JP6653884B2 - 分子インプリントポリマーの製造方法、分子インプリントポリマー、および標的タンパク質の検出方法 - Google Patents
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- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
- Addition Polymer Or Copolymer, Post-Treatments, Or Chemical Modifications (AREA)
Description
上記標的タンパク質を構成する分子の反応性基(1)を介して、末端にビニルモノマー基を有し且つ末端以外の部分に切断性基(1)を有する機能性モノマー(I)を複数結合させる工程(ここで、上記切断性基(1)は、ジスルフィド結合基、イミノ結合基、ボロン酸cisジオールエステル基、またはカルボン酸エステル基を示す);
上記標的タンパク質を構成する分子の反応性基(2)を介して、末端にビニルモノマー基を有し且つ末端以外の部分に切断性基(2)を有する機能性モノマー(II)を複数結合させる工程(ここで、上記切断性基(2)は、ジスルフィド結合基、イミノ結合基、ボロン酸cisジオールエステル基、またはカルボン酸エステル基であって、上記切断性基(1)とは異なる基を示す);
基材上に自己組織化単分子膜を形成する工程;
上記自己組織化単分子膜の表面へ、上記標的タンパク質を結合させる工程;
ビニルモノマーを添加し、上記機能性モノマー(I)および上記機能性モノマー(II)のビニルモノマー基と共重合させる工程;
少なくとも上記切断性基(1)および切断性基(2)を切断することにより、上記標的タンパク質を除去する工程;
上記切断性基(1)を切断することにより生成する基に、上記反応性基(1)と相互作用するポストインプリンティング化合物を複数結合させるか、または、上記切断性基(2)を切断することにより生成する基に、上記反応性基(2)と相互作用するポストインプリンティング化合物を複数結合させる工程;および、
上記切断性基(1)を切断することにより生成する基または上記切断性基(2)を切断することにより生成する基であって、上記ポストインプリンティング化合物を結合させなかった基に、蛍光レポーター化合物を複数結合させる工程を含むことを特徴とする方法。
蛍光レポーター化合物が特異的認識空間内に複数導入されていることを特徴とする分子インプリントポリマー。
上記ベース基板、金属層および消光抑制層の表面には複数の凹部からなる周期構造が形成されており、
上記周期構造上に、上記[3]に記載の分子インプリントポリマーが形成されていることを特徴とするプラズモニックチップ。
上記[3]に記載の分子インプリントポリマー、または上記[4]もしくは[5]に記載のプラズモニックチップの分子インプリントポリマーと、上記試料を接触させる工程、および、
上記分子インプリントポリマーと上記試料との接触による蛍光強度の変化を測定する工程を含むことを特徴とする方法。
(1−1) 標的タンパク質への機能性モノマー(I)の結合工程
本発明では、ジスルフィド基など選択的な切断が可能な切断性基を介して標的タンパク質にビニルモノマー基を導入したり、鋳型化合物である標的タンパク質を基材上に形成した自己組織化単分子膜に結合させる。本工程では、標的タンパク質を構成する分子の反応性基(1)を介して、末端にビニルモノマー基を有し且つ末端以外の部分に切断性基(1)を有する機能性モノマー(I)を複数結合させる。
W1−X1−Y1−Z1−Q1・・・ (I)
本工程では、標的タンパク質を構成する分子の反応性基(2)を介して、末端にビニルモノマー基を有し且つ末端以外の部分に切断性基(2)を有する機能性モノマー(II)を複数結合させる。
W2−X2−Y2−Z2−Q2・・・ (II)
[式中、W2、X2、Y2およびZ2は、それぞれW1、X1、Y1およびZ1と同義を示すが、Y2は、ジスルフィド結合基、イミノ結合基、ボロン酸cisジオールエステル基、またはカルボン酸エステル基であって、切断性基(1)とは異なる基を示し、Q2は、反応性基(2)、または反応性基(2)と反応させたリンカー基導入試薬中の反応性基と反応して共有結合を形成するための反応性基を示す。]
本工程では、基材上に自己組織化単分子膜(SAM:Self−Assembled Monolayer)を形成する。SAMは、基材へ化学結合していると共に、基材上に分子が分子間力により密に且つ規則的に整列していることから、安定で均一である。
M形成分子を洗浄により除去した後、乾燥すればよい。
本工程では、上記工程1−3で基材上に形成されたSAMの末端の反応性基を利用して、標的タンパク質をSAMの表面に結合させる。
本工程では、標的タンパク質が結合したSAMが形成された基材にビニルモノマーを添加し、鋳型化合物である標的タンパク質に結合させた機能性モノマー(I)および機能性モノマー(II)中のビニルモノマー基と共重合させることにより、標的タンパク質を含むポリマーを形成する。
