JP6602626B2 - ヒアルロナンを含む複合粒子を含有する乳化組成物 - Google Patents

Description

本発明は、微粒子化したヒアルロナンを皮膚に浸透させるための乳化組成物に関する。

皮膚外用剤の有効成分を角質細胞層内に送達するためには、従来以下のような点が問題とされてきた。
皮膚の角質細胞層は、外界からの異物の侵入を防ぐためにバリア機能を有しており、有効成分が角質細胞層内に到達しにくい。
特に、有効成分が高分子化合物である場合には、高分子化合物が低浸透性であるため角質細胞層内に浸透しにくく、有効成分が皮膚表面で凝集してしまう。

このような状況において、有効成分を角質細胞層内に送達するためのキャリアとして、ナノ粒子の開発が進められてきた。
特許文献１には、核酸、オリゴ核酸、又はその誘導体；カチオン性ポリマー又はカチオン性脂質若しくはそれを含む集合体；及びアニオン性ポリマーを含む複合体の凍結乾燥体が記載されている。

特許文献２には、直径１μｍ未満の活性成分の投与用のナノ粒子を得る方法であって、ａ）ヒアルロナン塩の水溶液を調製し、ｂ）カチオン性ポリマーの水溶液を調製し、ｃ）ポリアニオン塩を前記ヒアルロナン塩溶液に加え、ｄ）前記ｂ）およびｃ）において得られた溶液を撹拌混合し、自然発生的にナノ粒子を得ることを含んでなり、前記ａ）、ｂ）またはｃ）において得られた溶液のうち１つに、あるいは前記ｄ）において得られたナノ粒子の懸濁液に、前記活性成分を溶解させ、ナノ粒子に吸着させる、方法が記載されている。

特許文献３には、生物学的に活性な分子を放出するためのナノ粒子を含んでなる系であって、前記ナノ粒子が、ａ）少なくとも５０重量％のキトサンまたはキトサン誘導体、およびｂ）５０重量％未満のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはＰＥＧ誘導体を含んでなる共役物を含んでなり、前記料成分ａ）とｂ）とが、キトサンアミノ基を介して共有結合しており、前記ナノ粒子が架橋剤により架橋していることを特徴とする系が記載されている。

国際公開第２００７／１３２８７３号パンフレット 特表２００７−５２０４２４号公報 特表２００８−５３３１０８号公報

上述の通り、高分子化合物を皮膚に浸透させるためのナノ粒子が種々提案されている。特に皮膚の保湿性・バリア機能を担うヒアルロナンをナノ粒子化することを目的とする特許文献２に記載の技術は有用である。
しかし、本発明者の検証により、特許文献２等に記載のヒアルロナンを含むナノ粒子は、単相の水溶液の形態として塗布した場合、著しく皮膚への浸透効率が悪いことが確認された。
このような問題に鑑み、本発明の解決しようとする課題は、ヒアルロナンを皮膚に効率よく浸透させるための新規の技術を提供することにある。

上記課題を解決する本発明は、ヒアルロナン及びカチオン性ポリマーを含む複合粒子と、ＬｏｇＰ値が５以下である油剤を含有することを特徴とする乳化組成物である。
ヒアルロナンを含む複合粒子と、上記数値範囲のＬｏｇＰ値を有する油剤を含有する乳化組成物の形態で皮膚に適用することにより、ヒアルロナンを皮膚に浸透させることができる。

本発明の乳化組成物は水中油型とすることが好ましい。このような形態とすることによって、さっぱりとした使用感を有しながらも、ヒアルロナンの皮膚への浸透効率に優れた乳化組成物を提供することができる。

本発明の乳化組成物に含有させる油剤はジカルボン酸エステルであることが好ましい。
油剤としてジカルボン酸エステルを用いることにより、ヒアルロナンの皮膚への浸透効率を向上させることができる。

本発明においては、前記複合粒子は、カチオン性ポリマーに対する親和性がヒアルロナンに比して高い、ヒアルロナン以外のアニオン性ポリマーを含む形態とすることが好ましい。
上記アニオン性ポリマーを含む複合粒子はより粒径が小さく、経時安定性に優れる。その結果、かかる複合粒子を含む形態とすることにより、ヒアルロナンの浸透効率を向上させることができる。

