JP6641180B2 - 熱処理した透明トマト濃縮物を含む組成物 - Google Patents

Description

本発明は、予想外に高いレベルの抗炎症活性を有することが見出された熱処理したトマト由来濃縮物を含む組成物に関する。本発明はまた、熱処理したトマト由来濃縮物とカロテノイドとの相乗的な組み合わせを対象とする。

炎症過程は、非特異的な免疫系の重要な一部を構成しており、微生物作因や他の有害な可能性のある環境要因に遭った際の宿主の防御に欠くことのできない一連の複雑な化学的変化および細胞変化を特徴とする。しかし、多くの場合、炎症は不適切に惹起されたり、および／または宿主にとって有害になる程度まで持続したりする可能性がある。そのような場合、特に非感染性炎症性疾患の場合に、炎症過程の１つ以上の局面の進展を抑制するまたは防ぐ必要がある場合がある。

炎症過程の進展または制御には、非常に数多くの相異なる化学メディエータが関わることが示されてきた。複数の相異なる研究所による最近の研究は、様々な種類の関節炎、胃腸疾患、中枢神経系の炎症状態や特定の型の喘息を含めて種々の急性および慢性の炎症性疾患の重要なモジュレータとして一酸化窒素（ＮＯ）が関与することを示唆している。そのため、これらの炎症性疾患の治療および／または管理のために、ＮＯ産生の抑制が有用な治療メカニズムを提供し得ることが提唱されている。さらに、ＮＯ合成の抑制は、実際には本質的に炎症性ではないいくつかの状態または状況において有用であることも示されている。すなわち、例えば、ＮＯ合成の抑制は、２型糖尿病の個体において、運動中に、四肢組織内へのグルコースの取り込みを低減することが見出された。

インビボでのＮＯの産生は、リポ多糖（ＬＰＳ）、インターフェロンガンマやインターロイキン１（ＩＬ−１）などの数多くの相異なる免疫刺激によって活性化される誘導性一酸化窒素合成酵素（Ｉ−ＮＯＳ）などの一酸化窒素合成酵素（ＮＯＳ）酵素のファミリーによって媒介される。

ＮＯの抑制は、Ｌ−Ｎ^Ｇ−モノメチルアルギニンクエン酸塩（Ｌ−ＮＭＭＡ）を使用することによって、インビトロとインビボのどちらでも達成され得る。さらに、複数の天然産物を含めていくつかの他の化合物も、ＮＯ産生を抑制することが示されている。後者の群にはルテイン（Ｒａｆｉ Ｍ．Ｍ．ら、Ｍｏｌ Ｎｕｔｒ Ｆｏｏｄ Ｒｅｓ．２００７年３月、５１（３）：３３３−４０；Ｃｈｏｉ，Ｊ．Ｓ．、Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ．２００６年６月、２２（６）：６６８−７１）やリコペン（Ｒａｆｉ，Ｍ．Ｍ．ら、Ｊ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉ．２００７年１月、７２（１）：Ｓ０６９−７４）などの化合物が含まれる。しかし、多くの天然産物のＮＯ抑制剤の有効性と効力は特に高いというわけではないことが判明している。そのため、ＮＯ産生抑制の向上した天然由来の組成物が必要とされている。

極めて重要な他の炎症性メディエータは腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦ−アルファ）であり、これはマクロファージ、好中球およびリンパ球を含めて様々な細胞型によって産生されるサイトカインである。ＴＮＦ−アルファは、炎症過程の初期段階において重要な位置を占めており、多岐にわたる炎症促進性遺伝子の活性化を次々に引き起こす核因子−κＢなどの他の因子の産生刺激を担う。このように、炎症促進の鍵となる役割があるという観点から、ＴＮＦ−アルファは、紛れもなく抗炎症剤のための将来性ある重要な治療標的である。

ここで別の側面に転じてみると、健康で正常な骨の構造を維持するために、骨は継続的に再構築にさらされており、そこで骨は、破骨細胞によって破壊され、骨芽細胞によって再建される。

破骨細胞の分化は、とりわけＲＡＮＫＬ（ＮＦκＢリガンドの受容体アクティベータ）の影響を受けるが、ＲＡＮＫＬは骨芽細胞によって産生されるサイトカインであり、その骨芽細胞は破骨細胞前駆細胞に結合する。この過程の抑制は破骨細胞の活性の低減をもたらし、そのことによって骨吸収を抑制すると予想される。

骨再構築過程における骨吸収と新生骨産生とのバランスを変えるための代替の戦略は、骨芽細胞の活性の増加を引き起こすことと予想される。この結果はいくつかのやり方で達成される可能性があるが、考えられる１つの経路は、骨芽細胞における抗酸化剤応答配列（ＡＲＥ／Ｎｒｆ２）シグナル伝達の活性化を介するものである。

骨形成と骨吸収との不均衡は、骨粗鬆症、関節炎、歯周病、多発性骨髄腫や転移性がんなどの病的状態の進展を引き起こす可能性がある。骨粗鬆症の人にとって、骨折は代表的な生命を脅かす事象であり、今日では世界中の７０００万を超える人々に危険性がある。

骨吸収が過度である場合（骨粗鬆症で起こるような）、再吸収と新生骨蓄積とのバランスを変えることが可能であることが好都合であると予想される。これは、実質的に有害作用のない天然の無毒の物質を使用することによって達成されることが理想的である。本発明の目標の１つは、この要求を満たすことである。

Ｒａｆｉ Ｍ．Ｍ．ら、Ｍｏｌ Ｎｕｔｒ Ｆｏｏｄ Ｒｅｓ．２００７年３月、５１（３）：３３３−４０ Ｃｈｏｉ，Ｊ．Ｓ．、Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ．２００６年６月、２２（６）：６６８−７１ Ｒａｆｉ，Ｍ．Ｍ．ら、Ｊ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉ．２００７年１月、７２（１）：Ｓ０６９−７４

