KR102510365B1 - 비-알코올성 지방 간 질병을 확인하기 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 비-알코올성 지방간(NAFL)과 비-알코올성 지방간염(NASH)을 구별하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 생물학적 시료에서 에이코사노이드 및 지방산 수준을 측정하는 것을 포함한다. 본 발명의 방법은 또한 대상체에서 비-알코올성 지방간(NAFL)으로부터 비-알코올성 지방간염(NASH)을 구별하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 대상체로부터 생물학적 시료를 수득하는 단계; 시료를 알칼리 용액으로 처리하여 에스테르화된 에이코사노이드를 방출시키고 에이코사노이드를 회수하는 단계; 대상체로부터 수득한 생물학적 시료 중의 적어도 하나의 바이오마커의 수준을 NAFL대상체로부터 수득한 대조군 시료와 비교하는 단계를 포함하고, 대조군과 대비하여 대상체로부터 수득한 시료 중의 적어도 하나의 에이코사노이드의 수준 차이는 NASH를 나타낸다.

Description

비-알코올성 지방 간 질병을 확인하기 위한 방법 및 조성물
관련된 출원의 교차 참조
본원은 참조로 인용되는 미국 가출원(제62/116,107호, 2015년 2월 13일 출원)의 우선권을 주장한다.
기술분야
본 발명은 일반적으로 지방간 질환 및 비-알코올성 지방간염을 측정하는 물질 및 방법에 관한 것이다.
지방간 질병(또는 지방간염)은 종종 과도한 알코올 섭취 또는 비만과 관련되지만, 또한 인슐린 내성 및 당뇨를 비롯한 신진대사 결핍과 같은 다른 원인이 있다. 지방간은 간세포의 액포에서 중성지방 축적에 기인하며 이로 인해 간 기능이 저하되어 간경화 또는 간암을 일으킬 수 있다.
비-알코올성 지방간 질병(NAFLD)은 알코올 남용이 없을 때 발생하는 질병의 스펙트럼을 나타낸다.
본 발명은 대상체에서 비-알코올성 지방간(NAFL)으로부터 비-알코올성 지방간염(NASH)을 구별하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 대상체로부터 생물학적 시료를 수득하는 단계; 시료를 알칼리 용액으로 처리하여 에스테르화된 에이코사노이드를 방출시키고 에이코사노이드를 회수하는 단계; 및 대상체로부터 수득한 생물학적 시료에 적어도 하나의 에스테르화된 에이코사노이드 수준을 NAFL 대상체로부터 수득한 대조군 시료와 비교하는 단계를 포함하고, 대조군과 대비하여 대상체로부터 수득한 시료 중의 적어도 하나의 에이코사노이드의 수준 차이는 NASH를 나타낸다. 일 실시형태에서, 측정되는 에이코사노이드는 60% 초과로 회수된 에이코사노이드이다. 전술한 임의의 실시형태에 대한 다른 실시형태에서, 에이코사노이드는 8-HETrE 및 15-HETrE로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 전술한 임의의 실시형태에서, 생물학적 시료는 혈액, 혈장 및 혈청으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 전술한 임의의 또 다른 실시형태에서, 상기 방법은 알칼리 처리 전에 부틸화된 하이드록시톨루엔(BHT)을 첨가하는 것을 추가로 포함한다. 다른 실시형태에서, BHT는 약 2.5 mM의 BHT가 사용된다. 전술한 임의의 실시형태에 대한 다른 실시형태에서, 알칼리 용액은 수성 수산화칼륨(KOH)이다. 다른 실시형태에서, KOH는 약 0.6-0.7M KOH가 사용된다. 전술한 임의의 실시형태에 대한 다른 실시형태에서, 대조군과 대비하여 대상체로부터 수득한 시료 중의 적어도 하나의 에이코사노이드의 수준 증가는 NASH를 나타낸다. 또 다른 실시형태에서, 상기 방법은 시료 중의 오메가-3 지방산 DHA 및/또는 17-HDoHE의 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함하고, 대조군과 대비한 증가는 NASH를 나타낸다. 전술한 임의의 실시형태에서, 에이코사노이드는 액체 크로마토그래피에 의해 측정된다. 전술한 임의의 실시형태에서, 지방산은 기체 크로마토그래피 질량 분광분석법에 의해 측정된다.
본 발명은 또한 대상체에서 비-알코올성 지방간(NAFL)으로부터 비-알코올성 지방간염(NASH)을 구별하는 방법을 제공하여, 대상체로부터 생물학적 시료를 수득하는 단계; 시료를 알칼리 용액으로 처리하는 단계; 처리된 시료로부터 에이코사노이드 및 지방산을 회수하는 단계; 대상체로부터 수득한 생물학적 시료 중의 적어도 하나의 바이오마커의 수준을 알려진 NAFL을 갖는 대조군 시료와 비교하는 단계를 포함하고, 대조군과 대비하여 대상체로부터 수득된 시료 중의 적어도 하나의 바이오마커 수준 증가는 NASH를 나타내며, 상기 바이오마커는 8-HETrE, 15-HETrE, DHA, 17-HDoHE 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일 실시형태에서, 측정되는 에이코사노이드는 60% 초과로 회수된다. 다른 실시형태에서, 적어도 하나의 바이오마커는 8-HETrE 및 15-HETrE를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 생물학적 시료는 혈액, 혈장 및 혈청으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 임의의 전술한 실시형태에 대한 다른 실시형태에서, 상기 방법은 알칼리 처리 전에 부틸화된 하이드록시톨루엔(BHT)을 첨가하는 단계를 추가로 포함한다. 일 실시형태에서, 알칼리 처리는 수성 수산화칼륨(KOH)을 첨가하는 것을 포함한다. 다른 실시형태에서, KOH는 약 0.6 내지 0.7M KOH가 사용된다. 다른 실시형태에서, 약 2.5 mM BHT가 사용된다. 임의의 전술한 실시형태에 대한 또 다른 실시형태에서, 방법은 시료 중의 오메가-3 지방산 DHA 및/또는 17-HDoHE의 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함하고, 대조군과 대비한 증가는 NASH를 나타낸다. 다른 실시형태에서, 에이코사노이드는 액체 크로마토그래피에 의해 측정되고 지방산은 기체 크로마토그래피 질량 분광분석법에 의해 측정된다. 임의의 전술한 실시형태에 대한 다른 실시형태에서, 5-HETE, 8-HETE, 11-HETE, 15-HETE, 13-HODE, 9-oxoODE 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 전염증성(proinflammatory) 에이코사노이드의 수준을 측정하고, 상기한 것 중 임의의 것의 수준이 NAFL 대조군보다 낮은 것은 NASH를 나타낸다.
도 1A-B는 에이코사노이드 측정을 위한 도식을 나타낸다. (A) 알칼리 가수분해가 없는 대조군 및 (B) 알칼리 가수분해된 전체 에이코사노이드를 나타낸다.
도 2A-B는 알칼리 가수분해 조건에 노출하기 전(A) 및 후(B) HETE 선별을 위한 발췌된(extrated) 크로마토그래피를 나타낸다.
도 3은 아라키돈산(AA) 유래의 대사체(metabolite)를 나타낸다. 총 AA 및 혈장 내 COX, LOX, CYP 및 비-효소적 경로로부터 유래된 그의 대사체의 양은 각각의 대사체에 대한 3가지 임상 아암(arm)에 표시된다. 위스커 상자(whisker box)의 하단은 25%를 나타내며, 상자 내의 선은 50%를 나타내며, 상단은 75%를 나타낸다. 위스커는 측정치의 상하 양극을 나타낸다.
도 4는 총 리놀레산(LA) 및 각각의 대사체에 대한 3가지 임상 아암에 혈장 내 LOX 및 CYP 경로로부터 유래된 이의 대사체 양을 나타낸다.
도 5는 총 디호모-감마 리놀렌산(DGLA) 및 각각의 대사체에 대한 3가지 임상 아암에 혈장 내 LOX 및 비-효소적 경로로부터 유래된 이의 대사체의 양을 나타낸다. 그룹 간의 차이는 Student's t-test로 평가하였고 p 값 <0.05를 나타내었다.