本工程では、少なくとも、鋳型化合物である標的タンパク質とポリマーを結合している切断性基(1)および切断性基(2)を切断することにより、標的タンパク質を除去する。その結果、ポリマー中には、除去された標的タンパク質に特異的な認識空間が形成される。標的タンパク質を構成する分子の反応性基(3)と切断性基(3)を介して標的タンパク質をSAMの表面に結合させた場合には、SAMから標的タンパク質を除去するために当該切断性基(3)も切断する。分子−分子間の特異的相互作用を利用して標的タンパク質をSAMの表面に結合させた場合には、切断性基(1)と切断性基(2)の切断に加え、当該分子−分子間相互作用が解消されるよう、高濃度塩溶液や高pHまたは低pHの緩衝液を作用させればよい。
形成された分子インプリントポリマー(MIP)が得られる。当該特異的認識空間内には、少なくとも切断性基(1)と切断性基(2)の切断により生じた官能基が存在する。切断性基(1)と切断性基(2)は異なるので、特異的認識空間内には少なくとも2種の官能基が存在する。
本工程では、上記1−6工程により生成する特異的認識空間内の2種の官能基の一方に、標的タンパク質の反応性基と相互作用するポストインプリンティング化合物を複数結合させる。即ち、切断性基(1)を切断することにより生成する官能基に、反応性基(1)と相互作用するポストインプリンティング化合物を複数結合させるか、または、切断性基(2)を切断することにより生成する基に、反応性基(2)と相互作用するポストインプリンティング化合物を複数結合させる。特異的認識空間内に結合したポストインプリンティング化合物は、標的タンパク質が特異的認識空間内に挿入された場合、当該標的タンパク質の反応性基(1)または反応性基(2)と相互作用する。その結果、特異的認識空間の標的タンパク質に対する親和性や選択性が向上する。また、標的タンパク質とSAMを結合している切断性基(3)を切断することにより生成する官能基に、反応性基(3)と相互作用するポストインプリンティング化合物を結合させてもよい。
本工程では、上記工程1−7においてポストインプリンティング化合物を結合させなかった上記切断性基(1)を切断することにより生成する官能基または上記切断性基(2)を切断することにより生成する官能基に、蛍光レポーター化合物を複数結合させる。これら官能基は特異的認識空間の内部に存在するため、蛍光レポーター化合物も特異的認識空間の内部に結合することになる。蛍光レポーター化合物が特異的認識空間の内部に複数存在する場合、標的タンパク質の挿入の有無により蛍光強度が変化するので、試料中における標的タンパク質の有無やその濃度を容易に測定することが可能になり、標的タンパク質に対する検出感度は顕著に向上する。
以上で説明した本発明方法により製造される本発明に係る分子インプリントポリマーは、標的タンパク質に対する特異的認識空間を有し、また上記工程1−7における説明のとおり、特異的認識空間に挿入される標的タンパク質を構成する分子の反応性基と相互作用するポストインプリンティング化合物が特異的認識空間内に複数存在している。その結果、標的タンパク質に対する選択性と親和性が向上している。
以下、本発明に係る分子インプリントポリマーを用いた試料中における標的タンパク質の検出方法につき説明する。
本発明に係る分子インプリントポリマーをプラズモニックチップの周期構造上に形成した場合には、標的タンパク質の検出感度がより一層向上し得る。プラズモニックチップとは、表面に波長オーダーの周期構造が形成された金属層を含み、入射光をチップ界面に結合させて増強電場として局在化させることができ、チップに結合した蛍光レポーター化合物などの蛍光を増強させることにより、標的タンパク質などの高検出感度を実現するものである。
(1) N−Boc−エチレンジアミン(化合物1)の合成
収量:771.2mg,収率:90.9%
1H-NMR(300Hz,CDCl3)δ=4.86(br,1H,C(=O)-NH),3.20-3.14(q,2H,NHCH2CH2),2.82-2.78(t,2H,CH2NH2),1.45(s,9H,C(CH3) 3)
収量:1.627g,収率:77.3%
1H-NMR(300Hz,CDCl3)δ=6.68(br,1H,CH2=C(CH3)-C(=O)-NH),5.76,5.33(s,2H,H2C=C(CH3)),4.90(br,1H,NH-Boc),3.44-3.32(m,4H,NHCH2CH2NH),1.97(s,3H,CH2=C(CH3)),1.44(s,9H,C(CH3)3)
収量:1.146g,収率:98.0%
1H-NMR(300Hz,D2O)δ=5.54,5.29(s,2H,H2C=C(CH3)),3.44(t,2H,C(=O)-NHCH2),3.20(t,2H,CH2NH2),2.82,2.76(t,4H,CH2SSCH2),1.76(s,3H,CH3)
収量:1.023g(5.35mmol),収率:81.0%
1H-NMR(300Hz,CDCl3)δ=7.74(s,1H,O-NH-Boc),4.50(s,2H,O-CH2),1.51(s,9H,(CH3)3)
収量:281mg(0.93mmol),収率:23.3%
1H-NMR(300Hz,CDCl3)δ=8.321(s,1H,CH2NHC=O),7.90(s,1H,O-NH-Boc),6.86(s,1H,CH2=C(CH3)C(=O)NH),5.79-5.35(s,2H,CH2=C(CH3)),4.34(s,2H,O-CH2),3.51(s,4H,NHCH2CH2NH),1.98(s,3H,CH2=C(CH3)),1.48(s,9H,(CH3)3)
