疾患の進行を停止させ、肝硬変への進行を予防することができる。しかし、NASHを確実に診断するために現在利用可能な唯一の方法は、極めて侵襲的な手段である肝生検である。
本発明は、実質的に非侵襲的な肝疾患の診断に関する。本発明はさらに、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)を、非アルコール性脂肪肝(NAFL)および非-非アルコール性脂肪肝疾患(NAFLD)、ならびに正常対照と鑑別するための血漿バイオマーカーの使用に関する。具体的には、本発明は、NASHを、NAFLおよび非NAFLD正常対照と鑑別するための、血漿中の遊離エイコサノイドおよび他の多価不飽和脂肪酸(PUFA)代謝物レベルの使用に関する。
本明細書中で考察されるとおり、本発明による血漿エイコサノイドおよび他の酸化PUFAのプロファイリングは、NASHを有する患者 対 NAFLを有する患者 対 独特の表現型の(例えば、磁気共鳴画像法(MRI)ベースの測定によるプロトン密度脂肪画分(MRI-PDFF)により、5％未満の肝臓脂肪含有量を有することが示された)正常対照の間で鑑別することができる。
1つの実施形態において、本発明は、肝疾患と診断された患者における肝疾患の進行リスクを予測または評価する方法を提供する。この方法は、患者由来の血漿サンプルから得られた脂質抽出物中の1つ以上の遊離エイコサノイドおよび/または多価不飽和脂肪酸(PUFA)代謝物が何であるか（正体）および量を決定することによって実施される。本明細書中でさらに記載される好適な対照と比較した、1つ以上の遊離エイコサノイドおよび/またはPUFA代謝物の増加または低下は、肝疾患の進行リスクの増加を示し、それに応じて治療法を調整することができる。
好ましくは、1つ以上の遊離エイコサノイドおよび/またはPUFA代謝物は、標的分子を含む脂質が抽出された患者由来の血漿サンプル中で測定される。エイコサノイドおよび/またはPUFA代謝物の正体および量が決定され、正常対照におけるそれらのレベルと比較される。
この実施形態の一態様において、非アルコール性肝疾患(NAFLD)は、非アルコール性脂肪肝(NAFL)である。別の態様において、NAFLDは、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)である。さらなる態様において、肝疾患の進行リスクは、肝硬変への進行である。
さらなる態様において、1つ以上の遊離エイコサノイドおよび/またはPUFA代謝物は、PGE2、dhk PGD2、テトラノル-12-HETE、15-HETE、11,12-diHETrE、14,15-diHETrE、20-COOH AA、9-オキソODE、12,13-EpOME、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。具体的態様において、1つ以上の遊離エイコサノイドおよび/またはPUFA代謝物は、11,12-diHETrE、dhk PGD2および/もしくは20-COOH AA、またはそれらの任意の組み合わせである。好ましい態様において、1つ以上の遊離エイコサノイドおよび/またはPUFA代謝物は、dhk PGD2および20-COOH AAである。別の好ましい態様において、1つの遊離エイコサノイドは、20-COOH AAである。
さらなる態様において、1つ以上の遊離エイコサノイドおよび/またはPUFA代謝物は、AUROCによって測定される。さらなる態様において、AUROCは約少なくとも0.8である。別の態様において、AUROCは約少なくとも0.9である。なお別の態様において、AUROCは約少なくとも0.99である。
さらなる実施形態において、本発明は、肝疾患と診断された患者において、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)を非アルコール性脂肪肝と区別する方法を提供する。この方法は、患者由来の血漿サンプルから得られた脂質抽出物中の1つ以上の遊離エイコサノイドおよび/または多価不飽和脂肪酸(PUFA)代謝物の正体および量を決定することによって実施される。
また、1つ以上の遊離エイコサノイドおよび/またはPUFA代謝物は、好ましくは標的分子を含む脂質が抽出された患者由来の血漿サンプル中で測定されるが、脂質が抽出されていない血漿サンプルで決定を行うことも可能である。エイコサノイドおよび/またはPUFA代謝物の正体および量が決定され、正常対照におけるそれらのレベルと比較される。正常対照、ならびに鑑別のため、非アルコール性脂肪肝および非-非アルコール性脂肪肝疾患から得られたレベルと比較した、1つ以上の遊離エイコサノイドおよび/またはPUFA代謝物のレベルの統計学的に有意な増加または低下は、患者がNASHを有することを示す。その後、それに応じて治療を適用することができる。
ある態様において、1つ以上の遊離エイコサノイドおよび/またはPUFA代謝物は、PGE2、dhk PGD2、テトラノル-12-HETE、15-HETE、11,12-diHETrE、14,15-diHETrE、20-COOH AA、9-オキソODE、12,13-EpOME、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。具体的態様において、1つ以上の遊離エイコサノイドおよび/またはPUFA代謝物は、11,12-diHETrE、dhk PGD2および/もしくは20-COOH AA、またはそれらの任意の組み合わせである。好ましい態様において、1つ以上の遊離エイコサノイドおよび/またはPUFA代謝物は、dhk PGD2および20-COOH AAである。
さらなる態様において、1つ以上の遊離エイコサノイドおよび/またはPUFA代謝物は、AUROCによって測定される。さらなる態様において、AUROCは約少なくとも0.8である。別の態様において、AUROCは約少なくとも0.9である。なお別の態様において、AUROCは少なくとも0.99である。
さらなる実施形態において、本発明は、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)を、非アルコール性脂肪肝および非-非アルコール性脂肪肝疾患と区別する方法であって、患者由来の血漿サンプルから抽出された脂質中の1つ以上の遊離エイコサノイドおよび/または多価不飽和脂肪酸(PUFA)代謝物のレベルを測定することを含む、上記方法を提供する。正常対照、ならびに鑑別のため、非アルコール性脂肪肝および非-非アルコール性脂肪肝疾患において得られたレベルと比較した、1つ以上の遊離エイコサノイドおよび/またはPUFA代謝物のレベルの増加は、患者がNASHを有することを示す。従って、それに応じて治療を適用することができる。
ある態様において、1つ以上の遊離エイコサノイドおよび/またはPUFA代謝物は、PGE2、dhk PGD2、テトラノル-12-HETE、15-HETE、11,12-diHETrE、14,15-diHETrE、20-COOH AA、9-オキソODE、および12,13-EpOME、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。具体的態様において、1つ以上の遊離エイコサノイドおよび/またはPUFA代謝物は、11,12-diHETrE、dhk PGD2および/または20-COOH AAである。好ましい態様において、1つ以上の遊離エイコサノイドおよび/またはPUFA代謝物は、dhk PGD2および20-COOH AAである。
さらなる態様において、1つ以上の遊離エイコサノイドおよび/またはPUFA代謝物は、AUROCによって測定される。さらなる態様において、AUROCは約少なくとも0.8である。別の態様において、AUROCは約少なくとも0.9である。
有利なことに、本発明の方法は、医師が、肝疾患の進行について非侵襲的且つ正確な検査を利用することにより、以前に可能であったよりも肝疾患のより早い段階で介入できることを可能とする。