도 6은 총 에이코사펜타엔산 (EPA) 및 각각의 대사체에 대한 3가지 임상 아암에 혈장 내 COX, LOX 및 비효소 경로로부터 유래된 대사체의 양을 나타낸다.
도 7은 총 도코사헥사엔산(DHA) 및 각각의 대사체에 대한 3가지 임상 아암에서 혈장 내 LOX 및 CYP 경로로부터 유래된 이의 대사체의 양을 나타낸다. 그룹 간의 차이는 Student's t-test로 평가하였고 p 값 <0.05를 나타내었다.
본 명세서 및 청구 범위에서 사용되는 단수 형태는 문맥에 명백하게 달리 지시되어 있지 않는 한 복수 대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어 "유도체"에 대한 언급은 복수의 그러한 유도체를 포함하고, "대상체"에 대한 언급은 하나 이상의 대상체에 대한 언급을 포함한다.
또한, "또는"의 사용은 달리 언급하지 않는 한 "및/또는"을 의미한다. 마찬가지로, "포함한다", "포함하는", "함유한다" 및 "함유하는"은 상호교환 가능하며, 한정하려는 것이 아니다.
다양한 실시형태들에 대한 설명이 "포함하는"이라는 용어를 사용하는 경우, 당업자는 일부 특정 예에서 "본질적으로 이루어진" 또는 "이루어진"이라는 용어를 사용하는 실시형태가 대안적으로 기술될 수 있다는 것을 알 수 있다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에게 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 비록 명세서에 기술된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 물질이 개시된 방법 및 조성물의 실시에 사용될 수 있지만, 예시적인 방법, 장치 및 물질이 본 명세서에 기재되어 있다.
상기 및 본 명세서 전반에서 논의되는 공개물은 오로지 본 출원의 출원일 이전의 그들의 개시에 대해서만 제공된다. 본 명세서의 어떠한 내용도 본 발명자가 이전의 개시에 기인하여 그러한 개시에 앞설 자격이 없다고 인정하는 것으로 이해될 수 없다.
비-알코올성 지방간 질병(NAFL 또는 NAFLD)은 알코올 남용의 부재에서 발생하는 질병의 스펙트럼을 나타낸다. 이는 지방증(간안의 지방)의 존재를 특징으로 하고 대사 증후군(비만, 당뇨병 및 고 중성지방 혈증을 포함)의 간 발현을 나타낼 수 있다. NAFLD는 인슐린 내성과 관련이 있으며 성인과 소아에서 간 질병을 일으키고 궁극적으로 간경변을 일으킬 수 있다(Skelly et al., J Hepatol., 35: 195-9, 2001; Chitturi et al., Hepatology, 35(2):373-9, 2002). NAFLD의 중증도는 비교적 양성 고립된 만연한 거대공포성 지방증(즉, 비-알코올성 지방간 또는 NAFL)에서부터 비-알코올성 지방 간염(NASH)에 이르기까지 범위가 넓다(Angulo et al., J Gastroenterol Hepatol, 17 Suppl : S186-90, 2002). NASH는 지방증, 세포학적 풍선확장(cytological ballooning), 분산된 염증 및 세포 주위 섬유화(Contos et al., Adv Anat Pathol., 9: 37-51, 2002)의 조직학적 존재를 특징으로 한다. NASH로 인한 간 섬유화는 간경화 또는 간기능 부전으로 진행될 수 있으며, 경우에 따라 간세포 암으로 진행될 수 있다.
인슐린 내성(및 고 인슐린혈증)의 정도는 NAFL의 중증도와 관련이 있으며 단순 지방간보다 NASH 환자에서 더 두드러진다(Sanyal et al., Gastroenterology, 120 (5) : 1183-92, 2001). 그 결과, 인슐린 매개된 지방분해 억제가 일어나고 순환 지방산의 수준이 증가한다. NASH와 관련된 두 가지 요인에는 인슐린 내성과 간으로 유리 지방산 전달의 증가가 포함된다. 인슐린은 미토콘드리아에서 지방산의 산화를 차단한다. 간의 재-에스테르화 및 산화로 인한 유리 지방산의 증가는 간내 지방의 축적을 초래하고 간이 이차성 손상(secondary insults)에 취약하게 만든다.
소아에서 NAFLD의 유병율은 진단을 확인하기 위한 간의 조직학적 분석의 필요성 때문에 알려지지 않았다(Schwimmer et al., Pediatrics, 118 (4): 1388-93, 2006). 그러나 유병률을 간 초음파 및 향상된 혈청 아미노 전이효소 수치를 이용한 소아 비만 데이터 및 NAFLD 소아의 85%가 비만이라는 정보를 바탕으로 추정할 수 있다. 국가적 건강 및 영양 조사 설문의 데이터는 지난 35년간 유년기와 청소년 비만의 유병률이 3 배 상승했다는 것을 나타냈다; 2000년의 데이터는 6세에서 19세 사이의 14-16%의 어린이가 BMI가 95%를 초과하여 비만이라는 사실을 나타냈고(Fishbein et al., J Pediatr. Gastroenterol. Nutr., 36 (1): 54-61, 2003), 또한 NAFLD 어린이의 85%가 비만이라는 사실을 알게 되었다.
조직학적으로 입증된 NAFLD 환자에서, 혈청 간 아미노 전이효소, 특히 알라닌 아미노 전이효소(ALT) 수준은 정상 상한치 수준의 10 배로 상승한다(Schwimmer 등, J Pediatr., 143 (4) : 500-5, 2003; Rashid 등, J Pediatr Gastroenterol Nutr., 30 (1) : 48-53, 2000). ALT/AST(아스파르테이트 아미노 전이효소)의 비율은 알코올성 지방간염과는 달리 1 초과 (1.5-1.7 범위)이며 일반적으로 이 비율은 1 미만이다. NASH에서 비정상적으로 상승할 수 있는 다른 비정상적인 혈청학적 검사는 γ-글루타밀전이효소(γ-GT) 및 공복상태에서의 혈장 인슐린, 콜레스테롤 및 중성지방이 포함된다.
NAFLD가 NASH로 발전하는 정확한 기전은 불분명하다. 인슐린 내성은 NAFLD와 NASH 모두와 연관되어 있기 때문에 NASH가 발생하기 위해서는 다른 추가적인 요인들도 필요하다고 가정된다. 이는 "두가지 가격" 가설("two-hit" hypothesis) (Day CP, Best Pract. Clin. Gastroenterol., 16 (5) : 663-78, 2002)로 언급되며, 첫째, 간에서 지방의 축적 및 둘째, 증가된 산화 스트레스와 함께 많은 양의 유리 라디칼의 존재를 포함한다. 거대 공포성 지방증은 중성지방의 간 축적을 나타내며 이는 차례로 유리 지방산의 간으로의 전달 및 이용 사이의 불균형에 기인한다. 증가된 칼로리 섭취 기간 동안 중성지방은 축적되고 예비 에너지원으로 작용한다. 식이 열량이 충분하지 않을 때, 저장된 중성지방(지방세포 안)에 지방 분해가 일어나고 지방산은 순환계로 방출되어 간으로 흡수된다. 지방산의 산화는 활용을 위한 에너지를 생산할 것이다.
에이코사노이드 생합성 경로는 100개가 넘는 생활성 지질 및 복잡하고 뒤얽힌 지질-신호 네트워크로 조직화된 관련 효소를 포함한다. 생리적 자극시 포스포리파이제 A2(PLA2)에 의한 인지질의 가수분해를 통해 다중불포화 지방산(PUFA) 유래 지질 매개체의 생합성이 개시된다. 아라키돈산(AA), 디호모-감마-리놀렌산(DGLA), 에이코사펜타엔산(EPA) 및 도코사헥사엔산(DHA)을 포함한 PUFA는, 3가지의 상이한 계통의 산화 지질 부류를 생산하는, 리폭시게나아제(LOX), 시클로옥시게나제(COX) 및 시토크롬 P450의 3가지 효소에 의해 프로세싱된다. 이들 효소는 모두 유리 아라키돈산 및 관련 PUFA를 이들의 특정 대사체로 전환시킬 수 있으며 다양한 효능, 반감기 및 염증 및 신호 조절에 효용을 나타낸다. 또한, 비-효소적인 공정은 필수 지방산 리놀레산(LA) 및 알파 리놀렌산(ALA)으로부터의 대사체를 포함하는 산화된 PUFA 대사체를 생성할 수 있다.