収量:216.9mg(0.91mmol),収率:98.1%
1H-NMR(300Hz,D2O)δ=5.50-5.27(s,2H,CH2=C(CH3)),4.36(s,2H,O-CH2),3.26(s,4H,NHCH2CH2NH),1.73(s,3H,CH2=C(CH3))
収量:336mg(1.1mmol),収率:55.0%
1H-NMR(300Hz,DMSO-d6)δ=8.43-7.22(4H,pyridyl),5.95-4.07(5H,OH,CHO),4.02-3.20(6H,glucose)
1H-NMR(300Hz,D2O)δ=8.26-7.13(4H,pyridyl),5.31-5.29,4.08-3.64,3.16-2.96(6H,glucose)
MALDI-TOF-MS(matrix:DHB):m/z=306.16[M+H+],328.16[M+Na+],633.31[2M+Na+]
収量:364.7mg(0.746mmol),収率:86.0%
1H-NMR(300Hz,CD3OD)δ=8.43-7.25(4H,pyridyl),7.60(m,1H,ON=CH-),5.70-5.36(s,2H,CH2C(CH3)-),4.47(s,2H,C(=O)CH2ON),6.82,5.06,4.34-3.80,3.20(m,6H,glucose),3.30(s,4H,NHCH2CH2NH),1.92(s,3H,CH2C(CH3)C(=O))
MALDI-TOF-MS(matrix:DHB)m/z=511.67(M+Na+)
(1) ヒドロキシエチル ピリジル ジスルフィド(化合物7)の合成
収量:617.9mg(3.3mmol),収率:75%
1H-NMR(300Hz,CDCl3)δ=8.52(d,1H,pyridyl),7.61(t,1H,pyridyl),7.41(d,1H,pyridyl),7.16(t,1H,pyridyl),3.81(t,2H,-CH2-),2.96(t,2H,-CH2-)
収量:553.8mg(2.17mmol),収率:65.8%
1H-NMR(300Hz,CDCl3)δ=8.48(d,1H,pyridinyl),7.69(m,2H,pyridinyl),7.10(m,1H,pyridinyl),6.13(s,1H,vinyl),5.59(s,1H,vinyl),4.40(t,2H,-CH2-),3.09(t,2H,-CH2-),1.96(s,3H,methyl)
収量:296.6mg(1.19mmol),収率:54.7%
1H-NMR(300Hz,CDCl3)δ=6.14(s,1H,vinyl),5.59(s,1H,vinyl),4.41(t,2H,-CH2-),2.97(m,4H,-CH2-CH2-),2.79(t,2H,-CH2-),1.95(s,3H,methyl)
収量:93.1mg(0.21mmol),収率:41.5%
1H-NMR(300Hz,DMSO-d6)δ=6.05(s,1H,vinyl),5.70(s,1H,vinyl),4.34(t,2H,-CH2-),3.94(d,1H,-CH-),3.12-2.98(m,8H,-CH2- etc. ),1.88(s,3H,methyl)
(1) 3−ピリジルジチオプロピオン酸(P1)の合成
収量:233.2mg(1.08mmol),収率:90%
1H-NMR(300Hz,CDCl3)δ=8.47(d,1H,pyridyl),7.67(m,2H,pyridyl),7.18(m,1H,pyridyl),3.08(t,2H,-CH2-),2.79(t,2H,-CH2-)
収量:301mg(2.74mmol),収率:54.7%
1H-NMR(300Hz,D2O)δ=8.40(d,1H,pyridinyl),7.99(t,1H,pyridinyl),7.84(d,1H,pyridinyl),7.41(t,1H,pyridinyl),3.22(t,2H,-CH2-),2.97(t,2H,-CH2-)
(1) AFPへのチオール基の導入
ランニングバッファー: 10mMリン酸バッファー(pH7.4)
FM2修飾AFP溶液濃度: 10μg/mL(濃縮したFM2修飾AFP溶液を10mMリン酸バッファーで希釈)
流速: 5μL/min
接触時間: 5分間
インジェクションボリューム: 25μL
設定温度: 25℃
ランニングバッファー: 10mMリン酸バッファー(pH7.4)
還元剤溶液: 20mM TCEP水溶液
流速: 20μL/min
接触時間: 10分間
インジェクションボリューム: 200μL
設定温度: 25℃
上記実施例4で製造された分子インプリント膜のAFPに対する選択性を確認するために、以下の条件でSPR測定を行った。また、対照タンパク質としてヒト血清アルブミン(HSA)についても同様に測定を行った。なお、HSAの分子質量は66.5kDa、等電点(PI)は4.7であり、AFPとのアミノ酸配列同一性は66%である。
(i) ランニングバッファー(10mMリン酸バッファー(pH7.4))でベースラインを安定化
(ii) タンパク質溶液をインジェクション(5分間)
(iii) ランニングバッファーをインジェクション(5分間)
(iv) 以下、上記(ii)と(iii)を繰り返し
測定条件