図1は、アラキドン酸由来代謝物を示す。3つの臨床群における、血漿遊離アラキドン酸(AA)、ならびにシクロオキシゲナーゼ(COX)、5-リポキシゲナーゼ(5-LOX)、12-および15-リポキシゲナーゼ(12/15-LOX)、およびシトクロムP450(CYP)活性に由来するその代謝物の定量的量が、各代謝物について示される。この結果は箱髭図として表され、箱の下境界は25パーセンタイル値を示し、箱内の線は中央値を示し、また箱の上境界は75パーセンタイル値を示す。髭はデータ範囲の下端および上端を示す。 図2は、代替基質由来代謝物を示す。3つの臨床群における、血漿遊離リノール酸(LA)、α-リノレン酸(ALA)、エイコサトリエン酸(ETA)、エイコサペンタエン酸(EPA)およびドコサヘキサエン酸(DHA)、ならびに5-LOX、12/15-LOXおよびCYP活性に由来するそれらの代謝物の定量的量が、各代謝物について示される。結果は箱髭図として表され、箱の下境界は25パーセンタイル値を示し、箱内の線は中央値を示し、また箱の上境界は75パーセンタイル値を示す。髭は、データ範囲の下端および上端を示す。 図3(表1)は、研究集団中の患者のベースラインのデモグラフィック特徴、臨床的特徴、生化学的特徴、および組織学的特徴を示す。 図4(表2)は、正常対照 対 非アルコール性脂肪肝疾患 対 非アルコール性脂肪性肝炎におけるエイコサノイド代謝物の比較を示す。 図5(表3)は、NAFLをNASHと鑑別する血清バイオマーカーの診断精度を示す。
発明の詳細な説明
本発明は、肝疾患の診断に関する。本発明はさらに、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)を、非アルコール性脂肪肝(NAFL)、および非-非アルコール性脂肪肝疾患(NAFLD)を有さない正常対照と鑑別するための、血漿バイオマーカーの使用に関する。具体的には、本発明は、NASHをNAFLおよび非NAFLD正常対照と鑑別するための、血漿中の遊離エイコサノイドおよび他の多価不飽和脂肪酸(PUFA)代謝物レベルの使用に関する。
本組成物および方法を記載する前に、記載される特定の組成物、方法、および実験条件は変動し得るため、本発明はこのような特定の組成物、方法、および実験条件に限定されないことを理解されたい。本発明の範囲は添付の特許請求の範囲にのみ限定されるため、本明細書中で使用される用語は、特定の実施形態のみを説明することを目的としており、限定を意図するものではないことも理解されたい。
この明細書および添付の特許請求の範囲において用いられる単数形「a」、「an」、および「the」は、文脈により別途明確に示されない限り、複数参照を含む。従って、例えば、「方法」との参照は、本明細書に記載される種類の1つ以上の方法および/またはステップを含み、これは、この開示等を読めば当業者には明らかであろう。
別途定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学用語は、本発明が属する技術分野において通常の技能を有する者に一般的に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書中に記載される方法および材料と類似のまたは同等の任意の方法および材料を本発明の実施または検査において用いることができるが、ここでは好ましい方法および材料が記載される。以下に示される定義は本開示を理解するためのものであるが、当技術分野において通常の技能を有する者が有する用語の理解と置き換えられるものであると決して考えられてはならない。
肝疾患
肝疾患は、肝臓へのある種の損傷または肝臓の疾患である。100種類を超える肝疾患が存在する。最も広く蔓延している肝疾患は以下のとおりである：肝蛭症；肝炎；アルコール性肝疾患；脂肪肝疾患；肝硬変；肝臓；胆管；硬化性胆管炎；小葉中心性壊死；バッド・キアリ症候群；遺伝性肝疾患(体内での鉄の蓄積を伴うヘモクロマトーシス、およびウィルソン病)；トランスサイレチン関連の遺伝性アミロイドーシス；およびジルベール症候群。
本明細書中で使用される用語「肝疾患」は、肝臓に悪影響を及ぼす任意の疾患または障害を指す。肝疾患の例としては、限定するものではないが、アラジール症候群；アルコール関連肝疾患；アルファ-1抗トリプシン欠乏症；自己免疫性肝炎；良性肝腫瘍；胆管閉鎖症；肝硬変；ガラクトース血症；ジルベール症候群；ヘモクロマトーシス；A型肝炎；B型肝炎；C型肝炎；肝細胞癌；肝性脳症；肝嚢胞；肝癌；新生児黄疸；非アルコール性脂肪肝疾患(非アルコール性脂肪肝および非アルコール性脂肪性肝炎を含む)；原発性胆汁性肝硬変(PBC)；原発性硬化性胆管炎(PSC)；ライ症候群；I型糖原病およびウィルソン病が挙げられる。
非アルコール性脂肪肝疾患
非アルコール性脂肪肝疾患(NAFLD)は、過剰なアルコール使用に起因せずに肝臓内で脂肪が蓄積した場合に起こる、脂肪肝の１つの原因である。NAFLDはインスリン抵抗性およびメタボリックシンドロームに関連し、元は他のインスリン抵抗性状態(例えば2型糖尿病)のために開発された治療(例えば減量、メトホルミンおよびチアゾリジンジオン)に応答し得る。NAFLDは、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)と非アルコール性脂肪肝(NAFL)に下位分類することができる。NASHはより極端な形態のNAFLDであり、原因不明の肝臓の肝硬変の主な原因であると考えられる。
NAFLDを有する大部分の患者には、症状がほとんどないか、または症状がない。患者は、疲労、倦怠感、および右上腹部の鈍い不快感を訴える場合がある。稀ではあるが、軽度の黄疸が見つかる場合もある。より一般的には、NAFLDは、日常的な血液検査中の異常な肝機能検査の後に診断される。NAFLDは、インスリン抵抗性およびメタボリックシンドローム(肥満、混合型高脂血症、糖尿病(II型)および高血圧)を伴う。
一般的な所見は、肝酵素の上昇および脂肪症を示す肝超音波である。超音波は、胆石疾患(胆石症)を除去するためにも使用されうる。肝生検(組織検査)は、NASHを他の形態の肝疾患と明確に区別する検査として広く受け入れられている唯一の検査であり、炎症およびその結果として起こる線維症の重症度を評価するために使用することができる。
非アルコール性脂肪肝
非アルコール性脂肪肝(NAFL)は、NAFLDの一種であり、脂肪が肝細胞中に蓄積している状態である。NAFLは肝硬変への進行リスクが最も小さい。単純性脂肪肝は、通常は肝臓を損傷しないが、肝生検によって同定することができる状態である。単純性脂肪肝は、瘢痕または炎症などの何らかの他の肝臓異常を伴わない。これは、極めて体重過多であるかまたは糖尿病を有する患者において一般的な所見である。脂肪が肝臓の少なくとも5％を占める場合、患者は脂肪肝を有する。
非アルコール性脂肪性肝炎
非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)は、一般的な、しばしば「サイレントな」肝疾患である。NASHの主な特徴は、炎症および損傷を伴う肝臓内の脂肪である。NASHを有する大部分の人々は体調が良好で、肝障害を有していることに気づかない。それでもNASHは重症化する可能性があり、さらに肝硬変(肝臓が回復不能な損傷を受けて傷跡が残り、もはや適切に機能することができない)につながる可能性がある。
NASHは、通常、日常的な血液検査パネルに含まれる肝臓検査において、アラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)またはアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST)などの上昇を有することが見つかった人において最初に疑われる。追加的な評価が、肝疾患の明らかな原因を示さず、また肝臓のx線研究または画像研究が脂肪を示す場合、NASHが疑われる。NASHの確定診断を提供し、NASHを単純性脂肪肝と区別する唯一の手段は肝生検である。NASHは、炎症を伴う脂肪および肝細胞への損傷が生検から観察される場合に診断される。組織が炎症および損傷を有さない脂肪を示す場合、NAFLまたはNAFLDと診断される。現在のところ、いずれの血液検査または走査もこの情報を確実に提供することはできない。