本発明の１つの目的は、メディエータが関与することが示唆されている病的状況および過程を治療または管理するための手段として、ＮＯやＴＮＦ−アルファなどの１種以上の鍵となる炎症性メディエータの産生を抑制するために使用し得る天然物組成物を提供することである。

本発明の別の目的は、抗炎症性特性の向上したトマト由来組成物を提供することである。

本発明のなおさらなる目的は、骨の健康を改善するための天然物組成物を提供することである。

別の目標および目的は、説明の進行に従って明らかになる。

（発明の要旨）
本願の発明者らはここで、透明トマト濃縮物（ＣＴＣ：ｃｌｅａｒ ｔｏｍａｔｏ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ）として知られるトマト由来産物の抗炎症特性が、使用前にＣＴＣを熱処理にさらすことによって亢進されることを見出した。

「ＣＴＣ」という用語は、トマト素材（破砕したトマトやトマトジュースなど）を果肉と漿液とに分離して、果肉を廃棄し、次いで漿液を約４０から８０の間のブリックス値に、好ましくは５５°Ｂｘを超えて濃縮することによって得られる濃縮トマト漿液のことを指す。濃縮した漿液は「ＣＴＣ」と称される。本明細書の以下において、ＣＴＣの調製についてさらなる詳細を述べる。

したがって、本発明は、熱処理ＣＴＣを含む治療用組成物を主として対象とする。

いくつかの相異なる加熱措置が前述の熱処理ＣＴＣを調製するために使用され得るが、好適な一実施形態では、ＣＴＣ（およそ６０Ｂｘに対応する濃度）を摂氏９０度で１時間から３時間加熱する。特に好適な実施形態では、熱処理ＣＴＣは、摂氏９０度で１時間、ＣＴＣを加熱することによって調製される。

好適な一実施形態では、本発明の治療用組成物は本質的に熱処理ＣＴＣからなる。

「本質的に、からなる」という用語は、本開示および添付の特許請求の範囲にわたり用いられる場合、本発明の組成物が、主要な活性物質（加熱ＣＴＣ）に加えて、本発明の基礎をなす新規の発明的特徴に実質的に影響を与えない他の化合物、物質および薬剤を含み得る状況を指すことに留意されたい。

好適な一実施形態では、上記で開示された熱処理ＣＴＣを含む組成物は、２％ｗ／ｗ未満の総遊離アミノ酸濃度を有する。また、熱処理ＣＴＣを含む組成物の遊離グルタミン濃度は、好ましくは０．１％ｗ／ｗ未満である。

さらにここで意外なことに、加熱ＣＴＣはカロテノイドと相乗的に相互作用し、それにより抗炎症効果の亢進が生じることが見出された。したがって、本発明はさらに、熱処理ＣＴＣと１種以上のカロテノイドとの相乗的な組み合わせを含む治療用組成物を対象とする。

この組み合わせの組成物の好適な一実施形態では、総遊離アミノ酸濃度は２％ｗ／ｗ未満である。同様に、遊離グルタミン濃度は、好ましくは０．１％ｗ／ｗ未満である。

数多くの相異なるカロテノイドが本発明の組成物中に取り入れられていてもよく、好適な一実施形態では、組成物は、リコペン、フィトエン、フィトフルエン、ベータ−カロテンおよびルテイン、ならびに／またはそれらの誘導体からなる群から選択される１種以上のカロテノイドを含む。しかし、本発明の相乗的な組成物を調製するのに、他の数多くのカロテノイドも使用できることが認識されているものとする。

特に好適な実施形態では、本発明の組成物は加熱ＣＴＣとトマト含油樹脂とを含み、ここで含油樹脂は、カロテノイドであるリコペン、フィトエン、フィトフルエンおよびベータ−カロテンを含む。そのようなトマト含油樹脂の市販品の例は、出願人であるＢｅ’ｅｒ Ｓｈｅｖａ、ＩｓｒａｅｌのＬｙｃｏＲｅｄ Ｌｔｄ．によって製造されて供給されているＬｙｃ−Ｏ−Ｍａｔｏ（登録商標）である。

好適な一実施形態では、本発明の治療用組成物は、本質的に熱処理ＣＴＣと１種以上のカロテノイドとの相乗的な組み合わせからなる。特に好適な実施形態では、治療用組成物は、本質的に熱処理ＣＴＣと、リコペン、フィトエン、フィトフルエン、ベータ−カロテンおよびルテインからなる群から選択される１種以上のカロテノイドとの相乗的な組み合わせからなる。特に好適な一実施形態では、組み合わせの組成物はリコペンを含む。最も好ましくは、組成物は、本質的に熱処理ＣＴＣとトマト含油樹脂とからなる。

好ましくは、組み合わせの組成物中の総カロテノイド濃度は少なくとも０．１％（ｗ／ｗ）である。他の好適な一実施形態では、カロテノイドはリコペンを含み、リコペン濃度は少なくとも０．１％（ｗ／ｗ）である。

本発明はまた、１種以上のカロテノイド（上記で開示されたような）と、上記で定義された熱処理ＣＴＣに類似した化学的および／または生化学的組成物を有する改変型ＣＴＣとの組み合わせ、または改変型ＣＴＣのみに関する。そのため、一態様では、本発明は、１種以上のカロテノイドと総遊離アミノ酸濃度が２％ｗ／ｗ未満であるＣＴＣとの相乗的な組み合わせを含む、治療用組成物を対象とする。別の一実施形態では、本願は、少なくとも１種のカロテノイドと遊離グルタミン濃度が０．１％ｗ／ｗ未満であるＣＴＣとの相乗的な組み合わせを含む、治療用組成物を対象とする。

別の一態様では、本発明は、抗炎症性メディエータが関与することが示唆されている病的状態および過程を治療または管理する手段として、対象において１種以上の抗炎症性メディエータの産生を抑制または低減するための方法を提供し、本方法は、上記で開示されたいずれかの実施形態による治療用組成物を対象に投与する工程を含む。本方法は、数多くの相異なる炎症性メディエータの産生を抑制するのに使用されてもよいが、好適な一実施形態では、抗炎症性メディエータは、ＮＯ、ＴＮＦ−アルファおよびインターロイキン１からなる群から選択される。