本発明の乳化組成物は高分子乳化剤を含有する形態とすることが好ましい。
高分子乳化剤を含有することによって、ヒアルロナンの皮膚への浸透効率をより向上させることができる。

本発明によれば、ヒアルロナンを高効率で皮膚へ浸透させることが可能な組成物を提供することができる。

比較例１及び２の乳化組成物で処理したヘアレスマウスの皮膚の断面を共焦点レーザー走査型顕微鏡により撮影した写真である。 比較例３及び４の乳化組成物で処理したヘアレスマウスの皮膚の断面を共焦点レーザー走査型顕微鏡により撮影した写真である。 比較例５及び実施例１の乳化組成物で処理したヘアレスマウスの皮膚の断面を共焦点レーザー走査型顕微鏡により撮影した写真である。 ＦＬ−ＨＡを含む複合粒子の標準水溶液と、ＦＬ−ＨＡ単独の標準水溶液をＨＰＬＣ分析することで得られたチャートを示す。 ＦＬ−ＨＡを含む複合粒子の標準水溶液をＨＰＬＣ分析することにより作成した検量線を示す。 ＦＬ−ＨＡ単独の標準水溶液をＨＰＬＣ分析することにより作成した検量線を示す。 実施例１と比較例５の乳化組成物で処理したヘアレスマウスの皮膚をＨＰＬＣ分析することにより得られたチャートを示す。 実施例１と比較例５の乳化組成物で処理したヘアレスマウスの皮膚をＨＰＬＣ分析した結果を図５及び図６の検量線に当てはめて算出した、ＦＬ−ＨＡ濃度を表す棒グラフを示す。 ＵＶＢ照射を行った後、実施例１及び比較例５及び６の乳化組成物を塗布したヘアレスマウスの背部皮膚におけるＴＥＷＬの測定値を表す棒グラフを示す。対象実験として無処置のヘアレスマウスの背部皮膚におけるＴＥＷＬを測定した。

本発明の乳化組成物は、複合粒子と油剤を含む。以下、必須成分である複合粒子と油剤の説明を行ってから乳化組成物について説明を加える。

＜１＞複合粒子
（１）ヒアルロナン
複合粒子はヒアルロナンを含む。ヒアルロナンは、Ｄ−グルクロン酸およびＤ−Ｎ−アセチルグルコサミンの二糖を繰り返し単位とする多糖である。

本発明で用いられるヒアルロナンの分子量は制限されないが、好ましくは１００〜２０００ｋＤａ、さらに好ましくは２００〜１５００ｋＤａのものを用いることができる。
６００ｋＤａ以上の大きい分子量のヒアルロナンを用いても、後に詳述する、複合粒子の形態とすることによって、１００ｎｍ以下のナノ粒子を形成することが可能である。

ヒアルロナンは、ヒアルロン酸、又はヒアルロン酸塩のいずれであっても良い。
ヒアルロン酸塩を形成する塩としては、ナトリウム、カリウム、カルシウム、アンモニウム、マグネシウム、塩基性アミノ酸塩などが挙げられる。
ヒアルロナンは、市販品を用いることが可能である。

（２）カチオン性ポリマー
本発明で用いられるカチオン性ポリマーは、少なくとも水中でカチオン性を示し、ヒアルロナンに対して親和性を有するものである。本発明で用いられるカチオン性ポリマーは、好ましくは、天然又は合成タンパク質、又は合成高分子である。
カチオン性基又は上述した官能基として、カチオン性アンモニウム基やグアニジノ基、または、陽イオン化することのできる１級、２級、または３級のアミノ基やイミノ基が挙げられる。本発明のカチオン性ポリマーは、これらの基をポリマーの側鎖、または主鎖中に含有するものである。
このようなカチオン性ポリマーを用いることにより、後述するアニオン性ポリマーとの相互作用により、形成される複合粒子を強固なものとすることができ、複合粒子が微小化され、また、粒子の安定性が高まる。
例えば、前記カチオン性ポリマーは、ポリペプチドやタンパクである。このようなポリペプチドとして、プロタミン、ポリリジン、キトサンなどが例示できる。

