CN107407683A - 用于确定非酒精性脂肪肝病的方法和组合物 - Google Patents

用于确定非酒精性脂肪肝病的方法和组合物 Download PDF

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Abstract

本公开提供了区分非酒精性脂肪肝病与非酒精性脂肪肝炎的方法。该方法包括测量生物样品中的类二十烷酸和脂肪酸水平。本公开提供了区分受试者中的非酒精性脂肪肝炎(NASH)与非酒精性脂肪肝(NAFL)的方法。该方法包括从所述受试者获得生物样品；用碱性溶液处理所述样品以释放酯化的类二十烷酸并且回收所述类二十烷酸；以及比较获自所述受试者的生物样品与获自NAFL受试者的对照样品中的至少一种酯化的类二十烷酸水平，其中与对照相比获自所述受试者的样品中所述至少一种类二十烷酸的水平有差异指示有NASH。

Description

用于确定非酒精性脂肪肝病的方法和组合物
对相关申请的交叉引用
本申请要求于2015年2月13日提交的美国临时申请号62/116,108的优先权，该申请通过引用并入本文。
发明内容
本发明总体上涉及确定脂肪肝病和非酒精性脂肪肝炎的物质和方法。
背景技术
脂肪肝病(或脂肪性肝炎)经常与过量饮酒或肥胖有关，但是也有其他病因诸如代谢性缺陷包括胰岛素抗性和糖尿病。脂肪肝由肝细胞液泡中甘油三酯脂肪积累引起，导致肝功能下降，并且可能引起肝硬化或肝癌。
非酒精性脂肪肝病(NAFLD)代表了在不存在酗酒的情况下发生的疾病谱。
发明内容
本公开提供了区分受试者中非酒精性脂肪肝炎(NASH)与非酒精性脂肪肝(NAFL)的方法。该方法包括从受试者获得生物样品；用碱性溶液处理所述样品以释放酯化的类二十烷酸并且回收所述类二十烷酸；以及比较获自所述受试者的生物样品与获自NAFL受试者的对照样品中的至少一种酯化的类二十烷酸水平，其中与对照相比获自所述受试者的样品中所述至少一种类二十烷酸的水平有差异指示有NASH。在一个实施方案中，测量到的类二十烷酸是以大于60％的回收率回收的类二十烷酸。在任一前述实施方案的另一实施方案中，类二十烷酸选自由8-HETrE和15-HETrE组成的组。在任一前述实施方案的另一实施方案中，生物样品选自由血液、血浆和血清组成的组。在任一前述实施方案的又另一个实施方案中，所述方法进一步包括在碱处理之前添加丁羟甲苯(BHT)。在进一步的实施方案中，BHT为约2.5mM。在任一前述实施方案的另一实施方案中，碱性溶液是氢氧化钾(KOH)水溶液。在进一步的实施方案中，KOH以约0.6-0.7M KOH使用。在任一前述实施方案的另一实施方案中，与对照相比，获自受试者的样品中至少一种类二十烷酸的水平升高指示有NASH。在又另一实施方案中，所述方法进一步包括测量所述样品中ω-3脂肪酸DHA和/或17-HDoHE的水平，其中与对照相比的升高指示有NASH。在前述任一实施方案中，类二十烷酸通过液相色谱法测量。在前述任一实施方案中，脂肪酸通过气相色谱质谱法测量。
本公开还提供了一种区分受试者中非酒精性脂肪肝炎(NASH)与非酒精性脂肪肝(NAFL)的方法，包括：从所述受试者获得生物样品；用碱性溶液处理所述样品；以及从经处理的所述样品回收类二十烷酸和脂肪酸；以及比较获自所述受试者的生物样品与具有已知NAFL的对照样品中的至少一种生物标志物的水平，其中与所述对照相比获自所述受试者的样品中所述至少一种生物标志物的水平升高指示有NASH，并且进一步其中所述生物标志物选自由下列各项组成的组：8-HETrE、15-HETrE、DHA、17-HDoHE及其任意组合。在一个实施方案中，测量到的类二十烷酸是以大于60％的回收率回收的类二十烷酸。在另一个实施方案中，所述至少一种生物标志物包括8-HETrE或15-HETrE。在又另一个实施方案中，所述生物样品选自由血液、血浆和血清组成的组。还在前述任一实施方案中的另一实施方案中，所述方法进一步包括在碱处理前添加丁羟甲苯(BHT)。在一个实施方案中，碱处理包括添加氢氧化钾(KOH)水溶液。在进一步的实施方案中，添加KOH至约0.6-0.7M KOH。还在另一个实施方案中，使用约2.5mM BHT。在前述任一实施方案的又另一个实施方案中，所述方法进一步包括测量所述样品中ω-3脂肪酸DHA和/或17-HDoHE的水平，其中与对照相比的升高指示有NASH。在另一个实施方案中，类二十烷酸通过液相色谱法测量，并且脂肪酸通过气相色谱质谱法测量。还在前述任一实施方案的进一步实施方案中，测量促炎的类二十烷酸的水平，所述促炎的类二十烷酸选自由下列各项组成的组：5-HETE、8-HETE、11-HETE、15-HETE、13-HODE、9-氧代ODE及其任意组合，其中前述任一项的水平低于NAFL对照就指示有NASH。