さらなる態様では、本発明は、炎症性メディエータ、具体的にはＮＯ、ＴＮＦ−アルファおよび／またはインターロイキン１の抑制に応答性のある状態を治療するための医薬の製造において、熱処理ＣＴＣを使用することを対象とする。

さらなる態様では、本発明は、抗炎症性メディエータ、ＮＯ、ＴＮＦ−アルファおよび／またはインターロイキン１の抑制に応答性のある状態を治療するための医薬の製造において、熱処理ＣＴＣと１種以上のカロテノイドとを使用することを対象とする。

なおさらなる態様では、本発明は、骨の健康を改善するために有用な医薬の製造において、上記で開示されたいずれかの組成物を使用することを対象とする。好適な一実施形態では、この医薬は骨吸収を抑制することが可能であり、（これらに限定されないが）骨粗鬆症、関節炎、歯周病、多発性骨髄腫や転移性がんなどの状態の予防、治療または管理に使用されてもよい。

さらに、本発明はまた、ＮＯ、ＴＮＦ−アルファおよび／またはインターロイキン１が、治療を要する対象における病的状態のモジュレータまたはメディエータとして作用する病的状態の治療方法であって、上記で開示されたいずれかの実施形態による治療用組成物を対象に投与する工程を含む、治療方法を提供する。本方法の好適な一実施形態では、治療される状態は、急性炎症状態、慢性炎症状態、リウマチ性関節炎、成人呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）、喘息、鼻炎、特発性肺線維症、腹膜炎、心血管系炎症、心筋虚血、再灌流傷害、アテローム性動脈硬化、敗血症、外傷、２型糖尿病、網膜症、乾癬、胃腸炎、肝硬変、腹膜炎および炎症性腸疾患、ならびに例えばアルツハイマー病（ＡＤ）などの神経変性疾患からなる群から選択される。

好適な一実施形態では、治療される状態は炎症状態である。

別の一態様では、本発明は対象の骨の健康を改善するための方法を対象とし、本方法は上記で開示されたような治療用組成物を対象に投与する工程を含む。

この態様の好適な一実施形態では、骨の健康の改善は骨吸収の抑制を含む。骨の健康を改善するための方法は、その方法に応答性のある任意の状態または疾患を有する対象に使用されてもよく、状態または疾患としては骨粗鬆症、関節炎、歯周病、多発性骨髄腫および転移性がんが挙げられるが、これらに限定されない。

先に記載した方法の好適な実施形態では、対象は哺乳類対象であり、より好ましくはヒト対象である。

上記に開示した方法において、治療用組成物はどの便利な手段で投与されてもよいが、好適な一実施形態では、この組成物は医薬剤形の形態で投与される。一方で、別の好適な一実施形態では、治療用組成物は食品または飲料中に取り入れられる。

以上のおよび他の本発明の特徴および利点は、本発明の好適な実施形態についての以下の例示的で制限のない例からさらに理解されよう。

通常の非加熱ＣＴＣを用いて処理することによる腹腔マクロファージからのＮＯ産生の抑制をグラフで比較した図である。 熱処理ＣＴＣを用いて処理することによる腹腔マクロファージからのＮＯ産生の抑制をグラフで比較した図である。 腹腔マクロファージによるＮＯ産生を抑制する熱処理ＣＴＣの能力に対する異なる加熱時間（０−１２０分）の効果をグラフで例示した図である。 ５つの別々のＣＴＣバッチのそれぞれにおける、加熱前と加熱後の両方でのグルコース濃度をグラフで例示した図である。 ５つの別々のＣＴＣバッチのそれぞれにおける、加熱前と加熱後の両方でのフルクトース濃度をグラフで例示した図である。 ＬＰＳで刺激されたマクロファージによるＴＮＦ産生に熱処理ＣＴＣが及ぼす抑制効果を示した図である。３本のバーからなる各群の１番目は、新鮮な熱処理ＣＴＣを用いて得られた抑制を表し、２番目および３番目のバーは、それぞれ室温または４０Ｃで６ヶ月間保存された熱処理ＣＴＣを用いて得られた結果を表す。 トマト含油樹脂（Ｌｙｃ−Ｏ−Ｍａｔｏ）のみおよび加熱ＣＴＣのみによって引き起こされる腹腔マクロファージによるＮＯ産生の抑制を、トマト含油樹脂と加熱ＣＴＣとの組み合わせを用いた場合と、グラフで比較した図である。 ルテインのみおよび加熱ＣＴＣのみによって引き起こされる腹腔マクロファージによるＮＯ産生の抑制を、ルテインと加熱ＣＴＣとの組み合わせを用いた場合と共に、グラフで表示した図である。 ルテインのみおよび加熱ＣＴＣのみによって引き起こされる腹腔マクロファージによるＮＯ産生の抑制を、ルテインと加熱ＣＴＣとの組み合わせを用いた場合と共に、グラフで表示した図である。 ルテインのみおよび加熱ＣＴＣのみによって引き起こされる腹腔マクロファージによるＮＯ産生の抑制を、ルテインと加熱ＣＴＣとの組み合わせを用いた場合と共に、グラフで表示した図である。 ベータ−カロテンのみおよび加熱ＣＴＣのみによって引き起こされる腹腔マクロファージによるＮＯ産生の抑制を、ベータ−カロテンと加熱ＣＴＣとの組み合わせを用いた場合と共に、グラフで表示した図である。 ベータ−カロテンのみおよび加熱ＣＴＣのみによって引き起こされる腹腔マクロファージによるＮＯ産生の抑制を、ベータ−カロテンと加熱ＣＴＣとの組み合わせを用いた場合と共に、グラフで表示した図である。 ベータ−カロテンのみおよび加熱ＣＴＣのみによって引き起こされる腹腔マクロファージによるＮＯ産生の抑制を、ベータ−カロテンと加熱ＣＴＣとの組み合わせを用いた場合と共に、グラフで表示した図である。 ラット脚のカラギーナン誘導性炎症モデルにおいて、Ｌｙｃ−Ｏ−Ｍａｔｏと加熱ＣＴＣとの組み合わせが、インターロイキン１−Βの産生に及ぼす抑制効果をグラフで例示した図である。 酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）活性によって測定した場合の、ＲＡＮＫＬで誘導された破骨細胞の分化を抑制する加熱ＣＴＣと非加熱ＣＴＣの能力をグラフで比較した図である。結果は、加熱ＣＴＣが非加熱ＣＴＣよりもはるかに効力があることを示す。 ＴＲＡＰによって測定した場合の、ＲＡＮＫＬで誘導された破骨細胞の分化の抑制に及ぼすリコペンのみの影響を、ＣＴＣのみの影響およびリコペンとＣＴＣ添加の影響と、グラフで比較した図である。 ＭＣ３Ｔ３骨芽細胞における加熱ＣＴＣによる抗酸化剤応答配列（ＡＲＥ）の用量依存的な活性化を、非加熱ＣＴＣで見られたそのような活性化の欠如と、グラフで比較した図である。