（３）ヒアルロナン以外のアニオン性ポリマー
本発明においては、カチオン性ポリマーに対する親和性がヒアルロナンより高い、ヒアルロナン以外のアニオン性ポリマーを複合粒子に含有させることが好ましい。
複合粒子における第三の成分としてカチオン性ポリマーに対する親和性がヒアルロナンよりも高いアニオン性ポリマーを用いることにより、形成される複合粒子を強固なものとすることができ、粒子同士の凝集を防ぐことが可能となる。

例えば、前記アニオン性ポリマーは、硫酸化ポリマー、又はカルボキシル基高含有ポリマーである。
硫酸化ポリマーとしては、コンドロイチン硫酸、デキストラン硫酸、ヘパラン硫酸、デルマタン硫酸、フコイダン、ケラタン硫酸、ヘパリンなどの硫酸化多糖や、硫酸化ポリビニルアルコールなどの強酸性ポリマーが挙げられる。
カルボキシル基高含有ポリマーは、ヒアルロナンよりもカチオン性ポリマーに対して親和性が高いものとなるように多量のカルボキシル基を有しているポリマーと定義される。
カルボキシル基高含有ポリマーとしては、ポリアクリル酸、ポリアルギン酸、ポリアスパラギン酸などのカルボキシル基高含有ポリマーなどが挙げられる。
本発明の複合粒子を皮膚外用剤、化粧料などに用いる場合には、その安全性から硫酸化多糖を用いることが特に好ましい。
前記アニオン性ポリマーの分子量は、特に制限されないが、コンドロイチン硫酸を用いる場合は、５〜８０ｋＤａ程度のものを用いることができる。また、１０〜１５０００ｋＤａ程度のものを用いることが可能である。

（４）複合粒子
本発明の複合粒子は、上述したヒアルロナン及びカチオン性ポリマーを必須成分として含む。
上記２成分により複合粒子を構成する場合には、各成分の割合は、以下を基準とすることができる。なお、以下の基準は、仕込み質量％である。
ヒアルロナン：好ましくは２０〜８０質量％、さらに好ましくは２５〜７０質量％、より好ましくは３０〜６０質量％
カチオン性ポリマー：好ましくは１５〜４５質量％、さらに好ましくは２０〜４０質量％、より好ましくは２５〜３５質量％

複合粒子は、さらにカチオン性ポリマーに対する親和性がヒアルロナンよりも高いアニオン性ポリマーを含む形態とすることが好ましい。
該アニオン性ポリマーを含む３成分により複合粒子を構成する場合には、各成分の割合は、以下を基準とすることができる。なお、以下の基準は、仕込み質量％である。
ヒアルロナン：好ましくは２０〜５０質量％、さらに好ましくは２５〜４５質量％、より好ましくは３０〜４０質量％
カチオン性ポリマー：好ましくは１５〜４５質量％、さらに好ましくは２０〜４０質量％、より好ましくは２５〜３５質量％
アニオン性ポリマー：好ましくは２０〜５０質量％、さらに好ましくは２５〜４５質量％、より好ましくは３０〜４０質量％

（５）複合粒子の製造方法
本発明では、上述した成分の水溶液を混合撹拌することにより複合粒子を製造することができる。

以下、具体的な実施形態について、説明する。
（Ｉ）ヒアルロナン溶液の調製
ヒアルロナン水溶液を調製する。
ヒアルロナン水溶液におけるヒアルロナンの濃度は、好ましくは５〜５０００μｇ／ｍＬであり、より好ましくは１０〜１０００μｇ／ｍＬであり、さらに好ましくは２００〜１０００μｇ／ｍＬである。
このような濃度に調節しておくことにより、後の工程でカチオン性ポリマーと混合した際に、粒子の不要な凝集を回避することができる。

（ＩＩ）カチオン性ポリマー溶液の調製
カチオン性ポリマー水溶液を調製する。
カチオン性ポリマー水溶液におけるカチオン性ポリマーの濃度は、好ましくは５〜５０００μｇ／ｍＬ、さらに好ましくは１０〜１０００μｇ／ｍＬである。
このような濃度に調節しておくことにより、後の工程でヒアルロナン水溶液、アニオン性ポリマー水溶液と混合した際に、粒子の不要な凝集を回避することができる。