附图说明
图1A-B显示了用于测定类二十烷酸的方案。(A)不采用碱解的对照和(B)利用碱解获得的总类二十烷酸。
图2A-B显示了在暴露于碱解条件之前用于选择HETE的萃取色谱图(A)和在暴露于碱解条件之后用于选择HETE的萃取色谱图。
图3显示了花生四烯酸(AA)衍生的代谢物。血浆中总AA以及其衍生自COX、LOX、CYP和非酶促途径的代谢物的量对于每种代谢物以三临床臂显示。Whisker盒的下端指示第一四分位数，盒中的线指示第二四分位数，上端指示第三四分位数。Whisker指示测量值的下限和上限。
图4显示了血浆中总亚油酸(LA)的量及其对于每种代谢物以三临床臂显示的衍生自LOX和CYP途径的代谢物的量。
图5显示了血浆中总二高-γ-亚麻酸(DGLA)及对于每种代谢物以三临床臂表示的DGLA衍生自LOX和非酶促途径的代谢物的量。组间差异利用学生t-检验评价，且指示p值<0.05。
图6显示了血浆中总二十碳五烯酸(EPA)及其衍生自COX、LOX和非酶促途径的对于每种代谢物以三临床臂表示的代谢物的量。
图7显示了血浆中总二十二碳六烯酸(DHA)及其衍生自LOX和CYP途径的对于每种代谢物以三临床臂表示的代谢物的量。组间差异利用学生t-检验评价，且指示p值<0.05。
具体实施方式
如在本文中和在附带权利要求中所用，单数形式“一个”、“和”以及“所述”包括复数指代物，除非上下文清晰地指示是其他的情况。因此，例如，提到“衍生物”包括多种此类衍生物并且提及“受试者”包括提及一个或多个受试者，等等。
此外，除非另外指明，否则“或”的使用意指“和/或”。类似地，“包括”、“包含”和“含有”是可互换的并且不意在是限制性的。
要进一步理解的是对各个实施方案的描述使用术语“包括”的时候，本领域技术人员要理解在一些具体实例中，实施方案可以备选地使用表述“基本上由…组成”或“由…组成”来描述。
除非另外限定，本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域中的普通技术人员普遍理解的含义相同的含义。尽管与本文所述那些相似或等效的方法和材料可以在本公开的方法和组合物的实施中使用，但本文中描述了示例性的方法、装置和材料。
在上面和在全文中讨论的出版物仅因为它们在本申请的申请日之前公开而提供。本文中的任何内容并不能解释为承认本发明人因为之前的公开而没有资格先于这些公开获得授权。
非酒精性脂肪肝病(NAFL或NAFLD)代表了在不存在酗酒的情况下发生的疾病谱。其特征在于存在脂肪变性(肝脏中的脂肪)并且可以代表代谢综合征的肝脏表现(包括肥胖症、糖尿病和高甘油三酯血症)。NAFLD与胰岛素抵抗有关，其在成年人和儿童中导致肝脏疾病并且可以最终导致肝硬化(Skelly等人,J Hepatol.,35:195-9,2001；Chitturi等人,Hepatology,35(2):373-9,2002)。NAFLD的严重性从相对良性的主要为孤立的大泡性脂肪变性(即，非酒精性脂肪肝或NAFL)至非酒精性脂肪肝炎(NASH)(Angulo等人,JGastroenterol Hepatol,17Suppl:S186-90,2002)。NASH特征在于脂肪变性、细胞学气球样病变、散发的炎症和细胞旁纤维化的组织学证据(Contos等人,Adv Anat Pathol.,9:37-51,2002)。由NASH导致的肝纤维化可以进展成肝硬化或肝衰竭，并且在一些情况下可以引起肝细胞癌。
胰岛素抵抗(和高胰岛素血症)的程度与NAFLD的严重性相关，在患有NASH的患者中比患单纯性脂肪肝的患者中更突出(Sanyal等人,Gastroenterology,120(5):1183-92,2001)。结果，发生胰岛素介导的对脂解作用的抑制且循环脂肪酸的水平增加。两个与NASH相关的因素包括胰岛素抵抗和游离脂肪酸向肝脏的递送增加。胰岛素阻断线粒体脂肪酸氧化。游离脂肪酸产生增加以进行肝脏再酯化和氧化导致肝内脂肪积累并增加肝脏对二次创伤的易感性。