上記で開示されたように、本発明は、熱処理ＣＴＣのみまたは１種以上のカロテノイドとの組み合わせを含む組成物を提供する。ＣＴＣとして知られる画分は、典型的には（ただしそれに限らないが）以下の過程によって調製される。

工程１；トマトを洗って色と質とに応じて仕分けする。

工程２：清潔なトマトを破砕する。この時点で、破砕した生のトマトを、リコペン含量用および糖含量のためにサンプリングする。

工程３：破砕した生のトマトを４−６ｍｍおよび１２ｍｍの網を通して濾す。

追加工程３．１：皮の小片を除去するために、保持された固形物に水を加えて、０．６ｍｍおよび０．８ｍｍの網上で濾す。

工程４：工程３から得たスラリーをさらに１．５ｍｍから４ｍｍの網上で濾す。

工程５：工程４および工程３．１由来のスラリーを合わせて貯め、容器中に保存する。なお、この時点でスラリーをサンプリングして解析する。

工程６：スラリーを大きな貯蔵タンクに移す。

工程７：スラリーを８０−８５℃に加熱してサンプリングする。

工程８：温度が８０−８５℃に到達したら、横型遠心分離機（デカンタ）にて固形物から水相を分離する。

工程９：ドラム缶に据え付けたラミネート袋に固形材（果肉）を詰め、次にそれらをサンプリングしてラベルを貼る。次いで、果肉を入れたドラムを凍結して凍結状態で保存する。

工程１０：水相（デカンタからの漿液）をサンプリングする。

工程１１：余分な気泡を取り除くため、漿液を濾過して真空下で脱気する。

工程１２：漿液を一時的に大きな容器に保存する。

工程１３：漿液を遠心分離して、スラッジを工程５に戻す。

工程１４：漿液を真空下でエバポレーターにて所望のＢｘ値になるまで濃縮する。

上記のスキームは、ＣＴＣを産生するためのプロセスの一例にすぎず、本発明の範囲から逸脱させずに様々な他のプロセスも使用可能である。一方で、このプロセスの鍵となる段階を次のようにまとめることもできる。すなわち、破砕したトマトを２つの画分、つまり漿液と果肉とに分ける。トマト漿液を、４０から８０の間のブリックス値になるまで、好ましくは５５°Ｂｘよりも高値になるまで濃縮する。この生成物は透明なトマト濃縮物からなり、通常はＣＴＣと称する。

ＣＴＣの調製および特性に関するさらなる情報は、本明細書に組み込まれた共願のＷＯ９９／６０８６８に見ることができる。

本明細書で先に説明したように、本発明のＣＴＣを熱処理にさらす。いくつかの相異なる加熱措置が前述の熱処理ＣＴＣを調製するために使用される場合があるが、好適な一実施形態では、ＣＴＣ（およそ６０Ｂｘに相当する濃度）を摂氏９０度で１時間から３時間加熱する。特に好適な一実施形態では、熱処理ＣＴＣは、ＣＴＣを摂氏９０度で１時間加熱することによって調製される。

このような治療を必要とする対象に投与される組成物中に存在する加熱ＣＴＣの好適な１日あたりの量は、１００ｍｇから５００ｍｇの範囲である。

このような治療を必要とする対象に投与される熱処理ＣＴＣとカロテノイドのどちらも含有する組成物中の総カロテノイドの好適な１日あたりの量は、２ｍｇから２０ｍｇの範囲である。

好ましくは、熱処理ＣＴＣとカロテノイドのどちらも含有する組成物中に、カロテノイドは少なくとも０．１％の濃度で存在する。本発明の好適な一実施形態では、組み合わせの組成物（すなわち、加熱ＣＴＣとカロテノイドのどちらも含有する組成物）は、リコペンを少なくとも０．１％の濃度で含む。

本発明の組成物は、全身と局所のどちらの使用のためにも製剤化できる。全身投与の場合、熱処理ＣＴＣを、錠剤、カプレット、カプセル、シロップ、エリキシル、液体などの経口投与剤形内に取り入れてもよい。

別の好適な実施形態では、本発明の組成物を、局所的に、例えば皮膚上または粘膜上に投与してもよい（例えばクリーム、ローション、軟膏などとして）。熱処理ＣＴＣを含有する本発明の組成物を様々な相異なる剤形に取り入れる適当な方法のさらなる詳細を、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ、ＵＳＡ（１９８０年）などの当業者公知の任意の標準的な参考文献から得てもよい。

別の好適な実施形態では、本発明の組成物は、食品または飲料中に直接的に取り入れるのに適した食品添加物として調製される。

以下の実施例は、例示目的のために、そして本発明をさらに具体的に説明し記載するために提供される。しかし、本発明は、これらの実施例に開示される特定の実施形態に限定されない。