ランニングバッファー: 10mMリン酸バッファー(pH7.4)
流速: 20μL/min
接触時間: 5分間
インジェクションボリューム: 100μL
タンパク質濃度: 10,20,50,100,150,200ng/mL
(in 10mMリン酸バッファー(pH7.4))
設定温度: 25℃
(1) QCM−D金基板表面への重合官能基およびタンパク質固定化用基修飾
水晶振動子センサーを用いたQCM−D(Quartz Crystal Microbalance with Dissipation monitoring system)法のため、QCM−D金基板上へAFPインプリントポリマーを作製した。
以下の測定手法・条件により、QCM−Dオープンモジュールを用いて基板上へFM2修飾AFPを固定化し、その進行状況をモニタリングした。
設定温度: 25℃
オーバートーン次数: 9
(i) 10mMリン酸バッファー(pH7.4)200μLをセルに滴下し、ベースラインを安定化
(ii) 濃縮したFM2修飾AFP溶液を、そのセル内濃度が10μg/mLになるようにセルに10μL添加
(iii) シグナルが安定したところでセル上の溶液を吸引し、直ちに10mMリン酸バッファー(pH7.4)200μLをセルに滴下する操作を3回繰り返し、セル上の余分なFM2修飾AFPを除去
上記表2に示した組成のプレポリマー溶液を用いて、SI−ATRPによりポリマー合成を行った。詳しい実験操作を以下に示す。重合時間は1時間、温度は40℃で行った。また、架橋剤比率は10%とした。
ランニングバッファー: 10mMリン酸バッファー(pH7.4)
還元剤溶液: 20mM TCEP水溶液
流速: 25μL/min
インジェクションボリューム: 2.25mL
設定温度: 25℃
オーバートーン次数:9
鋳型分子除去後、ピリジルジスルフィド誘導体を用いたジスルフィド交換反応により、AFPとの相互作用部位としてカルボキシ基を導入した。反応は、5mM 3−ピリジルジチオプロピオン酸水溶液に基板を25℃で24時間浸漬することで行った。反応後、基板を純水で洗浄し、10mMリン酸バッファー(pH7.4)中、4℃で保存した。
相互作用部位導入後の基板を1mM Cy5−NHSエステルのDMSO溶液に25℃で12時間浸漬し、アルコキシアミン基とのカップリングにより蛍光レポーター化合物であるCy5をAFP認識空間に導入した。
上記実施例5で製造された分子インプリント膜のAFP結合能について、QCM−Dフローモジュールを用いて、以下の測定手法・条件によりAFP再結合実験を行った。
(i) ランニングバッファー(10mMリン酸バッファー(pH7.4))でベースラインを安定化
(ii) タンパク質溶液をインジェクション(5分間)
(iii) ランニングバッファーをインジェクション(5分間)
(iv) 以下、上記(ii)と(iii)を繰り返し
ランニングバッファー: 10mMリン酸バッファー(pH7.4)
流速: 25μL/min
接触時間: 5分間
インジェクションボリューム: 125μL
設定温度: 25℃
オーバートーン次数:9
タンパク質濃度:0.1,0.2,0.5,1.0,2.0,5.0,10μg/mL
(in 10mMリン酸バッファー(pH7.4))
QCM−Dウィンドウモジュールに、上記実施例5で得たMIP膜形成基板を設置し、以下の条件下、蛍光顕微鏡によってAFPの吸着に伴う基板の蛍光変化を観察した。また、対照タンパク質としてヒト血清アルブミン(HSA)についても同様に測定を行った。さらに、リン酸バッファーの代わりに100希釈血清を用い、同様に実験を行った。
ランニングバッファー: 10mMリン酸バッファー(pH7.4)
流速: 25μL/min
接触時間: 5分間
インジェクションボリューム: 125μL
タンパク質濃度: 10,20,50,100,150,200ng/mL
(in 10mMリン酸バッファー(pH7.4))
(i) QCM−Dウィンドウモジュールに基板を設置し、ランニングバッファーをインジェクションし、初期蛍光(I0)を測定
(ii) AFP溶液を5分間インジェクション
(iii) ランニングバッファーを5分間インジェクションしてリンスした後、蛍光を測定
対物レンズ: 倍率10×,N.A.0.30
蛍光フィルター: Exciter:600〜650nm,Emitter:675〜725nm
露光時間: 0.1sec
(i) 測定開始前のバッファーで満たされた状態下、金基板上で5つエリアを選択し、そのエリアの平均蛍光強度の平均値をIin(t=0)、基板上の金ではない淵の部分で5つエリアを選択し、そのエリアの平均蛍光強度の平均値をIout(t=0)として得た
(ii) 各タンパク質溶液をインジェクションし、バッファーでリンスした後の金基板上で5つエリアを選択しそのエリアの平均蛍光強度の平均値をIin(t)、基板上の金ではない淵の部分で5つエリアを選択しそのエリアの平均蛍光強度の平均値をIout(t)として得た
(iii) 測定毎のずれを補正するために、以下の式に従って測定毎の平均蛍光強度を算出した
Ireal(t)=[Iin(t)/Iout(t)]×Iout(t=0)
(iv) 以下の式から相対蛍光強度変化を算出する。
[Ireal(t)−Ireal(t=0)]/Ireal(t=0)