대사 증후군 및 비-알코올성 지방간 질병(NAFLD)에서 간 지방증에서 지방간염으로의 진전에서 중요한 조절 분자인 에이코사노이드는 항염증제 또는 전염증성 제제로서 작용한다. 지방간염에서의 지질 과산화의 일반적 역할에 대한 설득력 있는 증거는 확실하게 확립되어있지 않다; 그러나 10년간의 연구 결과는 이러한 과정이 일어나고 산화 스트레스가 간 독성 및 상해와 관련된다는 것을 강력하게 제시한다. 위에서 논의한 바와 같이, 비-알코올성 지방간 질병(NAFLD)은 비-알코올성 지방간(NAFL)에서 비-알코올성 지방간염(NASH)에 이르는 간 지방의 과다 축적과 관련된 광범위한 조직학적 경우를 포함한다. 그것은 세포학적 풍선확장, 염증, 그리고 높은 정도의 상처와 섬유증의 증거에 의해 NAF과 구별된다. 따라서 NASH는 심각한 상태이며 대략 10-25%의 환자가 진행된 간 질병, 간경변 및 간세포 암을 앓게 된다.
따라서, NASH와 NAFL을 구별하는 것은 중요하다. 현재 NASH의 진단을 위한 황금 표준 기술은 간 생검 검사이며, 이는 괴사-염증성 변화의 존재 및 범위, 간에서 풍선 확장 및 섬유화의 존재를 평가하는, 유일히 신뢰할 수 있는 방법으로 인정된다. 그러나 간 생검 검사는 가능한 심각한 합병증과 제한이 있는 침습적인 과정이다. 따라서 샘플링 위험을 피하기 위해서는 신뢰할 수 있는 비침습적 방법이 필요하다. 유리 에이코사노이드의 혈장 농도의 차이가 생검 입증된 NAFL 및 NASH을 갖는 잘-특성화된 환자에 대한 연구를 기반으로 NASH로부터 NAFL을 구별할 수 있다고 제안된다.
지질 대사의 변화는 증가된 지방 생성, 퍼옥시좀 및 미토콘드리아 β-산화의 결핍 및/또는 지방산을 방출하는 간 기능의 감소로 인해 지방산 및/또는 에이코사오이드의 변화를 초래하여 간 지방증을 유발할 수 있다. 몇몇 연구에서는 NASH의 및 관련 대사 증후군 발병에서 중성지방, 막 지방산 조성 및 저밀도 지질단백질(VLDL) 생산의 역할을 강조하였다.
에이코사노이드 대사의 핵심 효소인 사이클록시옥시게나제-2(COX-2)는 쥐의 간세포 세포자멸을 촉진하는 NASH에서 다량 발현된다. 9-하이드록시옥타다이엔산(9-HODE), 13-HODE, 9-옥소옥타디에노익산(9-oxoODE), 및 13-oxoODE 뿐만아니라 아라키돈산 5- 하이드록시에이코소사-테트라에노익산(5-HETE), 8-HETE, 11-HETE 및 15-HETE을 포함하는 LA의 산화된 지방 생산물들은 비-알코올성 지방간 질병에서의 조직학적 중증도와 연관되어 있다고 보고된다.
유리 지방산은 세포 독성이 있다; 따라서 포유류 체계에서 모든 지방산의 대부분은 인지질과 글리세로지질뿐만 아니라 다른 복합 지질로 에스테르화된다. 유사하게, 지방산의 산화된 대사체들은 유리 형태로 존재할 수도 있고 복잡한 지질 형태로 존재할 수도 있다. 분석을 위해 모든 에스테르화된 에이코사노이드를 포획하고 비누화 단계로 이들을 방출한다. 그러나 이러한 조건에서의 에이코사노이드의 안정성은 상세히 연구되지 않았으며 그 과정은 분해 및 안좋은 정량화로 이어질 수있다. 173 표준 라이브러리를 사용하여 알칼리 가수분해 조건에 노출된 후 각각 대사체의 안정성과 회수율을 평가하기 위한 실험을 수행했다.
본 발명은 NASH로부터의 NAFL의 구별에 유용한 방법, 키트 및 조성물을 제공한다. 이러한 방법은 질병의 조기 발병 및 치료에 도움이 될 것이다. 또한, 상기 방법은 현재 진단에 사용되는 간 생검과 관련된 생검 검사의 위험을 감소시킨다. 상기 방법 및 조성물은 진단시 변형된 에이코사노이드 및 PUFA를 포함한다. 이에, 바이오 마커는 측정되고 정량화되는 유도화된 바이오 마커를 제공하기 위해 화학적 변형에 의해 자연 상태로부터 조작된다. 특정 바이오 마커의 양을 정상 표준 시료(즉, 간 질환이 없는 사람)과 비교되거나 병걸린 집단(예를 들어, 임상적으로 NASH 또는 NAFL로 진단된 집단)으로부터 수득된 수준과 비교할 수 있다.
유리 에이코사노이드 및 PUFA 대사체의 수준은 AUROC(Receiver Operating Characteristic Curve 아래 면적)로 표현된다. AUROC는 안정한 동위 원소 희석에 의한 유리 에이코사노이드와 PUFA 대사체의 수준을 측정하여 결정된다. 간단히 말하면, 표준 곡선을 생성하는데 사용된 모든 1차 표준 및 각각의 시료에 동일한 양의 중수소화된 내부 표준이 추가된다. 에이코사노이드 및 PUFA 대사체의 수준은 내생 대사체와 일치하는 중수소화된 내부 표준 사이의 비율을 결정함으로써 계산된다. 비율은 선형 회귀에 의해 절대양으로 변환된다. 개별 에이코사노이드 대사체는 진단 테스트 수행 및 카이 제곱 검정, t-검정, AUROC를 포함한 통계 분석을 사용하여 NAFL과 NASH를 구별하는 능력에 대해 평가된다.
본 발명의 방법은 환자의 시료에서 적어도 하나의 유리 에이코사노이드 및/또는 다중 불포화 지방산(PUFA) 대사체의 수준을 측정하는 것을 포함한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "시료"란 용어는 환자의 모든 생물학적 시료를 의미한다. 예를 들면 타액, 모발, 피부, 조직, 가래, 혈액, 혈장, 혈청, 유리체, 뇌척수액, 소변, 정자 및 세포가 포함되나 이에 제한되지 않는다. 일 실시형태에서, 시료는 혈장 시료이다.
지질은 실시형태에서 상세히 설명한 바와 같이, 시료로부터 추출된다. 추출된 지질에서 에이코사노이드 및/또는 PUFA 대사체의 존재와 양을 먼저 결정한 다음 적절한 대조군과 비교한다. 측정은 임의의 적합한 지질 분석 기술, 예를 들어 분광 광도 분석(예를 들면, 비색계 설포-포스포-바닐린(SPV) 측정법(Cheng et al., Lipids, 46(1):95-103 (2011)))과 같은 대량 신속 처리를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 지질 함량의 검출 및 정량화에 적합한 다른 분석 방법은 ELISA, NMR, UV-Vis 또는 기체-액체 크로마토그래피, HPLC, UPLC 및/또는 MS 또는 발색법에 기반을 둔 RIA 방법을 포함하지만, 제한없이 당업자에게 공지되어있다. 지질 추출은 문헌(Bligh and Dyer, Can. J. Biochem. Physiol., 37, 91 1 (1959))에 기술된 액체 시료에 대한 통상적인 방법을 포함하여 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 수행될 수 있다.
