JP2016525676A - リピドミックバイオマーカー - Google Patents

Abstract

本出願はＣ型肝炎および肝線維症および肝細胞がんなどの関連症状に対する新規なリピドミックマーカーを提供する。【選択図】図２

Description

本願は米国仮特許出願第61/818,621号（2013年5月2日）に基づく優先権の利益を主張する。本出願の内容はその全体が援用により本明細書に組み込まれる。

本出願は病気や疾患の診断および／または予後診断、特に、リピドミックバイオマーカーを用いる診断および／または予後診断に関する。

一態様はＣ型肝炎感染症またはその感染症が原因の疾患もしくはその感染症を併発する疾患を評価する方法である。その方法は：（ａ）評価を必要とする対象から生体試料を入手すること；（ｂ）その生体試料中の少なくとも一種のＣ型肝炎リピドミックバイオマーカーの水準を決定すること；および（ｃ）工程（ｂ）の水準をＣ型肝炎リピドミックバイオマーカーの対照水準と比較し、対象のＣ型肝炎感染症またはその感染症が原因の疾患もしくはその感染症を併発する疾患を評価すること、を含む。

別の態様は治療反応性を評価する方法であって、（ａ）評価を必要とする対象に薬剤を投与すること；（ｂ）その対象から生体試料を入手すること；（ｃ）その生体試料のグルコシルセラミド、ラクトシルセラミドおよびスフィンゴミエリンのうちの少なくとも一種の不飽和指数を決定すること；および（ｄ）その不飽和指数の値を対照不飽和指数値と比較し薬剤に対する反応性を評価することを含み、決定された不飽和指数の値が対照値よりも高い場合に対象は薬剤に反応している、および／または治療効果があることを意味する方法である。

更に別の態様はインターフェロンおよびリバビリンのうちの少なくとも一種を含むＣ型肝炎治療に対する反応が見込めないＣ型肝炎患者を特定する方法である。その方法は：（ａ）Ｃ型肝炎感染症にかかっている対象から生体試料を入手すること；（ｂ）その生体試料のリポタンパク質中のグルコシルセラミド、ラクトシルセラミドおよびスフィンゴミエリンのうちの少なくとも一種の不飽和指数を決定すること；および（ｃ）その決定値を対照不飽和指数値と比較することを含み、その決定値が不飽和の対照値よりも高い場合、対象はインターフェロンおよびリバビリンのうちの少なくとも一種を含むＣ型肝炎治療に反応が見込めない、および／または治療効果が見込めない特定方法である。

図１は、選択された実験で用いる選択イミノ糖：ａ）Ｎ−ブチル−デオキシノジリマイシン（NB-DNJ；UV-1またはミグルスタット（miglustat））；ｂ）Ｎ−（９−メトキシノニル）−デオキシノジリマイシン（N9-DNJまたはUV-4）；ｃ）Ｎ−（５−アダマンタン−１−イル−メトキシ−ペンチル）−デオキシノジリマイシン（アダマンタン-ペンチル-dNM；AMP-DNMまたはAMP-DNJ）；ｄ）Ｎ−（Ｎ−ブチル）デオキシガラクトジリマイシン（NB-DGJ）；ｅ）Ｎ−（７−オキサ−ノニル）−１，５，６−トリデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−ガラクチトール（N-7-オキサ-ノニル MeDGJ）（UT231-B）；ｆ）Ｎ−（Ｎ−｛４’−アジド−２’−ニトロフェニル｝−６−アミノヘキシル）デオキシノジリマイシン（NAP-DNJまたはUV-5）を模式的に示す。これらの化合物は対応する糖分子環内の酸素原子が窒素原子で置換されているという共通の特徴を共有する。UV-1／NB-DNJ／ミグルスタットはZavesca（登録商標；ゴーシェ病の治療に用いられるグルコシルセラミドの阻害剤）の医薬品活性成分（ＡＰＩ）の成分である。NB-DGJはガラクトース型頭頂基を有するがグルコシルセラミド合成酵素の特異的阻害剤であり、ＥＲαグルコシダーゼに対しては阻害活性を示さない（グルコシダーゼも阻害するエピマー類似体のNB-DNJとは異なる）。

図２は、肝がんに感染した細胞および非感染細胞の測定した総脂肪酸含有量を提示する。細胞脂質の加水分解後の各試験群の脂肪酸メチルエステルの合計を示す。

図３（ａ）、（ｂ）は、図１の種々の化合物で処理した肝がん細胞およびＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に感染した肝がん細胞の総細胞脂肪酸組成の分析結果を提示する。提示した数字は脂肪酸メチルエステルの分析で決定された各脂肪酸の百分率組成である。データバーはMicrosoft Excel 2007のデフォルト設定を用いて、「縦に」符号化し、分子種毎の変化（ａ）を赤で、全体的な組成の変化（ｂ）を青で強調表示する。（前者の符号化は強調していなければ目立たないほどの僅かな種の変化を強調する）。

図４（ａ）〜（ｆ）は、異なる種類の細胞間で、総細胞脂肪酸組成中の特定の脂肪酸の割合を比較する。（ａ）ミード酸；（ｂ）ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）；（ｃ）オレイン酸；（ｄ）リノール酸；（ｅ）パルミトレイン酸ｗ９；（ｆ）パルミトレイン酸ｗ７。図４（ａ）〜（ｆ）は非感染の状態で脂肪酸組成にイミノ糖が及ぼす影響を示す。脂肪酸メチルエステル分析から特定の脂肪酸（即ち、感染またはイミノ糖の処理の結果として変化するもの）を百分率組成で示す。感染した試料は各パネルの左側（左側７本の棒線）に示す。

図５（ａ）、（ｂ）は、感染およびイミノ糖化合物影響下の包括的な不飽和指数および包括的な延長度指数を示す。脂肪酸メチルエステル分析による包括的な脂肪酸分析のデータ（図３）を、図のように非必須脂肪酸の不飽和指数および延長度指数として表示する。非感染細胞＝淡い色の棒線、感染細胞＝濃い色の棒線。

図６は、非感染細胞（左列）および感染細胞（右列）のコレステロールエステルの測定した細胞脂肪酸組成を示す。コレステロールエステルの最も多量に存在する種を材料および方法に記載した通りに測定し、百分率組成存在量として表示する。淡い色の棒線＝非感染、濃い色の棒線＝感染細胞。

図７は、感染およびイミノ糖化合物影響下の細胞トリグリセリド組成の表である。検出された種々のトリグリセリド種の百分率組成存在量を「横の」データバーで表示して各分子種の全体的な存在量の変化を示す。

図８は、感染した状態のトリグリセリド組成の変化を示す。トリグリセリド分子組成の変化は非感染の状態からの「倍率変化」で表し、存在量が著しく変化する希少種を強調表示する。濃い（青の）棒線＝感染で減少、淡い（赤の）棒線＝感染で増加。

図９は、感染およびイミノ糖の影響下のホスファチジルコリン（エステル体）の分子組成の表である。ＰＣ分子種の存在量の変化を表にする。矢印は感染した状態での増加または減少を示す。

図１０は、感染およびイミノ糖の影響下のホスファチジルコリン（エーテル体）脂肪酸組成のプロットを示す。ＰＣエーテル体（プラズマローゲン体）の組成存在量を示す。

図１１（ａ）〜（ｇ）は、感染およびイミノ糖の影響下のリゾホスファチジルコリンの脂肪酸組成のプロットを示す。各リゾＰＣ種の組成存在量（％）を示す。淡い色の棒線＝非感染、濃い色の棒線＝感染細胞。

図１２は、感染およびイミノ糖の影響下のホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）分子組成の表である。ＰＥ種の百分率存在量を縦に符号化したデータバーで表にして感染および非感染の状態間の変化を強調する。矢印は感染で増加または減少する種を示す。

図１３は、感染したホスファチジルセリン（ＰＳ）分子種の表である。ＰＳの場合、イミノ糖影響下の感染または非感染の状態では有意な変化は無かった。ＰＳ分子種の百分率存在量および非感染と感染の状態間でのその存在量の変化を割合で示す。

図１４は、感染およびイミノ糖の影響下のホスファチジルイノシトール（ＰＩ）分子種の表である。ＰＩは分子種が４種のみである。その存在量を縦のデータバーに符号化して感染した個々の分子種の存在量の変化を示す。

図１５（ａ）〜（ｆ）は、感染およびイミノ糖の影響下のスフィンゴ脂質の細胞存在量のプロットを示す。様々な処理をしたスフィンゴ脂質「セラミド」（Ｃｅｒ）、グリコシルセラミド（ＧｌｃＣｅｒ）およびラクトシルセラミド（ＬａｃＣｅｒ）の細胞存在量をタンパク質１ｍｇ当たりのナノモル単位で示す。

図１６は、グルコシルセラミドの主成分分析および判別分析の結果を示す。主成分分析（左側）および判別分析は、処理した細胞対未処理の細胞、およびイミノ糖で処理した細胞対未処理の細胞のすべてのデータセットで行った。ＧｌｃＣｅｒ２４：１とＧｌｃＣｅｒ２４：０との差異でデータセットの変化のほとんどを説明できることがＰＣＡで確認された。感染または非感染培養物からの未処理試料はこの分析では識別されなかったが、すべてのイミノ糖処理（非感染または感染状態で）の試料は未処理試料と識別できた（楕円は９５％信頼区間を示す）。

図１７は、感染およびイミノ糖の影響下のホスファチジルコリン分子種の主成分分析（ＰＣＡ）および判別分析の結果を示す。ＰＣＡおよび判別分析でＰＣ分子種（「感染」（四角の左半分）および「非感染」（四角の右半分）の主要２群を形成）が明確に識別され、Ｆ１次元（データセットの変化の９１．３％を占める）において相互に識別された。この場合、これは一価不飽和種（例えば、ＰＣ３２：１）における減少を表すが、飽和ＰＣ３２：０および３４：０並びにＰＵＦＡを多く含むＰＣ類（ＰＣ３４：４およびＰＣ３８：５）は感染によって多く含まれた（図９の矢印の列も参照）。ＧｌｃＣｅｒのＰＣＡおよび判別分析によって観察された変化とは異なり、ＰＣの場合は、イミノ糖処理した感染細胞は未処理の感染細胞と識別できなかった（その差異はＦ２（縦の）次元のほんの一部を占めるに過ぎず、それはデータセットにおける変化の僅か６．７９％であった。同様の結果がＰＥで得られた。即ち、イミノ糖処理した感染細胞は未処理の感染細胞と明確に識別されなかった。感染の作用がイミノ糖処理の作用よりも優位である。

図１８（ａ）〜（ｄ）は、感染およびイミノ糖化合物の影響下の細胞内ＧｌｃＣｅｒの不飽和指数（２４：１／２４：０）のプロットを示す。図１６に記載のＰＣＡおよび判別分析（２４：１種と２４：０種（Δ^９）間の変化がデータセットの主な変化と確認された）に続けて、対応のＧｌｃＣｅｒ不飽和指数を細胞試料および処理毎にプロットした（ａ、ｂ）。なお、ＧｌｃＣｅｒはΔ^９であるが、その脱飽和指数は感染および非感染の状態間で変化しない（ＰＣＡおよび判別分析の結果を反映している）。ＬａｃＣｅｒ（ＧｌｃＣｅｒから製造される）の不飽和指数もプロットする（ｃ、ｄ）。

特に指定がない限り、「ａ」または「ａｎ」は１以上を意味する。

本発明者らは、対象から入手した生体試料中の一種以上のリピドミックバイオマーカー（脂質代謝物であってよい）の水準を決定し、その決定された水準を対照の水準と比較することで、Ｃ型肝炎感染症および／または肝線維症、肝硬変および肝細胞がんなどの関連疾患を評価できることを見出した。

「リピドミックマーカー」または「リピドミックバイオマーカー」という用語は病気や疾患（例えば、Ｃ型肝炎感染症および／または関連疾患）のある対象の生体試料と対照の生体試料（一以上の健康な個体の試料、つまり病気や疾患のない一以上の個体の試料であってよい）間の脂質組成物中の特定の差異を指すことがある。態様によっては、「リピドミックマーカー」または「リピドミックバイオマーカー」という用語は病気や疾患（例えば、Ｃ型肝炎感染症および／または関連疾患）のある対象の生体試料と対照の生体試料間の一種以上の脂質成分またはその代謝物の絶対的存在量における特定の差異を指すことがある。更に態様によっては、「リピドミックマーカー」または「リピドミックバイオマーカー」という用語は病気や疾患（例えば、Ｃ型肝炎感染症および／または関連疾患）のある対象からの脂質成分またはその代謝物と対照間、つまり生体試料と対照間の相対的存在量における特定の差異を指すことがある。

「生体試料」は診断アッセイまたはモニタリングアッセイで用いられる生物体から入手した様々な種類の試料を包含する。この用語は血液および生体由来のその他の液体試料、生検標本や組織培養物などの固体組織試料、またはそれら由来の細胞およびその子孫を包含する。更に、この用語は循環腫瘍またはその他の細胞も包含できる。この用語は特に臨床試料を包含し、更に、細胞培養物中の細胞、細胞上清、細胞溶解物、血清、血漿、尿、羊水、生体液および組織試料を含む。この用語はまた入手後、特定の成分のために試薬で処理、可溶化、または濃縮など任意の方法で処理した試料も包含する。

生体試料は対象の体液または体組織の試料であってよい。例えば、生体試料は対象からの血液、血漿、血清、唾液、胆汁、尿、糞便または脳脊髄液の試料、もしくは細胞、組織または肝臓などの器官に由来する試料であってよい。多くの態様では生体試料として血液、血漿または血清を用いるのが好ましい。種々の手法を用いて生体試料を入手することができる。

本明細書で互換的に用いられる「個体」、「対象」、「宿主」および「患者」は診断、処置または治療が必要な任意の動物の対象、例えば、哺乳類の対象を指す。好ましい一態様では、個体、対象、宿主または患者はヒトである。その他の対象としては、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、霊長類、ウッドチャック、アヒルおよびマウスを含んでもよいが、これらに限定されない。

態様によっては、リピドミックバイオマーカーの水準を決定する前に生体試料を前処理してもよい。その前処理は、例えば、生体試料の少なくとも一画分を分離し、分離した画分中のリピドミックマーカーの水準を決定することを含んでもよい。そのような分画は、例えば、極低密度リポタンパク質画分や低密度タンパク質画分などのリポタンパク質画分、トリグリセリド画分などのグリセリド画分、またはリン脂質画分であってよい。態様によっては、分画は高密度リポタンパク質画分またはエキソソーム画分であってもよく、例えば、Keller、Sandersonら（以下の参考文献欄を参照）を参照のこと。特定の画分の分離には、好適な分離法、例えば、遠心分離、抽出、分取、限外濾過、タンパク質沈殿またはクロマトグラフ分離を用いてよい。

更に態様によっては、リピドミックマーカーの水準決定を前処理または分画していない試料に行ってもよい。

態様によっては、リピドミックマーカーの水準決定を絶食状態（最後の食事から少なくとも１時間、少なくとも１．５時間、少なくとも２時間、少なくとも２．５時間、または少なくとも３時間を意味し、例えば、午前の朝食前に）の対象から入手した前処理または分画していない試料に行うのが好ましい。

更に態様によっては、リピドミックマーカーの水準決定を絶食状態の対象から入手した食後の対象から入手した前処理または分画していない試料。

リピドミックバイオマーカーの水準決定は定量的または半定量的であってよい。態様によっては、定量決定は一種以上の脂質代謝物の絶対量または濃度を決定することを含んでもよい。更に態様によっては、定量決定は一種以上の脂質代謝物の一種以上のその他の代謝物に対する相対量または濃度を決定することを含んでもよい。例えば、態様によっては、少なくとも一種の代謝物Ａの量または濃度と少なくとも一種の代謝物Ｂの量または濃度との比率を決定してもよい。