実施例１
熱処理ＣＴＣを使用したＮＯの産生の抑制
方法および材料：
マクロファージの単離と細胞培養−採取の４日前に１．５ｍｌのチオグリコール酸ブロス（４％）を腹腔内投与した６−８週齢の雄ＩＣＲマウス（Ｈａｒｌａｎ、Ｉｓｒａｅｌ）の腹膜腔から、腹腔マクロファージを採集した。腹腔マクロファージを、ＰＢＳを用いて３回洗浄し、必要に応じて赤血球の低張溶解を行い、９０−９５％の純度とした。ＦＩＴＣ結合ラット抗マウスＦ４／８０抗体（ＭＣＡ４９７Ｆ）（Ｓｅｒｏｔｅｃ、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｅｎｇｌａｎｄ）を使用し、ＦＡＣＳ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）に搭載されたフロー・マイクロフルオロメトリを用いて、マクロファージをＦＡＣＳ解析によって同定した。それぞれの試料について、光散乱ゲーティングした１０，０００個の生細胞を解析した。腹腔マクロファージを、１０％ＦＣＳ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌ ペニシリン、１００μｇ／ｍｌ ストレプトマイシン（Ｂｅｉｔ−Ｈａｅｍｅｋ、Ｉｓｒａｅｌ）を含有するＲＰＭＩ１６４０培地中で、９６ウェルプレート（細胞１×１０^６個／ウェル）にて、３７℃、５％ＣＯ_２雰囲気下で培養した。加熱ＣＴＣの存在下または非存在下で、ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）を用いて細胞を刺激した。

適切な体積のＤＭＳＯ（０．１−０．２％）を対照に加えて、各試験管の抑制率をその対照と比較して算出した。

透明トマト濃縮物（ＣＴＣ）を前述したように調製し、水溶性であることから、温かい培養培地に所望の希釈率で直に添加した。

特に明記しない限り、本研究に使用する熱処理ＣＴＣは、摂氏９０度に１時間加熱したＣＴＣを指す。
ＮＯ産生アッセイ
Ｇｒｅｅｎ，Ｌ．Ｃ．、Ｗａｇｎｅｒ，Ｄ．Ａ．、Ｇｌｏｇｏｗｓｋｉ，Ｊ．、Ｓｋｉｐｐｅｒ，Ｐ．Ｌ．、Ｗｉｓｈｎｏｋ，Ｊ．Ｓ．およびＴａｎｎｅｎｂａｕｍ，Ｓ．Ｒ．（１９８２年）Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１２６：１３１−１３８に記載されているように、グリース（Ｇｒｉｅｓｓ）試薬と、標準として亜硝酸ナトリウムとを使用して、亜硝酸塩レベルをアッセイすることによって、細胞培養上清中のＮＯレベルを決定した。

統計学的解析
データを平均値±標準誤差（ＳＥＭ）として示した。スチューデントの対応のある両側ｔ検定（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｐａｉｒｅｄ ｔｗｏ−ｔａｉｌｅｄ ｔ ｔｅｓｔ）を使用して、群間比較の統計学的有意性を決定した。

結果
Ａ．ＣＴＣまたは加熱ＣＴＣによるＮＯ産生の用量依存的な抑制
図１に示すように、１ｍｇ／ｍｌ ＬＰＳを２４時間添加する１時間前に、異なる希釈率のＣＴＣまたは熱処理ＣＴＣをマクロファージに添加することによって、用量依存的な抑制が引き起こされたが、熱処理ＣＴＣの場合には有意にさらに一層効率よく引き起こされた。

図１Ａに見られるように、（無処理）ＣＴＣによる抑制は、まず１：２００希釈において観察されて、１６±４％の抑制を引き起こしたが、１００％という最大の抑制は、ＣＴＣの１：２５希釈によって達成された。

熱処理ＣＴＣによる抑制（図１Ｂ）は、同じ濃度の非加熱ＣＴＣによって引き起こされる抑制よりもさらに一層顕著であった。１：８０００の希釈率でさえ（データ示さず）、３．５±１．５％の僅かな抑制が検出された。１：２０００希釈では、観察された抑制が２０％を超え、用量依存的な有効性の増大は１：２００の希釈率まで認められたが、この１：２００希釈点ではＮＯ産生の最大（１００％）の抑制が観察された。

実施例２
最適な熱処理条件の決定
抗炎症性の有効性の最大限の向上を生じるのに必要な加熱時間の長さを調べるために、マクロファージに添加する前に、ＣＴＣを異なる継続時間で９０℃に加熱した。図２に示すように、試験したあらゆる異なるＣＴＣ希釈率について、１時間の定温放置は、ＮＯ産生の最大の抑制を達成するのに十分である。

実施例３
熱処理ＣＴＣの特性評価
熱処理ＣＴＣのある種の鍵となる構成成分の濃度を決定し、熱処理に付していない通常のＣＴＣ中の構成成分のレベルと比較した。

Ａ）アミノ酸
ＣＴＣ試料（加熱および非加熱）中の種々の遊離アミノ酸の濃度を、逆相ＨＰＬＣ法を使用して決定した。Ｚｏｒｂａｘ Ｅｃｌｉｐｓｅ ＸＤＢ−Ｃ８カラムを、Ｆｍｏｃ誘導体化アミノ酸の分離のために１．５ｍｌ／分の流速にて使用したが、この分離では、酢酸緩衝液／アセトニトリルの勾配を移動相として使用した。２６５ｎｍのＵＶ検出器を使用して、溶出された構成成分を検出して定量した。