AFPに導入されたチオール基はUV−vis測定から5つであることが分かっている。このうち1つが基板上への複合体の固定化に使用されているため、Cy5導入点は4箇所である。そこで、上記実施例5(4)において、Cy5−NHSエステルのDMSO溶液の代わりに、Cy5−NHSエステル:Ac−NHSエステル=1:3,2:2,4:0の混合DMSO溶液を用い、QCM−D金基板上に、AFP特異的認識空間内に蛍光レポーター化合物Cy5が導入されたAFPインプリントポリマーを形成した。溶液中におけるCy5−NHSエステルとAc−NHSエステルの濃度は、合計で1mMとなるようにした。
測定試料として、AFPのみを含む水溶液の他、不純物を含む試料として100倍希釈血清にAFPを溶解した溶液と、AFPに加えて1mg/mLのウシ血清アルブミン(BSA)を含む溶液についても、上記実施例7と同様に蛍光強度変化を算出した。結果を図7に示す。
本発明に係るMIP膜のAFPに対する選択性を確認するために、前立腺特異抗原(PSA)溶液についても上記実施例7と同様に蛍光強度変化を算出した。結果を図8に示す。
(1) 機能性モノマーとしてのアクリル酸ピロリジルの合成
収量:577.6mg(2.39mmol), 収率:79.8%
収量:389.1mg(2.19mmol), 収率:91.7%
収量:233.2mg(1.08mmol), 収率:90%
収量:301mg(2.74mmol), 収率:54.7%
無リン酸洗浄剤(「decon(登録商標)」ARBROWN社製)の5vol%溶液、純水、純水、エタノールを順に用いて、ガラス基板をそれぞれ10分間ずつ超音波洗浄した。超音波洗浄後、エタノールでリンスし、ドライヤーで乾燥させた。純水:エタノール:1mol/L酢酸=50:25:25(容量基準)の混合溶液に3−メタクリロイルプロピルトリメトキシシランを溶解した1vol%溶液に、超音波洗浄したガラス基板を浸漬させ、40℃で1時間反応させた。メタクリロイル化ガラス基板をエタノールでリンスし、ドライヤーで乾燥させた。
モールド1で周期構造を形成し、チタンと金をスパッタしたプラズモニックチップ(以下、「Ti/Auプラズモニックチップ」という)をDMFと純水で洗浄後、20分間UV−O3処理した。次に、シリコンシートを貼り付け、2.5mMビス[2−(2−ブロモイソブチリルオキシ)ウンデシル]ジスルフィドと5mM 11−アミノ−1−ウンデカンチオール塩酸塩の混合DMF溶液(SAMのモル比:Br/NH2=1/1)(100μL)を滴下し、25℃、24時間反応させることでMixed SAMを作製した。反応後、DMFと純水で洗浄し、N2ガスによって乾燥させた。
参考例3で作製したHSA−MIPプラズモニックチップに、0nM,50nM,100nM,200nM,400nMまたは800nMのCy5ラベル化HSA溶液(10mMリン酸緩衝液,pH7.4)を50μL滴下し、10分間反応させた。Cy5ラベル化HSAについては、Cy5ラベル化キットを用い、定法により作製した。反応後、10mMリン酸緩衝液(pH7.4,100μL)で3回リンスした。次いで、以下の条件下、蛍光顕微鏡で測定し、プラズモニックチップの周期構造による蛍光増強効果について評価した。
カメラ: U−HGLGPS(Olympus社製)
対物レンズ: ×10
露光時間 0.5秒
Cy5用蛍光フィルター: Exciter:608〜648nm,Emitter:672〜712nm
(1) Cy3.5導入HSA−MIPでのHSA蛍光検出
蛍光分子としてCy3.5を導入したHSA−MIPと、濃度3.125nM,6.25nM,12.5nM,25nMまたは50nMのHSAの10mMリン酸緩衝液溶液(pH7.4,50μL)溶液をそれぞれ20分間反応させた後、10mMリン酸緩衝液(pH7.4)でリンスし、下記条件下、蛍光顕微鏡で測定した。
カメラ: U−HGLGPS(Olympus社製)
対物レンズ: ×10
露光時間: 0.1秒
Cy3用蛍光フィルター: Exciter:511〜551nm,Emitter:573〜613nm
蛍光分子としてCy5を導入したHSA−MIPと、濃度3.125nM,6.25nM,12.5nM,25nMまたは50nMのHSAの10mMリン酸緩衝液溶液(pH7.4,50μL)溶液をそれぞれ20分間反応させた後、10mMリン酸緩衝液(pH7.4)でリンスし、下記条件下、蛍光顕微鏡で測定した。
カメラ: U−HGLGPS(Olympus社製)
対物レンズ: ×10
露光時間: 0.1秒
Cy5用蛍光フィルター: Exciter:608〜648nm,Emitter:672〜712nm
蛍光分子としてCy3.5とCy5を導入したHSA−MIPと、濃度3.125nM,6.25nM,12.5nM,25nMまたは50 nMのHSAの10mMリン酸緩衝液溶液(pH7.4,50μL)をそれぞれ20分間反応させた後、10mMリン酸緩衝液(pH7.4)でリンスし、下記条件下、蛍光顕微鏡で測定した。
カメラ: U−HGLGPS(Olympus社製)
対物レンズ: ×10
露光時間: 0.1秒
Cy3用蛍光フィルター: Exciter:511〜551nm,Emitter:573〜613nm
Cy3−Cy5用蛍光フィルター: Exciter:511〜551nm,Emitter:672〜712nm
(1) 機能性モノマーの合成