（ＩＩＩ）アニオン性ポリマー溶液
ヒアルロナン以外のアニオン性ポリマーを含む複合粒子を調製する場合には、アニオン性ポリマーの濃度が、好ましくは５〜５０００μｇ／ｍＬ、さらに好ましくは１０〜１０００μｇ／ｍＬとなるように水溶液を調製することが好ましい。
このような濃度に調節しておくことにより、後の工程でヒアルロナン水溶液、カチオン性ポリマー水溶液と混合した際に、粒子の不要な凝集を回避することができる。

（ＩＶ）各溶液の混合
続いて、調製したヒアルロナン溶液、カチオン性ポリマー溶液、好ましい形態ではさらにアニオン性ポリマー溶液を混合する。
各溶液の混合割合は、例えば以下を基準として決定することが好ましい。
カチオン性ポリマーの量は、カチオン性基（カチオンになりうる官能基）が、ヒアルロン酸とこれ以外のアニオン性ポリマーのアニオン性基（アニオンになりうる官能基）の総和のモル比にして０．６倍〜１０倍程度となるような量とすることが好ましい。

混合後の溶液に対するヒアルロナンの濃度が、好ましくは３〜３０００μｇ／ｍＬ、より好ましくは１０〜５００μｇ／ｍＬ、さらに好ましくは１００〜５００μｇ／ｍＬである。
混合後の溶液に対するカチオン性ポリマーの濃度が、好ましくは３〜３０００μｇ／ｍＬ、さらに好ましくは１０〜５００μｇ／ｍＬである。

さらにカチオン性ポリマーに対する親和性がヒアルロナンよりも高いアニオン性ポリマーを含む複合粒子を調製する場合には、混合後の溶液に対する該アニオン性ポリマーの濃度が、好ましくは３〜３０００μｇ／ｍＬ、さらに好ましくは１０〜５００μｇ／ｍＬである。

また、溶液における各成分の濃度は、荷電官能基の濃度にして０．０３ｍＭより大きくすること、例えば０．１〜２ｍＭ程度とすることが、複合粒子の製造効率の点から好ましい。また、上述した３成分を用いることで、上記のような濃度範囲で調整しても微粒子を製造することが可能となる。

混合の方法としては、各溶液を一度に混合する方法、一つの溶液に、他の溶液を滴下する方法などが挙げられる。いずれも、溶液を撹拌しながら混合を行うことが、凝集を回避する観点から好ましい。

ヒアルロナン、カチオン性ポリマー、及びカチオン性ポリマーに対する親和性がヒアルロナンよりも高いアニオン性ポリマーの３成分を含有する複合粒子を調製する場合には、これらの水溶液の混合の順序は特に制限されないが、アニオン性ポリマー溶液を、予めヒアルロナン溶液と混合しておいて、ここに、カチオン性ポリマー溶液を混合する方法が、作製される粒子を微小化する観点から特に好ましい。

このようにして作製した複合粒子は、凍結乾燥して保存することが可能である。
また、凍結乾燥後、再水和（再溶解）することも可能である。

複合粒子の平均粒子径は、好ましくは１０００ｎｍ以下、より好ましくは５００ｎｍ以下、より好ましくは３００ｎｍ以下、さらに好ましくは１００ｎｍ以下とする。

＜２＞油剤
本発明に用いる油剤のＬｏｇＰ値は５以下であり、好ましくは４以下であり、より好ましくは１〜４である。
このようなＬｏｇＰ値の油剤を用いることによって、複合粒子に含まれるヒアルロナンを効率的に皮膚に浸透させることが可能になる。

ここで「ＬｏｇＰ値」とは、水と１−オクタノールに対する有機化合物の親和性を示す係数である。１−オクタノール／水分配係数Ｐは、１−オクタノールと水の二液相の溶媒に微量の化合物が溶質として溶け込んだときの分配平衡で、それぞれの溶媒中における化合物の平衡濃度の比であり、底１０に対するそれらの対数ＬｏｇＰで示す。すなわち、「ＬｏｇＰ値」とは、１−オクタノール／水の分配係数の対数値であり、分子の親疎水性を表すパラメータである。
ｌｏｇＰ値は、ＭｅｙｌａｎおよびＨｏｗａｒｄによる論文「Ａｔｏｍ／Ｆｒａｇｍｅｎｔ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｅｓｔｉｍａｔｉｎｇ ｏｃｔａｎｏｌ−ｗａｔｅｒ ｐａｒｔｉｔｉｏｎ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ」、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．８４：８３〜９２、１９９５に記載の方法に従って計算することができる。この値はまた、市販の多数のソフトウエアパッケージにより計算することができ、これは、ｌｏｇＰ値を分子構造の関数として決定する。一例として、米国環境庁からのソフトウエアＥｐｉｗｉｎ、およびｔｈｅ Ｖｉｒｔｕａｌ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙソフトウエアを挙げることができる。