ＣＴＣ試料（加熱および非加熱）を以下のように調製した。すなわち、１ｇのＣＴＣを０．２モルのベース溶液（１６．８ｇの重炭酸ナトリウムを１リットルの水に溶解することによって調製）で希釈した。０．５ｍｌの希釈ＣＴＣを、次いで清潔なバイアルへ移して、そのバイアルへ０．５ｍｌの標準アミノ溶液（２０ｍｇから４０ｍｇの各アミノ酸標準を前述のベース溶液に溶解し、最終体積を１００ｍｌすることによって調製）を加えた。９ｍｌのＦｍｏｃ溶液（４０ｍｇのＦｍｏｃ−ＯｎＳＵを１００ｍｌの７５％アセトン／２５％水混合物に溶解することによって調製）をバイアルへ加えて、次いでバイアルを室温で３０分間、穏やかに撹拌した。ラセミ化とジペプチドの形成とを防ぐため、前述したように調製した試料を、Ｆｍｏｃ反応の完了後２時間以内に解析した。

ＣＴＣ試料と同様に処理した遊離アミノ酸の標準溶液を使用して、較正曲線を作成し、ＣＴＣ試料中のアミノ酸の濃度を求めるのに使用した。

典型的なＨＰＬＣの１回の試行から得られた結果は以下の通りである。

これらの結果は、加熱すると、ＣＴＣ中に測定される遊離アミノ酸の総量が低減する（非加熱ＣＴＣでは１．８８％であるのに対し、加熱ＣＴＣでは１．０７％）ことを示唆している。さらに、この低減の多くは、遊離グルタミン濃度が非加熱ＣＴＣ中での０．８９％から加熱ＣＴＣ中での０．０５％へのレベルに顕著に減少したことに起因する。

Ｂ）糖類−グルコースおよびフルクトース
ＣＴＣ試料（加熱および非加熱）中のグルコースおよびフルクトースの濃度を、ＨＰＬＣ手法を使用して測定した。

５つの別々のＣＴＣバッチ（加熱前および加熱後）におけるグルコースおよびフルクトースのアッセイについて、得られた結果を図３および図４にそれぞれ示す。各図の前方にあるバーの組は加熱ＣＴＣについて得られた結果を表し、一方、後方の組は非加熱ＣＴＣについて得られた結果を表す。これらの図から、ＣＴＣ試料の加熱は、それら試料のグルコース濃度には約３５％の減少を、フルクトース濃度には約１０％の減少をもたらすことを見ることができる。

実施例４
熱処理ＣＴＣを使用したＴＮＦαの産生の抑制
加熱ＣＴＣによるＴＮＦ−アルファ産生の用量依存的な抑制を決定付けるために、さらなる研究を実施した。

加熱した透明トマト濃縮物（ＣＴＣ）を前述したように調製した。マクロファージを、加熱ＣＴＣの存在下でＬＰＳを用いて刺激し、この加熱ＣＴＣを用いた処理に続いて、ＴＮＦ−アルファ産生のレベルを測定した（以下に記載するように）。

ＴＮＦ−アルファ産生アッセイ
ＴＮＦ−アルファの濃度を、ＥＬＩＳＡキット（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用して定量した。

加熱ＣＴＣを新たに調製した場合と、室温（摂氏２５度）および促進保存温度である摂氏４０度のどちらかで６ヶ月間保存した後の場合との両方において、ＴＮＦα産生の抑制は、示された加熱ＣＴＣの濃度で観察された。

本研究の結果を図５にまとめる。この図に示すように、異なる希釈率で熱処理ＣＴＣをマクロファージに添加することは、用量依存的な抑制を引き起こす。加熱ＣＴＣによる僅かな抑制は、まず１：２０００希釈で観察され、１：１０００希釈でさらに一層顕著となった。用量依存的な有効性の向上は１：２００の希釈率まで認められたが、この１：２００の希釈点ではＴＮＦα産生の最大（８０％）の抑制が観察された。

さらに、この図に示した棒グラフ（３本のバーからなる各群の１番目のバー）から、室温（摂氏２５度；各群の２番目のバー）と加速された保存温度の摂氏４０度（各群の３番目のバー）とのどちらかで６ヶ月間保存された後、試験したあらゆる希釈率の加熱ＣＴＣにおいて、ＴＮＦα産生の抑制の喪失が観察されなかったということを見ることができる。

実施例５
熱処理ＣＴＣとカロテノイドとの相乗的な組み合わせを使用したＮＯの産生の抑制
方法および材料：
マクロファージの単離と細胞培養
採取の４日前に１．５ｍｌのチオグリコール酸ブロス（４％）を腹腔内投与した、６−８週齢の雄ＩＣＲマウス（Ｈａｒｌａｎ、Ｉｓｒａｅｌ）の腹膜腔から、腹腔マクロファージを採集した。腹腔マクロファージを、ＰＢＳを用いて３回洗浄し、必要に応じて赤血球の低張溶解を行い、９０−９５％の純度とした。ＦＩＴＣ結合ラット抗マウスＦ４／８０抗体（ＭＣＡ４９７Ｆ）（Ｓｅｒｏｔｅｃ、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｅｎｇｌａｎｄ）を使用し、ＦＡＣＳ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）に搭載されたフロー・マイクロフルオロメトリを用いて、マクロファージをＦＡＣＳ解析によって同定した。それぞれの試料について、光散乱ゲーティングした１０，０００個の生細胞を解析した。腹腔マクロファージを、１０％ＦＣＳ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌ ペニシリン、１００μｇ／ｍｌ ストレプトマイシン（Ｂｅｉｔ−Ｈａｅｍｅｋ、Ｉｓｒａｅｌ）を含有するＲＰＭＩ１６４０培地中で、９６ウェルプレート（細胞１×１０^６個／ウェル）にて、３７℃、５％ＣＯ_２雰囲気下で培養した。ＬｙｃｏｍａｔｏもしくはＣＴＣおよびそれらの組み合わせの存在下または非存在下で、ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）を用いて細胞を刺激した。

いくつかの実験では、Ｌｙｃ−ｏ−ＭａｔｏをＤＭＳＯに溶解した（５ｍＭの終濃度まで）。混合物をボルテックスして、水浴中にて３７℃で１０分間定温放置し（撹拌しながら）、次いで超音波槽にて各回１５秒ずつを３回、超音波処理した。この貯蔵溶液を使用して、その適切な体積を温かい培養培地に添加することによって、所望の濃度物を調製した。