二炭酸 ジ−tert−ブチル(2.0g,9.08mmol)をジクロロメタン(20mL)に溶解させ、エチレンジアミン(7.0mL,100mmol)をジクロロメタン(50mL)に溶解させた溶液に、氷冷下で攪拌しながら1時間かけて滴下し、室温で一晩攪拌した。TLCにて二炭酸 ジ−tert−ブチルのスポット(Rf=0.8,展開溶媒:ジクロロメタン,アニスアルデヒドで発色)の消失および生成物のスポット(Rf=0.3,展開溶媒:メタノール,ニンヒドリンで発色)を確認し、反応終了とした。反応溶液を減圧留去し、残渣に水を加えてジ−Boc−エチレンジアミンを析出させメンブレンフィルター(孔径:0.22μm)を用いて濾別した。炭酸ナトリウムを用いて溶液を塩基性にした後、ジクロロメタンで抽出した。有機層を飽和炭酸ナトリウム水溶液で洗浄した。TLCのスポットは1つ(Rf=0.3,展開溶媒:メタノール,ニンヒドリンで発色)になった。溶媒を減圧留去し、真空乾燥を行うことで無色のオイル状の生成物を得た。1H−NMRにて目的物であることを確認した。
収量:882mg, 収率:60.5%
メタクリル酸(556μL,6.6mmol)、EDC・HCl(1371mg,7.15mmol)およびDIEA(1240μL,7.15mmol)をジクロロメタン(5mL)に溶解した。N−Boc−エチレンジアミン(882mg)をジクロロメタン(5mL)に溶解した溶液を、氷冷および窒素雰囲気下で加え、2時間攪拌したのち室温で一晩攪拌した。目的物のスポット(Rf=0.62,展開溶媒:メタノール,ニンヒドリン発色とUVを使用)を確認して反応を終了とした。反応溶液を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、クエン酸水溶液、および飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄した。このときTLCのスポットは2つ(Rf=0.62と0.25,展開溶媒:メタノール,ニンヒドリン発色とUVを使用)であった。溶液を減圧留去し、シリカゲルカラムクロマトグラフィ−(オートカラム,溶離液:酢酸エチル/ジクロロメタン=1/1⇒1/0)にて精製を行い、白色固体状の目的物を得た。1H−NMRにより目的物であることを確認した。
収量:938mg, 収率:74.9%
2−メタクリロイルアミノエチルカルバミン酸 tert−ブチルエステル(938mg,4.12mmol)をジクロロメタンに溶解し、氷冷下で攪拌しながら4.0M HCl/ジオキサン(4eq,4.13mL,16.52mmol)を加え、室温で一晩攪拌した。目的物のスポット(Rf=0,展開溶媒:酢酸エチル,ニンヒドリン発色とUVを使用)の出現、また原料のスポット(Rf=0.45,展開溶媒:酢酸エチル,ニンヒドリン発色とUVを使用)の消失を確認し、反応終了とした。生成した白色の沈殿をジエチルエーテルで洗浄した。1H−NMRにより目的物であることを確認した。
収量:628mg, 収率:92%
2−メタクリロイルアミノエチルカルバミン酸塩酸塩(130mg,1mmol)とトリエチルアミン(280μL,2mmol)をメタノール(5mL)に溶解し、氷冷下で攪拌しながら4−ホルミル安息香酸(150mg,1mmol)を加え、氷冷下で2時間、室温で一晩攪拌した。TLCにて反応生成物である4−[2−(N−メタクリルイミド)エチルアミノメチル]安息香酸のスポットを確認した(Rf=0.56,展開溶媒:ジクロロメタン/メタノール=1/1,ニンヒドリン発色とUVを使用)。氷冷下で反応溶液に還元剤として水素化ホウ素ナトリウム(38mg,1mmol)を加え、2時間攪拌した。TLCで目的物のスポット(Rf=0.55,展開溶媒:メタノール,ニンヒドリン発色とUVを使用)を確認した。また、未反応の4−[2−(N−メタクリルイミド)エチルアミノメチル]安息香酸のスポット(Rf=0.67,展開溶媒:メタノール,ニンヒドリン発色とUVを使用)を確認したので水素化ホウ素ナトリウム(20mg,0.53mmol)を追加し、さらに2時間攪拌した。還元前の化合物のスポットの消失を確認し、反応溶液に純水を加えて反応を停止した。反応後の溶液を減圧濃縮し、得られた残渣をジクロロメタンで洗浄した。残渣をMeOHに溶解しシリカゲルカラムクロマトグラフィー(オートカラム,溶離液:メタノール/ジクロロメタン=1/3⇒1/1)にて精製し、白色固体を得た。1H−NMRにより目的物であることを確認した。
収量:101.3mg, 収率:38.6%
収量:48mg, 収率:40%
ガラス基板(0.5×10mm)をピラニア溶液に5分間浸漬し、エタノールで洗浄後1% 3−アミノプロピルトリエトキシシラン溶液(溶媒:エタノール/水=95/5)に1時間浸漬させた。基板をエタノールで洗浄した後、ホットプレートを用いて110℃で15分間焼成した。
洗浄後、1mM Cy5−マレイミドのDMF溶液に基板を30分間浸漬した後、DMFと純水で洗浄することにより、基板の特異的認識空間内に蛍光分子を導入した。
以上のとおり、標的タンパク質に含まれる糖鎖を利用して標的タンパク質をSAM表面に結合させても、分子インプリントポリマーの作製が可能であることが明らかとなった。
(1) チオール誘導体化ヘパリンの合成