NAFLD在儿童中的患病率未知，因为要求对肝脏进行组织学分析以便确认诊断(Schwimmer等人,Pediatrics,118(4):1388-93,2006)。然而，对患病率的估计可以由使用肝脏超声得到的儿童肥胖症数据和血清转氨酶水平升高以及85％的患有NAFLD的儿童是肥胖的这一知识来推断。来自国家健康与营养调查研究的数据揭示了在过去35年中儿童和青少年肥胖症的患病率升高了三倍；来自2000的数据表明6-19岁之间的儿童有14-16％是肥胖的，BMI>95％(Fishbein等人,J Pediatr.Gastroenterol.Nutr.,36(1):54-61,2003)，以及下面的事实：85％的患有NAFLD的儿童是肥胖的。
在患有组织学证明的NAFLD的患者中，血清肝转氨酶，特别是丙氨酸转氨酶(ALT)水平从正常值的上限升高至此水平的10倍(Schwimmer等人,J Pediatr.,143(4):500-5,2003；Rashid等人,J Pediatr Gastroenterol Nutr.,30(1):48-53,2000)。ALT/AST(天冬氨酸转氨酶)的比率为>1(范围为1.5–1.7)，这一比率不同于酒精性脂肪肝，在后者中该比率通常<1。在NASH中可能异常升高的其他异常的血清学试验包括γ-谷氨酰转氨酶(γ-GT)以及血浆胰岛素的空腹水平、胆固醇的空腹水平和甘油三酯的空腹水平。
NAFLD发展成NASH的确切机制仍然不清楚。因为胰岛素抵抗与NAFLD和NASH两者均相关，因此假设对于发生NASH也需要其他另外的因素。这称作“两次打击(two-hit)”假设(Day CP.Best Pract.Res.Clin.Gastroenterol.,16(5):663-78,2002)并且首先涉及脂肪在肝脏内的积累，以及其次，存在大量的自由基，氧化应激增加。大泡性脂肪变性代表了甘油三酯在肝脏内的积累，并且相应地这是由于游离脂肪酸向肝脏的递送和利用之间的失衡引起的。在热量摄取增加的时期期间，甘油三酯将积累并充当储备能量来源。当饮食热量不足时，储存的甘油三酯(在脂肪中)经历脂解作用并且脂肪酸释放到循环中并被肝脏摄取。脂肪酸的氧化将产生能量用于利用。
类二十烷酸生物合成途径包括超过100种生物活性脂质和相关的酶，它们组织构成复杂的和错综复杂的脂质信号传导网络。在生理刺激下，多不饱和脂肪酸(PUFA)衍生的脂质介质的生物合成经由磷脂酶A2(PLA2)对磷脂的水解而启动。这些PUFA(包括花生四烯酸(AA)、二高-γ-亚麻酸(DGLA)、二十碳五烯酸(EPA)、和二十二碳六烯酸(DHA))然后被三个酶体系加工：脂氧合酶(LOX)、环氧合酶(COX)和细胞色素P450，产生三种截然不同谱系的氧化脂质类型。这些酶全部能够将游离花生四烯酸和相关的PUFA转变成它们的特异性代谢物并且显示出各种各样的效能、半衰期和在调节炎症和信号传导中的效用。另外，非酶促过程可以产生氧化的PUFA代谢物，包括来自必需脂肪酸亚油酸(LA)和α-亚麻酸(ALA)的代谢物。
类二十烷酸是代谢综合征中以及在非酒精性脂肪肝病(NAFLD)中肝脏脂肪变性进展成脂肪性肝炎的关键调控分子，其充当抗炎剂或充当促炎剂。对脂质过氧化在脂肪性肝炎中的因果关系的令人信服的证据还没有被明确地确定；然而，十年的研究已经强烈地提示这些过程的发生并且氧化应激与肝毒性和损伤相关。如上所讨论，非酒精性脂肪肝病(NAFLD)涵盖与肝脏脂肪积累过多相关的宽范围的组织学病例，范围从非酒精性脂肪肝(NAFL)至非酒精性脂肪肝炎(NASH)。通过细胞学气球样病变、炎症和较高程度的瘢痕形成和纤维化的证据可以区分其与NAFL。因此，NASH是一种严重的病况，并且约10-25％的受累患者最有发展成晚期肝病、肝硬化和肝细胞癌。
因此，重要的是区分NASH与NAFL。目前，诊断NASH的金标准技术是肝活组织检查，其被认为是肝中评价坏死-炎性改变的存在和程度、气球样病变和纤维化的存在的唯一可靠方法。然而，肝活组织检查是有创操作，可能有严重的并发症和限制。因此需要可靠的无创方法来避免取样风险。类二十烷酸基于对患有用活检证明的NAFL和NASH的充分表征的患者的研究提议游离类二十烷酸的血浆水平差异可以来区分NAFL与NASH。
