JP6630944B2

JP6630944B2 - ラマン散乱光の観測方法、ラマン散乱光の観測装置及びプログラム

Info

Publication number: JP6630944B2
Application number: JP2016007565A
Authority: JP
Inventors: 達之山本; ヌータラパティヘマンス; 魁上村; 宏夫浜口; 安藤　正浩; 正浩安藤
Original assignee: SPECTROSCOPIC SCIENCE LABORATORY CO., LTD.; National University Corp Shimane University
Current assignee: SPECTROSCOPIC SCIENCE LABORATORY CO., LTD.; National University Corp Shimane University
Priority date: 2016-01-19
Filing date: 2016-01-19
Publication date: 2020-01-15
Anticipated expiration: 2036-01-19
Also published as: JP2017129389A

Description

本発明はラマン散乱光の観測方法、ラマン散乱光の観測装置及びプログラムに関し、特にラマン散乱光を観測して得られる信号品質の向上に関する。

試料に光を当てて反射、屈折、吸収、散乱などの現象を観測し、当該試料の性質や特徴を分析することが広く行われている。散乱は反射、屈折、吸収に比べて微弱な信号しか与えないが、レーザ光を試料に集光することによって観測可能な信号強度を得ることができる。このうち、散乱光の振動数が入射光とのエネルギー差に相当する分だけシフトして観測されるものをラマン散乱という。上記の振動数又は相当する波数のシフト量を、ラマンシフトという。ラマンシフトが試料の主成分物質に固有の値を示すことから、ラマン散乱光を分光して解析するラマン分光法によって試料の計測や解析を行うことができる。

一方、試料が光を吸収した後、そのエネルギーを入射光よりも長波長側の光として放出することがある。これは蛍光と呼ばれる、散乱とは別の物理現象である。特定の蛍光物質からなる試料がそれに固有の蛍光を示す場合もあるが、試料中に混在したり試料の表面に付着したりした不純物に起因して蛍光が観測される場合もある。

試料からラマン散乱光だけでなく強い背景光として蛍光が観測され、ラマン散乱光の観測を妨げることがある。図９は、マウスの食道粘膜に対して一定時間以上にわたり連続的にレーザ光を照射して観測されたラマンスペクトルの一例である。図９の横軸はラマンシフト（単位は波数）、縦軸は信号強度（任意単位）である。上下の２通りのスペクトルのうち、上のスペクトルは試料へのレーザ照射の開始後２０秒の時点で観測されたもので、強い蛍光背景がラマン散乱光に重畳していることがわかる。

図９の下のスペクトルは、試料へのレーザ照射の開始後４００秒の時点で観測されたもので、上のスペクトルに比べて蛍光背景が弱まっていることがわかる。これは、時間の経過にともなう蛍光の消光と呼ばれる現象である（蛍光強度の時間依存性ともいえる。）。そのため従来は、レーザ照射を一定時間以上継続してから（蛍光の消光が進み背景光のレベルが低下してから）ラマンスペクトルを観測するという方法がとられることが多かった（例えば、特許文献１参照。）。

特許文献１に開示されたラマン分光装置は、移動する試料台に載せられて順次搬送されるプラスチックの試料に対して、まず蛍光除去用のレーザ光を照射し、その後に測定用のレーザ光を照射するものである。蛍光除去用のレーザと測定用のレーザは同一でもよく、別個でもよいことが記載されている。また、蛍光除去用のレーザ光を紫外光で代替してもよいことが記載されている。

特開２０１２−２０７９３５号公報

観測されたラマン散乱光の信号対雑音比（ＳｉｇｎａｌｔｏＮｏｉｓｅＲａｔｉｏ，以下ＳＮＲという。）を制限する要因としては、蛍光のような背景光だけでなく観測系に起因するガウス雑音がある。したがって、蛍光強度の時間依存性に基づいてその影響を低減させるだけでなく、ガウス雑音の影響も低減させることが望ましい。従来の技術では、蛍光の消光のための時間が経過した後のある瞬間にラマンスペクトルを計測するから、ガウス雑音の影響は低減されない。従来の技術では生かされていない消光のための時間分のスペクトルデータを何らかの形で利用することができれば、そのスペクトルデータをむだにすることなく、観測されたラマン散乱光のＳＮＲをさらに向上させられる可能性がある。