NASH로부터의 NAFL을 구별하기 위해, 수득한 값은 정상 대조군, NAFL 대상체 및/또는 NASH 대상체와 비교된다. 본 명세서는 8-HETrE 및 15-HETrE가 NAFL 대상체에 비해 NASH 대상체에서 증가함을 보여준다. 또한 이 값은 오메가-3 지방산 DHA (p <0.001) 및/또는 이의 대사체 17-HDoHE의 측정과 함께 사용할 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 명세서의 방법에서 8-HETrE, 15-HETrE, 오메가-3 지방산 DHA 및 17-HDoHE로 이루어진 군으로부터 선택된 마커 중 하나 또는 이의 조합의 마커를 사용할 수있다. 이 마커는 NAFL 또는 NASH를 결정할 때 여기에 설명된 기존 진단과 함께 사용할 수 있다. 대조군 및/또는 NAFL 개체와 비교하여 8-HETrE, 15-HETrE, 오메가-3 지방산 DHA, 17-HDoHE 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 마커의 증가는 NASH를 나타낸다.
따라서, 8-HETrE, 15-HETrE, 오메가-3 지방산 DHA 및 17-HDoHE로 구성된 군으로부터 선택된 마커의 증가는 간 질병의 진행 및/또는 NASH의 원하던 분화의 위험이 증가함을 시사하며 NASH의 치료는 그에 따라 적용될 수 있다.
유리 에코사노이드 및 PUFA 대사체의 수준은 AUROC(Receiver Operating Characteristic Curve 아래 면적)로 표현될 수 있다. AUROC는 안정한 동위 원소 희석에 의한 유리 에이코사노이드 및 PUFA 대사체의 수준을 측정하여 결정된다. 간단히 말하면, 표준 곡선을 생성하는 데 사용된 모든 1차 표준 및 각각의 시료에 동일한 양의 중수소화된 내부 표준이 추가된다. 에이코사노이드 및 PUFA 대사체의 수준은 내생 대사체와 일치하는 중수소화된 내부 표준 사이의 비율을 결정함으로써 계산된다. 비율은 선형 회귀에 의해 절대양으로 변환된다. 개별 에이코사노이드 대사 체는 진단 테스트 수행 및 카이 제곱 검정, t-검정, AUROC를 포함한 통계 분석을 사용하여 NAFL과 NASH를 구별하는 능력에 대해 평가된다.
약 0.8 이상, 약 0.9 이상, 약 0.95 이상, 약 0.96 이상, 약 0.97 이상, 약 0.98 이상, 약 0.99 또는 약 1.0 이상의 증가된 AUROC 값은 NASH를 결정하는데 충분한 차이를 나타낸다.
본 발명의 방법은 수득될 수 있는 에이코사노이드 및 PUFA의 양을 최적화하는 공정을 이용한다. 따라서, 본 명세서는 알칼리 치료동안 지질 대사체의 분해를 최소화고 보존하는 방법 및 조성물을 제공하고, 특정 에이코사노이드 및 질환에 대한 바이오 마커 역할을 할 수 있는 에스테르화된 지질로부터 방출되는 관련된 산화 PUFA를 검출한다.
본 발명은 그 특정 실시형태와 관련하여 서술되었지만, 이하의 실시형태뿐만 아니라 설명은 본 발명의 범위를 예시하고 제한하지 않는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명의 범주 내에 있는 다른 양상들, 장점들 및 수정들은 본 명세서에 기술된 당업자에게 명백할 것이다.
실시예
시약. 모든 시약은 HPLC 등급이며 Fisher Scientific에서 구입했다.
지질 가수분해 및 추출. 총 에이코사노이드를 추출하기 위해 메탄올 하의 25개의 중수소화된 내부 표준 물질의 칵테일 100 μl를 첨가한 50 μl 플라스마(각각 Cayman Chemicals, Ann Arbor, MI에서 구입)에 알칼리 처리를(0.66 M KOH) 37 ℃에서 1 시간 동안하여 에스테르화된 지방산을 가수분해시켰다. 지질 자동산화를 방지하기 위해, KOH 처리 전에 2.5 mM 부틸화된 하이드록시톨루엔(BHT)을 혼합물에 첨가하였다. 이 최적의 항산화제 농도는 0 내지 10 mM 범위의 다양한 BHT 농도를 갖는 예비 시험에 기초하여 선택되었는데, 1 mM 미만에서는 비효율을 나타내지만 5 mM에서는 결정화를 나타냈다. 대조군에서는 KOH 대신에 증류수가 첨가되었다(도 1).
내부 표준 및 KOH를 함유하는 혈장 시료를 아르곤 대기하에 37 ℃에서 1시간 동안 배양하여 유리 지방산을 유리시켰다. 지질 분해는 정제된 표준 물질을 KOH의 존재 또는 부재하에 처리하여 결정하였고, 그 결과를 회수율(%)로 나타내었다. 가수분해가 끝나면, 0.1M 글리신-HCl 완충액(pH 3.0) 200㎕를 첨가하고, 4M HCl을 서서히 첨가하여 최종 pH를 pH = 3으로 조정하였다. 고체상 추출로 에이코사노이드를 분리하는 동안 염의 간섭을 최소화하기 위해 각 성분에 대해 최종부피가 3ml가 되도록 H2O로 희석하였다.
지질 대사체는 3.5 ml의 100% 메탄올 및 3.5 ml의 물로 연속 세척의 활성화 절차를 사용하여 Strata-X 중합체 역상 칼럼(Phenomenex, Torrance, CA)상에서 고체상 추출에 의해 분리되었다. 시료를 적재하고 그 다음에 에코사노이드를 100% 메탄올 1ml로 용출시켰다. 용출액을 진공하에 건조시키고 60/40/0.02(v/v/v)의 물/아세토 니트릴/아세트산으로 이루어진 100㎕의 완충액 A에 용해시키고 즉시 분석에 사용하였다.
표준 곡선 및 내부 표준. 예비 시험에서는 비누화 과정에서 특정 에이코사노이드 대사체의 중대한 분해가 나타났다; 그러므로, 25가지 중수소의 내부 표준 용액의 칵테일을 동일한 알칼리 조건으로 적용한 다음 산성화 및 분리를 수행했다. 0.005에서 5.0 ng에 이르는 148개의 1차 표준에 대해 13개의 표준 곡선이 생성되었고, 각각의 1 ng의 내부 표준 물질은 중수소화된 에이코사노이드로 구성된 혼합물로 첨가되었다. 방법론은 에이코사노이드와 관련된 대사체에 대한 173 MRM 쌍 (148 대사체 + 25 중수소화된 내부 표준)을 포함하며, 이를 단일 5분 LC/MS/MS 분석으로 측정하였다(Dumlao et al., Biochim, Biophys. Acta, 1811:724-736, 2011; Quehenberger et al., BBA - Mol. Cell Biol. Lipids, 1811:648-656, 2011).
에이코사노이드의 분리 및 정량화. 분리를 RP18 컬럼(2.1 × 100mm, 1.7㎛, Waters)을 갖춘 Acquity 초고성능 액체 크로마토그래피(UPLC) 시스템(Waters, Milford, MA, USA)에서 수행하였다. 이동상 조건 및 질량 분광계 파라미터는 문헌 (Wang et al., J. Chromatogr., 1359: 60-69, 2014)에 기술되어 있다. 데이터를 AB/Sciex 6500 QTRAP hybrid, 음성 전기 분무(negative electrospray) 및 계획된 다중 반응 모니터링(MRM) 모드를 사용하는 삼중 4극 질량 분광계에서 수집하였다.
회수율은 KOH로 처리하기 전 및 후의 모든 내부 표준을 포함하는 173개의 정제된 표준 세트를 사용하여 피크 면적을 비교함으로써 결정하였다. 모든 측정을 3회 실시하였고 평균값을 기록하였다. 정량의 정확도를 3회 반복의 평균으로부터 계산되고 상대 표준편차(% RSD)로 표현된 변동 계수(CV)로 결정하였다.