エイコサノイド
エイコサノイドは、アラキドン酸または他の多価不飽和脂肪酸(PUFA)などの20炭素脂肪酸の酸化によって産生されるシグナル伝達分子である。エイコサノイドは、主に身体活動中および身体活動後の成長、毒性化合物および病原体の摂取後の炎症または免疫において、また中枢神経系におけるメッセンジャーとして、多くの身体システムにわたる複雑な制御を発揮する。エイコサノイドとしては、プロスタグランジン、プロスタサイクリン、トロンボキサン、ロイコトリエンならびに、PUFAへの酸素の酵素的付加または非酵素的付加によって形成される他の代謝物が挙げられる。
エイコサノイドは、オメガ-3(ω-3)またはオメガ-6(ω-6)脂肪酸のいずれかに由来する。一般的に、ω-6エイコサノイドは炎症性であり；ω-3は、それほど炎症性ではないか、または抗炎症性ですらあり得る。人の食事におけるこれらの脂肪の量およびバランスは、エイコサノイドによって制御される身体機能に悪影響を及ぼし、心血管疾患、トリグリセリド、血圧、および関節炎への影響を伴う。アスピリンおよび他のNSAIDなどの抗炎症薬は、エイコサノイド合成を下方制御することによって作用する。
プロスタグランジンを含め、複数のエイコサノイドのサブファミリー(例えば、プロスタサイクリン、トロンボキサン、リポキシン、およびロイコトリエン)が存在する。このそれぞれについて、ω-3 EFAまたはω-6 EFAのいずれかに由来する2つまたは3つの別々のシリーズが存在する。これらのシリーズの様々な活性は、ω-3脂肪およびω-6脂肪の健康効果を大部分説明する。
多価不飽和脂肪酸
多価不飽和脂肪酸(PUFA)は、それらの主鎖に2つ以上の二重結合を含む脂肪酸である。このクラスは、必須脂肪酸などの多くの重要な化合物を包含する。多価不飽和脂肪酸は、それらの化学構造によって以下のような様々な群に分類することができる：メチレン遮断ポリエン、共役脂肪酸および他のPUFA。PUFAは、20炭素(エイコサ)含有脂肪酸以外の脂肪酸、例えば18炭素含有リノール酸およびリノレン酸ならびに22炭素含有ドコサペンタエン酸(DPA)およびドコサヘキサエン酸(DHA)だけでなく、アラキドン酸および他の20炭素脂肪酸(例えばエイコサトリエン酸(ETA)およびエイコサペンタエン酸(EPA))の、シクロオキシゲナーゼ、リポキシゲナーゼ、シトクロムP450および非酵素的酸化に由来する代謝物も包含する。アラキドン酸および他のPUFAに作用してPUFAを産生する酵素の例としては、公知のとおり、COX、5-LOX、12/15-LOXおよびCYPが挙げられる。PUFAは、非酵素的酸化も受け得る。
遊離エイコサノイドおよびPUFA代謝物の例としては、限定するものではないが、PGE2(プロスタグランジンE2)、dhk PGD2(13,14-ジヒドロ-15-ケトプロスタグランジンD2)、テトラノル-12-HETE(2,3,4,5-テトラノル-12(R)-HETE)、15-HETE(15-ヒドロキシ-Y-5Z,8Z,11Z,13E-エイコサテトラエン酸)、11,12-diHETrE(11,12-ジヒドロキシ-エイコサトリエン酸)、14,15-diHETrE(14,15-ジヒドロキシ-5,8,11-イコサトリエン酸)、20-COOH AA(20-カルボキシアラキドン酸)、9-オキソODE(9-オキソ-オクタデカジエン酸)、12,13-EpOME(12(13)-イソロイコトキシン)、TxB2(トロンボキサンB2)、12-HHTrE(12-ヒドロキシ-ヘプタ-デカトリエン酸)、11-HETE(11-ヒドロキシ-5Z,8Z,12E,14Z-エイコサテトラエン酸)、5-HETE(5-ヒドロキシ-6E-8Z,11Z,14Z-エイコサテトラエン酸)、5,6-diHETrE(5,6-ジヒドロキシ-8Z,11Z,14Z-エイコサトリエン酸)、14,15-diHETrE(14,15-ジヒドロキシ-5,8,11-イコサトリエン酸)、13-HODE(13-ヒドロキシオクタデカジエン酸；)、9-HODE(9-ヒドロキシオクタデカジエン酸；)、9,10-EpOMe、9,10-diHOME((±)12,13-EpOMEの可溶性エポキシドヒドロラーゼ開口から生じるジオール)、12,13-diHOME、9-HOTrE、15-HETrE(15S-ヒドロキシ-8Z,11Z,13E-エイコサトリエン酸)、12-HEPE(12-ヒドロキシ-5,8,10,14,17-イコサペンタエン酸)、14-HDoHE(14-ヒドロキシドコサヘキサエン酸)、16-HDoHE(16-ヒドロキシドコサヘキサエン酸)および19,20-DiHDPA(19,20-ジヒドロキシ-4Z,7Z,10Z,13Z,16Z-ドコサヘペンタエン酸)、血漿遊離リノール酸(LA)、α-リノレン酸(ALA)、エイコサトリエン酸(ETA)、エイコサペンタエン酸(EPA)およびドコサヘキサエン酸(DHA)、ならびに5-LOX、12/15-LOXおよびCYPに由来するこれらの代謝物が挙げられる。
本発明はまた、肝疾患と診断された患者における肝疾患の進行リスクを予測または評価する方法であって、上記患者の血漿中の1つ以上の遊離エイコサノイドおよび/または多価不飽和脂肪酸(PUFA)代謝物のレベルを測定することを含み、ここで遊離エイコサノイドおよび/またはPUFA代謝物の増加、または異なるエイコサノイドもしくはPUFAへの変換(酸化を含み得る)による1つ以上の特定の遊離エイコサノイドおよび/またはPUFA代謝物の低下が、肝疾患の進行リスクの増加を示す、上記方法も提供する。一態様において、非アルコール性脂肪肝疾患(NAFLD)は、非アルコール性脂肪肝(NAFL)である。別の態様において、NAFLDは、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)である。
特に有用な態様において、血漿エイコサノイドプロファイリングが、NAFLとNASHを鑑別できることが本明細書中で示される。下記実施例に記載されるとおり、幾つかのエイコサノイド成分が同定され、これらは正常対照、NAFL、NASH間で有意に異なっていた(11,12-diHETrE、dhkPGD 2 および20-COOH AAは、NASH患者において、NAFL、正常対照と比較して用量依存的に著しく上昇した)。このデータは、11,12-diHETrE、dhkPGD 2 および20-COOH AAが、NASHの非侵襲的診断のための優れたエイコサノイド候補バイオマーカーであるという証拠を提供する。
これらの結果は、遊離形態で存在し、KOH処理されていない代謝物のみが測定された点において、先に報告された結果と異なっていた。遊離エイコサノイドのレベルは、脂質にエステル結合したエイコサノイドよりずっと低かったが、このアプローチはさらに多くの代謝物を捕捉し、はるかに広いプロファイリング戦略を可能とする。またこの方法は、脂質にエステル結合したエイコサノイドの分析において必須のステップである、塩基または酸を用いた処理による一部のエイコサノイドおよびPUFAの破壊も回避する。NAFLDでは、正常な脂質代謝が破壊され、遊離脂肪酸およびトリグリセリド合成のレベルの増加をもたらす。遊離脂肪酸は、肝毒性を誘発し、幾つかの機構を介してNAFLからNASHへの進行を刺激し得ることが示されている。遊離脂肪酸は直接的に細胞毒性であり、肝細胞における炎症経路の産生を刺激し得る。またこれらの脂肪酸は、炎症性エイコサノイドの前駆体としての役割も果たす。これと一致して、幾つかの遊離PUFAの血漿レベルは、NAFLおよびNASHにおいて、健康な対照と比較して一貫してより高かった(図1および2)。