上述した課題を解決するため、本発明に係るラマン散乱光の観測方法は、試料に対して、連続する複数の時間インターバルにわたってレーザ光を照射し、前記複数の時間インターバルごとに、前記試料から散射されるラマン散乱光及び前記試料から放射される蛍光を集光すると共に、前記ラマン散乱光及び前記蛍光を含むスペクトルを記録し、前記複数の時間インターバルごとに記録されたスペクトルから、多変量解析を用いて、前記ラマン散乱光の強度及び前記蛍光の強度のそれぞれの時間依存性を抽出すると共に前記ラマン散乱光のスペクトルを前記蛍光のスペクトルから分離することを特徴とする。

また、本発明に係るラマン散乱光の観測装置は、レーザ光を照射された試料が散射するラマン散乱光及び前記試料が放射する蛍光を集光すると共に、前記ラマン散乱光及び前記蛍光を含むスペクトルを記録することができる計測部と、前記記録されたスペクトルを前記計測部から受けることができ、かつ、前記試料が連続する複数の時間インターバルにわたり連続してレーザ光を照射されたときに前記複数の時間インターバルごとに記録されたスペクトルから、多変量解析を用いて、前記ラマン散乱光の強度及び前記蛍光の強度のそれぞれの時間依存性を抽出することができると共に前記ラマン散乱光のスペクトルを前記蛍光のスペクトルから分離することができる解析部を備えたことを特徴とする。

本発明によれば、多変量解析を用いて消光のための時間分のスペクトルデータを処理することにより、そのスペクトルデータをむだにすることなく、観測されたラマン散乱光のＳＮＲをさらに向上させることができる。

図１は本発明の実施例に係る観測装置１００の構成を示す系統図である。図２は本発明の実施例に係る全スペクトルデータを得るまでのタイムチャートである。図３は本発明の実施例に係る全スペクトルデータを得るまでのフローチャートである。図４は本発明の実施例を適用したラマンスペクトル観測の系統図である。図５は上記のラマンスペクトル観測で得られた実測スペクトルの一例である。図６は上記のラマンスペクトル観測における行列Wの初期値のスペクトルを示す。図７は上記のラマンスペクトル観測の処理結果である行列Wのスペクトルを示す。図８は上記のラマンスペクトル観測の処理結果である行列Ｈの時系列を示す。図９は従来のラマンスペクトル観測で得られた実測スペクトルの一例である。

以下、図１ないし図８を参照して、本発明の実施例を説明する。図１は、本発明の実施例に係る観測装置１００の構成を示す系統図である。図１の左側には、観測の対象である試料１０を示している。試料１０は、例えばマウスのような生体試料又はその他の試料である。

観測装置１００は、図１において一点鎖線で囲まれた構成を備える。それらの構成は、計測部１１０、解析部１２０及び制御部１３０である。計測部１１０は、受光部１１１、分光部１１２及び記録部１１３を備える。本発明の実施例では、レーザ光源を含む発光部２０も使用される。計測部１１０が発光部２０を含む構成であってもよい。発光部２０及び受光部１１１は、各種の商品化されたラマン分光分析装置の光学系に相当するように構成されることができる（ここでは詳しい説明を省略する。）。

上記の観測装置１００の構成は、後述するようにハードウェア又はソフトウェアを含む多様な手段を用いて実現され得るものであって、必ずしも上記の各構成のとおりに明りょうに区画されたハードウェア又はソフトウェアのブロックが存在することを限定的に意味するものではない。図１において、矢印付きの実線は観測及び処理される信号の流れを示し、矢印付きの破線は制御信号の流れを示す。