총 지방산 측정. 혈장 시료를 중수소화된 내부 표준과 함께 첨가한 후 유도체화하고 개개의 유리 지방산을 Quehenberger 등 (supra)의 방법에 의해 기체 크로마토그래피 질량 분광계(GC-MS)로 정량화하였다. GC-MS로부터 총 지방산 양이 얻어졌고, 알칼리 가수분해 중에는 분해가 관찰되지 않았다.
혈장 제조. 환자 및 건강한 지원자로부터 혈장 시료를 수집했다; 기초 인구 통계학적, 임상적, 생화학적 및 조직학적 특성을 포함하는 연구 집단의 환자에 대한 상세한 설명은 Loomba et al.(J. Lipid Res., 56 : 185-192, 2014), 표 1에 요약되어 있다. NAFLD 환자는 간 생검 검사에 의해 진단되고 확인되었다; 간 질환의 다른 원인을 가진 환자는 제외되었다. 모든 환자는 표준 병력 및 신체 검사, 생화학 검사 및 자기 공명 영상-추정된 양성자 밀도 지방 분율(MRI-PDFF)을 받았다. 간조직 검사를 바탕으로 NAFLD를 가진 대상체는 NAFL을 가진 개체와 NASH를 가진 두 그룹으로 나누었다. 수집된 혈장 시료를 -80 ℃에서 보관하였다. 각각의 에이코사노이드의 총량은 즉시 해동된 상태에서 결정하였다.
연구 집단에서 환자의 기초 인구 통계학적 및 조직학적 특성
대조군 n=3 NAFL n=10 NASH n=9 NAFL vs. NASH P-값
나이 45.03 ± 23.02 48.90 ± 14.03 45.89 ± 12.94 0.633
성별 33% male 40% male 44% male
BMI 22.42 ± 6.59 29.49 ± 5.39 29.59 ± 5.01 0.966
간 조직학
지방증 0.75 ± 0.5 2.33 ± 0.82 0.005
섬유화 0 ±0 1.60 ± 089 0.016
NAS 1.75 ± 0.5 6.33 ± 1.03 0.0001
Hap. Balloon. 0 ±0 1.50 ± 0.84 0.007
Lob. Infl. 1 ±0 2.17 ± 0.41 0.001
Portal Infl. 0.5 ± 0.55 0.17 ± 0.41 0.262
알칼리 처리에 의한 산화된 PUFA의 파괴. 강력한 알칼리 조건에 노출된 후의 에이코사노이드의 안정성을 중수소화된 내부 표준 세트를 사용하여 분석하였다(표 2). 강한 염기는 분자의 파괴에 더하여 중수소의 수소로의 교환을 촉매할 수 있다. 모든 질량 스펙트럼 데이터를 내부 표준에 대해 정규화해야 하므로 이 두가지 독립적인 사건을 구별하는 것이 중요하다. 사용된 유리 에이코사노이드의 분석을 위해 사용되었던 이전에 확립한 MRM 전이를 사용하였다(Wang et al., 상기 참조). 에스테르의 알칼리 가수분해에 사용되는 조건에 노출된 특정 중수소화된 내부 표준의 회수율은 표 1에 요약되어 있다. 알칼리 가수분해 용액에 의한 전처리는 중수소화된 모든 프로스타글란딘 및 그의 유도체뿐만 아니라 류코트리엔을 완전히 파괴시켰다. 다른 중수소화화된 내부 표준도 다양한 정도로 분해되었다. 아라키돈산 및 하이도록시화된 대사체 20-HETE만이 완전 회수를 보였으며(표 2) UPLC/MS로 측정된 비-중수소화된 1차 표준에 상응하는 유사한 회수율을 나타냈다. 이는 중수소가 알칼리 조건에서 수소 하에 교환되지 않았음을 나타낸다.
알칼리 가수분해 처리된 중수소화된 내부 표준의 회수율
내부 표준 대조군
(강도×10 4 ) 		RSD
(%) 		비누화
(강도×10 4 ) 		RSD
(%) 		회수율
(%)
(d8) AA 25.3 17 23.1 7.9 91
(d4) 9,10 diHOME 44.8 11 23.0 1.8 51
(d4) 12,13 diHOME 47.5 12 27.7 1.3 58
(d11) 8,9 EET 8.2 15 3.5 11 43
(d11) 11,12 EET 8.7 11 3.1 7.7 35
(d11) 14,15 EET 13.1 12 3.3 9.6 25
(d8) 5-HETE 23.9 10 11.8 1 49
(d8) 12-HETE 14.4 9.1 10.9 1.1 76
(d8) 15-HETE 36.7 6.8 21.8 11 59
(d6) 20-HETE 15.6 14.0 17.4 8.9 110
(d4) 9-HODE 60.0 8.7 23.9 12 40
(d4) 13-HODE 67.3 9.1 28.4 9.6 42
(d4) LTB4 27.1 19 4.0 12 15
(d5) LTC4 0.04 13 ND 0 0
(d5) LTE4 7.9 7.8 0.80 35 9.6
(d4) PGD2 22.8 12 ND 0 0
(d4) dhk PGD2 18.9 7.8 ND 0 0
(d4) PGE2 6.4 16 ND 0 0
(d4) 6k PGF1a 9.1 9.1 1.2 6.2 13
(d4) PGF2a 5.8 11 2.9 5 49
(d4) dhk PGF2a 7.8 1.1 2.3 6.7 29
(d11) 8-이소 PGF2a III 0.90 5.0 ND 0 0
(d4) 15d PGJ2 566 1.3 ND 0 0
(d4) TXB2 21.1 11 6.1 5 29
(d4) 레솔빈 E1 5.7 0.3 1.5 12 26
일부 내부 표준에 대한 저조한 회수율이 중수소 라벨의 소실 때문인지 또는 분자 구조의 파괴로 인한 것인지를 결정하기 위해, 안정성 테스트를 확대하여 염기 유도된 분해에 대한 내성 프로파일링에 전형적으로 사용하는 148개의 주요 에이코사노이드 표준을 모두 조사했다. 도 2 및 표 3에서 볼 수 있듯이, 많은 에이코사노이드는 질량 스펙트럼 강도의 변화에 의해 예시되는 것처럼 염기 유도된 분해에 영향을 받는다. 특히 모든 프로스타글란딘과 류코트리엔이 완전히 파괴되었다. 마찬가지로, 에폭시 또는 케토기를 함유한 다수의 에이코사노이드는 다양한 정도로 분해되었다. 흥미롭게도 16-HETE, 17-HETE, 18-HETE, 19-HETE, 20-HETE를 포함한 일부 대사체의 신호 강도는 강한 알칼리에 노출되기 전의 원래 피크와 비교했을 때 비누화 조건에 노출된 후에 증가했다(도 2). 이는 염기-유도된 대사체 전환 및 자동 산화의 결과일 수 있다.
분석의 정밀도(RSD,%)를 비누화 유무와 상관없이 모든 173개의 표준(148개의 대사체 및 25개의 중수소화된 내부 표준)의 3가지 독립적인 분석에서 측정하였고, 분석은 매우 재현가능함이 입증되었다. 일반적으로 RSD는 대다수의 대사체에 대해 10% 미만이었다(표 3).
인간 혈장을 포함하는 생물학적 시료에서 에스테르화된 에이코사노이드의 분석에 응용하기 위해, 에이코사노이드의 패널을 염기-유도된 분해에 내성이거나 단지 적은 재현성 있는 파괴만을 겪는 것으로 수집하였다. 실용적인 목적으로 이러한 기준을 만족하는 에이코사노이드 목록을 작성하기 위해 60%의 컷-오프 시점과 10% 미만의 RSD를 사용했다(표 2).