しかし、NAFLとNASHとの間に差はなく、そのことは、血漿遊離脂肪酸が、様々な段階のNAFLDを鑑別するには不十分なマーカーであることを示唆していた。対照的に、血漿遊離脂肪酸のエイコサノイドへの変換は、疾患進行において重要な機構を構成し、エイコサノイドレベルの分析は、脂肪酸レベルよりもむしろ、NAFLとNASHを識別するための有用な臨床的ツールであり得る。
1つ以上の遊離エイコサノイドおよび/またはPUFA代謝物は、PGE2、dhk PGD2、テトラノル-12-HETE、15-HETE、11,12-diHETrE、14,15-diHETrE、20-COOH AA、9-オキソODE、12,13-EpOME、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択することができる。具体的態様において、1つ以上の遊離エイコサノイドおよび/またはPUFA代謝物は、11,12-diHETrE、dhk PGD2および/もしくは20-COOH AA、またはそれらの任意の組み合わせである。好ましい態様において、1つ以上の遊離エイコサノイドおよび/またはPUFA代謝物は、dhk PGD2および20-COOH AAである。別の好ましい態様において、1つ以上の遊離エイコサノイドおよび/またはPUFA代謝物は、20-COOH AAである。
本方法は、患者の血漿サンプル中の1つ以上の遊離エイコサノイドおよび/または多価不飽和脂肪酸(PUFA)代謝物のレベルを決定することによって実施される。本明細書中で使用される用語「サンプル」は、患者由来の任意の生物学的サンプルを指す。例としては、限定するものではないが、唾液、毛髪、皮膚、組織、痰、血液、血漿、血清、硝子体、脳脊髄液、尿、精液および細胞が挙げられる。
脂質は、実施例においてさらに詳述されるように、血漿サンプルから抽出される。抽出された脂質中のエイコサノイドおよび/またはPUFA代謝物の正体および量をまず決定し、その後好適な対照と比較した。上記の決定は、任意の好適な脂質アッセイ技術、好ましくはハイスループットな脂質アッセイ技術；例えば、分光光度分析(Chengら, Lipids, 46(1)：95-103(2011年)の比色分析スルホホスホバニリン(SPV)評価法のような)によって行うことができる。脂質含有量の検出および定量に適した他の分析法は当業者に公知であり、例えば、限定するものではないが、ELISA、NMR、UV-Visまたはガス液体クロマトグラフィー、HPLC、UPLCおよび/またはMS、あるいはRIA法、酵素ベースの発色法が挙げられる。脂質抽出は、当業者に公知の様々な方法(BlighおよびDyer, Can J Biochem Physiol., 37, 911(1959年)に記載される液体サンプルのための従来の方法など)によって実施することもできる。
肝疾患進行の一般的判定のため、得られた値を正常対照と比較することができる。非アルコール性肝疾患(NAFLD)を有すると診断された患者において、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)を、非アルコール性脂肪肝(NAFL)と区別するため；例えば、NASHであるかまたは肝硬変であるかの決定のため、および/またはNASHとNAFLの鑑別のためである。対照は、正常対照を含み得る。対照と比較した遊離エイコサノイドおよび/またはPUFA代謝物の増加は、肝疾患の進行リスクの増加および/またはNASHの望ましい鑑別を示し、それに応じて治療を適用することができる。一部の例では、正常代謝物が酸化されるかまたは別の代謝物に変換される場合、1つ以上のエイコサノイドおよび/またはPUFAの低下があり得る。
遊離エイコサノイドおよびPUFA代謝物のレベルは、AUROC(受信者動作特性曲線下面積(Area Under Receiver Operating Characteristic Curve))として表される。AUROCは、安定同位体希釈により遊離エイコサノイドおよびPUFA代謝物のレベルを測定することによって決定される。手短に言えば、同一量の重水素化内部標準を、各サンプル、および標準曲線を作成するために使用される全ての一次標準に加える。エイコサノイドおよびPUFA代謝物のレベルは、内因性代謝物と対応する重水素化内部標準との比率を決定することによって計算される。比率は、線形回帰によって絶対量に変換される。個々のエイコサノイド代謝物は、カイ二乗検定、t-検定およびAUROCなどの統計学的解析を用いて、診断検査能およびNAFLとNASHを鑑別する能力について評価される。
肝疾患の進行リスクの増加は、約少なくとも0.8、約少なくとも0.9、約少なくとも0.95、約少なくとも0.96、約少なくとも0.97、約少なくとも0.98、約少なくとも0.99または1.0のAUROC値によって決定される。
本発明は、その全ての態様において、以下の実施例にさらに説明される。しかし、この実施例は、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を限定するものではない。
実施例1
コホートのデモグラフィック
この研究は、19人のNAFLDを有する患者(10人はNAFLの症例、9人はNASHの症例)と、10人の非NAFLD正常対照を含んでいた。NAFLDを有する患者の詳細なベースラインの特徴、例えばデモグラフィック、肥満度指数、生化学的検査、脂質プロファイル、対照についてのMRI-PDFF、および肝生検データなどは、表1に記載される。非NAFLD対照は、より低年齢で、より低いBMIを有し、また予想どおりより低い血清ALT、AST、GGT、ならびにグルコースおよびインスリンレベルを有していた。日常的な肝臓関連検査および代謝検査は、血漿トリグリセリドが、NASHを有する患者においてわずかに高かったことを除けば、NAFLとNASHとの間で有意に異ならなかった(表1)。NAFLを有する患者と比較して、NASHを有する患者は、より高度な脂肪症、膨化変性、小葉炎症および線維症を伴うより重度の肝組織像を有していた。
実施例2
PUFAおよび代謝物のリピドミクスプロファイリング
現在のところ、NASHを他の脂肪肝状態と区別するために十分な特異性を有する非侵襲的バイオマーカーは存在しない。肝生検は、依然としてNAFLとNASHを確実に同定するための基準であるが、その手段は侵襲的であり、一定のリスクを有する。このため、非侵襲的手段は治療選択肢および予後診断に有用な情報を提供することから、NAFLDを正確に特徴づけて病期分類することができる非侵襲的手段の開発に対して、臨床コミュニティーから大きな需要がある。炎症および酸化ストレスは、比較的良性の転帰を伴う脂肪症から、肝硬変および肝細胞癌のリスクを伴うNASHへの疾患進行の一因となる。本発明では、液体クロマトグラフィーおよび質量分析を使用して、NASH患者における肝炎に特徴的な循環中の生理活性脂質および脂質過酸化産物をプロファイリングおよび定量した。
肝生検スコアに従って階層化された、NAFLまたはNASHを有することが疑われる患者の十分に特徴づけられたコホートにおいて、完全なエイコサノイドプロファイルを確立し、アラキドン酸(20：4 ω6)および関連の多価不飽和脂肪酸(PUFA)に由来する遊離エイコサノイド(リノール酸(18：2 ω6)、a-リノレン酸(18：3 ω3)、ジホモガンマリノレン酸(20：3 ω6)、エイコサペンタエン酸(20：5 ω3)およびドコサヘキサエン酸(22：6 ω3)など)の血漿レベルを評価した(表1)。初期エイコサノイドプロファイルは、発明者らの分析的プラットフォームが確実に測定することができる158の個々の代謝物で構成した。これらのうち、26のエイコサノイドが、対照、NAFLまたはNASHの血漿サンプル中に測定可能なレベルで存在していた(表2)。これらのメディエーターは、複雑な生合成機構ならびに複数の修飾および分解経路を通じて産生された(27)。図1および2に示されるとおり、全3つの主要な酵素的経路(シクロオキシゲナーゼ経路(COX-1およびCOX-2)、リポキシゲナーゼ経路(5-LOX、12-LOXおよび15-LOX)ならびにシトクロムP450(CYP)経路)に由来するエイコサノイドは、対照、NAFLおよびNASHのサンプル中に様々な量で存在していた。ヒト血小板中でトロンボキサンシンターゼによって産生される一次AA代謝産物の1つである、COX由来トロンボキサンB2(TXB2)および12-ヒドロキシ-ヘプタトリエン酸(12-HHTrE)は、対照サンプル中では低レベルで検出されたが、NAFLサンプルおよびNASHサンプルのいずれにおいても有意に高かった；しかし、NAFLとNASHの間に有意差は見られなかった。対照的に、プロスタグランジンE2(PGE2)はNASHサンプル中でのみ上昇し、対照とNAFLの間に差は観察されなかった(図1)。プロスタグランジンD2(PGD2)は、いずれのサンプル中でも検出されなかったが、分解産物である13,14-ジヒドロ-15-ケトPGD2(dhk PGD2)は、NAFL(p値＜0.0011)または対照(p値＜0.0002)と比較すると、NASHにおいて有意に高かった(図1)。