上記数値範囲のＬｏｇＰ値を有する油剤であれば特に制限なく適用することが可能であるが、より好ましくはジカルボン酸エステルである油剤を用いることが好ましい。
ジカルボン酸エステルとしては、アジピン酸ジイソプロピル（ＬｏｇＰ≒３）、セバシン酸ジイソプロピル（ＬｏｇＰ≒４）などが好ましく挙げられる。

＜３＞乳化組成物
本発明の乳化組成物は複合粒子を含む水相と、ＬｏｇＰ値が５以下である油剤を含む油相からなる。本発明の乳化組成物は水中油型であっても油中水型であってもよいが、好ましくは水中油型の乳化組成物とする。

水相における複合粒子の含有量は、特に制限されないが好ましくはヒアルロナン及び／又はその塩のモル濃度換算で、好ましくは０．００１〜１００ｍＭ、より好ましくは０．０１〜５０ｍＭ、さらに好ましくは０．０５〜１０ｍＭとすることができる。

油相におけるＬｏｇＰ値が５以下である油剤の含有量は、特に制限されないが好ましく５０〜１００質量％であり、より好ましくは８０〜１００質量％とすることができる。

以下、水中油型とする場合の本発明の乳化組成物の製造方法について説明する。
（Ｉ）水相の調製
上述の方法で調製した複合粒子を含む水相成分を撹拌混合し、水相を調製する。水相には乳化剤を添加することが好ましく、特に高分子乳化剤を添加することが好ましい。

本発明において高分子乳化剤とは、重合体をその構成要素として含む両親媒性の分子のことを言う。高分子乳化剤としては、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリグリセリン、ポリオキシエチレン又はこれらの共重合体等の重合体を親水性基として有する乳化剤を用いることが好ましく、特に好ましくはアクリル酸・メタクリル酸アルキル共重合体を用いる。
特にゲル化効果、増粘効果を有する高分子乳化剤を用いることが好ましい。このような高分子乳化剤としては、グッドリッチ社より市販されている、ペムレンＴＲ−１とペムレンＴＲ−２等が好ましく例示できる。

高分子乳化剤として上のようなゲル化剤を用いる場合には、アルカリ性の化合物を水相成分に加える工程を踏むことで水相をゲル化しても良い。アルカリ性の化合物としては、水酸化ナトリウムや水酸化カリウムが好適に例示できる。

本発明の乳化組成物を水中油型とする場合には、高分子乳化剤の含有量は、好ましくは０．０５〜３質量％、より好ましくは０．１〜１質量％とすることが好ましい。

また、水相にはポリオールを含有させてもよい。ポリオールとしては化粧料に適用することができるものであれば特に制限されず、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、それらの共重合体及び誘導体や、ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリンのような低分子量のポリオールを例示することができる。
水相におけるポリオールの含有量は、好ましくは２〜３０質量％、より好ましくは５〜２０質量％、さらに好ましくは１０〜１５質量％とすることができる。

（ＩＩ）乳化
水相成分と油相成分の調製の後、水相と油相を撹拌混合し乳化する。
水相と油剤の質量比は、好ましくは１：１〜１０：１、より好ましくは１．５：１〜７：１、さらに好ましくは２：１〜４：１である。

＜試験例１＞ｉｎ ｖｉｔｒｏ皮膚浸透試験（Ｉ）
（１）複合粒子の作製
フルオレセインアミン標識ヒアルロン酸ナトリウム（平均分子量 １２０万、岩井化学薬品社、以下、ＦＬ−ＨＡとも言う）の水溶液と、プロタミン（ナカライテスク社、以下ＰＲＴとも言う）の水溶液を、調製電荷比がＦＬ−ＨＡ：ＰＲＴ＝５５：４５、ＦＬ−ＨＡの濃度が０．９ｍＭとなるように混合し、１５分間撹拌を続けることで複合粒子を作製した。
なお、ＦＬ−ＨＡは文献Ｊ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ ２００８； １０： ７０−８０に記載のある方法に従い、合成することもできる。