高分子量ヘパリン(平均で約5.56μmol)を酢酸水溶液(1mL)に溶解し、p−アミノチオフェノール(3.48mg,27.8μmol,5eq.)および還元剤として2−ピコリンボラン(5.7mg,27.8μmol,5eq.)を40〜70μLのメタノールに溶解させた溶液を加え、室温で24〜48時間激しく攪拌した。反応溶液をジクロロメタンで3回洗浄することにより、p−アミノチオフェノール、2−ピコリンボランおよび副生成物を除去し、水相を凍結乾燥して36.96mgの白色粉末を得た。分画分子量(MWCO)10000および5000のフィルタで限外ろ過して、分子量分布がMw:6000〜10000とMw:10000〜12000のチオール誘導体化高分子量ヘパリンを得た。
金基板をエタノールと純水でリンスし、N2ガスで乾燥後、20分間UV−O3処理して基板を洗浄した。その後、直ちに0.5mM 11−スルファニロウンデカ−1−イル 2−ブロモ−2−メチルプロピオネートおよび0.5mM (11−メルカプトウンデシル)テトラ(エチレングリコール)の混合エタノール溶液(1mL)30℃で24時間浸漬させ、金基板上にmixed SAMを形成した。mixed SAMを形成した基板は、エタノールと純水でリンスし、N2ガスで乾燥後、遮光下真空中で保存した。
以上のとおり、分子−分子間相互作用を利用して標的タンパク質をSAM表面に結合させても、分子インプリントポリマーの作製が可能であることが明らかとなった。
上記参考例3(4)でモールド2を用いて作製したAgベースのプラズモニックチップ(5×10×0.5mm)を20分間UV−O3処理した後、2wt%の3−アミノプロピルトリエトキシシラン(APTES)と1wt%酢酸を含む水溶液(10μL)を滴下し、40℃で1.5時間反応させた。反応後、純水とエタノールをかけ流して洗浄し、80℃ホットプレート上で2時間焼成した。このアミノ化プラズモニック微小反応板上に10mMビオチン−NHSと10mM DMAPのDMSO溶液(10μL)を滴下し、カバーガラスをかけ、25℃で1時間反応させた後、DMSOで洗浄して反応板上にビオチンを導入した。
対物レンズ: ×5
露光時間: 0.1秒
Cy5用蛍光フィルター: Exciter:608〜648nm,Emitter:672〜712nm
(1) シランカップリング反応によるチップ表面へのNH2基とSH基の導入
Ti/Ag/Au/Ti/SiO2プラズモニックチップをエタノールと純水で洗浄した。厚さ0.2mmのシリコンシートをプラズモニックチップの大きさに合わせて切り、中央に直径7mm程度の穴を空けたものをプラズモニックチップの周期構造内が見えるように貼り付けた。次に0.1wt% 3−アミノプロピルトリエトキシシラン(APTES)および0.1wt% (3−メルカプトプロピル)トリメトキシシランを含む水溶液(100μL)を中央部の穴に滴下し、25℃で1時間反応させた。反応後、純水で洗浄した。
上記(1)で得られた表面NH2,SH化プラズモニックチップ上のシリコンシートの穴の中に、5mM 2−ブロモイソブチリックアシッド(1eq),7.5mM 4−(4と6−ジメトキシ−1,3,5−トリアジン−2−イル)−4−メチルモルホリニウムクロライド n水和物(DMT−MM)(1.5eq)の混合水溶液(100μL)をピペットマンにて滴下し、25℃で1時間反応させた。反応後、純水で洗浄した。
上記(2)で得られた表面Br,NH2化プラズモニックチップ上のシリコンシートの穴の中に、2mM MAL−dPEG(登録商標)4−NHSエステル水溶液(100μL)をピペットマンにて滴下し、25℃で1時間反応させた。反応後、純水で洗浄した。
上記(3)で得られた表面Br,NHSエステル化プラズモニックチップ上のシリコンシートの穴の中に、1mMピリジルチジオエチルアミン塩酸塩水溶液(100μL)をピペットマンにて滴下し、25℃で1時間反応させた。反応後、純水で洗浄した。
上記(4)で得られた表面Br,ジスルフィド化プラズモニックチップ上のシリコンシートの穴の中に、100nMチオール−AFP リン酸緩衝液(pH7.4)溶液(100μL)をピペットマンにて滴下し、25℃で1時間反応させた。反応後、純水で洗浄した。
上記(5)で得られた表面Br,チオール−AFP化プラズモニックチップ上のシリコンシートの穴の中に、5mMヒドロキシエチルピリジルジスルフィド水溶液をピペットマンにて滴下し、25℃で1時間反応させた。反応後、純水で洗浄した。
上記(6)で得られた表面Br,AFP化プラズモニックチップを、NS共通摺合三角フラスコ(50mL,24/40のセプタム用)内に入れ、2mMピロリジルアクリレート、30mM MPC、8mM MBAA、0.5mM CuBr2および1mM 2,2’−ビピリジルの混合水溶液(120μL)をシリコンシート内の穴に滴下させ、セプタムでふたをし、脱気窒素置換を5回行った。0.25mM L−アスコルビン酸水溶液(30μL)をシリンジにて滴下し、脱気窒素置換を5回行い、SI−AGET−ATRPを開始した。重合は25℃で1時間行った。重合後、チップを純水で洗浄し、50mM EDTA−4Na水溶液をピペットマンにて滴下し、25℃で1時間静置して銅を除去した。プレポリマー溶液の組成を表7に示す。