脂质代谢的改变可以因为脂肪形成增加、过氧化物酶体缺陷和线粒体β-氧化、和/或肝脏输出脂质的能力较低导致脂肪酸和/或类二十烷酸的改变从而产生肝脂肪变性。一些研究已经突出了三酰甘油、膜脂肪酸组成、和极低密度脂蛋白(VLDL)产生在NASH和相关的代谢综合征的发生中的作用。
环氧合酶-2(COX-2)(类二十烷酸代谢中的关键酶)在NASH中丰富地表达，其促进大鼠中的肝细胞凋亡。其他作者已经报道LA的氧化脂质产物包括9-羟基辛二烯酸(9-HODE)、13-HODE、9-氧代辛二烯酸(9-氧代ODE)、和13-氧代ODE以及花生四烯酸的氧化脂质产物5-羟基二十四烯酸(5-HETE)、8-HETE、11-HETE、和15-HETE与非酒精性脂肪肝病中的组织学严重性有联系。
游离脂肪酸是细胞毒性的；因此哺乳动物体系中所有脂肪酸中的大多数被酯化成磷脂和甘油脂以及其他复合脂质。类似地，脂肪酸的氧合代谢物可以以它们的游离形式存在或酯化成复合脂质。为了俘获所有酯化的类二十烷酸用于分析，使用皂化步骤来释放它们。然而，在这些条件下类二十烷酸的稳定性还没有详细研究并且怀疑该过程引起变性和定量不佳。使用173个标准品的库，进行试验以评价在暴露于碱解条件后每种代谢物的稳定性和回收率。
本公开提供了课用于区分NAFL与NASH的方法、试剂盒和组合物。这样的方法将在疾病的早期发生和治疗中有帮助。而且，该方法减少与目前在诊断中使用的肝活检相关的活检风险。所述方法和组合物包括诊断中的经修饰的类二十烷酸和PUFA。同样，生物标志物通过化学修饰从其天然状态进行操作，以提供被测量和定量的衍生的生物标志物。特异性生物标志物的量可以与正常的标准品样品水平(即，缺少任何肝病的那些)进行比较或可以与从患病群体(例如，临床上诊断有NASH或NAFL的群体)获得的水平进行比较。
游离类二十烷酸和PUFA代谢物的水平可以表示为AUROC(接受者操作特征曲线下面积)。AUROC通过稳定同位素稀释通过测量游离类二十烷酸和PUFA代谢物的水平来确定。简言之，将相同量的氘化内标准品添加至每个样品以及用来生成标准曲线的所有基准物质。类二十烷酸和PUFA代谢物的水平通过测定内源性代谢物和相匹配的氘化内标准品之间的比率来计算。通过线性回归将比率转换成绝对量。使用统计学分析(包括卡方检验、t-检验和AUROC)评价单个类二十烷酸代谢物的诊断测试性能和区分NAFL和NASH的能力。
本公开的方法包括测定患者样品中一种或多种游离类二十烷酸和/或多不饱和脂肪酸(PUFA)代谢物的水平。如本文所用，术语“样品”是指来自患者的任何生物样品。实例包括，但不限于，唾液、毛发、皮肤、组织、痰、血液、血浆、血清、玻璃体、脑脊液、尿液、精液和细胞。在一个实施方案中，所述样品是血浆样品。
从样品中萃取液体，如实施例中进一步详述的那样。首先测定萃取的液体中类二十烷酸和/或PUFA代谢物的身份和数量，然后与合适的对照进行比较。通过任何合适的液体测定技术来做出测定，诸如高通量技术包括，但不限于，分光光度分析(例如，Cheng等人,Lipids,46(1):95-103(2011)的比色磺基-膦基-香草醛(SPV)评价法)。适合于检测和定量脂质含量的其他分析方法对于本领域技术人员来说是已知的，包括，不限于，ELISA、NMR、UV-Vis或气体-液相色谱法、HPLC、UPLC和/或MS或RIA法基于酶的发色底物法。液体萃取也可以通过本领域已知的多种方法来进行，包括在Bligh和Dyer,Can.J.Biochem.Physiol.,37,91 1(1959)中描述的用于液体样品的常规方法。
为了区分NAFL与NASH，获得的值与正常对照、患有NAFL的受试者和/或患有NASH的受试者比较。本公开证明了与NAFL受试者相比在NASH受试者中8-HETrE和15-HETrE升高。此外，这些值可以与ω-3脂肪酸DHA(p<0.001)和/或其代谢物17-HDoHE的测量组合使用。因此，本公开可以在本公开的方法中使用选自由下列各项组成的组的一种或任意标志物的组合：8-HETrE、15-HETrE、ω-3脂肪酸DHA和17-HDoHE。这些标志物可以与如本文所述确定NAFL或NASH的现有诊断组合使用。与对照和/或NAFL受试者相比，选自由8-HETrE、15-HETrE、ω-3脂肪酸DHA、17-HDoHE及其任意组合组成的组的标志物的升高指示有NASH。