リピドミックマーカーの水準を決定するのに多くの手法を用いることができる。態様によっては、リピドミックマーカーの水準を決定することはクロマトグラフ法、例えば、液体クロマトグラフ（ＬＣ）、高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）、ガスクロマトグラフ（ＧＣ）、薄層クロマトグラフ、サイズ排除または親和性クロマトグラフの使用を含んでもよい。態様によっては、リピドミックマーカーの水準を決定することは質量分析法、例えば、ガスクロマトグラフ−質量分析（ＧＣ−ＭＳ）、液体クロマトグラフ−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）、直接注入質量分析もしくはフーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析（ＦＴ−ＩＣＲ−ＭＳ）、キャピラリー電気泳動質量分析（ＣＥ−ＭＳ）、高速液体クロマトグラフ−質量分析（ＨＰＬＣ−ＭＳ）、四重極質量分析、ＭＳ−ＭＳまたはＭＳ−ＭＳ−ＭＳなど任意に順次組み合わせた質量分析、誘導結合プラズマ質量分析（ＩＣＰ−ＭＳ）、熱分解質量分析（Ｐｙ−ＭＳ）、イオン移動度質量分析、または飛行時間型質量分析（ＴＯＦ）の使用を含んでもよい。好適な手法は、例えば、Nissen, Journal of Chromatography A, 703, 1995: 37-57、米国特許第４，５４０，８８４号または米国特許第５，３９７，８９４号に開示されている。

態様によっては、リピドミックマーカーの水準を決定することは以下の手法：核磁気共鳴（ＮＭＲ）、磁気共鳴画像（ＭＲＩ）、フーリエ変換赤外分析（ＦＴ−ＩＲ）、紫外線（ＵＶ）分光、屈折率（ＲＩ）、蛍光検出、放射化学的検出、電気化学的検出、光散乱（ＬＳ）、分散ラマン分光、またはフレームイオン化検出（ＦＩＤ）のいずれかの使用を含んでもよい。態様によっては、例えば、特定のリポタンパク質画分（特定の血液リポタンパク質画分など）の脂肪アシル組成を決定するのに脂肪酸アシルエステル分析を用いてもよい。態様によっては、ＬＣ−ＭＳは個々の脂質種、例えば、リン脂質またはスフィンゴ脂質の決定に用いてもよい。

態様によっては、リピドミックマーカーの水準を決定することはガスクロマトグラフ−オンライン質量分析（ＧＣＭＳ）および／またはＬＣＭＳ２（高速液体クロマトグラフ−オンライン２次元質量分析）をソフトウェアツール、例えば、脂質質量スペクトル解析ソフトウェア（ＬＩＭＳＡ）（例として、データ処理はHaimi et al. Methods Mol. Biol. 2009, 580, 285-94を参照のこと）を用いる好適な内部標準と共に使用することを含んでもよい。

態様によっては、リピドミックマーカーの水準を決定することは特定の化学的または生物学的検定法を含んでもよい。その検定法は一種以上の薬剤（脂質代謝物の化学構造を明確に認識できる薬剤、もしくは他の化合物と反応する特性または生物学的読み取りシステムに反応を引き出せる特性によって脂質代謝物を明確に同定できる薬剤）を利用してもよい。例えば、態様によっては、薬剤（問題の分析物に特異的な抗体など）を用いて標的種の存在量を測定する場合は免疫検定法を用いてもよい。

態様によっては、リピドミックマーカーの水準を決定することは上記の２つ以上の手法の使用を含んでもよい。

態様によっては、Ｃ型肝炎リピドミックマーカーは生体試料中のミード酸の存在量、即ち、量または濃度であってよい。対照存在量値と比較してミード酸の存在量値が高い場合は、対象がＣ型肝炎感染症またはその感染症を併発する疾患もしくはその感染症が原因の疾患にかかっていることを意味する。

態様によっては、ミード酸の存在量は肝細胞がんのバイオマーカーとして用いてもよい。その場合、対照存在量値と比較してミード酸の存在量値が高い場合は、対象が肝細胞がんにかかっていることを意味する。

ミード酸の存在量を決定するための試料は、血漿、血液または血清などの生体液の試料であってよい。態様によっては、ミード酸の存在量の決定は処理または分画していない試料に行ってよい。更に態様によっては、ミード酸の存在量の決定は試料の特定の画分（例えば、極低密度リポタンパク質画分など）に行ってよい。

態様によっては、ミード酸の存在量を決定するための生体試料は対象が絶食状態（最後の食事から少なくとも１時間、少なくとも１．５時間、少なくとも２時間、少なくとも２．５時間、または少なくとも３時間を意味する）の時に入手してもよい。態様によっては、空腹時間が２４時間を超えないことが好ましい場合もある。更に態様によっては、ミード酸の存在量を決定するための生体試料は対象が食後の時に入手してもよい。

態様によっては、デノボ脂質生成の少なくとも一種の非必須脂肪酸副産物（例えば、パルミトレイン酸（Ｃ１６：１ω−９およびω−７）およびオレイン酸（Ｃ１８：１ω−９）の存在量、即ち、量または濃度はＣ型肝炎またはその感染症を併発する疾患もしくはその感染症が原因の疾患のバイオマーカーとして用いてもよい。その場合、対照存在量値と比較して決定された存在量値が低い場合は、対象がＣ型肝炎感染症またはその感染症を併発する疾患もしくはその感染症が原因の疾患にかかっていることを意味する。

態様によっては、非必須脂肪酸の不飽和指数（例えば、ＶＬＤＬ画分などの血液リポタンパク質画分（複数可）の脂質中に存在する非必須脂肪酸の不飽和指数であってよい）はＣ型肝炎またはその感染症を併発する疾患もしくはその感染症が原因の疾患のバイオマーカーとして用いてもよい。その場合、対照不飽和指数値と比較して不飽和指数値が低い場合は、対象がＣ型肝炎感染症またはその感染症を併発する疾患もしくはその感染症が原因の疾患にかかっていることを意味する。このようなバイオマーカーは他のバイオマーカー（血流中のウイルスなど）に比べて肝障害のより好適な尺度となる。不飽和指数は、例えば、（（１６：１，ω−７＋１６：１，ω−９）／１６：０）比、つまり、１６：１，ω−７および１６：１，ω−９脂肪酸の存在量の合計と１６：０脂肪酸の存在量との比率とすることができる。

態様によっては、生体試料中の非必須脂肪酸の延長度はＣ型肝炎感染症またはその感染症を併発する疾患もしくはその感染症が原因の疾患のバイオマーカーとして機能する。その場合、対照延長度値と比較して生体試料の決定された延長度値が高い場合は、対象がＣ型肝炎感染症またはその感染症を併発する疾患もしくはその感染症が原因の疾患にかかっていることを意味する。このようなバイオマーカーは他のバイオマーカー（血流中のウイルスなど）に比べて肝障害のより好適な指標となる。延長度は、例えば、（１８：１ω−７／１６：１ω−７）比、つまり、１８：１ω−７脂肪酸と１６：１ω−７脂肪酸の存在量の比率を用いて決定してもよい。

態様によっては、Ｃ型肝炎感染症またはその感染症を併発する疾患もしくはその感染症が原因の疾患のリピドミックバイオマーカーは少なくとも一種の多価不飽和ω−６およびω−３脂肪酸（例えば、アラキドン酸およびドコサヘキサエン酸）の存在量であってよい。その場合、対照存在量値（ＨＣＶに感染していない一以上の健康な個体の存在量値であってよい）と比較して生体試料の決定された存在量値が高い場合は、対象がＣ型肝炎感染症またはその感染症を併発する疾患もしくはその感染症が原因の疾患にかかっていることを意味する。このようなバイオマーカーは他のバイオマーカー（血流中のウイルスなど）に比べて肝障害の進行のより好適な指標となる。

態様によっては、生体試料のコレステロールエステル組成中の一種以上の脂肪酸の存在量、即ち、濃度または量はＣ型肝炎感染症またはその感染症を併発する疾患もしくはその感染症が原因の疾患のリピドミックバイオマーカーとして機能する。コレステロールエステル組成を測定するために、コレステロールエステルをクロマトグラフ精製などの分離法を用いて生体試料から精製する。特定の場合において、その脂肪酸は少なくとも一種の多価不飽和必須ω−３またはω−６脂肪酸（例えば、２０：４脂肪酸、２０：５脂肪酸、２２：６脂肪酸および２２：５脂肪酸）であってよい。その場合、対照存在量値と比較して、一種以上のそのような多価不飽和脂肪酸の決定された存在量値が高い場合は、対象がＣ型肝炎感染症またはその感染症を併発する疾患もしくはその感染症が原因の疾患にかかっていることを意味する。このようなバイオマーカーは他のバイオマーカー（血流中のウイルスなど）に比べて肝障害の進行のより好適な指標となる。特定の場合において、コレステロールエステル組成中の特定の脂肪酸が欠乏していると、感染した個体の肝細胞にＨＣＶが存在または作用していることを意味する。その場合、脂肪酸は少なくとも一種の一価不飽和脂肪酸（例えば、１６：１脂肪酸および１８：１脂肪酸）であってよい。その場合、対照存在量値と比較して、一種以上のそのような一価不飽和脂肪酸の決定された存在量値が低い場合は、対象がＣ型肝炎感染症またはその感染症を併発する疾患もしくはその感染症が原因の疾患にかかっていることを意味する。

態様によっては、生体試料中の一種以上のトリグリセリドの存在量、即ち、濃度または量はＣ型肝炎感染症またはその感染症を併発する疾患もしくその感染症が原因の疾患のリピドミックバイオマーカーとして機能する。そのトリグリセリドは、例えば、Ｃ５４：５−Ｃ１８：０トリグリセリド、Ｃ５４：６−Ｃ１８：１トリグリセリド、Ｃ５６：５−Ｃ２０：４トリグリセリドまたはＣ５６：７−Ｃ２２：６トリグリセリドであってよい。その場合、対照存在量値と比較してそのトリグリセリドの存在量値が高い場合は、対象がＣ型肝炎感染症またはその感染症を併発する疾患もしくはその感染症が原因の疾患にかかっていることを意味する。

態様によっては、トリグリセリドバイオマーカーの存在量の決定は処理または分画していない生体試料（例えば、血漿、血液または血清検体）に行ってもよい。更に態様によっては、トリグリセリドバイオマーカーの存在量の決定は生体試料の画分（例えば、極低密度リポタンパク質画分およびトリグリセリド画分）に行ってもよい。態様によっては、トリグリセリドバイオマーカーの存在量の決定は絶食状態（即ち、最後の食事から少なくとも１時間、少なくとも１．５時間、少なくとも２時間、少なくとも２．５時間、または少なくとも３時間）の対象から入手した生体試料に行ってもよい。更に態様によっては、トリグリセリドバイオマーカーの存在量の決定は食後の対象から入手した生体試料に行ってもよい。Ｃ５４：５−Ｃ１８：０トリグリセリド、Ｃ５６：５−Ｃ２０：４トリグリセリドまたはＣ５６：７−Ｃ２２：６トリグリセリドの存在量の決定は、絶食状態の対象から入手した未分画の生体試料（例えば、血漿、血液または血清検体）を用いるのが好ましい。或いは、これらのバイオマーカーには、生体試料の画分、例えば、極低密度リポタンパク質画分およびトリグリセリド画分を用いてもよい。Ｃ５４：６−Ｃ１８：１トリグリセリドの存在量の決定は、絶食状態または食後の対象から入手した未分画の生体試料（例えば、血漿、血液または血清検体）に行ってもよい。

態様によっては、生体試料中のリン脂質のうちの一種以上の脂肪酸の存在量、即ち、濃度または量はＣ型肝炎感染症またはその感染症を併発する疾患もしくはその感染症が原因の疾患のリピドミックマーカーとして機能する。態様によっては、生体試料中のエステル結合リン脂質のうちの一種以上の脂肪酸の存在量、即ち、濃度または量がそのようなリピドミックマーカーとして機能する。例えば、態様によっては、生体試料のジエステル型ホスファチジルコリン中の少なくとも一種の脂肪酸の存在量がリピドミックマーカーであってよい。その脂肪酸は、例えば、ＰＣ（３２：１）種、ＰＣ（３２：０）種、ＰＣ（３４：０）種、ＰＣ（３４：４）種およびＰＣ（３４：５）種から選択されてよい。その場合、ＰＣ（３２：０）種、ＰＣ（３４：０）種、ＰＣ（３４：４）種およびＰＣ（３４：５）種の少なくとも一種の存在量値がこれらの種の対照値よりも高い場合は、対象がＣ型肝炎感染症またはその感染症を併発する疾患もしくはその感染症が原因の疾患にかかっていることを意味する。ＰＣ（３２：１）種の存在量値がその対照値より低い場合もまた対象がＣ型肝炎感染症またはその感染症を併発する疾患もしくはその感染症が原因の疾患にかかっていることを意味する。

態様によっては、生体試料のジエステル型ホスファチジルエタノールアミン中の少なくとも一種の脂肪酸の存在量、即ち、濃度または量はＣ型肝炎感染症またはその感染症を併発する疾患もしくはその感染症が原因の疾患のリピドミックマーカーとして用いてもよい。そのような脂肪酸は、例えば、ａ）ミード酸、ｂ）少なくとも一種のパルミトレイン酸（例えば、１６：１ω−７酸およびω−９酸）、またはｃ）少なくとも一種の必須ω−３脂肪酸またはω−６脂肪酸（例えば、２０：３ω−３、２０：４ω−６、２０：５ω−３、２２：６ω−３、２２：５ω−３および２２：４ω−６）から選択されてもよい。その場合、ミード酸または少なくとも一種の必須ω−３またはω−６の決定された存在量値がそれらの対照存在量値よりも高い場合は、対象がＣ型肝炎感染症またはその感染症を併発する疾患もしくはその感染症が原因の疾患にかかっていることを意味する。少なくとも一種のパルミトレイン酸の存在量値がその対照値より低い場合もまた対象がＣ型肝炎感染症またはその感染症を併発する疾患もしくはその感染症が原因の疾患にかかっていることを意味する。

態様によっては、生体試料のジエステル型ホスファチジルセリン中の少なくとも一種の脂肪酸の存在量、即ち、濃度または量はＣ型肝炎感染症またはその感染症を併発する疾患もしくはその感染症が原因の疾患のリピドミックマーカーとして機能する。そのような脂肪酸は、例えば、３８：３種または４０：６種であってよい。その場合、３８：３種および４０：６種のうちの少なくとも一種の存在量値がそれらの対照値よりも高い場合は、対象がＣ型肝炎感染症またはその感染症を併発する疾患もしくはその感染症が原因の疾患にかかっていることを意味する。

態様によっては、生体試料のジエステル型ホスファチジルイノシトール中の少なくとも一種の脂肪酸の存在量、即ち、濃度または量はＣ型肝炎感染症またはその感染症を併発する疾患もしくはその感染症が原因の疾患のリピドミックマーカーとして機能する。そのような脂肪酸は、例えば、ＰＩ（３８：３）種、ＰＩ（３６：４）種、ＰＩ（３８：４）種またはＰＩ（３８：５）種であってよい。その場合、ＰＩ（３８：３）種の決定された存在量値がその対照存在量値よりも高い場合、またはＰＩ（３６：４）種、ＰＩ（３８：４）種およびＰＩ（３８：５）種のうちの少なくとも一種の存在量値がそれらの対照存在量値よりも低い場合は、対象がＣ型肝炎感染症またはその感染症を併発する疾患もしくはその感染症が原因の疾患にかかっていることを意味する。