LOX由来代謝物はまた、NAFLDにおいても増加した。5-LOX、12/15-LOX経路のAA由来産物は、NAFLにおいて最も高いと考えられるが(図1)、関連PUFA由来の代謝物(リノール酸、a-リノレン酸、ジホモガンマリノレン酸、EPAおよびDHAなど)は、NASHにおいて一般的により高いという点に注目すべきである(図2)。同様に、CYP経路のAA由来代謝物は、NASHにおいては大部分が上昇したが、NAFにおいては健康な対照と比較して変化しなかった(図1および2)。特に、11,12-ジヒドロキシ-エイコサトリエン酸(11,12-diHETrE)および14,15-ジヒドロキシ-エイコサトリエン酸(14,15-diHETrE)は、NASHにおいて、NAFLまたは対照と比較して有意に上昇した。これらの代謝物は、当初の基質AAに対するCYPエポキシゲナーゼ経路の一次産物であるエポキシエイコサトリエン酸に対する可溶性エポキシドヒドラーゼ(sEH)の作用によって産生される。心保護的血管拡張、白血球抗遊走および抗炎症作用などの多くの生物学的作用が、エポキシエイコサトリエン酸に起因する。エポキシドの、sEHによる対応するジオールへの変換は、それらの機能的レベルを低下させ、これにより関連する健康上の利益を減少させる。同様に、20-ヒドロキシエイコサテトラエン酸(20-HETE)(CYPヒドロキシラーゼ経路によって合成されるAA代謝物)は、重要な血管作動特性を有すると報告されている。血漿中では20-HETEは検出されなかったが、NASHサンプル中では20-カルボキシアラキドン酸(20-COOH AA)の一貫した増加が見られた。しかし、NAFLとNASHを比較した場合、20-COOH AAの増加は、この特定のサンプルセットにおいては統計学的有意に達しなかった(表2)。20-HETEの、20-COOH AAへの変換はCYP酵素によって触媒され、生物活性の低下に関与する。
実施例3
NASHを検出するための診断ツールとしてのエイコサノイドパネルの同定
表2に基づき、NAFLDの評価において9つのバイオマーカーが有意であることが見出された。AUROCを用いてこれらの個々の診断検査能を評価し、それらを表3に報告した。NAFLをNASHと鑑別するための単一バイオマーカーとしての最上位候補は、11,12s-diHETrE(AUROCは1)であった。さらに、dhkPGD 2 および20-COOH AAを含むパネルがAUROC 1を有することが見出された。
実施例4
方法
研究設計および参加者
この研究は、生検により確定診断されたNAFLD(NASHおよびNAFLを含む)を有する3群の独特の表現型の患者ならびに正常な非NAFLD対照を含む前向きコホート内症例対照研究に由来する横断的分析であった。全参加者は、カリフォルニア大学サンディエゴ校(UCSD)非アルコール性脂肪性肝疾患研究病院(NAFLD Research Clinic)に由来し、2011年1月から2012年11月(18-20)に診察された。全参加者はのインフォームド・コンセント書面を提出し、病歴、アルコール使用および定量歴(quantification history)(AuditおよびSkinner質問票を使用)、身体検査、身体測定、空腹時生化学検査を含む詳細な標準化臨床研究診察ならびに他の原因の肝疾患の詳細な除外を受けた(以下の試験対象基準および試験除外基準を参照されたい)。臨床研究診察日の朝に、空腹時血漿サンプルを採取し、カリフォルニア大学サンディエゴ校非アルコール性脂肪性肝疾患トランスレーショナルリサーチユニット(Translational Research Unit)に収容された-80℃のフリーザー中で保存した。
コホートの説明
この研究に包まれるNAFLDの全ての症例は、NAFLDの肝生検による確定診断を有していた。生検は、臨床データ、リピドミックデータおよび画像データに対して盲検化された、経験を積んだ肝臓病理医によってスコア付けされた。NASH CRN組織学的スコアリングシステムを使用して、生検をスコア付けした。全患者において、NAFLD活性スコア(NAS)ならびに線維症スコアを記録した。NASスコアは0〜8の範囲であり、また脂肪症の程度(0〜3)、小葉炎症の程度(0〜3)、および肝細胞膨張の程度(0〜2)の総和である。肝線維症は0〜4の範囲であって、0は線維症なし、4は肝硬変である。
NASHの定義
生検により確定診断されたNAFLDを有する患者であって、主にゾーン3大滴性脂肪症および小葉炎症、ならびに古典的膨化変性の存在を有していた者を、NASHを有すると分類した。
NAFLDの試験対象基準および試験除外基準
試験対象基準は、同意プロセスの間少なくとも18歳であること、インフォームド・コンセント書面を提出する能力および意志、NAFLDと整合してアルコール使用歴が最小であるかまたはアルコール使用歴がないこと(除外基準を参照)、および肝生検の90日以内の血漿の採取、を含んでいた。試験除外基準は、アルコール性肝疾患の臨床的または組織学的証拠：問診前2年以内の習慣的且つ過剰なアルコールの使用(男性では1週間に14杯超、または女性では1週間に7杯超のアルコール摂取として定義される)を含んでいた。約10gのアルコールが1「杯」単位に相当する。1単位は1オンスの蒸留酒、1本12オンスのビール、または1杯4オンスのグラスワインに相当し、肝脂肪症の二次的原因として、既往手術、肥満手術、完全非経口栄養、短腸症候群、脂肪合成薬物療法(steatogenic medication)、血清中のHBsAgの存在によって示される慢性B型肝炎の証拠、血清中の抗HCVまたはHCV RNAの存在によって示される慢性C型肝炎の証拠、他の原因の肝疾患(例えば、アルファ-1-抗トリプシン欠乏症、ウィルソン病、糖原病、異常βリポタンパク質血症、既知表現型ヘモクロマトーシス、自己免疫性肝疾患もしくは薬物性肝臓損傷)の証拠、または随伴性重症基礎全身性疾患が挙げられ、これらは、治験責任医師の意見では本研究を妨げる可能性がある。
正常対照の定義
この研究の新規な態様は、独特に十分特徴づけられた非NAFLD正常対照群を含むことであった。参加者は、5％未満のMRI-PDFF由来の脂肪画分による正確な肝脂肪定量により、正常な非NAFLDと分類された(18,20)。肝生検は、正常個体においては非倫理的である。他の非侵襲的手段、例えば超音波およびコンピューター断層撮影法は不正確であり、とりわけ1〜10％の肝臓脂肪画分において感度が不足する。このため、本研究においては、肝脂肪症の不存在の正確な診断のためにMRI-PDFFを利用した(Noureddinら, Hepatology (2013年)、58：1930)。MRI-PDFFは、非常に正確で、高感度で、再現性があり、且つ精密である。
正常(非NAFLD)対照コホートの試験対象基準および試験除外基準
健康な(非NAFLD)対照群における試験対象基準は、(1)18歳超；(2)肝臓MRI-PDFF＜5％；および(3)既知の肝疾患の病歴なし、を含んでいた。試験除外基準は、(1)18歳未満；(2)顕著な全身性疾患；(3)MRIを受けることができない；および(4)肝疾患の可能性の証拠(任意の以前の肝生検、要請のB型肝炎表面抗原、C型肝炎ウイルスRNA、または自己免疫性血清学、アルファ-1抗トリプシン欠乏症、ヘモクロマトーシス遺伝子検査もしくは低セルロプラスミンなど)を含んでいた。