因此，选自由8-HETrE、15-HETrE、ω-3脂肪酸DHA和17-HDoHE组成的组的标志物的升高指示进展为肝病的风险增加和/或期望的区分NASH,对于其可以相应地施加治疗。
游离类二十烷酸和PUFA代谢物的水平可以表示为AUROC(接受者操作特征曲线下面积)。AUROC通过稳定同位素稀释通过测量游离类二十烷酸和PUFA代谢物的水平来确定。简言之，将相同量的氘化内标准品添加至每个样品以及用来生成标准曲线的所有基准物质。类二十烷酸和PUFA代谢物的水平通过测定内源性代谢物和相匹配的氘化内标准品之间的比率来计算。通过线性回归将比率转换成绝对量。使用统计学分析(包括卡方检验、t-检验和AUROC)评价单个类二十烷酸代谢物的诊断测试性能和区分NAFL和NASH的能力。
AUROC值增加约至少0.8、约至少0.9、约至少0.95、约至少0.96、约至少0.97、约至少0.98、约至少0.99或1.0指示是足以确定NASH的差异。
本公开的方法利用了优化可以获得的类二十烷酸和PUFA的量的过程。因此本公开提供了在碱处理期间保留脂质代谢物并使脂质代谢物的降解最小化并且鉴定从酯化脂质释放的特异性类二十烷酸和相关的氧化PUFA(可以充当疾病的生物标志物)的方法和组合物。
要理解的是尽管本公开已经结合其具体实施方案进行了描述，但前述描述以及后面的实施例意在举例说明并且不限制本公开的范围。在本公开的范围内的其他方面、优势和改动对于本公开所属领域的技术人员来说是显而易见的。
实施例
试剂。所有试剂均是HPLC级并且购自Fisher Scientific。
脂质水解和萃取。为了萃取总类二十烷酸，50μl血浆,加入100μl 25个氘化内标准品在甲醇中的混合物(各自购自Cayman Chemicals,Ann Arbor,MI),接受碱处理(0.66MKOH)在37℃持续1小时以水解酯化的脂肪酸。为了防止脂质自氧化，将2.5mM丁羟甲苯(BHT)在KOH处理之前加入至混合物中。此最适抗氧化剂浓度基于利用各种浓度的BHT(范围为从0至10mM)的初步测试来选择，所述初步测试证明了小于1mM无效，而在5mM时结晶。在对照中加入蒸馏水代替KOH(图1)。
含有内标准和KOH的血浆样品在试管中在氩气气氛中在37℃孵育1h以释放游离脂肪酸。利用用KOH或不用KOH处理的纯化标准品测定脂质降解，结果表示为回收率百分比。在水解结束时，加入200μl 0.1M甘氨酸-HCl缓冲液(pH 3.0)，并将最终pH调整至pH＝3，同时缓慢加入4M HCl。为了在通过固相萃取分离类二十烷酸的过程中使盐干扰最小化，用H2O将每个样品稀释至3ml的最终体积。
在Strata-X聚合物反相柱(Phenomenex,Torrance,CA)上通过固相萃取分离脂质代谢物，使用利用3.5ml 100％甲醇接着3.5ml水连续冲洗的活化步骤。将样品上样，然后类二十烷酸用1ml 100％甲醇洗脱类二十烷酸。洗脱液在真空下干燥，并溶解在100μl缓冲液A(由60/40/0.02(v/v/v)水/乙腈/乙酸组成)中并立即用于分析。
标准曲线和内标准品。初步实验指示在皂化过程中某些类二十烷酸代谢物显著降解；因此，25个氘化内标准品的混合物接受相同的碱性条件，接着接受酸化和分离。对于148个范围为0.005-5.0ng的基准物并且含有1ng每种内标准品(所述内标准品加入作为由25个氘化类二十烷酸组成的混合物)生成13点标准曲线。该方法对于类二十烷酸和相关代谢物含有173个MRM对(148个代谢物+25个氘化内标准品),在单一5min LC/MS/MS分析中对它们进行监测(Dumlao等人,Biochim,Biophys.Acta,1811:724-736,2011；Quehenberger等人,BBA–Mol.Cell Biol.Lipids,1811:648-656,2011)。
类二十烷酸的分离和定量。在Acquity超高效液相色谱(UPLC)系统(Waters,Milford,MA,USA)上进行分离，该系统装有RP18柱(2.1×100mm；1.7μm；Waters)。流动相条件和质谱仪参数记述于Wang等人(J.Chromatogr.,1359:60-69,2014)。在AB/Sciex6500QTRAP复合三重四级杆质谱仪上使用负电喷射和按时间表的多反应监测(MRM)模式采集数据。