態様によっては、生体試料の少なくとも一種のリゾホスファチジルコリンの中から少なくとも一種の脂肪酸の存在量、即ち、濃度または量はＣ型肝炎感染症またはその感染症を併発する疾患もしくはその感染症が原因の疾患のリピドミックマーカーとして機能する。そのような脂肪酸は１６：１種、１６：０種、２０：４種または２２：６種であってよい。その場合、対照値よりも１６：０種、２０：４種および２２：６種のうちの少なくとも一種の決定された存在量値の方が高いか、１６：１種の値の方が低い場合は、対象がＣ型肝炎感染症またはその感染症を併発する疾患もしくはその感染症が原因の疾患にかかっていることを意味する。

態様によっては、エステル結合ホスファチジルコリンおよびエステル結合ホスファチジルエタノールアミン中の脂肪酸の存在量を決定するのに生体試料の画分、例えば、生体試料の極低密度リポタンパク質画分を用いるのが好ましい。

本バイオマーカーはＣ型肝炎感染症またはその感染症を併発する疾患もしくはその感染症が原因の疾患の診断に用いてよい。その場合、対照水準または対照値はＣ型肝炎感染症またはその感染症を併発する疾患もしくはその感染症が原因の疾患にかかっていない健康な個体で決定されたバイオマーカーの水準または値を指してよい。対照水準または値は健康な個体の集団における平均の水準または値であってもよい。

本バイオマーカーはＣ型肝炎感染症またはその感染症を併発する疾患もしくはその感染症が原因の疾患の進行または退縮の評価に用いてよい。その場合、対照水準または対照値は以前の時点で決定された同一対象のバイオマーカーの水準または値を指してよい。

本バイオマーカーはＣ型肝炎感染症またはその感染症を併発する疾患もしくはその感染症が原因の疾患に関する薬剤の効果の評価に用いてよい。その場合、対照水準または対照値は、例えば、対象に薬剤を投与する前に決定されたバイオマーカーの水準または値を指してよい。

本バイオマーカーはまたＣ型肝炎感染症または関連疾患の治療に対する反応性の評価に用いてもよい。その場合、対照水準または対照値は、例えば、対象に治療を施す前に決定されたバイオマーカーの水準または値を指してよい。

本発明者らはまた治療（対象への治療薬投与を含んでもよい）に対する反応性にリピドミックバイオマーカー（対象から入手した生体試料のグルコシルセラミド、ラクトシルセラミドおよびスフィンゴミエリンのうちの少なくとも一種の不飽和指数であってよい）を用いることも見出した。決定された不飽和指数値が対照値（即ち、薬剤を投与する前に入手した対象の試料で決定された値）よりも高い場合は、対象が薬剤に反応していることを意味する。その不飽和指数は２４：１／２４：０比であってよい。

態様によっては、不飽和指数は生体試料の極低密度リポタンパク質画分で決定してもよい。

態様によっては、不飽和指数はグルコシルセラミドおよびラクトシルセラミドのいずれかで決定してもよい。更に態様によっては、不飽和指数はグルコシルセラミドおよびラクトシルセラミド両方で決定してもよい。

態様によっては、治療に対する反応は不飽和指数マーカーに加えて、生体試料のグルコシルセラミドの存在量、即ち、濃度または量を用いて更に評価してもよい。その場合、特にＶＬＤＬ血液画分中のグルコシルセラミドの存在量が対照値（即ち、薬剤を投与する前の値）よりも減少した場合は、対象が治療に反応していることを意味する。

態様によっては、対象はＣ型肝炎感染症または関連疾患、例えば、肝線維症や肝細胞がんにかかった対象であってよい。そのような対象に投与される薬剤はＣ型肝炎に有効とされるイミノ糖であってよい。そのイミノ糖は、例えば、Ｎ−置換デオキシノジリマイシンおよびそれらの医薬的に許容できる塩、Ｎ−置換デオキシガラクトノジリマイシンおよびそれらの医薬的に許容できる塩、およびＮ−置換Ｍｅ−デオキシガラクトノジリマイシンおよびそれらの医薬的に許容できる塩のいずれかであってよい。典型的なイミノ糖としては、Ｎ−ブチルデオキシノジリマイシンおよびその医薬的に許容できる塩およびＮ−（７−オキサ−ノニル）−１，５，６−トリデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−ガラクチトールおよびその医薬的に許容できる塩が挙げられるが、これらに限定されない。Ｃ型肝炎に有効なイミノ糖は、例えば、米国特許第７，６１２，０９３号および第６，４６５，４８７号に開示されている。

態様によっては、対象はリソソーム蓄積症、例えば、ゴーシェ病またはニーマン・ピック病Ｃ型にかかった対象であってよい。そのような対象に投与される薬剤はリソソーム蓄積症に有効とされるイミノ糖であってよい。そのイミノ糖は、例えば、Ｎ−置換デオキシノジリマイシンおよびそれらの医薬的に許容できる塩、Ｎ−置換デオキシガラクトノジリマイシンおよびそれらの医薬的に許容できる塩、およびＮ−置換Ｍｅ−デオキシガラクトノジリマイシンおよびそれらの医薬的に許容できる塩のいずれかであってよい。典型的なイミノ糖としては、Ｎ−ブチルデオキシノジリマイシンおよびその医薬的に許容できる塩、Ｎ−ノニルデオキシノジリマイシンおよびその医薬的に許容できる塩、およびＮ−ブチルデオキシガラクトノジリマイシンおよびその医薬的に許容できる塩が挙げられるが、これらに限定されない。Ｃ型肝炎に有効なイミノ糖は、例えば、米国特許第５，４７２，９６９号、第５，５２５，６１６号、第５，５８０，８８４号、第５，６５６，６４１号、第５，７８６，３６９号、第５，７９８，３６６号、第５，８０１，１８５号、第６，２９１，６５７号、第６，４６５，４８８号、第６，４９５，５７０号、第６，６１０，７０３号、第６，６６０，７４９号、第６，６９６，０５９号、第７，３４８，０００号に開示されている。

態様によっては、対象は糖尿病、例えば、２型糖尿病にかかった対象であってよい。そのような対象に投与される薬剤はインシュリン感作物質、例えば、イミノ糖、ビグアニドまたはチアゾリジンジオンであってよい。インシュリン感作イミノ糖の一例としては、Ｎ−（５−アダマンタン−１−イル−メトキシペンチル）−ＤＮＪおよびその医薬的に許容できる塩が挙げられる。チアゾリジンジオンインシュリン感作物質の例としては、ピオグリタゾンおよびロシグリタゾンが挙げられるが、これらに限定されない。ビグアニドインシュリン感作物質の非限定的な一例はメトホルミンである。一般に、ビグアニドおよびインシュリン感作物質は当業者に広く知られている。

本発明者らはまた、Ｃ型肝炎治療（ペグ化インターフェロンαなどのインターフェロン、およびリバビリンのうちの少なくとも一種を投与することを含む）に対して反応が見込めないＣ型肝炎患者（非反応患者）を、そのような患者から入手した生体試料のリポタンパク質中のグルコシルセラミド、ラクトシルセラミドおよびスフィンゴミエリンのうちの少なくとも一種の不飽和指数値を決定することで特定してもよいと想定する。決定された不飽和指数値が対照不飽和指数値よりも高いと判明した場合、その患者はインターフェロンおよびリバビリンのうちの少なくとも一種を含むＣ型肝炎治療に対する反応が見込めない。その場合、その特定された非反応患者にはインターフェロンおよび／またはリバビリン療法に加えて、もしくはインターフェロンおよび／またはリバビリン療法に対して代替療法を施してもよい。そのような代替療法として、米国特許第７，６１２，０９３号および第６，４６５，４８７号に開示されているように、Ｃ型肝炎に有効とされるイミノ糖の投与を含んでもよい。その不飽和指数は２４：１／２４：０比であってよい。態様によっては、代替療法は直接作用する抗ウイルス剤、例えば、ＨＣＶプロテアーゼ阻害剤（テラプレビルやボセプレビルなど）またはポリメラーゼ阻害剤を投与することを含んでもよい。

態様によっては、不飽和指数は生体試料の極低密度リポタンパク質画分で決定してもよい。

態様によっては、不飽和指数はグルコシルセラミドおよびラクトシルセラミドのいずれかで決定してもよい。更に態様によっては、不飽和指数はグルコシルセラミドおよびラクトシルセラミド両方で決定してもよい。

本出願はまたキットも提供し、それには（ａ）一種以上のリピドミックバイオマーカーの水準を測定するための一種以上の試薬、および（ｂ）使用説明書を含んでもよい。そのキットは１、２、３、４、５、１０、またはそれ以上のリピドミックバイオマーカーの水準を測定するための１、２、３、４、５、１０、１５、２０、またはそれ以上の試薬を提供してもよい。態様によっては、キットは免疫検定法のための一種以上の試薬を含んでもよい。態様によっては、キットはＭＳ分析法のための一種以上の試薬を含んでもよい。態様によっては、試薬は脂肪酸などの脂質代謝物に対する抗体であってもよい。抗体の製造方法は当業者に周知である。

側面によっては、キットは（ａ）脂肪酸などの脂質代謝物に対する抗体、および（ｂ）使用説明書を含んでいてもよい。態様によっては、キットは更に（ｃ）脂肪酸などの第二の脂質代謝物に対する二次抗体を含んでいてもよい。態様によっては、キットは更に（ｄ）脂肪酸などの第三の脂質代謝物に対する三次抗体を含む。

なお、本発明は以下の実施例により更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

複製可能Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶｃｃ）の感染、及びＥＲグルコース分解酵素及び／又はグルコシルセラミド合成酵素の阻害剤である様々な抗ウイルス性を有するイミノ糖による処理が、肝がん細胞の脂質組成に及ぼす影響を調べた。非感染の場合、イミノ糖で処理されていない肝がん細胞の全脂肪酸組成は、細胞が構成的な脂肪酸欠乏状態にあったことを意味する不飽和非必須脂肪酸量の顕著な増加を示した。特に、ミード酸（エイコサトリエン酸、２０：３ω−９）量が顕著に増加していた。複製可能Ｃ型肝炎ウイルスへの感染は、脂肪酸の新規生合成を著しく阻害し（ミード酸及び一価不飽和脂肪酸含有量の低下より明らかである）、高度の多価不飽和必須ω−３脂肪酸及びω−６脂肪酸含有量の増加を引き起こした。Ｃ型肝炎ウイルスへの感染は、細胞の脂肪酸含有量を増加させ、且つ、リン脂質、トリグリセリド及びコレステロールエステルの脂肪酸−アシル組成を大きく変えて、細胞内で合成される非必須脂肪酸アシル鎖の鎖長と飽和度を増加させ、且つ、高度の多価不飽和必須脂肪酸の膜脂質及び蓄積脂質への取り込みを促進した。イミノ糖はグルコシドセラミドの存在量を低下させ、かつ、驚くべきことに、グルコシルセラミドの不飽和度を増加させた。イミノ糖によるグルコシルセラミドの存在量及び不飽和度の変化は、感染状態及び非感染状態の両方で観察された。ＨＣＶの影響とは異なり、イミノ糖は、新規脂質生成（de novo lipogenesis, DNL）及びミード酸生成を促進したが、この促進は非感染状態でのみ観察された。これらの新たに観察された細胞脂質組成の変化は、発がん性形質転換、ＨＣＶ感染及びイミノ糖処理があったことを意味するものであり、Ｃ型肝炎の診断マーカー及び／又は予測マーカーとして使用でき、かつ肝細胞がんの診断に使用できると考えられる。

Ｃ型肝炎及びそれに関連する症状
世界の人口の約３％がＣ型肝炎ウイルスに感染しており（Marcellin 1999、末尾のREFERENCEセクションを参照）、肝線維症、肝硬変及び肝細胞がんを含む肝疾患の主要な要因となっている。しかも、Ｃ型肝炎ウイルスへの感染は、米国及び欧州において肝移植の最大の適応症である（Chen and Morgan 2006）。この感染は、ペグ化インターフェロンαとリバビリン（Ribavirin）との併用によって、約５０％が「治療可能」（つまり、持続性ウイルス陰性化可能）であるが、この治療は最長１年を必要とし、重大な副作用がある（例えば、インターフェロンに起因するインフルエンザ様症状）（Awad, Thorlund et al. 2010; Pawlotsky 2011）。近年認可された新たな「直接作用型」抗ウイルス剤（例えば、プロテアーゼ阻害剤であるTelaprevir及びBoceprevir）や、ヌクレオチド類縁体ポリメラーゼ阻害剤であるギリアド社（Gilead）のGS-7977（前名称PI-7977）等の開発中薬剤によって、治癒率は向上している。これら新薬は大きな期待を集めているものの、この高い変異性を有するウイルスに長期間どの程度の薬効を奏するか、また、インターフェロンの使用及びそれに伴う副作用を避けつつ、再感染を防ぐために必要と思われる他の薬剤と併用した場合にどの程度の薬効を奏するか、は未だ不明である（Pawlotsky 2011）。更に、上記の新承認薬剤は高価であるが、保険及び医療予算は限られており、薬剤経済学的に見て、どの患者がこの高額な治療を必要とする可能性が高く、どの患者を歴史的に確立された標準的治療（つまりインターフェロンとリバビリンとの併用）を処置すべきかを見分けることは重要であると考えられる。同様に、どの患者が疾患の進行が早く、他の患者に比べてより早期に、より積極な治療又は肝移植が必要となる可能性が高いかを予測可能にすることも、重要であると考えられる。

Ｃ型肝炎ウイルス感染患者の血中Ｃ型肝炎ウイルス量は、その患者の肝臓の基礎疾患の重篤度のよい指標となるという期待があるかも知れないが、実際はそうではなく、肝疾患の病態に関する最も信頼性のある指標と考えられている（一方で苦痛を伴い患者を重大なリスクにさらす）肝生検に比べ、ウイルス血症（viaremia）（又は血中ウイルス濃度、比較的非侵襲的な血液サンプリングによって算定される）と重篤度とには明確な関連性がない（Hollingsworth RC 1996）。現在まで、血中タンパク質バイオマーカーの測定による線維症（肝硬変の予測因子）の発症及び進行の検出に非侵襲的な予測調査の焦点が当てられてきた。その検出のために、タンパク質バイオマーカーパネルが開発されている（例えば、米国においてFibroSureとして知られるFibrotest）（Castera, Vergniol et al. 2005）（Gangadharan, Bapat et al. 2012）。このようなタンパク質バイオマーカーを用いた試験（FibroTest）によって、肝硬変の発症をその発症前段階において示唆する線維症の検出が可能である。更に、本発明者らがこれまでに発見したような新規なタンパク質バイオマーカーも、疾患活動性の有用な指標となり得る。しかし、非侵襲的方法又は出来るだけ侵襲度の低い方法によって肝臓疾患の病態に対するＣ型肝炎ウイルスの影響の早期指標を得ることが、より強く求められている。また、患者にとって反応性が一番高い薬剤又は薬剤の組み合わせを用いて治療が行われるように、つまり、いわゆる「個別化」医療又は「層別化」医療が行われるようにするために、ある治療に対する反応性を予測することができるバイオマーカー又はバイオマーカーパネルを特定することに関心が集まっている。このような試みによって、本質的に医療予算に上限がある中で、患者にとっての最大利益と社会にとっての最大利益（つまり、同様の強さの医療ニーズを有する、別の疾患に罹患した患者を含んでいる社会）とを均衡させることができる。