脂質抽出
リピドミックプロファイリングのための血漿サンプルを、症例および対照それぞれに対する肝生検およびMRI-PDFFの90日以内に得た。先に記載したとおり、遊離脂肪酸およびエイコサノイドの単離のため、全ての血漿サンプルを-80℃で保存し、1回解凍して直ぐに使用した。手短に言えば、50μlの血漿に、26種類の重水素化内部標準(Cayman Chemicals社(アナーバー、ミシガン州)から個別に購入)のカクテルを添加し、10％メタノールを用いて1mlの体積にした。次いで、3mlの100％メタノール、その後3mlの水を用いた連続洗浄からなる活性化手段を用いて、Strata-Xカラム(Phenomenex社、トーランス、カリフォルニア州)上の固相抽出によってサンプルを精製した。次いで、エイコサノイドを1mlの100％メタノールで溶出し、溶出剤を真空下で乾燥させ、60/40/0.02 水/アセトニトリル/酢酸 = 60/40/0.02(v/v/v)からなる50μlのバッファーAに溶解し、以下のとおりに直ぐに分析に使用した。遊離脂肪酸分析については、50μlの血漿に重水素化脂肪酸標準を添加し、メタノールおよびイソオクタンによる選択的抽出によって遊離脂肪酸を単離した。抽出された脂肪酸を誘導体化し、ガスクロマトグラフィーおよび質量分析により、記載された(Dumlaoら (2011年)、1811：724)ようにして分析した。
逆相液体クロマトグラフィーおよび質量分析
血漿中のエイコサノイドを分析し、液体クロマトグラフィータンデム質量分析(LC-MS/MS)によって定量した。手短に言えば、エイコサノイドを、1.7uM 2.1x100mm BEHシールドカラム(Waters社、ミルフォード、マサチューセッツ州)およびAcquity UPLCシステム(Waters社、ミルフォード、マサチューセッツ州)を用いた逆相クロマトグラフィーによって分離した。カラムをバッファーAで平衡化し、5μlのサンプルを、オートサンプラーにより注入した。100％バッファーAで開始して1分間、次いで50％バッファーB(50％アセトニトリル、50％イソプロパノールおよび0.02％酢酸からなる)にて3分間にわたって、その後100％バッファーBにて1分間にわたって行う段階的勾配を用いて、サンプルを溶出した。液体クロマトグラフィーをlonDrive Turbo Vイオン源と接続して、三連四重極型AB SCIEX 6500 QTrap質量分析計(AB SCIEX社、フラミンガム、マサチューセッツ州)上で質量スペクトル分析を実施した。エイコサノイドを、ネガティブイオンモードのエレクトロスプレーイオン化、および最も豊富な特定の前駆体イオン/生成物イオン遷移を用いた多重反応モニタリング(MRM)を用いて測定し、158種類の分析物と26種類の内部標準を検出することができる取得法を構築した。イオンスプレー電圧を、温度550℃で−4500Vに設定した。エイコサノイド前駆体イオンの衝突活性化は、各代謝物に対して最適化されたデクラスタリング電位、入口電位および衝突エネルギーを有する衝突ガスとしての窒素を用いて達成した。エイコサノイドは、それらのMRMシグナルおよびクロマトグラフィー保持時間を純同一標準のMRMシグナルおよびクロマトグラフィー保持時間と一致させることによって同定した。
脂質の定量
エイコサノイドおよび遊離脂肪酸を、安定同位体希釈法によって定量した。手短に言えば、同一量の重水素化内部標準を、各サンプル、および標準曲線を作成するために使用した全ての一次標準に加えた。サンプル中のエイコサノイドおよび遊離脂肪酸の量を計算するため、内因性代謝物と対応する重水素化内部標準のピーク面積の比率を計算した。比率は、同一条件下で作成された標準曲線の線形回帰分析により、絶対量に変換した。
統計学的解析
カテゴリー変数間の比較にはカイ二乗(x2)検定を使用し、連続変数間の比較にはt-検定を使用した。本発明者らは、正常対照、生検により確定診断された軽度NAFLを有する患者、および生検により確定診断されたNASHを有する患者の間の、血漿エイコサノイドプロファイルにおける差を試験した。最終的に、本発明者らは、NAFLをNASHと鑑別するためのバイオマーカーとして有意差を生じた9つのバイオマーカーの診断精度を試験した。両側p値0.05は統計的に有意であると考えられた。統計学的解析は、SAS統計ソフトウェアパッケージバージョン9.4(ケーリー、ノースカロライナ州、SAS Inc.社)を用いて実施した。
本発明は以下の実施形態を包含する。
[１] 肝疾患と診断された患者における肝疾患の進行リスクを予測または評価する実質的に非侵襲的な方法であって、該患者の血漿サンプル中の1つ以上の遊離エイコサノイドおよび/または多価不飽和脂肪酸(PUFA)代謝物のレベルを測定することを含み、ここで正常対照と比較した遊離エイコサノイドおよび/またはPUFA代謝物の増加または低下は、肝疾患の進行リスクの増加を示す、前記方法。
[２] 以下：
(a) 前記血漿サンプルからの脂質の抽出；
(b) 該抽出された脂質においてエイコサノイドおよび/またはPUFA代謝物を同定すること；
(c) 該抽出された脂質においてエイコサノイドおよび/またはPUFA代謝物のレベルを定量すること；および
(d) 該決定されたレベルを、正常対照において決定されたレベルと比較すること、ここで該対照と比較した遊離エイコサノイドおよび/またはPUFA代謝物の増加または低下は、肝疾患の進行リスクの増加を示す、
を含む、実施形態１に記載の方法。
[３] 前記肝疾患が、非アルコール性脂肪肝疾患(NAFLD)である、実施形態１に記載の方法。
[４] 前記NAFLDが、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)である、実施形態３に記載の方法。
[５] 前記得られた結果が医師に伝えられる、実施形態１に記載の方法。
[６] 前記医師が、前記結果が肝疾患の進行を示すことを確認し、それに応じて治療を前記患者に適用する、実施形態５に記載の方法。
[７] 前記1つ以上の遊離エイコサノイドおよび/またはPUFA代謝物が、PGE2、dhk PGD2、テトラノル-12-HETE、15-HETE、11,12-diHETrE、14,15-diHETrE、20-COOH AA、9-オキソODE、12,13-EpOME、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、実施形態１に記載の方法。
[８] 前記1つ以上の遊離エイコサノイドおよび/またはPUFA代謝物が、11,12-diHETrE、dhk PGD2および/もしくは20-COOH AA、またはそれらの任意の組み合わせである、実施形態７に記載の方法。
[９] 前記1つ以上の遊離エイコサノイドおよび/またはPUFA代謝物が、dhk PGD2および20-COOH AAである、実施形態８に記載の方法。
[１０] 前記1つ以上の遊離エイコサノイドおよび/またはPUFA代謝物が、20-COOH AAである、実施形態８に記載の方法。
[１１] 前記1つ以上の遊離エイコサノイドおよび/またはPUFA代謝物が、AUROCによって測定される、実施形態１に記載の方法。
[１２] 前記AUROCが、約少なくとも0.8である、実施形態１１に記載の方法。
[１３] 前記AUROCが、約少なくとも0.9である、実施形態１１に記載の方法。
[１４] 前記AUROCが、約少なくとも0.99である、実施形態１１に記載の方法。
[１５] 前記肝疾患の進行リスクが、肝硬変への進行である、実施形態１に記載の方法。