使用一组173个含有所有内标的纯化标准品通过比较KOH处理前和处理后的峰值面积来确定回收率。所有测定一式三份地进行，并且报告平均值。定量的精度通过变异系数(CV)来确定，变异系数由三个重复测定值的均数计算并且表示为相对标准误(％RSD)。
总脂肪酸测定。向血浆样品加入氘化内标准品，然后衍生化，并通过Quehenberger等人(见上)的方法通过气相色谱质谱法(GC-MS)定量单个的游离脂肪酸。从GC-MS获得总脂肪酸值，在碱解过程中没有观察到降解。
血浆制备。从患者和健康志愿者采集血浆样品；在Loomba等人(J.Lipid Res.,56:185-192,2014)中提供了对研究群体中患者的详细描述，包括基线人口统计学、临床、生化和组织学特征，并总结在表1中。诊断患有NAFLD的患者并通过肝活检检查确认；排除患有其他病因的肝病的患者。所有患者经历标准的病史和物理检查、生化测试和磁共振成像评估的质子密度脂肪分数(MRI-PDFF)。基于肝脏组织学，患有NAFLD的受试者分成两组，患有NAFL的组和患有NASH的组。采集的血浆样品储存在-80℃。由立即冻融的样品测定每种类二十烷酸的总量。
表1:研究群体中的患者的基线人口统计学和组织学特征。
通过碱处理破坏氧化的PUFA。使用一组氘化内标准品分析暴露于强碱条件后类二十烷酸的稳定性(表2)。可想到除了破坏分子以外，强碱催化氘与氢的交换。由于所有质谱数据需要对内标准品进行归一化，因此重要的是区分这两个独立的事件。使用以前建立的被采用用于分析游离类二十烷酸的MRM跃迁(Wang等人，见上)。接受用于酯碱解的条件的特定氘化内标准品的回收率总结在表1中。采用碱解溶液的预处理完全破坏了所有氘化的前列腺素及其衍生物以及白三烯。其他的氘化内标准品也被降解成各种程度。仅花生四烯酸及其羟基化代谢物20-HETE显示完全回收(表2)并且它们显示与也通过UPLC/MS测量的它们的相应非氘化基准物相比相似的回收率。结果指示在碱性条件下在氢气中氘没有被交换。
表2:接受碱解的氘化内标准品的回收率。
为了确定一些内标准品的不佳回收率是否是因为氘标记的丢失或分子结构的破坏所引起，我们扩展了我们的稳定性测试并且检验了所有148个基本类二十烷酸标准品，我们一般使用这148个基本类二十烷酸标准品用于分析它们对碱诱导降解的耐受性。如图2和表3中所示，许多类二十烷酸对碱诱导降解易感，如它们的质谱强度变化所例证。特别地，所有前列腺素和白三烯完全被破坏。相似地，许多含有环氧或酮基的类二十烷酸经历降解成各种程度。有趣的是，在暴露于皂化条件后，与它们暴露于强碱之前的原始峰相比一些代谢物(包括16-HETE、17-HETE、18-HETE、19-HETE、20-HETE)的信号强度增加(图2)。这可能是碱诱导的代谢物转化和自氧化的结果。
分析精度(RSD,％)在皂化或不皂化的条件下所有173个标准品(148个代谢物和25个氘化内标准品)的三个独立分析批中确定，并且证明该测定是可高度重复的。通常，对于大多数代谢物，RSD小于10％(表3)。
对于在分析生物样品(包括人血浆)中的酯化类二十烷酸的应用，汇集一组类二十烷酸，它们耐受碱诱导的降解或仅受到很小的但可再现的破坏。为了实用目的，使用60％的截止点和小于10％的RSD来集合成满足这些标准的类二十烷酸列表(表2)。
NAFL vs NASH血浆中的氧化PUFA。然后将此规程应用于对人血浆的分析。之前研究已经针对了脂质萃取。那些研究在分析前使用碱解来释放脂肪酸，但没有报道测试强碱对类二十烷酸稳定性的作用。考虑到表3中概括的限制条件并且使用算法来鉴定表2中总结的稳定代谢物，鉴定并定量了许多类二十烷酸，这些类二十烷酸存在于对照、NAFL和NASH患者的血浆中，并且显示在图3至图7中。NAFL和NASH组之间的差异采用学生t-检验来评估。对于NAFL/NASH观察到统计学显著差异(p<0.05)，并且显示在图5和7中。
衍生自AA的代谢物展示在图3中并且显示在NAFL和NASH中水平稍稍增加，但在此研究中这些增加并没有达到显著性。相似地，9,10-EpOME、9,10-二HOME、13-HODE和9-氧代ODE、衍生自亚油酸(LA)的所有代谢物显示与对照相比在NAFL和NASH中的逐步增加(图4)。在临床上，重要的是能够区分NAFL与NASH，并且这些代谢物中的数个(包括13-HODE和9-氧代ODE)与NASH相比在来自NAFL的血浆中以较高的水平存在。另外，衍生自DGLA的几种代谢物(包括8-HETrE和15-HETrE)在NASH中也显著增加，而在对照和NAFL之间没有发现差异(图5)。有趣的是，两种ω-3脂肪酸DHA及其抗炎代谢物17-HDoHE的血浆水平在NASH中显著增加(图7)。