抽出後、溶液中のリコペン濃度を以下のようにして決定した。すなわち、予め加熱した培地中にて２０μＭの濃度に新たに調製した１ｍｌのリコペン溶液へ、０．０２５％ＢＨＴを含有する０．５ｍｌのイソプロパノール＋１．５ヘキサン／ジクロロメタン（１：５ｖ／ｖ）を添加した。この溶液をボルテックスし、３０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離によって相を分離した。

スペクトル解析を行ってリコペン含量を測定した（４７１ｎｍの吸収ピーク）。

別の実験では、精製したベータ−カロテンまたはルテインを加熱ＣＴＣと組み合わせて使用した。これらのカロテノイドのそれぞれの貯蔵溶液および希釈物を、先にＬｙｃ−Ｏ−Ｍａｔｏについて記載したように調製した。

適切な体積のＤＭＳＯ（０．１−０．２％）を対照に加えて、各試験管の抑制率をそれぞれの対照について算出した。

透明トマト濃縮物（ＣＴＣ）を前述したように調製し、水溶性であることから、温かい培養培地に所望の希釈率で直に添加した。

特に明記しない限り、本研究に使用する熱処理ＣＴＣは、摂氏９０度に１時間加熱したＣＴＣである。
ＮＯ産生アッセイ
Ｇｒｅｅｎ，Ｌ．Ｃ．、Ｗａｇｎｅｒ，Ｄ．Ａ．、Ｇｌｏｇｏｗｓｋｉ，Ｊ．、Ｓｋｉｐｐｅｒ，Ｐ．Ｌ．、Ｗｉｓｈｎｏｋ，Ｊ．Ｓ．およびＴａｎｎｅｎｂａｕｍ，Ｓ．Ｒ．（１９８２年）Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１２６：１３１−１３８に記載されているように、グリース（Ｇｒｉｅｓｓ）試薬と、標準として亜硝酸ナトリウムとを使用して、亜硝酸塩レベルをアッセイすることによって、細胞培養上清中のＮＯレベルを決定した。

統計学的解析
データを平均値±標準誤差（ＳＥＭ）として示した。スチューデントの対応のある両側ｔ検定を使用して、群間比較の統計学的有意性を決定した。

結果
Ｌｙｃｏｍａｔｏと加熱ＣＴＣとの組み合わせによるＮＯ産生の相乗的な抑制
図６に示すように、加熱ＣＴＣを１：４０００から１：１０００の希釈範囲で０．２μＭ Ｌｙｃｏ−Ｏ−ｍａｔｏと組み合わせることによって、ＬＰＳ処理したマクロファージによるＮＯ産生について相乗的な抑制があった。図の各バー対の１番目のバーは、加熱ＣＴＣのみを用いて得られた結果を表し、一方、各対の２番目のバーは、示された希釈率の加熱ＣＴＣと０．２μＭ Ｌｙｃｏｍａｔｏとの組み合わせを用いて得られた結果を表す。示した結果は、それぞれ３連で行われた３回の別々の実験の平均値である。

最大の相乗効果は、２８．１±６％の抑制を引き起こした１：４０００のＣＴＣ希釈物と０．２μＭ Ｌｙｃｏｍａｔｏとの組み合わせによって得られた。加熱ＣＴＣ（１：４０００）のみは４．９±２．１％の抑制を引き起こし、０．２μＭ ｌｙｃｏｍａｔｏはごく僅かな抑制を引き起こした。このように、この組み合わせの効果は、各成分の相加効果より５．７倍高かった。

ルテインと加熱ＣＴＣとの組み合わせによるＮＯ産生の相乗的な抑制
図７に示すように、１：１０００から１：７０００の希釈範囲にある加熱ＣＴＣと、１μＭと２μＭの両方のルテインとの組み合わせは、ＬＰＳ処理したマクロファージによるＮＯ産生について相乗的な抑制を引き起こした。示した結果は３回の別々の実験についての平均値である。

最大の相乗効果が、ルテイン（試験した両方の濃度）と１：２０００から１：５０００の範囲の加熱ＣＴＣ希釈物との組み合わせによって得られたことに留意されたい。

ベータ−カロテンと加熱ＣＴＣとの組み合わせによるＮＯ産生の相乗的な抑制
図８に示すように、１：１０００から１：７０００の希釈範囲にある加熱ＣＴＣと、０．５μＭと１μＭの両方のベータ−カロテンとの組み合わせは、ＬＰＳ処理したマクロファージによるＮＯ産生について相乗的な抑制を引き起こした。示した結果は３回の別々の実験についての平均値である。

０．５μＭベータ−カロテンの場合に、最大の相乗効果が、１：２０００から１：７０００の範囲の加熱ＣＴＣ希釈物との組み合わせによって得られたことに留意されたい。

これらの結果は、加熱ＣＴＣとカロテノイドとの間に、炎症を抑制するための能力に関して相乗的な相互作用が存在することを明確に示唆している。

実施例６
熱処理ＣＴＣとカロテノイドとの相乗的な組み合わせを使用したＮＯインターロイキン１−ベータの産生の抑制
炎症促進性サイトカインであるＩＬ１−ベータの産生に及ぼす、熱処理ＣＴＣとトマト含油樹脂（Ｌｙｃ−Ｏ−Ｍａｔｏ、Ｌｙｃｏｒｅｄ Ｌｔｄ．、Ｉｓｒａｅｌ）との組み合わせの効果を調べるために、カラギーナン誘導性脚部炎症モデルを使用した。

方法：
Ｌｙｃ−Ｏ−Ｍａｔｏおよび熱処理ＣＴＣ（前述したように調製）を、１日１回、７日間、経口経路によって実験用ラットに投与した（別々にまたは一緒に）。ジクロフェナク（カラギーナン投与する２時間前に腹腔内を刺激）を陽性対照として使用した。