発光部２０は試料１０に対して、後述するように制御部１３０から指示された時間にわたって連続してレーザ光を照射する。受光部１１１は、レーザ照射の結果として試料１０から散射されるラマン散乱光及び試料１０由来の蛍光その他の背景光を集光する。分光部１１２は、受光部１１１が集光した光を分析して、ラマンシフトを一方の軸（例えば横軸）及び光の強度を他方の軸（例えば縦軸）とする平面上にそのスペクトルをプロットすることができる。ラマンシフトを表す軸は、光の波数、波長又は振動数のいずれかを単位とすることができる。

制御部１３０は、上記のレーザ光の照射時間を連続する複数の時間インターバルに分けることができる。記録部１１３は、時系列に従って（すなわち、制御部１３０から指示された複数の時間インターバルの順で）、分光部１１２がプロットしたスペクトルを記録することができる。すべての時間インターバルについて記録されたスペクトルのデータ（以下、全スペクトルデータという。）は、例えば行の番号をラマンシフト軸上の位置（ピクセルという。）により、列の番号を上記の時系列上の順序により、それぞれ定めた行列の形で表すことができる。

解析部１２０は、例えばパーソナルコンピュータ（ＰＣ）に組み込まれたソフトウェアによって実現され、上記の全スペクトルデータの行列を入力として後述する多変量解析を含む処理を行うことにより、蛍光成分の信号強度の時系列及びＳＮＲが改善されたラマン散乱光のスペクトルを得ることができる。

観測装置１００の具体的な構成は、上述したものに限らない。それぞれの部分をハードウェア又はファームウェア主体に構成してもよく、ハードウェア又はファームウェアとソフトウェアを適宜組み合わせてもよく、本発明に係るプログラムを商品化された分光分析装置にインストールしたものであってもよい。

図２ないし図８を参照して、観測装置１００を用いて実施するラマン散乱光の観測方法を説明する。図２は、行列の形で記録された全スペクトルデータを得るまでのタイムチャートである。図２の時間軸（ｔ軸）は時間インターバルＴで区切られており、計測部１１０はその区切りごとに制御部１３０の指示に基づいてスペクトルデータを取得して記録する。すなわち、ｔ＝０のタイミングでレーザ照射を開始した後、ｔ＝Ｔ、２Ｔ、…、ＮＴ（Ｎは２桁以上の整数であることが好ましい。）の各タイミングでスペクトルデータを記録し、ｔ＞ＮＴとなった時点でレーザ照射を停止する。

複数の時間インターバルごとにそれぞれのタイミングで記録されたスペクトルデータをラマンシフト軸上のＭ個の位置においてプロットすれば、ｔ≧ＮＴの時点で全スペクトルデータがＭ行Ｎ列の実測値行列Aとして得られる（後述する「数１」式参照。）。図３は、本発明の実施例に係るラマン散乱光の観測方法において、レーザ照射を開始してから全スペクトルデータを得るまでの処理を説明するフローチャートである。動作の開始（ＳＴＡＲＴ）後、制御部１３０は計時値ｔをリセットする（ｔ＝０）と共に時間インターバルの順序ｎを初期化して（ｎ＝１）計時を開始する（ステップＳ３００）。制御部１３０はさらに、発光部２０に対して試料１０へのレーザ光の照射を指示する（ステップＳ３１０）。

制御部１３０は、ｎの値が上限値Ｎ以下であるとき（ステップＳ３２０の“ＹＥＳ”）、計時値ｔが上記の時間軸の区切りｎＴに達したら（ステップＳ３３０の“ＮＯ”）図２の時間軸上で第ｎ番目のタイミングで得られたスペクトルを記録部１１３に記録させる（ステップＳ３４０）。次に制御部１３０は、ｎの値に１を加算して（ステップＳ３５０）ステップＳ３２０に戻る。ｎの値が上限値Ｎを超えたとき（ステップＳ３２０の“ＮＯ”）、制御部１３０は発光部２０に対してレーザ光照射の停止を指示して（ステップＳ３６０）、ここまでの処理を終了する。