[１６] 肝疾患と診断された患者において、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)を、非アルコール性脂肪肝および非-非アルコール性脂肪肝疾患と区別する実質的に非侵襲的な方法であって、該患者の血漿中の1つ以上の遊離エイコサノイドおよび/または多価不飽和脂肪酸(PUFA)代謝物のレベルを測定することを含み、ここで1つ以上の遊離エイコサノイドおよび/またはPUFA代謝物のレベルの増加または低下は、該患者がNASHを有することを示す、前記方法。
[１７] 実施形態１６に記載の方法であって、以下：
(a) 前記血漿サンプルから抽出された脂質の抽出；
(b) 該抽出された脂質においてエイコサノイドおよび/またはPUFA代謝物を同定すること；
(c) 該抽出された脂質においてエイコサノイドおよび/またはPUFA代謝物のレベルを定量すること；および
(d) 該決定されたレベルを、肝疾患と診断された患者における非アルコール性脂肪肝および非-非アルコール性脂肪肝疾患、および場合によりさらに正常対照において得られたレベルと比較すること、ここで該対照と比較した、特定の遊離エイコサノイドおよび/またはPUFA代謝物の増加または低下は、該患者がNASHを有することを示す、
を含む、前記方法。
[１８] 前記1つ以上の遊離エイコサノイドおよび/またはPUFA代謝物が、PGE2、dhk PGD2、テトラノル-12-HETE、15-HETE、11,12-diHETrE、14,15-diHETrE、20-COOH AA、9-オキソODE、12,13-EpOME、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、実施形態１６に記載の方法。
[１９] 前記1つ以上の遊離エイコサノイドおよび/またはPUFA代謝物が、11,12-diHETrE、dhk PGD2および/もしくは20-COOH AA、またはそれらの任意の組み合わせである、実施形態１８に記載の方法。
[２０] 前記1つ以上の遊離エイコサノイドおよび/またはPUFA代謝物が、dhk PGD2および20-COOH AAである、実施形態１９に記載の方法。
[２１] 前記1つ以上の遊離エイコサノイドおよび/またはPUFA代謝物が、20-COOH AAである、実施形態１９に記載の方法。
[２２] 前記1つ以上の遊離エイコサノイドおよび/またはPUFA代謝物が、AUROCによって測定される、実施形態１６に記載の方法。
[２３] 前記AUROCが、約少なくとも0.8である、実施形態２２に記載の方法。
[２４] 前記AUROCが、約少なくとも0.9である、実施形態２２に記載の方法。
[２５] 前記AUROCが、約少なくとも0.99である、実施形態２２に記載の方法。

Claims (21)

  1. 脂肪肝と診断された患者における脂肪肝疾患の進行リスクを予測または評価する方法であって、該患者の血液、血清若しくは血漿サンプル中のdhk-PGD2のレベルを測定することを含み、ここで正常対照と比較したdhk-PGD2の増加は、脂肪肝疾患の進行リスクの増加を示す、前記方法。
  2. 以下：
    (a) 前記血液、血清若しくは血漿サンプルからの脂質の抽出；
    (b) 該抽出された脂質においてdhk-PGD2を同定すること；
    (c) 該抽出された脂質においてdhk-PGD2のレベルを定量すること；および
    (d) 該決定されたレベルを、正常対照において決定されたレベルと比較すること、ここで該対照と比較したdhk-PGD2の増加は、脂肪肝疾患の進行リスクの増加を示す、
    を含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記脂肪肝疾患が、非アルコール性脂肪肝疾患(NAFLD)である、請求項１に記載の方法。
  4. 前記NAFLDが、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)である、請求項３に記載の方法。
  5. さらに、PGE2、テトラノル-12-HETE、15-HETE、11,12-diHETrE、14,15-diHETrE、20-COOH AA、9-オキソODE、12,13-EpOME、またはそれらの任意の組み合わせから選択される、1つ以上の遊離エイコサノイドおよび/またはPUFA代謝物のレベルを測定することを含む、請求項１に記載の方法。
  6. 前記1つ以上の遊離エイコサノイドおよび/またはPUFA代謝物が、11,12-diHETrEおよび/もしくは20-COOH AA、またはそれらの任意の組み合わせから選択される、請求項５に記載の方法。
  7. 前記1つ以上の遊離エイコサノイドおよび/またはPUFA代謝物が、20-COOH AAである、請求項６に記載の方法。
  8. 前記dhk-PGD2が、AUROCによって測定される、請求項１に記載の方法。
  9. 前記AUROCが、少なくとも0.8である、請求項８に記載の方法。
  10. 前記AUROCが、少なくとも0.9である、請求項８に記載の方法。
  11. 前記AUROCが、少なくとも0.99である、請求項８に記載の方法。
  12. 前記脂肪肝疾患の進行リスクが、肝硬変への進行である、請求項１に記載の方法。
  13. 脂肪肝と診断された患者において、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)を、非アルコール性脂肪肝および非-非アルコール性脂肪肝疾患と区別する方法であって、該患者の血液、血清若しくは血漿中のdhk-PGD2のレベルを測定することを含み、ここでdhk-PGD2のレベルの増加は、該患者がNASHを有することを示す、前記方法。
  14. 請求項１３に記載の方法であって、以下：
    (a) 前記血液、血清若しくは血漿サンプルから脂質を抽出すること；
    (b) 該抽出された脂質においてdhk-PGD2を同定すること；
    (c) 該抽出された脂質においてdhk-PGD2のレベルを定量すること；および
    (d) 該決定されたレベルを、脂肪肝と診断された患者における非アルコール性脂肪肝および非アルコール性脂肪肝疾患、および／または正常対照において得られたレベルと比較すること、ここで該非アルコール性脂肪肝もしくは正常対照と比較した、dhk-PGD2の増加は、該患者がNASHを有することを示す、
    を含む、前記方法。
  15. さらに、PGE2、テトラノル-12-HETE、15-HETE、11,12-diHETrE、14,15-diHETrE、20-COOH AA、9-オキソODE、12,13-EpOME、またはそれらの任意の組み合わせから選択される、1つ以上の遊離エイコサノイドおよび/またはPUFA代謝物のレベルを測定することを含む、請求項１３に記載の方法。
  16. 前記1つ以上の遊離エイコサノイドおよび/またはPUFA代謝物が、11,12-diHETrEおよび/もしくは20-COOH AA、またはそれらの任意の組み合わせから選択される、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記1つ以上の遊離エイコサノイドおよび/またはPUFA代謝物が、20-COOH AAである、請求項１６に記載の方法。
  18. dhk-PGD2が、AUROCによって測定される、請求項１３に記載の方法。
  19. 前記AUROCが、少なくとも0.8である、請求項１８に記載の方法。
  20. 前記AUROCが、少なくとも0.9である、請求項１８に記載の方法。
  21. 前記AUROCが、少なくとも0.99である、請求項１８に記載の方法。
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Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2732310T3 (es) * 2013-12-10 2019-11-21 Univ California Diagnóstico diferencial de enfermedad hepática
