JP6614435B2 - 乳がんの検査方法 - Google Patents
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Description
(1)被験者から採取された試料を分析して、ポリアミン及びそのモノ又はジアセチル体から選ばれるポリアミン類であって、N1−アセチルスペルミジン(N1−AcSPD)を含む複数種類のポリアミン類の割合から乳がんか否かを判定する乳がんの検査方法。
(2)前記ポリアミン類が、少なくともスペルミン(SPM)、N−アセチルスペルミン(N−AcSPM)、スペルミジン(SPD)、N1−アセチルスペルミジン(N1−AcSPD)、N8−アセチルスペルミジン(N8−AcSPD)及びカダベリン(CAD)を含む前記(1)に記載の検査方法。
(3)被験者から採取された試料が唾液試料である前記(1)又は(2)に記載の検査方法。
試料は使用前にそれぞれの試料に応じて前処理をすることが好ましい。具体的には、唾液試料は使用前に前処理、例えば、アセトニトリル等の有機溶媒による希釈、遠心分離による除タンパクをすることが好ましい。通常、除タンパク後の上清を分析に用いる。
本発明の対象となるポリアミン類としては、N1−アセチルスペルミジン(N1−AcSPD)を含む複数種類のポリアミン類であれば特に制限はなく、N1−アセチルスペルミジン(N1−AcSPD)以外のポリアミン類としては、例えばジアミノプロパン(DAP)、プトレシン(PUT)、N−アセチルプトレシン(N−AcPUT)、カダベリン(CAD)、スペルミジン(SPD)、N8−アセチルスペルミジン(N8−AcSPD)、ジアセチルスペルミジン(DAcSPD)、スペルミン(SPM)、N−アセチルスペルミン(N−AcSPM)、ジアセチルスペルミン(DAcSPM)が挙げられる。
(Yは判別得点を表し、Xは6種のポリアミン類の合計を100%としたときの各ポリアミン類の割合を表し、Aは係数「0.5」、Bは係数「−3」、Cは係数「−0.15」、Dは係数「−3.5」、Eは係数「0.5」、Fは係数「0.04」を表す。)
(実施例1)
個人間の差が小さくなるよう、健常者及び乳がん患者の唾液(初発群、再発群)各20検体を5検体ずつプールしたサンプルを用意し、2倍量のアセトニトリルを加え、遠心分離して除タンパク後の上清を0.45μmフィルターでろ過した。この上清10μLをLC−TOF−MS(Waters)にインジェクションし、分析した。カラムには逆相(RP)系のDiscoveryTMHS F5(SUPELCO)、HILIC系のTSK−Gel Amide80(東ソー)を用い、ESIポジティブ及びネガティブモードの計4系列で測定した。質量範囲はm/z100〜1000、保持時間はRP→0〜20分、HILIC→0〜25分とした。得られたクロマトグラムをMarkerLynx(Waters)で解析した。ポリアミン類の測定には、Anal. Chem. 2013, 85, 11835-11842(非特許文献2)に記載の4−(N,N−ジメチルアミノスルホニル)−7−フルオロ−2,1,3−ベンゾキサジアゾール(DBD−F)を用いる誘導体化によるLC−MS/MS(Xevo TQ−S;Waters)法を用いた。
従って、他のポリアミン類の増減を定量分析することにより更なる情報が得られるのではないかと考え、これらも含んだ一斉分析に着手した。
唾液試料30μL、内部標準(IS)としての1,6−ジアミノヘキサン(DAH)、及びアセトニトリル120μLの混合液を3000gで10分間遠心分離して除タンパクした上清120μLを溶媒留去した。残渣を0.1Mホウ砂水溶液やトリエチルアミン等の塩基に溶解し、4−(N,N−ジメチルアミノスルホニル)−7−フルオロ−2,1,3−ベンゾキサジアゾール(DBD−F)と反応させて誘導体化した後、UPLC−ESI−MS/MSで分析した。
ほとんど全てのポリアミン類が患者群で高くなっている傾向が見られ、特にスペルミン系、スペルミジン系の代謝物にはt検定において有意な差があることが明らかになった。
例えば、N1−アセチルスペルミジン(N1−AcSPD)の割合は乳がん患者初発群で多く、プトレシン(PUT)の割合は健常者群で多い。
従って、割合の値を用いたROC解析を行い、診断指標としてのカットオフ値を設定することとした。
視覚的には十分差があったように見えたが、いずれのポリアミン類も軒並み65%程度とマーカーとしては信頼に値しないものであった。
この結果を受け、特に感度、特異度の和が大きかったものにしぼり、判別分析を行い、精度の高い診断が可能とならないかと検討した。
判別分析で得られた結果を図12に示す。
この判別式が母集団に近いモデルなのかを回帰統計値で確かめた結果、重相関係数は0.5以上またこれに関する分散分析のP値は0.1%程度と十分有用性が得られる結果となった。
以上より、本発明の検査方法は生体試料を用いる乳がん診断に適用できると考えられる。
Claims (4)
- 被験者から採取された試料を分析して、スペルミン、N−アセチルスペルミン、スペルミジン、N1−アセチルスペルミジン、N8−アセチルスペルミジン及びカダベリン(CAD)を含むポリアミン類を定量し、得られた分析結果を次式:
Y=AX SPM +BX N−AcSPM +CX SPD +DX N8−AcSPD +EX N1−AcSPD +FX CAD
(式中、Yは判別得点を表し、Xは前記6種のポリアミン類の合計を100%としたときの各ポリアミン類の割合を表し、Aは係数「0.5」、Bは係数「−3」、Cは係数「−0.15」、Dは係数「−3.5」、Eは係数「0.5」、Fは係数「0.04」を表し、SPMはスペルミン、N−AcSPMはN−アセチルスペルミン、SPDはスペルミジン、N1−AcSPDはN1−アセチルスペルミジン、N8−AcSPDはN8−アセチルスペルミジン、CADはカダベリンを表す。)
で示される判別式に代入し、判別得点Yに基づいて、乳がんか否かを判定する乳がんの検査方法。 - 判別得点Yに基づいて、健常者又は乳がん初発患者のいずれかと判別する請求項1記載の検査方法。
- 判別得点Yが負であれば健常者、正であれば乳がん初発患者と判別する請求項2記載の検査方法。
- 被験者から採取された試料が唾液試料である請求項1〜3のいずれか1項に記載の検査方法。
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