Ｃ型肝炎ウイルス感染に対する治療反応性を予測するための現時点で最も定評のあるバイオマーカーの例として、ペグ化インターフェロンαとリバビリンとの併用（近年まで、Ｃ型肝炎の「標準治療法」とされていた）の持続性ウイルス学的著効性の予測因子となるＩＬ２８Ｂ遺伝子多型が挙げられる。しかし、ＩＬ２８多型のみでは予測価値（predictive value）が低く、患者がある治療計画に対する反応性を有するかどうかの臨床判断には未だ使用されていない。ＩＬ２８多型は、別の遺伝子多型と組み合わせて追加的又は相乗的に予測価値を上げることができる可能性があり、また、別のバイオマーカー（例えばタンパク質バイオマーカー）と併用することもでき、新たに承認された薬剤や開発中薬剤の出現によって薬剤の選択肢がより増えるという新たな治療環境において、治療に関する決定の一助となる可能性がある（Clark and Muir 2012）。しかし現時点では、Ｃ型肝炎ウイルス感染に対するバイオマーカー戦略としては、タンパク質及び遺伝子バイオマーカーに限られており、今までのところ、脂質バイオマーカーの使用可能性については、調査もなされておらず、確証も得られていない。

Ｃ型肝炎ウイルスの複製サイクルは、肝細胞の脂質代謝、特にコレステロール代謝に大きく依存する（Barba, Harper et al. 1997; Sagan, Rouleau et al. 2006; Aizaki, Morikawa et al. 2008; Amemiya, Maekawa et al. 2008; Burlone and Budkowska 2009; Lyn, Kennedy et al. 2009; McLauchlan 2009; Ogawa, Hishiki et al. 2009; Diamond, Syder et al. 2010; Herker, Harris et al. 2010; Syed, Amako et al. 2010; Merz, Long et al. 2011; Miyoshi, Moriya et al. 2011; Clark, Thompson et al. 2012; Moriishi and Matsuura 2012; Rodgers, Villareal et al. 2012）。生体内において、Ｃ型肝炎ウイルスの子孫は感染細胞の小胞体から、超低比重リポタンパク質（ＶＬＤＬ）を伴ったエンベロープを有するビリオン（つまり、脂質膜に覆われたウイルス粒子）として、リポウイルス粒子（lipoviral particle）の形態で出現する。新たに細胞に感染するために、このウイルス粒子は、細胞表面の受容体（テトラスパニン、スカベンジャー受容体Ｂ１（ＳＲＢ１）及びＬＤＬ受容体（ＬＤＬ−Ｒ）等）に結合する必要があると考えられる。ＳＲＢ１及びＬＤＬ−Ｒはリポタンパク質受容体である。これらの受容体は、「脂質ラフト」（コレステロール及び飽和スフィンゴ糖脂質が豊富に存在する膜マイクロドメインのこと）と関与を持つ。Ｃ型肝炎ウイルスがひとたび細胞のエンドソームに入ると、Ｃ型肝炎ウイルスは、細胞質内に逃げ込むために、更にコレステロール受容体である「ニーマン・ピック病Ｃ型様タンパク質１」（Niemann-Pick type-C disease like protein 1, NPCL1）と相互作用する必要があると考えられている（Sainz, Barretto et al. 2012）。Ｃ型肝炎ウイルスがひとたび細胞の細胞質内に入ると、Ｃ型肝炎ウイルスは、ウイルス自身による細胞小器官（「membranous web」と呼ばれる膜構造）を形成してウイルス自身の複製装置の機能を援護するために、小胞体の脂質代謝を阻害する。ビリオンの集合体（アセンブリ）は、コアタンパク質と脂質滴表面との結合を契機に、脂質滴（小胞体（以下ＥＲとも記載する）内のＶＬＤＬの直接前駆体）上に形成される。次いで完全ウイルス粒子（intact virons）がＶＬＤＬを伴うリポウイルス粒子として出現し、以上のサイクルが繰り返される。

ＨＣＶが自身の複製のために肝細胞の脂質代謝の多くの側面を制御及び利用することから、本発明者らは、ＨＣＶは細胞の脂質組成に特異的且つ検出可能な影響を及ぼし、更には、肝臓から分泌される血中リポタンパク質の脂質組成（特にＶＬＤＬの成分）の変化として、そうした脂質組成の変化が血中に現れるという仮説、そして、肝生検試料の脂質組成の変化として分析可能であるという仮説を立てた。加えて、本発明者らは、ＨＣＶが宿主細胞に及ぼす影響の指標としての、感染細胞に対するＨＣＶの「リピドームの足跡（lipidomic imprint）」、すなわち肝細胞の脂質代謝にＨＣＶが及ぼす影響は、ウイルス血中濃度に比べて、疾患活動性のバイオマーカーとしてより優れたものとなることを発見した。この発見は、「リピドームの足跡（lipidomic imprint）」が、肝機能及び肝疾患の病理に対する悪影響をより直接的に反映するものであると考えられること、及び、単独では予測価値の小さい種々の遺伝子多型によって影響を受けやすい、ウイルス感染に対する細胞の複雑な代謝反応の全体を反映するものであると考えられることに基づいている。更に、本発明者らは、Ｃ型肝炎ウイルスに感染した患者の血漿及び生検試料におけるリピドームの足跡の予測価値は、現時点において未利用のバイオマーカー使用を可能にするものであり、遺伝子多型やプロテオミックバイオマーカーと併用することで、ある治療計画に対する治療反応性や、肝線維症、肝硬変及び原発性肝細胞がんを発症する危険性及び可能性をより正確に予測可能となることを見出した。加えて、本発明者らは、脂質代謝が活発な肝細胞から生じる原発性肝細胞がんは、肝細胞の変化後の状態に特徴的な脂質代謝の変化を反映する特有のリピドームの足跡を有することを見出し、更に、肝細胞がん（ＨＣＣ）において発現されないこともあるα−フェトプロテイン（約８０％の症例で発現、Huo, Hsia et al. 2007）等の、現時点で利用されているバイオマーカーでは信頼性が確保できなかった肝細胞がんの早期発見に、血中リポタンパク質組成としての原発性肝細胞がんのリピドミームの足跡が利用可能であることを見出した。従って、本発明者らは、原発性肝がん細胞（Ｈｕｈ７．５）のリピドームに複製可能Ｃ型肝炎ウイルスＨＣＶｃｃ感染が及ぼす影響、並びに、イミノ糖による処理に対する感染細胞及び非感染細胞のリピドーム組成及びリピドームの応答を調べた。このイミノ糖は、ＥＲαグルコース分解酵素及びグルコシルセラミド合成酵素の阻害剤であること、タンパク質フォールディングに影響を及ぼす（グルコース合成酵素の阻害作用による）こと（Branza-Nichita, Durantel et al. 2001; Chapel, Garcia et al. 2006; Chapel, Garcia et al. 2007）、グルコシルセラミド合成酵素の阻害（Platt, Reinkensmeier et al. 1997; Butters, Dwek et al. 2003; Butters, Dwek et al. 2005）、及び、中性のリソソーム外グルコシルセラミド合成酵素であるβ−グルコシダーゼ２（ＧＢＡ２）の阻害（Boot, Verhoek et al. 2007）によって脂質代謝に影響を及ぼすことが知られているものである。

感染細胞及び非感染細胞の脂質含有量
感染状態及び非感染状態の肝がん細胞の全脂肪酸含有量（遊離脂肪酸及び脂肪アシル鎖の合計）を測定した（図２）。感染細胞の脂質含有量は、非感染細胞に比べ顕著に高かった（３〜５倍）が、この脂質含有量の上昇の原因は即断できない。なぜなら、例えば、肝がん細胞は（リポタンパク質受容体を介して）脂質を取り込み、同様に脂質を（リポタンパク質として）分泌可能であり、更に新規脂質生成によって脂質を新たに生成することが出来るためである。後述の理由によって、感染細胞の高脂質含有量は、ヒト細胞においては生成できない必須脂肪酸（おそらくリポタンパク質の脂質成分として）の取り込みを伴うものであり、また、この高脂質含有量は、感染状態においては強く抑制される新規脂質生成に起因するものではないことが示唆された。または、リポタンパク質の分泌が減少（肝細胞に対するＨＣＶ感染の影響として知られている）したことが原因であるとも考えられる。

非感染細胞の全脂肪酸組成
宿主細胞のリピドームに感染及びイミノ糖が及ぼす影響の全体像を把握するため、全脂肪酸の酸性メチル基転移反応を行った非感染細胞の全脂肪酸（脂肪酸メチルエステルとして）組成を調べた。この分析においては、非エステル化脂肪酸及びエステル化脂肪酸（後者は、コレステロールエステル、トリグリセリド、種々のリン脂質及びスフィンゴ脂質の一部）が分析対象に含まれる（図３）。驚くべきことに、イミノ酸処理をしていない非感染細胞の「ミード酸」（２０：３、ω−９、全脂肪酸の１３％を占める）の含有量が非常に高かった（図４）。ミード酸はパルミチン酸エステル（Ｃ１６：０）から生成され、鎖長延長反応及び不飽和化反応を控えた新規脂質生成の直接前駆体である。初代肝細胞の全脂肪酸組成におけるミード酸発現量（百分率として）は、肝がん細胞Ｈｕｈ７．５の培養細胞のミード酸発現量に比べ、顕著に低くなる（Claude Wolf、私信による）。

ミード酸は、ヒト及び動物の体内が必須脂肪酸欠乏状態になると、その量が大きく増加することが知られている（Siguel, Chee et al. 1987; Duffin, Obukowicz et al. 2000）。従って、ミード酸量の上昇は、非感染宿主細胞が必須脂肪酸、つまり主要な食物由来必須脂肪酸であるリノレン酸（１８：２、ω−６）及びαリノレン酸（１８：３、ω−３）（ω−６脂肪酸であるアラキドン酸及びω−３脂肪酸であるドコサヘキサエン酸を含む高度の多価不飽和脂肪酸の生合成に必須である）の事実上の欠乏状態にあることを示す。

このミード酸量上昇現象は、ＨＣＣ患者の肝がん細胞は、健康な肝細胞と異なりミード酸をＶＬＤＬ等のリポタンパク質の脂質成分の脂肪アシル鎖として分泌すること、更には、このようなＶＬＤＬ組成の変化が、食物由来必須脂肪酸量が変化しても起こることを示唆している。本発明者らは、原発性肝細胞がんの臨床的に有用なタンパク質バイオマーカーであるα−フェトプロテインと異なり、このようなＶＬＤＬ組成の変化は、血清α−フェトプロテイン（長く使用されてきたＨＣＣのバイオマーカー）の有無に関わらず、ＨＣＣ患者において普遍的に現れるという仮説を立てた。この仮説のもと、本発明者らは、ＶＬＤＬ中のミード酸量上昇に基づいた診断テストが、α−フェトプロテイン（約８０％の症例で上昇）を用いた場合に比べ、感受性がより高く且つより信頼性のある、潜在する原発性肝細胞がんの指標となるという仮説を立て、更に、このようなテストを別の少なくとも１種のＨＣＣ診断方法と組み合わせることで、その組み合わせる別のＨＣＣ診断方法を、診断の正確性及び信頼性を高めるという観点から補完するものであるという仮説を立てた。

ＨＣＶｃｃ感染細胞の全脂肪酸組成
ＨＣＶの感染によって、感染細胞のミード酸含有量は大きく減少した（２０倍以上、図４）。ＨＣＶの感染によって、ミード酸以外の新規脂質生成の非必須脂肪酸副生成物、つまりパルミトレイン酸（Ｃ１６：１、ω−９及びω−７）及びオレイン酸（Ｃ１８：１、ω−９）の存在量も減少した（非感染細胞と比べた場合）。一方で、新規脂質生成で生成される別の非必須脂肪酸であるバクセン酸（Ｃ１８：１、ω−７）には変化がなかった。ＨＣＶがミード酸及びその他新規脂質生成の副生成物の存在量を減少させるメカニズム、又はなぜこのような減少が起きるのか（おそらくは細胞代謝の自己防衛反応だと思われる）は、明らかではない。しかし少なくとも、新規脂質生成の直接前駆体であるパルミチン酸エステル（１６：０）は、組成におけるその存在量が感染によって変化しなかったことから、このエステルが阻害要因であるとは考えにくい。よって、ＨＣＶは、ミード酸を生成するのに必要な不飽和化及び鎖長延長反応を阻害していると考えられる（ヒト細胞において、ミード酸は、Δ^９不飽和化酵素（デサチュラーゼ）、Δ^６不飽和化酵素及びΔ^５不飽和化酵素、並びに鎖長延長酵素であるＥＬＯＶＬ６及びＥＬＯＶＬ５による、連続した不飽和化反応及び鎖長延長反応によって、パルミチン酸（１６：０）から生成される）。なお、ラット体内の食物由来コレステロールは、肝臓内のΔ^５不飽和化酵素及びΔ^６不飽和化酵素（両者はミード酸生成に必須である）の活性を抑制することが知られている（Muriana, Vazquez et al. 1992; Bernasconi, Garda et al. 2000）。本発明はこの作用機序によって限定解釈されるべきではないが、ミード酸合成の抑制は、ＨＣＶ感染による細胞内コレステロール量の上昇の結果であると考えられる。ここで、ＨＣＶ感染は細胞内コレステロール量の上昇を引き起こすことが知られている（Sagan, Rouleau et al. 2006; Kapadia, Barth et al. 2007; Waris, Felmlee et al. 2007; Ye 2007）。感染細胞で観察された非必須脂肪酸（細胞内で生成されたもの）の不飽和化の抑制は、感染によってその量が顕著に増加することが観察され（後述）、且つ肝臓に含まれる３種の関連する不飽和化酵素（つまりΔ^９、Δ^６及びΔ^５不飽和化酵素）の発現を阻害することで知られるアラキドン酸やドコサヘキサエン酸（Cho, Nakamura et al. 1999; Cho, Nakamura et al. 1999; Ntambi 1999）等の高度の多価不飽和脂肪酸の影響によるものであるとも考えられる。また、感染細胞において、Δ^９不飽和指数が減少していた（図５）。この減少は、感染細胞においてＰＵＦＡ又はコレステロール量が増加したことと整合する。

感染状態における、非必須脂肪酸の不飽和度の減少及び鎖長延長度の促進
原則的には、不飽和化酵素及び鎖長伸長酵素がミード酸合成に必須であることから、感染状態におけるミード酸量の減少は上述の不飽和化酵素活性の低下、又は鎖長伸長活性の低下に起因するものである可能性が考えられた。しかし実際は、脂肪酸鎖長伸長は感染によって抑制されず、全脂肪酸組成分析によって、感染状態における脂肪酸の鎖長伸長反応を（１８：１、ω−７／１６：１、ω−７）の比率で確認したところ、酵素ＥＬＯＶＬ−１及びＥＬＯＶＬ−６による伸長反応は促進されていた（図５）。それに対し、感染状態においては、不飽和化酵素活性が減少していた。よって、Δ^９不飽和化酵素（ステアロイルＣｏＡ不飽和化酵素１（ＳＣＤ１）としても知られる）が、パルミチン酸（１６：０）及びステアリン酸（１８：０）の両方を不飽和化していたことが分かる。１６：１／１６：０の比は感染によって低下しており、Δ^９不飽和化酵素活性が低下したことが示唆された。具体的には、Δ^９不飽和化酵素活性は、パルミチン酸種の存在量に対する、パルミトレイン酸存在量の比率（つまり、（１６：１ω−７＋１６：１ω−９）／１６：０の比）によって確認し、感染状態においてその比の減少が確認された。この分析結果は、感染状態においては、Δ^９不飽和化酵素活性の低下及び鎖長伸長反応の促進が起こっていたことを示している。これらの発見（つまりΔ^９不飽和化酵素に関する発見）は、Δ^５及びΔ^６不飽和化酵素活性の低下を示唆するミード酸量の減少という結果と整合するものであり、感染状態において、不飽和化酵素（Δ^９、Δ^６及びΔ^５）の活性低下は、非必須脂肪酸量（ミード酸を含む）の低下の要因であることを示唆するものである。