KR102510365B1 (ko) * 2015-02-13 2023-03-15 더 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아 비-알코올성 지방 간 질병을 확인하기 위한 방법 및 조성물
MX2017017136A (es) * 2015-06-26 2018-05-28 Pronova Biopharma Norge As Composicion para el tratamiento de la nafld.
EP3151007A1 (en) 2015-09-30 2017-04-05 One Way Liver S.L. Metabolomic signature of diagnosis and disease progression in non-alcoholic fatty liver disease (nafld)
WO2017167821A1 (en) * 2016-03-29 2017-10-05 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Lipid biomarkers and compositions
EP3246401A1 (en) 2016-05-20 2017-11-22 Commissariat À L'Énergie Atomique Et Aux Énergies Alternatives New fatty acid decarboxylase and its uses
WO2018007422A1 (en) 2016-07-05 2018-01-11 One Way Liver,S.L. Identification of human non-alcoholic fatty liver disease (nafld) subtypes
CN107630084A (zh) * 2016-07-18 2018-01-26 昆山德诺瑞尔生物科技有限公司 非酒精性脂肪性肝炎的多基因组合检测试剂盒
ES2949940T3 (es) * 2017-03-14 2023-10-04 Sjt Molecular Res Sl Compuestos para uso en la prevención y/o el tratamiento de esteatosis hepática no alcohólica y esteatohepatitis no alcohólica
EP3502703A1 (en) * 2017-12-22 2019-06-26 Metanomics Health GmbH Method for the assessment of nafld
WO2020073000A1 (en) * 2018-10-05 2020-04-09 The Regents Of The University Ofcalifornia Methods and compositions for determination of non-alcoholic fatty liver disease (nafld) and non-alcoholic steatohepatitis (nash)
KR102186416B1 (ko) * 2019-01-16 2020-12-07 서울대학교산학협력단 12-lox 발현 촉진제를 포함하는 간 질환 예방 또는 치료용 조성물
CN110057955B (zh) * 2019-04-30 2021-06-11 中国医学科学院病原生物学研究所 乙型肝炎特异性血清标志物的筛选方法
US20220308071A1 (en) * 2019-06-13 2022-09-29 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for determination of liver fibrosis
CN112964807B (zh) * 2021-03-30 2022-09-23 浙江大学 乙肝慢加急性肝衰竭预后的代谢标记物及其筛选方法

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5753702A (en) * 1996-05-22 1998-05-19 University Of Vermont Arachidonic acid metabolite, 16-hete
US6395781B1 (en) * 1998-02-26 2002-05-28 Mcw Research Foundation 20-HETE antagonists and agonists
SE0301009D0 (sv) * 2003-04-07 2003-04-07 Astrazeneca Ab Novel compounds
ES2288358B1 (es) * 2005-07-01 2008-11-16 Proyecto De Biomedicina Cima, S.L. Marcadores de fibrosis.
US20090304704A1 (en) * 2006-05-03 2009-12-10 Geisinger Clinic Methods for diagnosing and predicting non-alcoholic steatohepatitis (nash)
CN101523221A (zh) * 2006-08-08 2009-09-02 利普米克斯科技公司 非酒精性脂肪肝病(nafld)和非酒精性脂肪性肝炎(nash)的标记及其使用方法
WO2009090882A1 (ja) * 2008-01-18 2009-07-23 The University Of Tokyo 非アルコール性脂肪性肝疾患の診断方法
US20130131140A1 (en) * 2010-01-14 2013-05-23 Jerry L. Nadler Treatment of diabetes and disorders associated with visceral obesity with inhibitors of human arachidonate 12 lipoxygenase and arachidonate 15-lipoxygenase
WO2011140093A2 (en) * 2010-05-03 2011-11-10 The Cleveland Clinic Foundation Detection and monitoring of nonalcoholic fatty liver disease
US9140686B2 (en) 2010-06-10 2015-09-22 Metanomics Health Gmbh Biomarkers for diagnosing liver disease
WO2012049874A1 (ja) * 2010-10-13 2012-04-19 ヒューマン・メタボローム・テクノロジーズ株式会社 脂肪性肝疾患を診断するためのバイオマーカー、その測定方法、コンピュータプログラム、および、記憶媒体
JP6260275B2 (ja) * 2011-06-30 2018-01-17 味の素株式会社 脂肪肝の評価方法、脂肪肝評価装置、脂肪肝評価方法、脂肪肝評価プログラム、脂肪肝評価システム、および端末装置
EP2810079A4 (en) * 2012-01-31 2015-08-05 Teknologian Tutkimuskeskus Vtt Oy PROCESS FOR DETERMINING THE LIVERY QUANTITY OF LIQUID AND METHOD FOR DIAGNOSIS OF NAFLD
JP6143015B2 (ja) * 2012-04-27 2017-06-07 宮崎　徹 肝疾患の予防または治療剤
ES2732310T3 (es) * 2013-12-10 2019-11-21 Univ California Diagnóstico diferencial de enfermedad hepática

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