혈장 중 NAFL vs NASH 산화된 PUFA. 이 프로토콜을 다음 인간 혈장의 분석에 적용하였다. 이전 연구에서 지질 추출에 대해 조사하였다. 이 연구에서는 분석 전에 알칼리-가수분해를 사용하여 지방산을 유리시켰으나, 에이코사노이드의 안정성에 대한 강한 염기의 효과를 검사한 것은 보고하지 않았다. 표 3에 서술된 제한사항 및 표 2에 요약된 안정적인 대사체 확인 알고리즘을 사용하여 대조군, NAFL 및 NASH 환자의 혈장에 존재하는 수많은 에이코사노이드를 확인하고 정량화하였으며 이는 도 3 내지 7에 나타내었다. NAFL 및 NASH 그룹간의 차이는 Student 's t-test로 평가하였다. NAFL/NASH 에 대한 통계적으로 유의미한 차이가 p <0.05로 관찰되었고 이는 도 5 및 7에 나타내었다.
AA로부터 유래된 대사체는 도 3에 표시되고, NAFL 및 NASH에서 약간 증가된 수준을 나타내지만, 이러한 증가는 이 연구에서 유의미한 수준에 도달하지 못했다. 유사하게, 리놀레산(LA)로부터 수득된 모든 대사체들(9,10-EpOME, 9,10-DIHOME, 13-HODE, 및 9-oxoODE)은 대조군에 비해 NASH 및 NASH에서 단계적 증가를 나타냈다(도 4). 임상적으로 NASH에서 NAFL을 구분할 수 있는 것은 중요하며, 13-HODE 및 9-oxoODE를 포함한 몇몇의 대사체가 NASH와 비교하여 NAFL의 혈장에 더 높은 수준으로 존재한다. 또한, 8-HETrE및 15-HETrE를 포함한 DGLA에서 유래된 몇몇의 대사체들이 NASH에서 유의미하게 증가한 반면, 대조군과 NAFL간에 차이는 발견되지 않았다(도 5). 흥미롭게도 오메가-3 지방산 DHA 및 이의 항-염증제 대사체인 17-HDoHE의 혈장 농도는 NASH에서 유의미하게 증가했다(도 7).
예비적 UPLC/MS/MS 방법을 개발하는 동안, 시료 추출물 용액에서 상이한 농도의 KOH(0.33-1.31M) 및 BHT(0 내지 10mM)를 비교하였다. 피크 모양의 품질 및 대사체의 분해능에 기초하여, 지질 추출 용액 내의 약 0.66M KOH(예, 약 0.62-0.70M KOH) 및 약 2.5mM BHT(예를 들어, 약 2.0 내지 3.0mM BHT)에서 최적의 결과가 산출되는 것을 확인하였다. 더 많은 양의 염기는 너무 많은 에이코사노이드 분해를 야기하고, 적은 양은 에스테르화된 산화 복합체 지질의 가수분해를 불충분하게 하였다. 일 실시형태에서, KOH의 양은 0.66M이다. 너무 높은 농도의 BHT에서는 결정화가 발생한다. 다른 실시형태에서, BHT의 양은 2.5 mM이다. SPE 컬럼 이전의 공정 동안, 추출물을 H2O로 희석하였고 SPE 추출 중에 너무 높은 염 농도가 발생하지 않도록 하였다.
일반적으로, 내부 표준은 알칼리 가수분해 조건 하에서 어느 정도까지 분해되었다. 특히 극성 에이코사노이드(LTB4, LTC4, LTE4, PGE2, PGD2, PGJ2, 6k PGF1a, dhk PGF2a, 15d PGJ2)는 분해에 특히 민감한 것으로 나타났다. 지방산과는 달리 대부분의 자연적으로 발생하는 프로스타글란딘은 그들의 직접적인 환경에 따라 가수분해, 탈수 또는 이성질화에 상당한 가능성이 있었다. 프로스타글란딘에는 여러 개의 하이드록시기, 케토기 및 견고한 5-원 프로스탄 고리를 포함하고 있다. 생성된 β-하이드록시 케톤 체계는 불안정하고 산성 또는 염기성 조건하에서 사이클로펜테논 고리를 함유하는 A형 프로스타글란딘와 같은 프로스타글란딘 A2으로 쉽게 탈수될 수 있다. 염기 조건하에서, A 프로스타글란딘은 프로스타글란딘 B와 같은 B 프로스타글란딘으로 더 이성질화 될 수 있다. 강한 알칼리 용액에서 PGB2의 형성은 매우 빠르다(9:1 메탄올-물에서 0.5M KOH로 수초 이내). 5,6-이중결합이 없는 PGE는 0.1M 염기로 처리하여 본질적으로 비활성 PGB로 전환될 수 있지만, PGB의 형성은 연구에서 관찰되지 않았다
중수소화된 내부 표준의 경우, 알칼리 가수분해 후의 회수율은 매우 다양하고, 일부 대사체는 상당히 분해되었고 나머지를 완전히 회수되었다(표 1). 일반적으로 비-중수소화된 1차 표준의 회수율은 중수소화된 내부 표준의 회수율과 일치했다(표 2 및 표 3). 이러한 결과는 알칼리 조건에 노출된 후 중수소화된 표준의 회수율이 감소한 것은 수소와의 교환 반응으로 인한 중수소의 손실에 기인한 것이 아니라 주로 분자구조의 재배열 또는 분해의 결과임을 나타낸다. 이 가설과 일치하여, 이 연구는 알칼리 조건이 실제로 몇몇 대사체의 수준을 증가시킨다는 것을 보여준다. 예를 들어, 16-HETE, 17-HETE, 18-HETE, 19-HETE 및 20-HETE를 포함하는 AA의 하이드록실화된 대사체가 증가했다(표 3). 이 대사체는 CYP 경로를 통해 효소적으로 생성되거나 자동 산화의 결과로서 비-효소적으로 생성될 수 있다. 본 명세서는 시료에서 에스테르화된 산화 지방산을 가수분해하기 위해 적용되는 비누화 공정이 중수소화 및 비-중수소화된 에이코사노이드의 일부 분해 또는 이성질화를 유도할 수 있음을 입증했다. 대조적으로, 에이코사노이드 및 관련된 산화 PUFA의 지방산 전구체 알칼리 조건하에서 훨씬 더 안정하다.