イミノ糖が全脂肪酸組成に及ぼす影響
非感染状態において、イミノ糖は概して、全脂肪酸組成において既に高かったミード酸量を更に抗ウイルス活性を与える濃度にまで高めていた（図４）。あるイミノ糖（AMP-DNJ）の場合、ミード酸含有量は約２倍になっていた。イミノ糖のこれらの影響は、統計学的に有意なものであった。

イミノ糖によるミード酸生成の促進は、Δ^６及びΔ^５不飽和化酵素の活性が更に上昇したことによるものであり、元々ミード酸量が高かったという事実から、これら不飽和化酵素の活性上昇は、培養肝がん細胞にとって構成的に高レベルといえる量を超えた活性上昇であったと考えられる。このイミノ糖の影響は、HCV感染の影響と真逆のものである、逆に言えば、HCV感染の効果が非常に支配的であるために、感染状態においては観察されないものである。非感染状態におけるこのイミノ糖の影響は、細胞のイミノ糖処理によってインシュリンへの感受性が高まったことを示唆していると考えられる。イミノ糖の一種（ＡＭＰ−ＤＮＪ、ＡＭＰ−ＤＮＭとしても知られる）は、肥満マウスにおいて、肝臓のインシュリン感受性を上昇させ、脂肪酸合成酵素の活性を低下させ、脂肪肝を改善するものである（Bijl, Sokolovic et al. 2009）。また、インシュリンはΔ^６不飽和化酵素発現を促進し、活性（ミード酸生成の律速因子である（Wang, Botolin et al. 2006））を上昇させるものであり、このことは、イミノ糖がインシュリン感受性を上昇させたという仮説を支持するものであると考えられる。本発明者らは、ＨＣＶに感染したＩＩ型糖尿病患者において、ＨＣＶ感染に対する治療（インターフェロンとリバビリンの併用）に対する反応性が悪いと予想できるということ、及びＨＣＶ感染症が治癒した患者はインシュリン抵抗性も治癒していたということ（Clement, Pascarella et al. 2009; Eslam, Khattab et al. 2011）は、イミノ糖のインシュリン感受性向上効果は、Ｃ型肝炎ウイルスの複製にとって有利となる肝細胞に潜在する代謝異常に拮抗できるイミノ糖薬剤によって、抗ウイルス治療が可能であることを示唆するものである。

全脂肪酸組成における必須多価不飽和脂肪酸成分にHCV感染が及ぼす影響
哺乳細胞は、必須脂肪酸であるリノレン酸及びαリノレン酸を生合成することができない。また、上述の通り、哺乳細胞は、これらの必須脂肪酸の深刻な欠乏状態にある。従って、感染状態においてアラキドン酸やドコサヘキサエン酸等の高度の多価不飽和ω−６及びω−３脂肪酸の存在量が大きく上昇していたという発見は、驚くべきものである。本発明はこの作用機序によって限定解釈されるべきではないが、感染状態においてこれら高度の多価不飽和脂肪酸の相対的な存在量が上昇したことは、細胞内で脂肪酸を生成する新規脂質生成がウイルス感染によって抑制され、その結果これらの脂肪酸が希釈されなかったことを単純に反映したものであると考えられる。

遊離状態のドコサヘキサエン酸等の多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）が、ＨＣＶの複製及び感染システムを阻害する抗ウイルス効果を有する（Leu, Lin et al. 2004; Kapadia and Chisari 2005; Miyoshi, Moriya et al. 2011）ことを鑑みると、ＨＣＶ感染細胞がＰＵＦＡを高含量で含むことは更に驚くべきことである。本発明はこの作用機序によって限定解釈されるべきではないが、感染状態においてコレステロールエステル及びトリグリセリド中のω−３脂肪酸及びω−６脂肪酸のＰＵＦＡ含有量が高い（後述）のは、ＨＣＶが、これら脂肪酸のウイルス複製抑制作用が阻害される脂肪滴にこれらの脂肪酸を取り込む傾向にあることを反映するものであると考えられる。

感染状態において観察された、細胞内の多価不飽和ω−３及びω−６脂肪酸量のこの驚くべき高さは、これらの脂肪酸の高い血漿中量が、ＨＣＶ感染の度合、又はＨＣＶ感染が肝臓の代謝機能に及ぼす影響の定量的な指標となり得ることを示唆すると考えられる。しかし、これらの必須脂肪酸（ＥＦＡ）は一般的な食品成分（肉類に多い（ω−６）、又は魚類に多い（ω−３））であるので、血漿中の全脂肪酸組成におけるこれらの脂肪酸の存在量をバイオマーカーに利用する方法は、食生活の変化に影響を受けてしまう可能性がある。従って、この食生活が全脂肪酸組成に及ぼす影響を鑑みると、より精密な分析方法が求められる。

各脂質クラス（lipid class）における脂肪酸組成
コレステロールエステル： 感染状態及び非感染状態において、コレステロールエステル中の最も一般的な脂肪酸を測定した。感染によって、コレステロールエステルの脂肪酸組成は大きく変化しており（図６）、必須ω−３及びω−６脂肪酸（２０：４、２２：６及び２２：５）が５〜１４倍増加し、ＥＦＡ形態に変換されない一価不飽和脂肪酸（１６：１及び１８：１）が減少していた。つまり、コレステロールエステルにおける変化は、ＨＣＶ感染による全脂肪酸組成の変化を反映しており、従って、培養肝がん細胞の全脂肪酸組成に大きく寄与するものである。全脂肪酸組成とは異なり、イミノ糖で処理しても、感染状態及び非感染状態の両方において、コレステロールエステルの脂肪酸組成はあまり変化しなかったが、一方で、コレステロールエステルの脂肪酸組成において、ミード酸（通常コレステロールエステルの主要成分としては検出されない）は測定されなかった。超低比重リポタンパク質（ＶＬＤＬ）の直接前駆体であるコレステロールエステルは脂肪滴の主要成分であること、及び、ＶＬＤＬはＨＣＶリポウイルス粒子のリポタンパク質成分であることから、ＥＦＡ種で富化されたコレステロールエステル量の増加は、Ｃ型肝炎細胞の感染に関する有用なバイオマーカーとして、又はＣ型肝炎ウイルスが感染患者の肝細胞の代謝に及ぼす影響を分析するのに、有用である。

トリグリセリド： トリグリセリドは、脂肪滴の主要成分であり、分泌されたＶＬＤＬ及びリポウイルス粒子の核を（コレステロールエステルと共に）形成するものである。本明細書において本発明者らが述べた、血中のＶＬＤＬ／リポウイルス脂質組成が肝細胞の代謝にＨＣＶ感染が及ぼす影響に対する感度の高い指標となり得るという理論を鑑みれば、トリグリセリドは特に注目に値する。分子当たり１個だけ脂肪アシル鎖が含まれるコレステロールエステルとは異なり、トリグリセリドには３個の脂肪アシル鎖が含まるものである。そして、合成酵素の基質選択性、及び細胞内の利用可能な遊離脂肪酸前駆体量を反映して、これら３つは、いずれかの脂肪アシル鎖が他と同様のものではない傾向にある（Berry 2009）。トリグリセリド生合成のこういった特徴は、脂肪アシル鎖の異性体組成の多様性に自由度を与え、他の脂質に比べてその多様性を顕著に高めている。図７は、検出された種々のトリグリセリドの百分率組成、及びＨＣＶ感染及びイミノ糖処理がこの組成に及ぼす影響を示すものである。

注目すべきことに、全てのトリグリセリドの１／４から１／３を占める、最も豊富に存在するトリグリセリドであって、パルミトレイン酸（１６：１）を含むトリグリセリドである「Ｃ５２：２−Ｃ１６：１」の脂質組成における存在量には、ＨＣＶの感染による変化は検出されなかった。しかし、このグリセリドより存在量の少ない数種のトリグリセリドに、際立った量の変化が検出された。９種のトリグリセリドの存在量が半分より少なくなり、６種のトリグリセリドの存在量は２倍を超えて上昇した。以下に記すトリグリセリドの存在量が、ＨＣＶ感染によって最も大きく上昇した。その上昇は感染前の１５倍を超えるものであった。

Ｃ５４：５−Ｃ１８：０
Ｃ５４：６−Ｃ１８：１
Ｃ５６：５−Ｃ２０：４
Ｃ５６：７−Ｃ２２：６

注目すべきことに、トリグリセリドＣ５４：６−Ｃ１８：１の量は、感染によって９６倍も上昇したが、上昇後でも、感染状態におけるトリグリセリド組成中１．７％を占めるに過ぎない。以上のトリグリセリド量の変化は、ルーチンの臨床診断テストにおける従来の血中トリグリセリドの検査では明らかにされていなかった。なぜならば、従来のテストでは、トリグリセリド総量を測定するのみで、各トリグリセリドの脂肪酸組成や分子種まで分析するものではなかったからである。同様に注目すべきことに、二重結合を非常に多く含み、且つ必須脂肪酸を含むトリグリセリドであるＣ５６：５−Ｃ２０：４（アラキドン酸（２０：４）を含む）及びＣ５６：７−Ｃ２２−６（ドコサヘキサエン酸を含む）の量が、感染状態において顕著に上昇していた（１６倍超）。しかし、これらのトリグリセリドの上昇後の量は、細胞全トリグリセリド量に対しては依然微量のままであった（図８）。

完全に飽和化されたトリグリセリドであるＣ４４：０−Ｃ１６：０の存在量は、感染状態において１／５にまで減少していたので、血中トリグリセリド又はＶＬＤＬに含まれるこのトリグリセリド存在量の減少は、肝臓の脂質代謝にＣ型肝炎ウイルスが及ぼす影響を決定するために有用となり得る。イミノ糖は、この飽和トリグリセリド存在量を非感染状態において上昇させ、感染状態においては減少させる傾向を示したが、これら以外には、トリグリセリドの脂肪酸組成に体系的な影響を及ぼさなかった。イミノ糖が特定のトリグリセリドに限って及ぼすこの軽微な影響には、診断及び予測上の重要性はないと考えられる。

ホスファチジルコリン： エーテル結合を有するＰＣの場合（後述）と異なり、エステル結合を有するリン脂質ＰＣ、ＰＥ、ＰＳ及びＰＩは、感染によって、リゾ型ＰＣ等に大きく再構築された。ジエステル型ＰＣの場合、感染によって一価不飽和ＰＣ３２：１の量が減少した一方で、感染によって飽和ＰＣ３２：０、飽和ＰＣ３４：０及びＰＵＦＡ富化ＰＣ（ＰＣ３４：４及びＰＣ３８：５）の量が上昇していた（図９）。この分析では、全分子種に含まれる異性体に起因する曖昧さにより、ミード酸と他の多価不飽和脂肪酸とを明確に区別することが出来ない。しかし、感染状態において観察された多価不飽和脂肪アシルの形態のＰＣの増加は、上述の全脂肪酸組成及びコレステロールエステル組成の分析結果、すなわち感染状態において必須多価不飽和脂肪アシルの存在量が上昇するとともに膜リン脂質の形態に組み込まれたという驚くべき結果と、整合するものである。

エーテル型リン脂質形態のＰＣ（つまり、ペルオキシソーム内で合成される「プラズマローゲン」型ＰＣ）の脂肪酸組成は、感染の影響を受けないことが観察された（図１０）。ＥＲ内で合成されるエステル結合型リン脂質の選択的再構成は、ＨＣＶが、リン脂質の再構成に対して部分特異的に影響を及ぼすことで、ペルオキシソームではなくＥＲに影響を及ぼすことを示すものである。このことは、ＨＣＶが、「membranous web」と呼ばれる膜構造（前述）の生成、脂肪滴へのウイルスコアタンパク質の組み込み（ＥＲも密接に関与する）、及びＥＲからのリポウイルス粒子としての出芽に関して、ＥＲに密接に依存していることと整合するものである。

リゾ型ＰＣの分析（図１１）によって、上述の異性体に起因する曖昧さを解消することができる。ジエステル結合型ＰＣから合成され、且つ１個の脂肪アシル鎖のみを含むリゾ型ＰＣの場合、感染状態においては、不飽和パルミチン酸（１６：１）量が減少し、それに伴って１６：０のパルミチン酸が増加したことが観察された。この観察結果は、上述のΔ^９不飽和指数の観察結果と整合するものであり、更に、全脂肪酸組成分析によって観察された優勢的な変化が、蓄積脂質及び膜脂質における変化を反映していることを示すものである。リゾ型ＰＣと同様に、２０：４（アラキドン酸）及び２２：６の明らかな増加も観察された。この観察結果は、感染状態においてより多量であるこれらの必須脂肪酸が膜リン脂質に組み込まれる経路が存在することを示すものである。

ホスファチジルエタノールアミン： ジエステル型ＰＥを分析したところ（図１２）、ミード酸（Ｃ２０：３、ω−９）が明らかに検出された。全脂肪酸組成については、感染によってミード酸量が１／２０未満にまで減少し、一方で、イミノ糖で処理したところ、イミノ糖の種類によって異なるものの、ミード酸量に２倍迄の増加が観察された（ただし、この増加は非感染状態のみで観察された）。同様に、感染によって、パルミトレイン酸（１６：１、ω−７及びω−９）量の顕著な減少、及び必須ω−３及びω−６脂肪酸（２０：３、ω−３；２０：４、ω−６；２０：５、ω−３；２２：６、ω−３；２２：５、ω−３、及び２２：４、ω−６）量の顕著な上昇が観察された。これらのＰＥの脂肪アシル組成分析結果は、上述の全脂肪酸組成、コレステロールエステル組成及びジエステル型ＰＣ組成の結果を、強く支持するものである。しかし、ジエステル型ＰＣ組成と異なり、ＰＥの場合は、（一価不飽和型と比べて）飽和型の存在量が均衡を保つよう上昇していなかった。よって、ＰＥの場合、ＨＣＶの感染は、（細胞分裂やＥＲからのウイルス出芽に必要とされる）膜への融合及び分裂特性に対し大きな影響を及ぼす可能性が示唆された。

ホスファチジルセリン： ジエステル型ＰＳの場合、ＨＣＶ感染によって、１８：０及びミード酸（２０：３、ω−９）を含んでいると思われるＰＳ３８：３種の量が１／２未満にまで減少した。よってＰＳは他の脂質クラスに比べて、全脂肪酸組成において優勢的だった諸変化に対する可塑性が低かったことが示された（図１３）。この相対的に低い可塑性は、ＰＳの比較的低い代謝回転率を反映したものだと考えられた。更には、４０：６種の量が、感染によって減少していた。しかし、このレベルの分析では、このＰＳ種が、１個の２２：６とＣ１８：０との組み合わせ、又はＣ２０：３同士の組み合わせのどちらであるかは明らかにはできない。