上記(7)で得られたポリマー薄膜作製プラズモニックチップ上のシリコンシートの穴の中に50mM TCEP−100mM酢酸バッファ(pH5.0)溶液(100μL)を滴下し、25℃で6時間反応させた。反応後、純水で洗浄した。さらに、還元したポリマー薄膜作製プラズモニックチップ上のシリコンシートの穴の中に、330mM NaClと0.33wt% SDSの混合水溶液(100μL)を滴下し、25℃で1時間静置した。1時間後、純水で洗浄した。
上記(8)で得られたAFP−MIP修飾プラズモニックチップ上のシリコンシートの穴の中に、1mMピリジルジチオエチルアミン塩酸塩水溶液(100μL)をピペットマンにて滴下し、25℃で1時間反応させた。反応後、純水で洗浄した。
上記(9)で得られた表面NH2基導入AFP−MIP修飾プラズモニックチップ上のシリコンシートの穴の中に、蛍光レポーター化合物であるAlexa Fluor(登録商標)647 NHSエステルを20μMと、消光剤であるBHQ−3カルボン酸を5μM含む7.5%DMSO 10mMリン酸緩衝液(pH7.4)溶液(100μL)をピペットマンにて滴下し、25℃で1時間反応させた。反応後、純水で洗浄した。
上記(10)で得られたAFP−MIP修飾プラズモニックチップ上のシリコンシートの穴の中に、10mMリン酸緩衝液(pH7.4,30μL)を滴下し、丸型カバーガラスを被せ、蛍光顕微鏡にてBackground測定を行った(測定値:F0)。続いて、濃度62.5pM、125pM、250pM、500pMまたは1000pMのAFPの10mMリン酸緩衝液(pH7.4)溶液(20μL)をそれぞれ20分間反応させ、以下の条件で蛍光強度を測定した(測定値:F)。
カメラ: U−HGLGPS(Olympus社製)
対物レンズ: ×10
露光時間 :プラズモニックチップ0.5秒
Cy5用蛍光フィルタ: Exciter:608−648 nm,Emitter:672〜712nm
Claims (6)
- 標的タンパク質に対する特異的認識空間を有する分子インプリントポリマーを製造するための方法であって、
上記標的タンパク質を構成する分子の反応性基(1)を介して、末端にビニルモノマー基を有し且つ末端以外の部分に切断性基(1)を有する機能性モノマー(I)を複数結合させる工程(ここで、上記切断性基(1)は、ジスルフィド結合基、イミノ結合基、ボロン酸cisジオールエステル基、またはカルボン酸エステル基を示す);
上記標的タンパク質を構成する分子の反応性基(2)を介して、末端にビニルモノマー基を有し且つ末端以外の部分に切断性基(2)を有する機能性モノマー(II)を複数結合させる工程(ここで、上記切断性基(2)は、ジスルフィド結合基、イミノ結合基、ボロン酸cisジオールエステル基、またはカルボン酸エステル基であって、上記切断性基(1)とは異なる基を示す);
基材上に自己組織化単分子膜を形成する工程;
上記自己組織化単分子膜の表面へ、上記標的タンパク質を結合させる工程;
ビニルモノマーを添加し、上記機能性モノマー(I)および上記機能性モノマー(II)のビニルモノマー基と共重合させる工程;
少なくとも上記切断性基(1)および切断性基(2)を切断することにより、上記標的タンパク質を除去する工程;
上記切断性基(1)を切断することにより生成する基に、上記反応性基(1)と相互作用するポストインプリンティング化合物を複数結合させるか、または、上記切断性基(2)を切断することにより生成する基に、上記反応性基(2)と相互作用するポストインプリンティング化合物を複数結合させる工程;および、
上記切断性基(1)を切断することにより生成する基または上記切断性基(2)を切断することにより生成する基であって、上記ポストインプリンティング化合物を結合させなかった基に、蛍光レポーター化合物を複数結合させる工程を含むことを特徴とする方法。 - 上記反応性基(1)または反応性基(2)としてアミノ基を利用し、当該アミノ基に2−イミノチオランを反応させることによりチオール基を導入し、当該チオール基に上記機能性モノマー(I)または機能性モノマー(II)を結合させる請求項1に記載の方法。
- 特異的認識空間に挿入される標的タンパク質を構成するアミノ酸残基の反応性基(1)または反応性基(2)と相互作用するポストインプリンティング化合物が特異的認識空間内に複数導入されており、且つ、
蛍光レポーター化合物が特異的認識空間内に複数導入されていることを特徴とする、標的タンパク質に対する特異的認識空間を有する分子インプリントポリマー。 - ベース基板、表面プラズモン共鳴光を発生し得る金属からなる金属層、消光抑制層をこの順で含み、
上記ベース基板、金属層および消光抑制層の表面には複数の凹部からなる周期構造が形成されており、
上記周期構造上に、請求項3に記載の分子インプリントポリマーが形成されていることを特徴とするプラズモニックチップ。 - 直径2mm以上、6mm以下の円形孔を通過可能な形状を有する請求項4に記載のプラズモニックチップ。
- 試料中における上記標的タンパク質を検出する方法であって、
請求項3に記載の分子インプリントポリマー、または請求項4もしくは請求項5に記載のプラズモニックチップの分子インプリントポリマーと、上記試料を接触させる工程、および、
上記分子インプリントポリマーと上記試料との接触による蛍光強度の変化を測定する工程を含むことを特徴とする方法。
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