在初期的UPLC/MS/MS方法开发期间，比较了样品萃取溶液中不同浓度的KOH(0.33-1.31M)和BHT(0-10mM)。基于代谢物的峰形和分辨率的质量，确认液体萃取溶液中约0.66M KOH(例如，约0.62-0.70M KOH)和约2.5mM BHT(例如，约2.0-3.0mM BHT)产生了最佳结果。较高的碱浓度导致太多的类二十烷酸降解，而较低则使得酯化的氧化复合脂质的水解不充分。在一个实施方案中，KOH的量为0.66M。太高的BHT浓度产生结晶。在另一个实施方案中，BHT的量为2.5mM。在该过程期间和SPE柱之前，萃取物用H2O稀释以避免SPE萃取期间太高的盐浓度。
通常，在碱解条件下内标准品被降解至一定的程度。特别地，极性类二十烷酸(LTB4、LTC4、LTE4、PGE2、PGD2、PGJ2、6k PGF1a、dhk PGF2a、15d PGJ2)证明对降解特别易感。不像脂肪酸，大多数天然存在的前列腺素对水解、脱水或异构化具有相当大的潜力，取决于它们的直接环境。前列腺素含有多个羟基、酮基和刚性的5元前列烷环。得到的β-羟基酮体系是不稳定的并且在酸性或碱性条件下容易经历脱水成为A-型前列腺素，即含有环戊烯酮环的那些诸如前列腺素A2。在碱性条件下，A型前列腺素可以进一步异构化成B型前列腺素诸如前列腺素B。在强碱溶液中，PGB2的形成非常快(利用处于9:1甲醇-水中的0.5MKOH，在几秒内)。通过用0.1M碱处理，缺少5,6-双键的PGE可以快速地转变成基本上无活性的PGB，而在本研究中没有观察到PGB的形成。
对于氘化的内标准品，碱解后的回收率变化非常大，一些代谢物大量降解，而其他的则完全回收(表1)。通常，未氘化的基准物的回收率与氘化的内标准品的回收率相匹配(表2和表3)。这些结果指示暴露于碱性条件后氘化标准品的回收率降低不是因由于与氢的交换反应所导致的氘损失所引起的，而主要是分子结构的重排或降解的结果。与此假设一致，本研究显示碱性条件实际上升高几种代谢物的水平。例如，AA的羟基化代谢物包括16-HETE、17-HETE、18-HETE、19-HETE和20-HETE增加(表3)。这些代谢物可以经由CYP途径酶促生成或以非酶促方式作为氧化的结果生成。本公开证明被用来水解样品中的酯化氧化脂肪酸的皂化过程可以诱导氘化和未氘化类二十烷酸的一些降解或异构化。相反，类二十烷酸的脂肪酸前体和相关的氧化PUFA在碱性条件下稳定得多。
表3.接受碱解的基准物的回收率1。
1ND意指无法检测到的，指示具有小于3:1的信噪比(S/N)的峰。RSD是相对标准误。
来自NAFLD样品的主要发现涉及将具体的脂肪酸氧化产物鉴定为用于区分NASH与NAFL的潜在的新的全身性的无创标志物。评价来自患有NAFLD的患者和健康个体的血浆中来自酶和自由基途径的LA、AA、DGLA、EPA和DHA衍生物的浓度。大多数文献宣称氧化应激是引起疾病进展和NAFLD的核心异常；然而，体内促成氧化损害的途径尚未阐明。
与对照相比在NAFL和NASH受试者中PUFA产物中的许多升高很多(图3-图7)。在与甘油三酯升高相关的过氧化期间在肝脏中在被细胞脂氧合酶催化的反应中来源于LA转化的脂质过氧化产物诸如HODE和来源于AA的转化的HETE增加。与NASH患者和对照受试者相比，在NAFL患者中促炎的类二十烷酸包括5-HETE、8-HETE、11-HETE、15-HETE、13-HODE和9-氧代ODE的血浆浓度升高得很多(图3,图4)。NASH的降低指示一些类二十烷酸降解成其他物质。Feldstein等人表征了从脂肪肝至脂肪性肝炎的HODE和氧代ODE的增加(J.Lipid Res.,51:3046-3054,2010)。使用限定为回收率>60％的算法，这些代谢物不满足回收率的标准(表4和表3)，并且因此被排除进行进一步分析。使用优化的皂化步骤以及应用代谢物纳入/排除算法的方式获得了对代谢物，特别是8-HETrE和15-HETrE的鉴定，与NAFL相比，在NASH中8-HETrE和15-HETrE显著升高(p<0.001)。使用来自同一患者和对照池的血浆，与NAFL和对照相比，在疾病的NASH阶段游离15-HETrE和总15-HETrE两者显著升高。如图5中所见，8-HETrE遵循同样的趋势。