ホスファチジルイノシトール： ４種のみが存在するジエステル型ＰＩは、ＨＣＶ感染によって、その脂肪酸組成が大きく変化した（図１４）。感染によって、ＰＩ３８：３量が１／６に減少し、一方で、ＰＩ（ＰＩ３６：４、３８：４及び３８：５）の残留ＰＵＦＡ富化種の量がそれぞれ約２倍に上昇した。ＰＩにおける組成のうち一番大きな変化は、感染によって引き起こされたものであり（イミノ糖で処理した場合とは異なる）、ＰＩ３８：３のＰＩ３８：４への実質的な総置換であった。ＰＩ３８：３の構造は１８：０／２０：３と予想されるため、感染による変化は、感染状態におけるミード酸（２０：３、ω−９）量の減少と整合するものである。ミード酸は感染状態において最も多量に存在する脂肪酸であるアラキドン酸（２０：４、ω−６）と置換された。つまり、１８：０／２０：３（ステアリン酸／ミード酸）から、１８：０／２０：４（ステアリン酸／アラキドン酸）に変化した。また、感染状態においてのみ、イミノ糖の存在下で、ＰＩ３８：３種の量が上昇する傾向が観察され、この傾向はイミノ糖による全脂肪酸組成におけるミード酸量の大きな上昇を若干反映したものであったといえる。ＰＩは細胞内シグナル伝達機構に深く関与している。よって、（感染又はイミノ糖処理によってもたらされる）ＰＩの脂肪酸組成の変化は、ＰＩを介した細胞内シグナル伝達（例えば、インシュリン感受性）に影響を及ぼすものと考えられる。ここで、アラキドン酸（ω−６）は、インシュリンによるＰＩ３キナーゼ活性化を阻害し、そのＰ３８ＭＡＰキナーゼを介したグルコース６リン酸脱水素酵素の誘導を阻害する（Talukdar, Szeszel-Fedorowicz et al. 2005）。また、感染によるＰＩの脂肪酸組成の変化は、ＰＩ３キナーゼに対する基質としてのＰＩの挙動を変化させると考えられる。加えて、この感染によるＰＩにおける変化はＣ型肝炎ウイルス感染において大きな病理学的意義を持つと確信させる、（インシュリン耐性とは別の）理由がある。その理由とは、ＰＩはエイコサノイド合成に使用されるアラキドン酸の主要供給源であるため、感染によってＰＩ中のアラキドン酸量が３倍に上昇すると、これら生物活性成分の生合成量が上昇し、それによって宿主細胞のウイルスに対する炎症性反応を向上させると考えられるというものである。

バイオマーカーの特定におけるリン脂質脂肪酸組成の意義

肝臓は、ＨＣＶビリオンを、ＶＬＤＬ粒子を伴うＨＣＶビリオンを含むリポウイルス粒子（前述）の一部として分泌する。本発明はこの作用機序によって限定解釈されるべきものではないが、本発明者らは、ＶＬＤＬ粒子の脂質表面はＰＣ及びＰＥが優勢的に存在するので、細胞内におけるＰＣ及びＰＥの脂肪酸組成にＨＣＶウイルスが及ぼす影響は、ＨＣＶ感染患者の血中ＶＬＤＬの脂肪酸組成の変化に現れるという仮説を立てた。ＰＣの場合、感染による脂肪酸組成変化は、ジエステル型ＰＣの脂肪酸組成のみに観察された。よって、バイオマーカーの特定という観点からは、ＶＬＤＬに含まれるジエステル型ＰＣの脂肪酸組成変化が最も注目されるべきものであること、そして、エーテル型ＰＣの脂肪酸組成が対照群（コントロール）として有用であると考えられる。この点に関して、まず注意すべきは、感染によってＰＣ３２：１量は減少し、一方で飽和ＰＣ３２：０及び３４：０、並びにＰＵＦＡ富化ＰＣ（ＰＣ３４：４及びＰＣ３８：５）量は上昇することが観察されているという点である。よって、ジエステル型ＰＣ３２：１量の減少及び上記ジエステル型ＰＣ量の上昇（つまりＰＣ３２：０、３４：０、３４：４及び３８：５量の上昇）は、肝細胞のリン脂質代謝に対しＨＣＶが影響を及ぼしたことを示すものであると考えられる。

ＰＥの場合は、非感染状態におけるミード酸量の上昇が観察されており、原発性肝細胞がんに起因する血中ＶＬＤＬ粒子中のミード酸もまた上昇していると考えられるので、血中ＶＬＤＬのミード酸含有量は、原発性肝細胞がんのバイオマーカーとして有用であると考えられる。更に、感染によってパルミトレイン酸（１６：１、ω−７及びω−９）量が大きく減少し、必須ω−３及びω−６脂肪酸（２０：３、ω−３；２０：４、ω−６；２０：５、ω−３；２２：６、ω−３、２２：５、ω−３；及び２２：４、ω−６）量が大きく上昇することが観察されおり、従って、感染状態に特徴的な血中ＶＬＤＬにおける後者の脂肪酸群の量変化は、ＨＣＶ感染が肝細胞に及ぼす影響の指標となり得、またバイオマーカーとして有用であると考えられる。

ＶＬＤＬに少量含まれるリン脂質成分であるＰＩ及びＰＳのＨＣＶ感染のバイオマーカーとしての有用性は、比較的低いと考えられる。しかし、ＶＬＤＬ中のＰＩに含まれるミード酸量の減少、又はＰＩ３８：３量の減少については、ＨＣＶ感染の影響の有用な指標となり得ると考えられる。また、ＶＬＤＬ中のＰＩ及びＰＳ（これらは通常、細胞膜及びＥＲによって細胞内に形成された膜内に取り込まれる）の量の上昇は、ＨＣＶ感染が起こったことを意味するものであると考えられる。従って、ＨＣＶ感染状態で起こる肝細胞のアポトーシスは、膜非対称性を増大し、その結果として、通常ＶＬＤＬから多量に排除されるＰＩ及びＰＳ等の脂質量を上昇させ、ＶＬＤＬのリン脂質単層表面に存在するＰＩ及びＰＳ存在量を大きく上昇させる。

感染細胞及び非感染細胞、並びに処理済み細胞及び非処理細胞における、スフィンゴ糖脂質の存在量及び脂肪酸組成
感染及び非感染細胞を、抗ウイルス活性を奏する濃度のイミノ糖で処理すると、「グリコシルセラミド」（ここで、現在の質量分光分析では、グルコシル型とガラクトシル型は区別されない）の細胞内濃度が、グルコシルセラミド合成酵素の阻害によって、大幅に減少する（図１５）。この影響は、グルコシルセラミドの産物であることが（質量分光分析ではグルコースかガラクトースかが明白にならない「グリコシルセラミド」とは異なり）明白なラクトシルセラミドにおいて、より顕著に現れる。以上の結果は、これらの化合物が既にグルコシルセラミド合成酵素の阻害剤として知られていたことから、予測可能なものであった。

しかし、予想外なことに、イミノ糖処理によって、グルコシルセラミドの脂肪酸組成が変化したことが観察された。一方で、（上述の、感染による主要及び微量細胞脂質の大幅な再構成及びΔ^９総不飽和指数の変化を鑑みると）驚くべきことに、感染によっても、ＧｌｃＣｅｒの脂肪酸組成は変化しなかった。それに対し、イミノ糖処理によって、ＧｌｃＣｅｒの鎖長延長及び不飽和化が起こった（これらの影響のうち、後者がより顕著なものであった）。これらの現象（つまり不飽和化及び鎖長延長）は、感染状態でも非感染状態でも同様に観察された。図１６は、グルコシルセラミド不飽和化反応の、これら薬剤に対する反応性を示すものである。図１７は、これらの変化が、スフィンゴ脂質（ＧｌｃＣｅｒ及びＬａｃＣｅｒ）に特有のもの、つまりＰＣ及びＰＥでは観察されなかったことを示すものである。

ＧｌｃＣｅｒの脂肪酸組成の変化（感染状態及び非感染状態で同様に観察されたイミノ糖による不飽和度の上昇）は、上述の、感染状態で観察された不飽和化酵素活性の低下及びそれに基づく仮説（前述）といくつかの点で整合しないものの、上記観察結果によれば、イミノ糖によるＧｌｃＣｅｒの不飽和化は、非感染状態より感染状態の方が軽度であった。これらの変化は、好都合なことに、ＧｌｃＣｅｒの「不飽和指数」、つまりＣ２４：１／Ｃ２４：０の存在量比（つまり、ネルボン酸／リグノセリン酸脂肪アシル鎖のモル比）に反映される（図１８）。ＧｌｃＣｅｒの不飽和指数及びＬａｃＣｅｒの不飽和指数（より低い不飽和指数）はイミノ糖によって上昇したことが観察された。一方で、関連化合物であるスフィンゴ脂質セラミド（ＧｌｃＣｅｒの直接前駆体）の不飽和指数は変化しなかった（図示せず）。ＧｌｃＣｅｒ合成酵素の阻害剤であるイミノ糖の存在下における不飽和ＧｌｃＣｅｒの蓄積は、ＬａｃＣｅｒ合成酵素（ガラクトース転移酵素Ｉ）又はより複雑な飽和型グリコスフィンゴ脂質合成経路のより下流の酵素による不飽和化の方が、感染状態において強く抑制されたΔ^９不飽和化酵素の活性（この抑制は、前述の細胞内全脂肪酸組成より明らかである）を介した不飽和化より優勢であったためと考えることができる。又は、これらの変化は不飽和鎖をより多く含むガングリオシド合成につながる、つまり、ＬａｃＣｅｒ合成酵素のＧｌｃＣｅｒ前駆体プールの大半は不飽和型であると考えること、又は、これらの変化は、後述するように、不飽和型ＧｌｃＣｅｒによるＬａｃＣｅｒ合成の競合的阻害につながると考えることもできる。

ＧｌｃＣｅｒ及びＬａｃＣｅｒはガングリオシドの主要前駆体であること（Butters, Dwek et al. 2005; Fuller 2010）、及びガングリオシドは脂質ラフトの重要な成分（スフィンゴミエリン及びコレステロールと共に）であること（Quinn 2010）から、本発明者らは、細胞のＧｌｃＣｅｒ存在量の減少は、細胞膜脂質ラフトの存在量及び／又は大きさの減少、又は細胞脂質ラフトの機能を変化させるという仮説を立てた。更に、ＨＣＶの複製サイクルのいくつかの段階は脂質ラフトに大きく依存することから（Aizaki, Lee et al. 2004; Matto, Rice et al. 2004; Aizaki, Morikawa et al. 2008; Weng, Hirata et al. 2010）、イミノ糖による脂質ラフトの存在量の減少又は機能変化は、イミノ糖の抗ＨＣＶ効果の原因であると考えられた。加えて、グルコシルセラミド合成酵素の阻害剤であるイミノ糖は、ＧｌｃＣｅｒの存在量の減少に加え、驚くべきことに、ＧｌｃＣｅｒの不飽和度の上昇も引き起こしたことが観察された。この上昇は脂質ラフトの量及び性質に影響を及ぼすものである、つまり、不飽和型ガングリオシドの脂質ラフトへの取り込み（脂質ラフトは「飽和型の」ミクロドメインであるという特徴を有する）によって、脂質ラフトの構造及び機能を変化させるものと考えられる。ガングリオシドの病的蓄積によって、コレステロールが細胞膜に取り込まれる（この現象は、ゴーシェ病等の、ガングリオシドを蓄積する疾患において観察される）ので、イミノ糖は、コレステロールの局在化又は輸送に影響を及ぼすと考えられる。例えば、脂質ラフトにおいてガングリオシド成分が枯渇すると、脂質ラフトからコレステロールが遊離され、細胞膜内の「遊離」コレステロール濃度が高くなると考えられる。よって、イミノ糖は、その脂質ラフトへ及ぼす直接的影響に加えて、ＧｌｃＣｅｒの脂肪酸組成を変化させてコレステロールを膜脂質ラフトから遊離させ、それによって抗ウイルス効果を奏するものと考えられる。

コレステロールの脂質ラフトからの遊離は、「コレステロール過多」状態にあると細胞に誤解させ、遊離コレステロールに起因するコレステロール合成阻害を引き起こし、ウイルスの複製に必要なコレステロールを、ウイルスから奪う結果につながると考えられる。

スフィンゴ糖脂質の存在量及び不飽和指数のバイオマーカー用途の意義
上記から、グルコシルセラミドの存在量、並びに血中リポタンパク質中のグルコシルセラミド及びラクトシルセラミドの不飽和指数は、イミノ糖を用いた治療の抗ＨＣＶ治療効果の指標となり得ると考えられる。同様に、これらの不飽和指数は、ゴーシェ病やニーマン・ピック病Ｃ型等の、遺伝性のライソゾーム病に対するグルコシルセラミド合成酵素阻害剤による治療への反応性の指標ともなると考えられる。これまで、グルコシルセラミドのガングリオシド産物（つまり白血球表面のＧＭ３）存在量はゴーシェ病に対する治療への反応性のバイオマーカーとして試験的に使用されてきたが、このような疾病に対するグルコシルセラミド合成酵素阻害剤による治療に対する反応性のバイオマーカーとして、グルコシルセラミドの不飽和指数を使用することは、全く示唆されていなかった。同様に、全脂肪酸組成及びスフィンゴ脂質（具体的には、セラミド、スフィンゴミエリン及びセレブロシド）におけるネルボン酸（２４：１）の存在量は、Ｉ型糖尿病のラット及びネズミ科モデルにおいて減少していた（Fox, Bewley et al. 2011）ことが知られているが、現在まで、グルコシルセラミドの不飽和指数が、ＩＩ型糖尿病の疾患活動性、又はＩＩ型糖尿病に対するインシュリン抵抗性改善薬による治療への反応性に関するバイオマーカーとして使用可能であることは、全く示唆されていなかった。本発明者らは、メタボリックシンドローム及びＩＩ型糖尿病は、（高インシュリン血症に起因する）ＶＬＤＬ中のグルコシルセラミドの不飽和指数の上昇によって特徴づけられること、そしてインシュリン抵抗性改善薬（例えば特定のイミノ糖、ビグアニド及びチアゾリジンジオン）による治療によって、インシュリン感受性を改善（特に、インシュリンによって刺激されるグルコース取り込み量、及び肝臓におけるグルコース生成量の減少という観点からの改善）して高インシュリン血症を改善することで、この不飽和指数を正常値に戻すことができることを、ここに初めて示した。

メタボリックシンドローム及びＩＩ型糖尿病が、ＨＣＶ感染症に対するインターフェロン及びリバビリンの併用の治療反応性の負の予測因子である（Clement, Pascarella et al. 2009; Eslam, Khattab et al. 2011）ことを鑑みると、血中ＶＬＤＬのＧｌｃＣｅｒ及び／又はＬａｃＣｅｒの不飽和度は、インターフェロン及びリバビリンの併用への反応性が低いＨＣＶ感染体を特定するために使用可能であると考えられる。例えば、ＧｌｃＣｅｒ又はＬａｃＣｅｒの不飽和指数としての２４：１／２４：０比が異常に高いＨＣＶ感染患者（例えば未診断のメタボリックシンドロームによる高インシュリン血症を呈するＨＣＶ感染患者）は、インターフェロン及びリバビリンの併用への反応性が低く、新規承認薬を用いたより積極的な治療（その新規承認薬のみ、新規承認薬同士の併用、又は新規承認薬と、インターフェロン及びリバビリンとの併用等）を必要とすると考えられる。同様に、このような患者は、グルコシルセラミド合成酵素阻害剤であるイミノ糖を用いて（肝臓を含む）体内組織のインシュリン感受性を改善し高インシュリン血症を改善するという治療への反応性が、他のＨＣＶ感染患者よりも低いと考えられる。反応性がより高い薬剤をＣ型肝炎患者が使用できるようにすることが患者の利益となり、治療コストも軽減される。