알칼리 가수분해 처리된 1차 표준의 회수율1
번호 표준 대조군
(강도x10 4 ) 		RSD
(%) 		비누화
(강도x10 4 ) 		RSD
(%) 		회수율
(%)
COX 생합성 경로
1 11-HEPE 1,060 4.3 721 3.7 68
2 11-HETE 3,060 3.4 2,160 1.5 71
3 12-HHTrE 295 4.4 19 18 7
4 PGA2 2,890 2.9 34 9.2 1
5 15d PGA2 12 11 ND 0 0
6 PGB2 1,120 5.6 ND 0 0
7 PGD1 90 6.5 ND 0 0
8 PGD2 279 3.9 ND 0 0
9 15d PGD2 1,300 6.8 ND 0 0
10 dhk PGD2 228 3.6 ND 0 0
11 PGD3 89 3.9 ND 0 0
12 tetranor-PGDM 14 1.7 3.8 15 27
13 PGE1 107 8.9 ND 0 0
14 6k PGE1 385 9.3 ND 0 0
15 PGE2 437 13 ND 0 0
16 11b PGE2 402 7.2 ND 0 0
17 bicyclo PGE2 274 5.9 ND 0 0
18 dhk PGE2 63 29 ND 0 0
19 15k PGE2 150 7.2 9.5 21 6
20 19oh PGE2 115 3.6 ND 0 0
21 20oh PGE2 98 1.5 ND 0 0
22 PGE3 262 1 ND 0 0
23 PGEM 168 2 ND 0 0
24 PGF1a 213 4.3 93 3.6 44
25 6,15 dk-,dh- PGF1a 22 3.9 4.2 0.7 18
26 d17 6k PGF1a 174 1.2 18 1.9 11
27 6k PGF1a 221 1.1 32 5.5 15
28 2,3 dinor-6k PGF1a 7.6 14 0.3 11 4
29 15k PGF1a 67.1 5.5 ND 0 0
30 PGF2a 188 0.8 89 0.4 48
31 11b PGF2a 4.7 5.3 1.7 18 36
32 2,3 dinor 11b PGF2a 133 2.2 75 2.6 56
33 dh PGF2a 117 12 77 8 66
34 dhk PGF2a 132 0.9 42 3.6 32
35 11b dhk PGF2a 75 12 0.5 20 1
36 dihomo PGF2a 129 17 63 1.8 49
37 5-iso PGF2a VI 97 2.8 32 0.5 34
38 8-iso PGF2a III 181 4 89 0.4 49
39 2,3 dinor 8-iso PGF2a 587 1.3 325 5.4 55
40 15k PGF2a 88 1.9 ND 0 0
41 19oh PGF2a 1.2 29 ND 0 0
42 20oh PGF2a 61 1.8 23 0.9 38
43 PGF3a 83 9.3 42 0.8 51
44 PGFM 134 0.7 ND 0 0
45 15d PGJ2 199 4.1 ND 0 0
46 PGJ2 2,130 4.1 12 16 1
47 PGK1 32 25 73 23 228
48 PGK2 3.9 31 ND 0 0
49 TXB1 301 2.6 71 8.2 24
50 TxB2 372 2.9 110 3.4 30
51 2,3 dinor TXB2 6.0 0.1 2.4 9.1 41
52 11d-TXB2 152 0.8 152 0.4 100
53 TXB3 333 3.7 100 4.8 30
LOX 생합성 경로
54 5-oxoETE 545 3.5 9.2 4.6 2
55 12-oxoETE 245 6.2 6.7 7.3 3
56 15-oxoETE 524 4.5 11.5 6 2
57 13 HDoHE 290 1.4 188 6.8 65
58 5-HETE 653 2.3 336 1.3 51
59 5,6-diHETE 242 0.8 244 12 101
60 8-HETE 826 2 579 3.2 70
61 12-HETE 121 1.3 87 5.5 72
62 tetranor 12-HETE 805 5.9 350 3.5 44
63 15-HETE 492 2.4 309 6.7 63
64 5-HEPE 329 1.6 248 4.2 75
65 8-HEPE 174 2.1 264 3.2 152
66 8,15-diHETE 127 2.2 18 12 14
67 12-HEPE 719 1.5 1,050 3.4 147
68 15-HEPE 823 3.9 1,150 5.1 141
69 5-HETrE 494 3.4 299 1.5 61
70 8-HETrE 746 2.5 448 3.5 60
71 15-HETrE 2,170 2.2 1,320 6.2 61
72 9-HODE 1,200 2 524 11 44
73 13-HODE 1,220 1.9 571 7.6 47
74 9-HOTrE 567 1.8 329 7.5 58
75 13-HOTrE 219 3.3 277 4.9 126
76 13-HOTrE(y) 1,180 2.8 1,170 8.4 100
77 HXA3 34 1.7 12 1.9 35
78 HXB3 396 2.6 81 10 21
79 LTB4 2,460 6.4 283 17 12
80 20oh LTB4 288 2.6 58 7.8 20
81 6t LTB4 2,660 7.6 322 15 12
82 12epi LTB4 2,650 7.1 316 14 12
83 6t,12epi LTB4 2,640 6.8 293 16 11
84 12oxo LTB4 2,630 6.1 291 19 11
85 LTC4 1.1 78 ND 0 0
86 14,15 LTC4 172 7.1 ND 0 0
87 14,15 LTD4 30 68 ND 0 0
88 11t LTC4 0.3 70 ND 0 0
89 LTD4 105 6.1 ND 0 0
90 11t LTD4 124 0.3 ND 0 0
91 LTE4 139 0.5 12 28 9
92 11t LTE4 51 6.7 4.5 24 9
93 14,15 LTE4 48 3.3 1.6 49 3
94 6R-LXA4 ND 0 ND 0 0
95 6S-LXA4 225 8.9 12 9.4 6
96 LXA5 2.3 12 ND 0 0
97 LXB4 117 3.5 13 28 11
98 9-oxoODE 261 3.6 134 8.9 52
99 13-oxoODE 111 1.9 53 9.5 48
100 15oxoEDE 365 5.7 160 8.7 44
101 10S-Protectin D1 0.9 7.9 ND 0 0
102 Resolvin D1 232 11 27 17 12
103 20cooh LTB4 62.6 2.5 13 6.1 22
104 17 HDoHE 55.6 3.8 34 2.3 62
105 17k DPA 252 7.7 8.0 17 3
CYP 생합성 경로
106 20COOH AA 709 0.0 1,100 2.1 156
107 9,10 EpOME 1,000 4.7 159 14 16
108 12,13 EpOME 1,170 4.7 170 14 15
109 16-HETE 374 2.2 472 2.3 127
110 17-HETE 1420 2.0 1,790 2.5 126
111 18-HETE 1020 1.4 1,430 3.6 140
112 19-HETE 206 3.4 267 2.6 130
113 20-HETE 175 2.7 229 2.7 131
114 18-HEPE 1040 3.2 631 5.1 60
115 5,15-diHETE 337 2.0 71 12 21
116 19,20 DiHDPA 398 1.5 276 0.1 69
117 5,6-diHETrE 589 3.2 1,760 0.3 299
118 8,9-diHETrE 418 0.4 319 0.1 76
119 11,12-diHETrE 1,820 4.4 1,259 1.8 69
120 14,15-diHETrE 2,100 3.7 1,510 0.2 72
121 9,10 diHOME 2,120 4.6 1,410 0.3 67
122 12,13 diHOME 1,830 4.5 1,400 0.1 77
123 5,6-EET 206.1 5.6 25 14 13
124 8,9-EET 224.0 6.3 79 7.4 36
125 11,12-EET 840.1 9.9 286 3.4 34
126 14,15-EET 219.5 7.2 44 10 20
127 14(15) EpETE 481.0 6.2 291 2.1 61
128 17(18) EpETE 245.8 3.3 44 12 18
129 16(17) EpDPE 106.6 0.5 45 7.3 43
130 19(20) EpDPE 407.3 5.5 116 1.2 29
비- 효소적 경로
131 4 HDoHE 299.9 4.8 170 3.2 57
132 7 HDoHE 332.5 2.8 200 4.0 60
133 8 HDoHE 153.1 8.2 88 6.1 58
134 10 HDoHE 833.3 4.7 525 1.5 63
135 11 HDoHE 577.1 5.3 349 2.9 61
136 14 HDoHE 322.4 2.9 216 3.2 67
137 16 HDoHE 1,310 3.7 809 2.1 62
138 20 HDoHE 529.6 2.3 309 5.2 58
139 9-HEPE 474.5 3.7 661 5.7 140
140 9-HETE 171.8 1.9 120 3.0 70
141 9-Nitrooleate 40.9 6.4 ND 0.0 0
142 10-Nitrooleate 19 7.0 ND 0.0 0
143 7(R) Maresin-1 179 4.7 ND 0.0 0
144 5-iso PGF2a VI 97 2.8 32 0.5 34
145 8-iso PGF2a III 181 4.0 89 0.4 49
146 2,3 dinor 8-iso PGF2a 587 1.3 325 5.4 55
147 8-iso-15k PGF2b 90 6.3 ND 0.0 0
148 8-iso PGF3a 193 6.7 85 9.5 44
1ND 는 감지할 수 없으며 이는 신호 대 잡음비(S/N)가 3:1보다 낮은 피크를 의미한다. RSD는 상대적 표준 편차이다.
NAFLD 시료로부터 주요한 발견은 NAFL로부터 NASH를 구별하기 위한 잠재적인 신규하고, 전신적이며, 비침습성 마커로서 특정 지방산 산화 생성물의 확인과 관련된다. NAFLD 환자 및 건강한 개인의 혈장에서 효소 및 유리 라디칼 경로로부터의 LA, AA, DGLA, EPA 및 DHA 유도체의 농도를 평가하였다. 대부분의 문헌에서 산화적 스트레스를 질병 진전 및 NAFLD의 원인인 핵심 이상으로 언급하고 있다; 그러나, 생체내 산화적 손상에 기여하는 경로는 잘 알려져 있지 않다.