有趣的是，与NAFL和对照相比，在NASH中ω-3脂肪酸DHA(p<0.001)及其代谢物17-HDoHE(p<0.0001)显著升高(图7)。对后一代谢物特别感兴趣，因为其是保护素(protectin)的前体，保护素是一组具有抗炎特性的脂质介质。
表4.在碱解后以≥60％回收的基准物。
本领域技术人员能够预期如在上面的说明性实施例所提出的本发明中的大量改动和变化形式。因此，仅应当对本发明施加如在附带权利要求中出现的限制。

Claims (24)

1.一种区分受试者中非酒精性脂肪肝炎(NASH)与非酒精性脂肪肝(NAFL)的方法，包括：
(a)从所述受试者获得生物样品；
(b)用碱性溶液处理所述样品以释放酯化的类二十烷酸并且回收所述类二十烷酸；以及
(c)比较获自所述受试者的生物样品中的至少一种酯化的类二十烷酸与获自NAFL受试者的对照样品中的至少一种酯化的类二十烷酸的水平，其中与所述对照相比获自所述受试者的样品中的所述至少一种类二十烷酸的水平有差异指示有NASH。
2.权利要求1所述的方法，其中获自(b)的所述类二十烷酸是以大于60％的回收率回收的类二十烷酸。
3.权利要求1或2所述的方法，其中所述类二十烷酸选自由8-HETrE和15-HETrE组成的组。
4.权利要求1所述的方法，其中所述生物样品选自由血液、血浆和血清组成的组。
5.权利要求1所述的方法，进一步包括在碱处理之前添加丁羟甲苯(BHT)。
6.权利要求1所述的方法，其中所述碱溶液是氢氧化钾(KOH)水溶液。
7.权利要求6所述的方法，其中使用约0.6-0.7M KOH。
8.权利要求5所述的方法，其中使用约2.5mM BHT。
9.权利要求3所述的方法，其中与所述对照相比，获自所述受试者的所述样品中的所述至少一种类二十烷酸的水平升高指示有NASH。
10.权利要求1所述的方法，进一步包括测量所述样品中ω-3脂肪酸DHA和/或17-HDoHE的水平，其中与对照相比升高指示有NASH。
11.权利要求1所述的方法，其中所述类二十烷酸通过液相色谱法测量。
12.权利要求10所述的方法，其中脂肪酸通过气相色谱质谱法测量。
13.一种区分受试者中非酒精性脂肪肝炎(NASH)与非酒精性脂肪肝(NAFL)的方法，包括：
a)从所述受试者获得生物样品；
b)用碱性溶液处理所述样品；以及
c)从经处理的所述样品回收类二十烷酸和脂肪酸；以及
d)比较获自所述受试者的生物样品的至少一种生物标志物的水平与具有已知NAFL的对照样品中的至少一种生物标志物的水平，其中与所述对照相比获自所述受试者的样品中所述至少一种生物标志物的水平升高指示有NASH，并且进一步其中所述生物标志物选自由下列各项组成的组：8-HETrE、15-HETrE、DHA、17-HDoHE及其任意组合。
14.权利要求13所述的方法，其中所述类二十烷酸以大于60％的回收率回收。
15.权利要求13所述的方法，其中所述至少一种生物标志物包括8-HETrE和15-HETrE。
16.权利要求13所述的方法，其中所述生物样品选自由血液、血浆和血清组成的组。
17.权利要求31所述的方法，进一步包括在碱处理前添加丁羟甲苯(BHT)。
18.权利要求13所述的方法，其中所述碱性溶液是氢氧化钾(KOH)水溶液。
19.权利要求18所述的方法，其中使用约0.6-0.7M KOH。
20.权利要求17所述的方法，其中使用约2.5mM BHT。
21.权利要求15所述的方法，进一步包括测量所述样品中ω-3脂肪酸DHA和/或17-HDoHE的水平，其中与对照相比升高指示有NASH。
22.权利要求13所述的方法，其中所述类二十烷酸通过液相色谱法测量。
23.权利要求13所述的方法，其中所述样品中的脂肪酸通过气相色谱质谱法测量。
24.权利要求13所述的方法，进一步包括测量促炎类二十烷酸的水平，所述促炎的类二十烷酸选自由下列各项组成的组：5-HETE、8-HETE、11-HETE、15-HETE、13-HODE、9-氧代ODE及其任意组合，其中前述任一项的水平低于NAFL对照就指示有NASH。
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