血中ＶＬＤＬのトリグリセリド中のパルミトレイン酸の不飽和指数１６：１／１６：０比は、代謝疾患のマーカーとして使用可能であるといわれてきた（Peter, Cegan et al. 2009）。具体的には、この不飽和指数は代謝異常症候群において上昇する。しかし、このマーカー使用は、スフィンゴ糖脂質がインシュリンシグナル伝達に関与していることを示すものである、アダマンタン化合物であるＡＭＰ−ＤＮＪ／ＡＭＰ−ＤＮＭに例示されるイミノ糖のインシュリン感受性改善作用によるインシュリン感受性に特に関連する、本発明で特定されたグルコシルセラミドの不飽和指数の利用価値の高さを予測させるものではない。更に、本明細書に記載される観察結果は、（グルコシルセラミドの不飽和指数とは異なり）１６：１／１６：０比が、感染細胞においてＨＣＶの感染によって減少する（少なくとも、感染細胞の全脂肪酸組成において）傾向にあるため、ＨＣＶ感染状態における代謝疾患のマーカーとしての有用性が限定的なものであることを示唆している。

診断テストの実施
血液は、数種の異なる形態のリポタンパク質を含むものであり、それらリポタンパク質のいくつかは、食品摂取に応じて徐々に動的に変化する。例えば脂肪分は、食事中最も濃度が高くなり、且つ食後急速に（６時間以内）消失する、カイロミクロンの形態で吸収される。カイロミクロンは食物脂肪を主に含み、加えてトリグリセリド、ジグリセリド、コレステロールエステル、遊離コレステロール、リン脂質及び遊離脂肪酸を含むものである。それに対し、ＶＬＤＬは、肝臓由来産物であり、リン脂質に加えて、再構成され再内包されたトリグリセリド及びコレステロールエステルを含み、これらは全て、本発明者らによる仮説に基づけば、ＨＣＶ感染によって影響を受けた細胞の脂質代謝に、影響を受ける。これまでに、ＨＣＶ感染が肝細胞の代謝に及ぼす影響を分析するのに適しているといわれる様々な脂質バイオマーカーが特定されてきたが、そのうちのいくつかの血漿濃度を測定しても、カイロミクロン形態の食物由来脂質によって測定バックグラウンドが変化するため、測定値がその変化に影響を受けやすい。しかし、別のいくつかのバイオマーカー、例えば（感染によって９６倍にまで増加する）Ｃ５４：６−Ｃ１８：１トリグリセリドは、絶食状態でも食後でも、非分画血漿中の量を測定するのであれば、バイオマーカーとして有用であると考えられる。また、ヒト血漿中の全脂肪酸組成に関する近年の研究によって、種々の脂肪酸の存在量は、狭い範囲内に収まるように制御されていることが報告されており（Lamaziere, Wolf et al. 2012）。よって、血漿中の全脂肪酸組成自体のバイオマーカーとしての有用性は限定的であると報告されているものの（Flowers 2009）、栄養状態で変動するバックグラウンドが、Ｃ型肝炎の脂質分子組成バイオマーカーに及ぼす影響は、ＨＣＶ感染が代謝に及ぼす影響のバイオマーカーとしての使用を断念させるほどには大きなものではないと考えられる。しかし、血漿中の食物由来脂質の動的な変化が及ぼす影響を解消する方法は、少なくとも２つあると考えられる。

絶食状態では、血中トリグリセリドは、主にリポタンパク質ＶＬＤＬに貯留される（Flowers 2009; Peter, Cegan et al. 2009）。従って絶食状態では、血漿中トリグリセリドの組成は、ＶＬＤＬ中のトリグリセリド組成と同等であると考えられる。よって、絶食状態においては、少なくとも肝臓における代謝にＨＣＶ感染が及ぼす影響の指標として本明細書において特定されたトリグリセリド種の組成に関しては、その非分画血漿の分析結果が本明細書に記載するバイオマーカーとして適切に使用可能であると期待できる。

バックグラウンドの食物由来脂質が及ぼす影響に対する二つ目の解消方法は、密度勾配遠心法等の適切な分離操作やクロマトグラフ法によって、血液からＶＬＤＬを分離する方法である。（トリグリセリドの場合には）また、薄層クロマトグラフ法やＨＰＬＣによって、血漿中のトリグリセリドを単離精製することもできる。ヒト血漿からのＶＬＤＬ及びトリグリセリド画分の単離は、例えばPeter et al. 2009に記載されている。

グルコシルセラミドの不飽和指数（２４：１／２４：０比）の測定に関しては、（肝臓由来の）ＶＬＤＬも、上述の他のマーカー（例えば、特定のトリグリセリド種）のように、血中リポタンパク質として適切な分析対象となることを認識する必要がある。しかし、血管を循環するスフィンゴ脂質のうち、スフィンゴミエリンはグルコシルセラミドより多量に存在することが分かっている（Hammad, Pierce et al. 2010）。ＶＬＤＬ中のグルコシルセラミドの不飽和状態の測定に加えて、本発明者らによって、グルコシルセラミドの不飽和指数と同様の機序でイミノ糖の影響を受けることが見出されたスフィンゴミエリンの不飽和指数２４：１／２４：０比も測定することで、より高い有用性及び高感受性が達成されると考えられる。

材料及び方法
Ｈｕｈ７．５細胞及びＨＣＶ株Ｊｃ１の細胞培養： 肝がん細胞における複製可能ＨＣＶの細胞培養系の方法の要点はすでに知られている通りである（Pollock, Nichita et al. 2010）。Ｈｕｈ７．５細胞（Apath, LLC製）を、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、２ｍＭのＬ−グルタミン、１×ＭＥＭ及び１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭで増殖させた。培養条件は、全て３７℃及び５％ＣＯ_２とした。イミノ糖による処理が細胞脂質組成に及ぼす影響を、ＨＣＶｃｃ感染細胞及び非感染細胞の両方について調べた。ＨＣＶ株Ｊｃ１（遺伝子型２ａ）をＨｕｈ７．５細胞に感染させるために、既知の感染価を有するウイルスストックを用いて、感染多重度（ＭＯＩ）＝０．０２の条件で、当該ウイルスの存在下Ｈｕｈ７．５細胞を１時間培養した。一部の細胞しか感染させられず、感染細胞が「感染状態」として示すリピドミックな足跡が薄まってしまうことを防ぐため、約２週間培養して、ほぼ１００％の細胞を感染させた。感染の有無は、ＨＣＶコアタンパク質の免疫蛍光法によって確認した。次いで、ＨＣＶ感染細胞及び非感染細胞の両方を、イミノ糖の存在下又は非存在下で４日間培養し、培養後、トリプシン／ＥＤＴＡを用いて回収し、氷冷ＰＢＳで３回洗浄し、トリパン青（trypan blue）染色によって細胞数を計数し、脂質組成分析に先立って、細胞ペレットをメタノール：アセトン（容積比１：１）に再懸濁した。各試料について、少量（液量）をブラッドフォードタンパク質分析（Bio-Rad）に供して、総タンパク質量を見積もった。

リピドミクス方法
全脂質の脂肪酸組成：ＧＣＭＳによる全脂質中のＦＡの測定方法は、既に公開されている（Wolf 2008; Quinn, Rainteau et al. 2009）。簡潔に説明すると、以下のとおりである。まず、培養した肝がん細胞Ｈｕｈ７．５ペレットに、Bligh & Dyerによる方法に従ってクロロホルム抽出を行った（Bligh and Dyer 1959）。培養した肝がん細胞Ｈｕｈ７．５細胞ペレットからクロロホルムで抽出した脂質抽出物に、内部標準物質としてヘプタデカン酸を添加した。次いで、この溶媒抽出物を真空内で乾燥させ、乾燥させた脂質フィルムを、不活性窒素／アルゴン雰囲気下、抗酸化剤としてブチル化ヒドロキシトルエンを加え、メタノール硫酸（１８Ｎ、容積百分率２％）で１時間、７０℃で処理して、脂質のメチル基転移反応を行った。このとき、多価不飽和脂肪酸の過酸化反応を最小限に抑えるため、テフロンで密封したガラス製ディスポーザブルチューブを用いた。冷却後、水（容積比１／２となる量の水）を加え、ＦＡメチルエステル（ＦＡＭＥ）をヘキサン内に抽出した。ヘキサン抽出物を窒素ガス中で濃縮し、濃縮物を、２００μｌのガラス製容器が嵌め込み装着された自動サンプリング装置用バイアル（Agilent 5975 ; 91940 Les Ulis,フランス）に移した。１μｌずつ、スプリットレスモードのＧＣＭＳ装置（Agilent 5975; 91940 Les Ulis,フランス）に注入した。不飽和ＦＡＭＥ異性体（ω−２重結合位置がｎ３、ｎ６、ｎ７、ｎ９）を、ポリエチレングリコールが極性結合したキャピラリーカラム上に分離した（Omegawax; Sigma-Aldrich, L'Isle d'Abeau Chesnes 38297 Saint-Quentin Fallavier,フランス）。次いで、付加物（ＦＡＭＥ＋ＮＨ_４ ^＋）を、試薬ガスとしてアンモニアを用い（≒１０^−４トール（Ｔｏｒｒ）、ソース温度（source temperature）≒１００℃）化学イオン化モードで分析した。内部標準物質（ヘプタデカン酸）に基づいて標準化し、Ponderal calibration mixture（Mix-37; Supelco-Sigma-Aldrich L'Isle d'Abeau Chesnes 38297 Saint-Quentin Fallavier,フランス）を用いて応答係数を較正した後のピーク面積を積分法で求めて、定量を行った。

全コレステロール（ＧＣＭＳ）： 全コレステロール（エステル化したもの及びエステル化していないものの合計）及びステロール代謝物を、トリメチルシリルエステル誘導体にし、文献（Chevy, Illien et al. 2002; Chevy, Humbert et al. 2005）の記載に従って、ＧＣＭＳによって組成分析した。簡潔に説明すると、以下の通りである。まず、脂質のクロロホルム抽出物に、ｄ７−クロロホルム（Avanti Polar Lipids, Lipid MS standards, Alabaster, AL 35007）、及び内部標準物質としてエピコプロスタノール（Sigma-Aldrich）を加えた。上述のＦＡＭＥ調製物に対するメチル基転移反応を行った後、ヘキサン抽出物を窒素気流中で乾燥させた。ステロールを０．５ｍｌのＢＳＴＦＡ（Ｎ，Ｏ−ビス（トリメチルシリル）トリフルオロアセトアミド）及び１％ＴＭＣＳ（トリメチルクロロシラン）（Supelco Sigma-Aldrich 38297 Saint-Quentin-Fallavier Cedex）で、６０℃で６０分処理して、ステロールをシリル化した。次いで、過剰な試薬を蒸発させ、シリル化ステロールを、ＧＣに注入するためにヘキサンに溶解させた。コレステロール及び代謝物を、２００〜２５０℃に加熱された、ジフェニル−ジメチルポリシロキサンが中程度の極性で極性結合したキャピラリーカラム（RTX50; Restek France Lisses France 9109）上で分離した。正モードで、特徴的なフラグメントイオンに由来するピークの面積を積分法によって求めて、検出、及びPonderal校正混合物に対する相対量を得た（電子衝突エネルギーは７０ｅＶに設定した）。

ＬＣＭＳ２によるリピドミクス測定： ＬＣＭＳ２法は、既に方法に関する総説に記載されている（(Ivanova, Milne et al. 2007; Myers, Ivanova et al. 2011）。簡潔に説明すると、以下の通りである。まず、リン脂質のクロロホルム抽出物を、Ｈｕｈ７．５細胞ペレットから調製し、内部脂質標準物質の混合物（Avanti Polar Lipids, Lipid MAPS MS standards, Alabaster, AL 35007）を抽出物に加えた。各クラスの脂質をＨＰＬＣ（Agilent 1200 Series）を用いて、ポリビニルアルコール修飾型シリカカラム（PVASil, YMC, ID 4mm, length 250mm, Interchim, Montlucon 03100,フランス）上で分離した。極性の低い脂質（トリグリセリド、ジグリセリド、コレステロールエステル、セラミド、グルコシルセラミド及びラクトシルセラミド）は、ヘキサン／イソプロパノール／１０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液（容積比４０／５８／２）によって、５〜１５分の画分に溶出された。それらに続いて、リン脂質が、ヘキサン／イソプロパノール／１０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液（容積比４０／５０／１０）によって、より極性の高い１５〜６０分の画分に溶出された。リン脂質の溶出順は以下の通りである：ホスファチジルエタノールアミン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルコリン、スフィンゴミエリン、リゾホスファチジルコリン。溶出された脂質を、分光計のエレクトロスプレーインターフェース（TurboIon, Framingham, MA 01701, USA）へと流し、ポジティブモードで脂質をイオン化し、Ｍ＋ＮＨ_４ ^＋及びＭ＋Ｈ^＋を検出した。ソースを「衝突誘起解離」モード（又は「前駆体」モード）で運転している三連四重極型質量分析計（API3000, ABSciex, Toronto,カナダ）に連結して、上記順次溶出された脂質クラスに特徴的なフラグメントイオンを監視した。特徴的なフラグメントイオンの由来である前駆体分子種は、ソフトウェアＬＩＭＳＡ（Haimi, Chaithanya et al. 2009）を用いて、培養肝がん細胞用に調製されたライブラリと照合して同定した。脂質の分子種が同定されたので、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）による定量のために、イオンの組み合わせ（前駆体／産物イオン）のリストを作成した。続いて、対応するＭＲＭピークに対し時間積分を行った。そして、脂質量を、応答係数が各脂質クラスの全ての分子種で等しいと仮定して、各脂質クラスの適切な標準物質に対する相対量として得た。

統計解析：脂質及び脂肪酸組成を統計的に比較するため、ソフトウェアXLStat^{（登録商標）}（version 2011. 2; Addinsoft,フランス）を用いた。文献（Golmard 2012）に詳述される手法に基づいて、パラメトリック検定、多変量解析、相関検定及び回帰分析を行った。

Claims (57)