次に、解析部１２０が行う全スペクトルデータの処理を説明する。この処理では、全スペクトルデータを表すＭ行Ｎ列の実測値行列Aがラマンスペクトル成分の時系列（時間順の信号強度プロファイル、以下同じ。）と蛍光成分の時系列から構成される点に着目して、行列Aが上記のそれぞれの成分のスペクトルデータを表す列ベクトルからなるM行２列の行列Ｗと、それぞれの成分の強度の時系列データを表す行ベクトルからなる２行N列の行列Ｈに因子分解することを考える（「数１」及び「数２」の各式を参照。「数１」における「実測スペクトル（ｋＴ）」は、図２の時間軸上のタイミング「ｋＴ」（１≦ｋ≦Ｎ）において実測され記録されたスペクトルを表す。）。

上記の「数１」式から行列Ｗを求めることができれば、蛍光スペクトルから分離されると共に、時系列に沿って積分されることによりガウス雑音の影響が軽減されたラマンスペクトルが得られる。したがって、ラマンスペクトルのＳＮＲを従来技術に比して向上させられることが期待される。

「数１」式を解析的に解くことはできないが、行列Ｗになんらかの初期値を与えて最小二乗法により行列Ｈを近似し、そのＨの近似値から最小二乗法によりさらにＷを近似する演算を所与の収束条件を満たすまで繰り返すことにより、行列Ｗ及びＨの近似解を得られることが知られている（交互最小二乗法）。交互最小二乗法において最初に与える行列Ｗの初期値は、乱数スペクトル、行列Ａに対する特異値分解の結果、又は実測スペクトルの線形結合から選ぶことができる。

上述した交互最小二乗法では、実測値を要素とする行列Ａ及び近似値を要素とする行列Ｗ・Ｈの残差の二乗ノルム||Ａ−Ｗ・Ｈ||_２を行列Ｗ又はＨのいずれか一方について最小化することにより、行列Ｗ又はＨのもう一方の次の段階の近似値を求める。この最小化演算をよりシンプル、かつ、高精度なものにするため、複数の条件（ラマンスペクトルの性質を反映した条件と、数学的によく知られた条件）を課すこととする。

ラマンスペクトルの性質を反映した条件は、「数２」式における行列Ｈの第１行ベクトル（ラマンスペクトル強度の時系列）の全要素の値を一定とすることである。図９に示すように、ラマンスペクトルには蛍光のような消光現象が見られず、レーザ光が同一強度で照射されている間は強度がほとんど変化しないことが知られている。したがって演算をシンプルなものにするため、上記の条件を課すものとする。

数学的によく知られた条件の第１は、非負値行列因子分解の条件である（例えば、亀岡「非負値行列因子分解」、計測と制御第５１巻、第９号、ｐｐ．８３５−８４４、２０１２年９月）。行列Ａの全要素は非負であるからこの条件が適用され、その結果として演算をよりシンプルにする効果を得られることが知られている。

数学的によく知られた条件の第２及び第３は、それぞれ、Ｌ１ノルム正則化（ｌａｓｓｏ推定）及びＬ２ノルム正則化（ｒｉｄｇｅ推定）と呼ばれる拘束条件である（例えば、川野他「回帰モデリングとＬ_１型正則化法の最近の展開」、日本統計学会誌第３９巻、第２号、ｐｐ．２１１−２４２、２０１０年３月）。これらの拘束条件に従い、上述した残差の二乗ノルムに正則化項を加算して最小化する。例えば行列Ｈを所与として行列Ｗを近似する場合、「数３」式の値をラマンシフト軸上の各ピクセルｉ（１≦ｉ≦Ｍ）において最小化するように行列Ｗを求める。

「数３」式の第1項は行列Ａ及びＷ・Ｈの残差の二乗ノルムであり、第２項は行ベクトルＷ_ｉのＬ１ノルム（ｐ＝１の場合）又はＬ２ノルム（ｐ＝２の場合）である。変数λは、近似の精度と収束の早さの兼ね合いで決まるパラメータである。このような拘束条件を課すことにより、演算をよりシンプルにしたり結果を安定させたりする効果を得られることが知られている。