８日目にカラギーナン溶液をラットの左脚内に注射した。この注射に引き続いて、ＲＯＳと炎症促進性サイトカインを生じる好中球の流入によって媒介された炎症が、処理した脚に進展した。炎症促進性サイトカインであるインターロイキン１ベータの炎症組織への分泌を、標準的なＥＬＩＳＡキットを使用して測定した。

結果：
図９から、３ｍｇ／ｋｇ Ｌｙｃ−Ｏ−Ｍａｔｏ（トマト含油樹脂）と５ｍｇ／ｋｇ 加熱ＣＴＣとの組み合わせは、炎症組織内へのＩＬ−１ベータの分泌において、顕著で統計学的有意性のある減少を引き起こしたことを見ることができる。この減少は、陽性対照であるジクロフェナクによって引き起こされる減少の程度と類似していた。

実施例７
骨の健康に関する加熱ＣＴＣおよび加熱ＣＴＣとカロテノイドとの組み合わせの陽性効果
骨芽細胞と破骨細胞のどちらも骨再構築に関与する。本発明者らは、加熱ＣＴＣが少な
くとも２つの相補的なメカニズム、すなわち、
１．破骨細胞の分化の低減
２．骨芽細胞での抗酸化剤応答配列シグナル伝達（ＡＲＥ／Ｎｒｆ２）の刺激
によって骨の健康を改善することを見出している。

ＣＴＣがＲＡＮＫＬ媒介性の破骨細胞の分化と活性化に及ぼす抑制効果を、インビトロで研究した。
方法：
１．破骨細胞の分化
破骨細胞前駆細胞系譜のマウス単球−マクロファージ細胞株ＲＡＷ２６４．７由来の細胞を、示された希釈率でのＣＴＣ（非加熱または加熱）を使用してまたは使用せずに、２０ｎｇ／ｍｌのＲＡＮＫＬと共に３日間定温放置して、ＴＲＡＰ活性（破骨細胞分化のマーカー）用に染色した。ＲＡＮＫＬのみの存在下で得られる活性から、抑制率を算出した。ＬｙｃｏＭａｔｏ（１μＭリコペンと等価）を、図９に示したように添加した。データは、それぞれ３連で行われた３回の実験からの代表例から得た。
２．骨芽細胞における抗酸化剤応答配列（ＡＲＥ／Ｎｒｆ２）シグナル伝達の測定
ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１マウス骨芽細胞の培養物をこの検討に使用した。共願のＷＯ２００７／０４３０４６に記載された方法に従って、ＣＴＣ（加熱および非加熱）のみまたはリコペン（６，１４’）酸化生成物と共に細胞に加えて、ＡＲＥレポーター遺伝子の転写活性を測定した。

この検討の結果を図１０−１２にまとめた。

図１０に示すように、ＴＲＡＰによって測定された場合に、加熱ＣＴＣと非加熱ＣＴＣのどちらも、破骨細胞のＲＡＮＫＬ媒介性分化の用量に関連する抑制を引き起こす。しかしながら、ＣＴＣ試料の加熱は、破骨細胞の分化の抑制において、ＣＴＣの効力に有意な向上をもたらす。

図１１は、熱処理ＣＴＣとリコペンとの組み合わせによって引き起こされる、破骨細胞の分化の抑制を示した結果を提示している。グラフに示した種々の処理の結果の比較は、リコペンと熱処理ＣＴＣとの間の相乗性を示唆している。

図１２は、加熱ＣＴＣを用いた処理による、培養したＭＣ３Ｔ３骨芽細胞における用量相関性ＡＲＥシグナル伝達の刺激を示す結果を提示している。このモデルでは、非加熱ＣＴＣが効果のないことも観察され得る。

例示する目的で本発明の特定の実施形態を記載してきたが、本発明は、その精神を逸脱することなく、または特許請求の範囲に記載の範囲を超えることなく、数多くの修正、変形および適合を用いて、当業者によって実際に実施され得ることが理解されよう。

Claims (13)

1. ＮＯおよび／またはＴＮＦ−アルファが、治療を要する哺乳類対象における病的状態のモジュレータまたはメディエータとして作用する病的状態を治療するための、熱処理した透明トマト濃縮物（ＣＴＣ）を含む治療用組成物。
2. 総遊離アミノ酸濃度が２％ｗ／ｗ未満である、請求項１に記載の治療用組成物。
3. 遊離グルタミン濃度が０．１％ｗ／ｗ未満である、請求項１に記載の治療用組成物。
4. 熱処理した透明トマト濃縮物（ＣＴＣ）と１種以上のカロテノイドとの相乗的な組み合わせを含む、ＮＯ、ＴＮＦ−アルファおよび／またはインターロイキン１−ベータが、治療を要する哺乳類対象における病的状態のモジュレータまたはメディエータとして作用する病的状態を治療するための治療用組成物であって、カロテノイドがリコペン、フィトエン、フィトフルエン、ベータ−カロテンおよびルテインからなる群より選択される、治療用組成物。
5. 総遊離アミノ酸濃度が２％ｗ／ｗ未満である、請求項４に記載の治療用組成物。
6. 遊離グルタミン濃度が０．１％ｗ／ｗ未満である、請求項４に記載の治療用組成物。
7. カロテノイドがリコペンである、請求項４に記載の治療用組成物。
8. １種以上のカロテノイドがトマト含油樹脂によって提供される、請求項４から６のいずれか一項に記載の治療用組成物。
9. 組成物の総カロテノイド濃度が少なくとも０．１％（ｗ／ｗ）である、請求項４から８のいずれか一項に記載の治療用組成物。
10. リコペン濃度が少なくとも０．１％（ｗ／ｗ）である、請求項９に記載の治療用組成物。
11. 治療される状態が炎症状態である、請求項１に記載の治療用組成物。
12. 治療用組成物が医薬剤形の形態で投与される、請求項１から１０のいずれか一項に記載の治療用組成物。
13. 治療用組成物が食品または飲料中に取り入れられる、請求項１から１０のいずれか一項に記載の治療用組成物。

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