1. Ｃ型肝炎感染症または前記感染症が原因の疾患もしくは前記感染症を併発する疾患を評価する方法であって、
   （ａ）評価を必要とする対象から生体試料を入手すること、
   （ｂ）前記生体試料中の少なくとも一種のＣ型肝炎リピドミックバイオマーカーの水準を決定すること、および
   （ｃ）工程（ｂ）の前記水準を前記Ｃ型肝炎リピドミックバイオマーカーの対照水準と比較し、前記対象のＣ型肝炎感染症または前記感染症が原因の疾患もしくは前記感染症を併発する疾患を評価すること、を含む方法。
2. 前記生体試料が前記対象の血清検体または前記対象の血漿検体である請求項１に記載の方法。
3. 前記対象がヒトである請求項１に記載の方法。
4. 前記水準を決定することが前記生体試料中のミード酸の存在量を決定することであり、対照存在量値と比較して決定された存在量の方が低い場合は、前記対象はＣ型肝炎感染症または前記感染症が原因もしくは前記感染症を併発する疾患にかかっていることを意味する請求項１に記載の方法。
5. 対照存在量値と比較して決定された存在量の方が高い場合は、前記対象は肝細胞がんを患っていることを意味する請求項４に記載の方法。
6. 前記ミード酸の存在量を決定することが、生体試料の極低密度タンパク質画分中のミード酸の存在量を決定することを含む請求項４に記載の方法。
7. 前記水準を決定することがパルミトレイン酸およびオレイン酸うちの少なくとも一種の存在量を決定することを含み、ここで決定された存在量の方が対照存在量値よりも低い場合は、前記対象がＣ型肝炎感染症または前記感染症が原因もしくは前記感染症を併発する疾患にかかっていることを意味する請求項１に記載の方法。
8. 前記水準を決定することが前記生体試料中の非必須脂肪酸の不飽和水準を決定することを含み、ここで決定された不飽和水準の方が対照不飽和水準値よりも低い場合は、前記対象がＣ型肝炎感染症または前記感染症が原因もしくは前記感染症を併発する疾患にかかっていることを意味する請求項１に記載の方法。
9. 前記水準を決定することが前記生体試料中の細胞中の（１６：１，ω−７＋１６：１，ω−９）／１６：０比を決定することを含み、前記バイオマーカー験体中の細胞中の（１６：１，ω−７＋１６：１，ω−９）／１６：０比が、対照（１６：１，ω−７＋１６：１，ω−９）／１６：０比よりも低い場合は、前記対象がＣ型肝炎感染症または前記感染症が原因もしくは前記感染症を併発する疾患にかかっていることを意味する請求項８に記載の方法。
10. 前記水準を決定することが前記生体試料中の非必須脂肪酸の延長度を決定することを含み、前記生体試料中の延長度の値の方が対照延長度の値よりも高い場合は、前記対象がＣ型肝炎感染症または前記感染症が原因もしくは前記感染症を併発する疾患にかかっていることを意味する請求項１に記載の方法。
11. 前記水準を決定することが前記生体試料中の多価不飽和ω−６脂肪酸およびω−３脂肪酸の少なくとも一種の存在量を決定することを含み、前記生体試料中の存在量値の方が対照存在量値よりも高い場合は、前記対象がＣ型肝炎感染症または前記感染症が原因もしくは前記感染症を併発する疾患にかかっていることを意味する請求項１に記載の方法。
12. 前記水準を決定することがアラキドン酸およびドコサヘキサン酸のうちの少なくとも一種の存在量を決定することを含み、前記生体試料中の存在量値の方が対照存在量値よりも高い場合は、前記対象がＣ型肝炎感染症または前記感染症が原因もしくは前記感染症を併発する疾患にかかっていることを意味する請求項１１に記載の方法。
13. 前記水準を決定することがコレステロールエステル組成中の一種以上の脂肪酸の濃度を決定することを含む請求項１に記載の方法。
14. 前記一種以上の脂肪酸が２０：４脂肪酸、２０：５脂肪酸、２２：６脂肪酸および２２：５脂肪酸から選ばれた少なくとも一種の多価不飽和必須ω−３脂肪酸およびω−６脂肪酸を含み，前記生体試料のコレステロールエステル組成中の多価不飽和脂肪酸の濃度値の方が多価不飽和脂肪酸の対照コレステロールエステル組成濃度よりも高い場合、前記対象がＣ型肝炎感染症または前記感染症が原因もしくは前記感染症を併発する疾患にかかっていることを意味する請求項１３に記載の方法。
15. 前記一種以上の脂肪酸が１６：１脂肪酸および１８：１脂肪酸から選択された少なくとも一種の一価不飽和脂肪酸を含み、前記生体試料の細胞中のコレステロールエステル組成における一価不飽和脂肪酸の濃度値が前記一価不飽和脂肪酸の対照コレステロールエステル組成濃度よりも減少する場合、前記対象がＣ型肝炎感染症または前記感染症が原因もしくは前記感染症を併発する疾患にかかっていることを意味する請求項１３に記載の方法。
16. 前記水準を決定することが前記バイオマーカー験体中の少なくとも一種のトリグリセリドの濃度を決定することを含む請求項１に記載の方法。
17. 前記少なくとも一種のトリグリセリドがＣ５４：５−Ｃ１８：０トリグリセリド、Ｃ５４：６−Ｃ１８：１トリグリセリド、Ｃ５６：５−Ｃ２０：４トリグリセリドおよびＣ５６：７−Ｃ２２：６トリグリセリドから選ばれ、前記少なくとも一種のトリグリセリドの決定された濃度の値の方が前記少なくとも一種のトリグリセリドの対照値よりも高い場合、前記対象がＣ型肝炎感染症または前記感染症が原因もしくは前記感染症を併発する疾患にかかっていることを意味する請求項１６に記載の方法。
18. 前記水準を決定することが前記試献体中のＣ５４：６−Ｃ１８：１トリグリセリドの濃度を決定することを含み、Ｃ５４：６−Ｃ１８：１トリグリセリドの決定された濃度の方がＣ５４：６−Ｃ１８：１トリグリセリドの対照値よりも高い場合は、前記対象がＣ型肝炎感染症または前記感染症が原因もしくは前記感染症を併発する疾患にかかっていることを意味する請求項１６に記載の方法。
19. 前記生体試料が前期対象の未分画血漿検体である請求項１８に記載の方法。
20. 前記生体試料を入手することが、前期対象が絶食状態のときに行われる請求項１６に記載の方法。
21. 前記水準を決定することが、生態試料中の少なくとも一種のエステル結合リン脂質の中から少なくとも一種の脂肪酸の濃度を決定することを含む請求項１に記載の方法。
22. 前記水準を決定することが前記生体試料のジエステル型ホスファチジルコリン中の少なくとも一種の脂肪酸の濃度を決定することを含み、前記少なくとも一種の脂肪酸はＰＣ（３２：１）種、ＰＣ（３２：０）種、ＰＣ（３４：０）種、ＰＣ（３４：４）種およびＰＣ（３４：５）種から選択され、ＰＣ（３２：０）種、ＰＣ（３４：０）種、ＰＣ（３４：４）種およびＰＣ（３４：５）種の少なくとも一種の濃度値の方がこれらの種の対照値よりも高い場合、或いはＰＣ（３２：１）種の濃度値が対象値より低い場合は、前記対象がＣ型肝炎感染症または前記感染症が原因もしくは前記感染症を併発する疾患にかかっていることを意味する請求項２１に記載の方法。
23. 前記水準を決定することが、生態試料中の少なくとも一種のリゾホスファチジルコリンの中から少なくとも一種の脂肪酸の濃度を決定することを含み、前記脂肪酸が１６：１、１６：０種、２０：４種および２２：６種から選ばれ、対照値よりも前記１６：０種、２０：４種および２２：６種のうちの少なくとも一種の濃度値の方が高いか、前記１６：１の濃度値の方が低い場合は、前記対象がＣ型肝炎感染症または前記感染症が原因もしくは前記感染症を併発する疾患にかかっていることを意味する請求項１に記載の方法。
24. 前記水準を決定することが生体試料の細胞のジエステル型のホスファチジルエタノールアミン中の少なくとも一種の脂肪酸の濃度を決定することを含み、前記少なくとも一種の脂肪酸がａ）ミード酸、ｂ）１６：１ω−７酸およびω−９酸から選ばれた少なくとも一種のパルミトレイン酸、およびｃ）２０：３ω−３、２０：４ω−６、２０：５ω−３、２２：６ω−３、２２：５ω−３および２２：４ω−６から選ばれた必須ω−３脂肪酸およびω−６脂肪酸のうちの少なくとも一種から選択され、ミード酸または前記少なくとも一種の必須ω−３酸またはω−６酸の決定された濃度値の方がそれらの対照値よりも高い場合、あるいは前記少なくとも一種のパルミトレイン酸の決定された濃度値の方がその対照値よりも低い場合、前記対象がＣ型肝炎感染症または前記感染症が原因もしくは前記感染症を併発する疾患にかかっていることを意味する請求項２３に記載の方法。
25. 前記水準を決定することが生体試料のジエステル型のホスファチジルセリン中の少なくとも一種の脂肪酸の濃度を決定することを含み、前記少なくとも一種の脂肪酸が３８：３種および４０：６種から選ばれ、前記３８：３種および４０：６種のうちの少なくとも一種の決定された濃度値の方がこれらの対照値よりも高い場合は前記対象がＣ型肝炎感染症または前記感染症が原因もしくは前記感染症を併発する疾患にかかっていることを意味する請求項２４に記載の方法。
26. 前記水準を決定することが前記生体試料のジエステル型のホスファチジルイノシトール中の少なくとも一種の脂肪酸の濃度を決定することを含み、前記少なくとも一種の脂肪酸がＰＩ（３８：３）種、ＰＩ（３６：４）種、ＰＩ（３８：４）種およびＰＩ（３８：５）種から選ばれ、前記ＰＩ（３８：３）種の決定された濃度の値の方がその対照値よりも高い場合、または少なくとも一種の前記ＰＩ（３６：４）種、ＰＩ（３８：４）種およびＰＩ（３８：５）種のうちの少なくとも一種の濃度値がそれらの対照値よりも低い場合、前記対象がＣ型肝炎感染症または前記感染症が原因もしくは前記感染症を併発する疾患にかかっていることを意味する請求項２１に記載の方法。
27. 前記水準を決定することが生体試料の極低密度リポタンパク質画分中のエステル結合ホスファチジルコリンおよびエステル結合ホスファチジルエタノールアミンのうちの少なくとも一種中の少なくとも一種の脂肪酸の濃度を決定することを含む請求項２１に記載の方法。
28. 生体試料の極低密度リポタンパク質画分を分離することをさらに含み、前記水準を決定することが前記生体試料の極低密度リポタンパク質画分中の少なくとも一種のＣ型肝炎リピドミックバイオマーカーの水準を決定することを含む請求項１に記載の方法。
29. 前記分離が密度勾配超遠心分離法またはクロマトグラフ法により行われる請求項２６に記載の方法。
30. 生体試料のトリグリセリド画分を分離することをさらに含み、前記水準を決定することが前記生体試料のトリグリセリド画分中の少なくとも一種のＣ型肝炎リピドミックバイオマーカーの水準を決定することを含む請求項１に記載の方法。
31. 前記水準を決定することがガスクロマトグラフ−質量分析法および液体クロマトグラフ−質量分析法のうちの少なくとも一種を用いて決定することを含む請求項１に記載の方法。
32. 前記方法がＣ型肝炎感染症の重症度を確認、監視又は評価する方法である、請求項１に記載の方法。
33. 前記方法がＣ型肝炎感染症の進行又は退縮を評価する方法である、請求項１に記載の方法。
34. 前記方法がＣ型肝炎感染症に関する薬剤の効果を決定する方法であり、該入手の前に前記対象に前記薬剤を投与することをさらに含み、前記対照水準が前記投与の前に入手された前記対象の生体試料中で決定される請求項１に記載の方法。
35. 前記方法がＣ型肝炎感染症の治療に対する反応を評価する方法であり、前記入手の前に対象に治療を施すことをさらに含み、前記対照水準が前記治療の前に入手された前記対象の生体試料中で決定される請求項１に記載の方法。
36. 治療反応性を評価する方法であって、
    （ａ）評価を必要とする対象に薬剤を投与すること、
    （ｂ）前記対象から生体試料を入手すること、
    （ｃ）生体試料のグルコシルセラミド、ラクトシルセラミドおよびスフィンゴミエリンのうちの少なくとも一種の不飽和指数を決定すること、および
    （ｄ）前記不飽和指数の値を対照不飽和指数値と比較し前記薬剤に対する反応性を評価することを含み、決定された前記不飽和指数の値が対照値よりも高い場合に前記対象は前記薬剤に反応していることを意味する方法。
37. 前記生体試料が前記対象の血清検体または前記対象の血漿検体である請求項３６に記載の方法。
38. 前記対象がヒトである請求項３６に記載の方法。
39. 前記生体試料の極低密度リポタンパク質画分を分離することをさらに含み、前記水準を決定することが前記生体試料の前記極低密度リポタンパク質画分における不飽和指数の水準を決定することを含む請求項３６に記載の方法。
40. 前記分離が密度勾配超遠心分離法またはクロマトグラフ法によって行われる請求項３９に記載の方法。
41. 前記水準を決定することが前記生体試料のリポタンパク質中のグルコシルセラミドおよびラクトシルセラミドのうちの少なくとも一種の２４：１／２４：０比を決定することを含む請求項３６に記載の方法。
42. 前記決定が前記生体試料のリポタンパク質中のグルコシルセラミドおよびラクトシルセラミド両方の不飽和指数を決定することを含む請求項３６に記載の方法。
43. 前記生体試料のリポタンパク質中のグルコシルセラミドの濃度を決定することをさらに含む請求項３６に記載の方法。
44. 前記対象がＣ型肝炎感染症および遺伝性リソソーム蓄積症のうちの少なくとも一種の症状を患っている請求項３６に記載の方法。
45. 前記対象がゴーシェ病またはニーマン・ピック病Ｃ型を患っている請求項４４に記載の方法。
46. 前記薬剤がイミノ糖を含む請求項４４に記載の方法。
47. 前記イミノ糖がＮ−置換デオキシノジリマイシンおよびそれらの医薬的に許容できる塩、Ｎ−置換デオキシガラクトノジリマイシンおよびそれらの医薬的に許容できる塩、およびＮ−置換Ｍｅ−デオキシガラクトノジリマイシンおよびそれらの医薬的に許容できる塩から選択される請求項４６に記載の方法。
48. 前記イミノ糖がＮ−ブチルデオキシノジリマイシンおよびその医薬的に許容できる塩、メトキシノニル−デオキシノジリマイシンおよびその医薬的に許容できる塩、Ｎ−（５−アダマンタン−１−イル−メトキシペンチル）−ＤＮＪおよびその医薬的に許容できる塩、Ｎ−ブチル＝デオキシガラクトノジリマイシンおよびその医薬的に許容できる塩、Ｎ−（７−オキサ−ノニル）−１，５，６−トリデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−ガラクチトールおよびその医薬的に許容できる塩、およびＮ−（Ｎ−｛４’−アジド−２’−ニトロフェニル｝−６−アミノヘキシル）デオキシノジリマイシンまたは医薬的に許容できるその塩から選ばれる請求項４７に記載の方法。
49. 前記対象が２型糖尿病を患っており、前記薬剤がインシュリン感作物質である請求項３６の方法。
50. 前記インシュリン感作物質がイミノ糖、ビグアニドおよびチアゾリジンジオンから選ばれる請求項４９に記載の方法。
51. インターフェロンおよびリバビリンのうちの少なくとも一種を含むＣ型肝炎治療に対する反応が見込めないＣ型肝炎患者を特定する方法であって、
    （ａ）Ｃ型肝炎感染症を患っている対象から生体試料を入手すること、
    （ｂ）前記生体試料のリポタンパク質中のグルコシルセラミド、ラクトシルセラミドおよびスフィンゴミエリンのうちの少なくとも一種の不飽和指数を決定すること、および
    （ｃ）前記決定値を対照不飽和指数値と比較することを含み、前記決定値が前記不飽和の対照値よりも高い場合は、前記対象はインターフェロンおよびリバビリンのうちの少なくとも一種を含むＣ型肝炎治療に反応が見込めない、特定方法。
52. 前記生体試料が前記対象の血清検体または前記対象の血漿検体である請求項５１に記載の方法。
53. 前記対象がヒトである請求項５１に記載の方法。
54. 前記生体試料の極低密度リポタンパク質画分を分離することをさらに含み、前記水準を決定することが前記生体試料の前記極低密度リポタンパク質画分中の不飽和指数の水準を決定することを含む請求項５１に記載の方法。
55. 前記分離が密度勾配超遠心分離法またはクロマトグラフ法によって行われる請求項５４の方法。
56. 前記水準を決定することが前記生体試料のリポタンパク質中のグルコシルセラミドおよびラクトシルセラミドのうちの少なくとも一種の２４：１／２４：０比を決定することを含む請求項５４に記載の方法。
57. 前記決定が前記生体試料のリポタンパク質中のグルコシルセラミドおよびラクトシルセラミド両方の不飽和指数を決定することを含む請求項５４に記載の方法。