本発明の実施例を適用したラマンスペクトル観測の結果の一例を、図４ないし図８を参照して説明する。図４は、当該ラマンスペクトル観測の系統図である。図４を図１に示した観測装置１００の構成と対応させて、以下に説明する。レーザ光源、ＮＤフィルター（強度調節用のフィルター）及び光路に沿って配置された２個のミラーが、図１に示した発光部２０に含まれる。エッジフィルター（レーザ光源からの出射光の通過を阻止するフィルター）及び試料１０の直近に配置されたミラーが受光部１１１を構成すると共に、発光部２０にも含まれる。レーザ照射を受けた試料から受光部１１１が集光したラマン散乱光や蛍光は、分光部１１２に対応するＣＣＤ検出器によって分光され、そのスペクトルデータが記録部１１３及び解析部１２０に対応する解析ソフトウェア付きＰＣに送られる（同ＰＣは、図１に示した制御部１３０の機能を果たしてもよい。）。

図５に、実測スペクトルの一例を示す。この例では、試料にレーザ光を連続して照射しながら、一定のインターバルで２０回にわたりスペクトルを観測して記録した。図５の横軸はラマンシフト(単位は波数)、縦軸は強度（任意単位）である。図５には、上から順に、１回目、２回目、４回目、１０回目及び２０回目の観測で記録されたスペクトルを示している。回数を重ねるにつれ蛍光由来の背景光の強度が低下する一方、ラマンスペクトルの強度（個々のラマンバンドにおけるピークの振幅）はほぼ一定であることがわかる。

図６に、この例で使用した行列Wの初期値のスペクトルを示す。横軸は図５と同じであり、縦軸は上の図及び下の図に分けて強度（任意単位）を表す。上の図は、第１列のラマンスペクトルの初期値として用いた第２回目の実測スペクトルを示す。下の図は、第２列の蛍光スペクトルの初期値として用いた第１回目及び第２回目の実測スペクトルどうしの差を示す。

図７に、二乗誤差||Ａ−Ｗ・Ｈ||_２の収束をもって反復計算の終了を判断した後の処理結果である行列Wのスペクトルを示す。横軸は図５と同じであり、縦軸は上の図及び下の図に分けて強度（任意単位）を表す。上の図は、処理の結果として得られた第１列のラマンスペクトルを示す。下の図は、処理の結果として得られた第２列の蛍光のスペクトルを示す。例えば１６５０ｃｍ^−１のラマンバンド（タンパク質由来）においてラマンスペクトル強度の蛍光（背景光）強度に対する比をとると、図７では１．２３という値が得られた。同じ計算を１回目の実測スペクトルについて行って得た値は０．３であり、全２０回の平均では０．６８であるから、本実施例によるラマンスペクトルのＳＮＲ向上が明らかに実証された。

図８に、上記の反復計算の終了を判断した後の行列Ｈの時系列データを示す。横軸は何回目の観測であるかを示し、縦軸は相対強度を示す。傾きゼロの直線が第１行のラマンスペクトルの時系列を示し、右下がりの曲線が第２行の蛍光スペクトルの時系列を示す（蛍光の消光現象を表している。）。

本発明の実施例によれば、ラマン散乱光に蛍光が重畳して観測される場合に、蛍光のレベルが低下するまでの間に反復して観測したスペクトルデータを活用することによりラマンスペクトルのＳＮＲを改善することができる。以上に述べた実施例は、本発明の要旨の範囲内で適宜変形することができる。例えば、図２では説明の便宜上スペクトルデータ取得のタイミングの周期を一定値（時間インターバルＴ）としたが、必ずしも一定値でなくてもよい。「数３」式に示したパラメータｐの値を１又は２として説明したが、それら以外の数であってもよい。