PUFA 생성물의 다수가 대조군과 비교하여 NAFL 및 NASH 대상체에서 훨씬 더 향상된다(도 3 내지 도 7). 세포 리폭시게나제에 의해 촉매된 반응에서 AA의 전환으로부터 유래된 LA 및 HETE의 전환으로부터유래 된 HODE와 같은 지질 과산화 생성물은 중성지방의 증가와 연관된 과산화 반응동안 간에서 증가되었다. 5-HETE, 8-HETE, 11-HETE, 15-HETE, 13-HODE 및 9-oxoODE를 포함하는 염증성 에이코사노이드의 혈장 농도는 NASH 환자 및 대조군 대상체에 비해 NAFL 환자에서 훨씬 향상되었다(도 3 및 도 4). NASH의 감소는 몇몇의 에이코사노이드가 다른 것으로 분해되었음을 나타냈다. Feldstein et al. 은 지방간에서 지방간염으로의 HODE 및 oxoODE의 증가를 특징으로한다(J. Lipid Res., 51 : 3046-3054, 2010). 회수율 > 60%로 정의된 알고리즘을 사용하여, 이러한 대사체는 회수 기준(표 4 및 표 3)을 만족시키지 못하여 추가 분석에서 제외하였다. 최적화된 비누화 공정을 사용하고 대사체 포함/배제 알고리즘의 적용은 대사체, 특히 8-HETrE 및 15-HETrE의 확인을 가능케 하고 이는 NAFL과 비교하여 NASH에서 유의하게 높았다(p <0.001). 동일한 환자 및 대조군 집단의 혈장을 사용하여 NAFL 및 대조군과 비교하여 유리 및 총 15-HETrE모두가 질병의 NASH 단계에서 유의하게 향상되었다. 도 5에서 볼 수 있듯, 8-HETrE도 같은 추세를 따랐다.
흥미롭게도, 오메가-3 지방산 DHA(p <0.001) 및 그의 대사체 17-HDoHE(p <0.0001)는 NAFL 및 대조군에 비해 NASH에서 유의하게 증가하였다(도 7). 후자의 대사체는 항-염증 특성을 지닌 지질 매개체의 그룹인 프로텍틴의 전구체이기 때문에 특히 중요한 관심을 받는다.
가수분해 후 ≥ 60%로 회수된 1차 표준
경로 대사체 회수율( % ) 경로 대사체 회수율(%)
COX CYP
11-HEPE 68 20COOH AA 156
11-HETE 71 16-HETE 127
dh PGF2a 66 17-HETE 126
PGK1 228 18-HETE 140
11d-TXB2 100 19-HETE 130
LOX 20-HETE 131
13 HDoHE 65 18-HEPE 60
5,6-diHETE 101 19,20 DiHDPA 69
8-HETE 70 5,6-diHETrE 299
12-HETE 72 8,9-diHETrE 76
15-HETE 63 11,12-diHETrE 69
5-HEPE 75 14,15-diHETrE 72
8-HEPE 152 9,10 diHOME 67
12-HEPE 147 12,13 diHOME 77
15-HEPE 141 14(15) EpETE 61
5-HETrE 61 비- 효소적
8-HETrE 60 7 HDoHE 60
15-HETrE 61 10 HDoHE 63
13-HOTrE 126 11 HDoHE 61
13-HOTrE(y) 100 14 HDoHE 67
16 HDoHE 62
17 HDoHE 62
9-HEPE 140
9-HETE 70
전술한 예시적 실시형태에서 설명한 본 발명의 많은 수정 및 변형이 당업자에게 발생할 것으로 예상된다. 따라서, 첨부된 청구범위에 나타나는 그러한 제한사항만이 본 발명에 놓여야 한다.

Claims (24)

  1. 대상체에서 비-알코올성 지방간(NAFL)으로부터 비-알코올성 지방간염(NASH)을 구별하기 위한 정보를 제공하는 방법으로서,
    (a) 대상체로부터 수득한 생물학적 시료를 0.6∼0.7M KOH를 포함하는 알칼리 용액으로 처리하여 에스테르화된 에이코사노이드를 가수분해하고 가수분해된 에이코사노이드를 회수하는 단계; 및
    (b) 대상체로부터 수득한 처리된 생물학적 시료 중의 8-HETrE 및 15-HETrE로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 에스테르화된 에이코사노이드 수준을 NAFL 대상체로부터 수득한 대조군 시료와 비교하는 단계
    를 포함하고,
    대조군과 대비하여 대상체로부터 수득한 시료 중의 적어도 하나의 에이코사노이드의 수준 차이는 NASH를 나타내는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 단계 (a)로부터 수득한 에이코사노이드는 60% 초과로 회수된 에이코사노이드인 방법.
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서, 생물학적 시료는 혈액, 혈장 및 혈청으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 알칼리 처리 전에 부틸화된 하이드록시톨루엔(BHT)을 첨가하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 제5항에 있어서, 2.5 mM BHT가 사용되는 방법.
  9. 제1항에 있어서, 대조군과 대비하여 대상체로부터 수득한 시료 중의 8-HETrE 및 15-HETrE로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 에이코사노이드의 수준 증가는 NASH를 나타내는 방법.
  10. 제1항에 있어서, 시료 중의 오메가-3 지방산 DHA 및/또는 17-HDoHE의 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함하고, 대조군과 대비한 증가는 NASH를 나타내는 방법.
  11. 제1항에 있어서, 에이코사노이드는 액체 크로마토그래피에 의해 측정되는 방법.
  12. 제10항에 있어서, 지방산은 기체 크로마토그래피 질량 분광분석법에 의해 측정되는 방법.
  13. 대상체에서 비-알코올성 지방간(NAFL)으로부터 비-알코올성 지방간염(NASH)을 구별하기 위한 정보를 제공하는 방법으로서,
    a) 대상체로부터 수득한 생물학적 시료를 0.6∼0.7M KOH를 포함하는 알칼리 용액으로 처리하는 단계;
    b) 처리된 시료로부터 에이코사노이드 및 지방산을 회수하는 단계; 및
    c) 대상체로부터 수득한 생물학적 시료 중의 적어도 하나의 바이오마커의 수준을 알려진 NAFL을 갖는 대조군 시료와 비교하는 단계
    를 포함하고,
    대조군과 대비하여 대상체로부터 수득된 시료 중의 적어도 하나의 바이오마커 수준 증가는 NASH를 나타내며, 상기 바이오마커는 8-HETrE, 15-HETrE, DHA, 17-HDoHE 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 에이코사노이드는 60% 초과로 회수되는 방법.
  15. 제13항에 있어서, 적어도 하나의 바이오마커는 8-HETrE 및 15-HETrE를 포함하는 방법.
  16. 제13항에 있어서, 생물학적 시료는 혈액, 혈장 및 혈청으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  17. 제13항에 있어서, 알칼리 처리 전에 부틸화된 하이드록시톨루엔(BHT)을 첨가하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  18. 삭제
  19. 삭제
  20. 제17항에 있어서, 2.5 mM BHT가 사용되는 방법.
  21. 제15항에 있어서, 시료 중의 오메가-3 지방산 DHA 및/또는 17-HDoHE의 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함하고, 대조군과 대비한 증가는 NASH를 나타내는 방법.
  22. 제13항에 있어서, 에이코사노이드는 액체 크로마토그래피에 의해 측정되는 방법.
  23. 제13항에 있어서, 시료 중의 지방산은 기체 크로마토그래피 질량 분광분석법에 의해 측정되는 방법.
  24. 제13항에 있어서, 5-HETE, 8-HETE, 11-HETE, 15-HETE, 13-HODE, 9-oxoODE 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 전염증성 에이코사노이드의 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함하고, 상기 전염증성 에이코사노이드 중 어느 하나의 측정된 수준이 NAFL 대조군보다 낮은 것은 NASH를 나타내는 방법.
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