１０試料
２０発光部
１００観測装置
１１０計測部
１１１受光部
１１２分光部
１１３記録部
１２０解析部
１３０制御部

Claims

試料に対して、連続する複数の時間インターバルにわたってレーザ光を照射し、
前記複数の時間インターバルごとに、前記試料から散射されるラマン散乱光及び前記試料から放射される蛍光を集光すると共に、前記ラマン散乱光及び前記蛍光を含むスペクトルを記録し、
前記複数の時間インターバルごとに記録されたスペクトルから、多変量解析を用いて、前記ラマン散乱光の強度及び前記蛍光の強度のそれぞれの時間依存性を抽出すると共に前記ラマン散乱光のスペクトルを前記蛍光のスペクトルから分離する
ことを特徴とするラマン散乱光の観測方法。
前記多変量解析は、
前記記録されたスペクトルを、前記ラマン散乱光のスペクトル及び前記蛍光のスペクトルからなる第１の行列と、前記複数の時間インターバルごとの順序に対応する前記ラマン散乱光の信号強度プロファイル及び前記複数の時間インターバルごとの順序に対応する前記蛍光の信号強度プロファイルからなる第２の行列に分解して表したとき、
前記記録されたスペクトルが非負値行列で表され、かつ、前記第２の行列の前記ラマン散乱光の信号強度プロファイルが前記複数の時間インターバルごとの順序によらず一定であるという条件に加えて、誤差に正則化項を加算する拘束条件を課した最小二乗法を用いて、前記第１の行列及び前記第２の行列を交互に求める演算を所定の収束条件が満たされるまで反復する
ことを特徴とする請求項１に記載のラマン散乱光の観測方法。
前記正則化項としてＬ１ノルム又はＬ２ノルムを加算する拘束条件を課したことを特徴とする請求項２に記載のラマン散乱光の観測方法。
レーザ光を照射された試料が散射するラマン散乱光及び前記試料が放射する蛍光を集光すると共に、前記ラマン散乱光及び前記蛍光を含むスペクトルを記録することができる計測部と、
前記記録されたスペクトルを前記計測部から受けることができ、かつ、前記試料が連続する複数の時間インターバルにわたり連続してレーザ光を照射されたときに前記複数の時間インターバルごとに記録されたスペクトルから、多変量解析を用いて、前記ラマン散乱光の強度及び前記蛍光の強度のそれぞれの時間依存性を抽出することができると共に前記ラマン散乱光のスペクトルを前記蛍光のスペクトルから分離することができる解析部を
備えたことを特徴とするラマン散乱光の観測装置。
前記解析部は、
前記記録されたスペクトルを、前記ラマン散乱光のスペクトル及び前記蛍光のスペクトルからなる第１の行列と、前記複数の時間インターバルごとの順序に対応する前記ラマン散乱光の信号強度プロファイル及び前記複数の時間インターバルごとの順序に対応する前記蛍光の信号強度プロファイルからなる第２の行列に分解して表したとき、
前記記録されたスペクトルが非負値行列で表され、かつ、前記第２の行列の前記ラマン散乱光の信号強度プロファイルが前記複数の時間インターバルごとの順序によらず一定であるという条件に加えて、誤差に正則化項を加算する拘束条件を課した最小二乗法を用いて、前記第１の行列及び前記第２の行列を交互に求める演算を所定の収束条件が満たされるまで反復することができる
ことを特徴とする請求項４に記載のラマン散乱光の観測装置。
前記解析部は、前記正則化項としてＬ１ノルム又はＬ２ノルムを加算する拘束条件を課すことができることを特徴とする請求項５に記載のラマン散乱光の観測装置。
レーザ光を照射された試料が散射するラマン散乱光及び前記試料が放射する蛍光が集光されて記録されたスペクトルを解析する処理をコンピュータに行わせるプログラムにおいて、
前記試料が連続する複数の時間インターバルにわたり連続してレーザ光を照射されたときに前記複数の時間インターバルごとに記録されたスペクトルから、多変量解析を用いて、前記ラマン散乱光の強度及び前記蛍光の強度のそれぞれの時間依存性を抽出し、
前記ラマン散乱光のスペクトルを前記蛍光のスペクトルから分離する
処理を実行することを特徴とするプログラム。