また、ＦＬ−ＨＡ水溶液とＰＲＴ水溶液を、上と同一の調製電荷比（ＦＬ−ＨＡ：ＰＲＴ＝５５：４５）で、ＦＬ−ＨＡの濃度が０．１ｍＭとなるように混合し、１５分間撹拌を続けることで調製した複合粒子の平均粒子径とゼータ電位を測定した結果を表１に示す。
なお、複合粒子の平均粒子径はＺｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ−ＺＳ ＺＥＮ３６００、Ｍａｌｖｅｒｎ社（動的光散乱法）を用いて測定した。また、ゼータ電位はＺｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ−ＺＳ ＺＥＮ３６００、Ｍａｌｖｅｒｎ社（レーザードップラー法）を用いて測定した。

調製した複合粒子のゼータ電位は表１に示すように、−２７．３７ｍＶであった。ゼータ電位においてヒアルロナン単体は約−６３ｍＶであるため、表１の結果はヒアルロナンとプロタミンが複合粒子を形成していることを示している。

（２）乳化組成物の作製
表２に示す処方の乳化組成物を以下の方法により作製した。すなわち、表２に示した水酸化カリウム以外の水相成分を７０℃に加熱し、ホモジナイザーで撹拌・混合（５０００ｒｐｍ、５分）した後、水酸化カリウムを添加することでゲル化した。この混合液に７０℃に調整した油剤を加え、ホモジナイザーで混合・撹拌（１００００ｒｐｍ、５分）した。その後、３０℃まで冷却することで乳化組成物を得た。
なお、油剤としてはＬｏｇＰ値がそれぞれ１４、６、３であるスクワラン、流動パラフィン及びアジピン酸ジイソプロピルを用いた。また、比較例として複合粒子の水溶液に代えてＦＬ−ＨＡ水溶液（０．９ｍＭ）を用いて乳化組成物を調製した。

（３）Ｉｎ ｖｉｔｒｏ皮膚浸透試験（蛍光顕微鏡観察）
雄性ヘアレスマウス（系統 Ｈｏｓ：ＨＲ−１、７−８週齢）の全層皮膚を採取し、有効透過面積１．７７ｃｍ^２の縦型拡散セルに装着し、レシーバー側（真皮側）にＰＢＳ ５ｍＬを適用した。その後、実施例１及び比較例１〜５の乳化組成物をドナー側に１ｍＬ適用し、４８時間の処理を行った。処理後、皮膚表層の余剰製剤を数回のテープストリップで除去した後、全層皮膚の断面を共焦点レーザー走査型顕微鏡により蛍光観察を行った。結果を図１〜３に示す。

図１及び２に示すように、油剤としてＬｏｇＰ値が１４のスクワランと、ＬｏｇＰ値が６の流動パラフィンを用いた乳化組成物（比較例１〜４）を適用した場合には、皮膚中にＦＬ−ＨＡの蛍光を観察することはできなかった。また、油剤としてＬｏｇＰ値が３であるアジピン酸ジイソプロピルを用いた場合であっても、ＦＬ−ＨＡ単独の水溶液を水相成分とした乳化組成物（比較例５）では皮膚中にＦＬ−ＨＡの蛍光を観察することはできなかった（図３）。
一方、油剤としてＬｏｇＰ値が３であるアジピン酸ジイソプロピルを用い、かつ、水相成分としてＦＬ−ＨＡを含む複合粒子を含有する乳化組成物（実施例１）を適用した場合には、皮膚中にＦＬ−ＨＡの蛍光を観察することができた（図３）。
これらの結果は、ヒアルロナン及び／又はその塩を含む複合粒子と、ＬｏｇＰ値が５以下の油剤を含む乳化組成物によれば、ヒアルロナンを効率よく皮膚へ浸透させることができることを示している。

＜試験例２＞ｉｎ ｖｉｔｒｏ皮膚浸透試験（ＩＩ）
濃度既知であるＦＬ−ＨＡを含む複合粒子の標準水溶液と、ＦＬ−ＨＡ単独の標準水溶液を以下の条件でＨＰＬＣ分析し、検量線を作成した。図４にＨＰＬＣ分析の結果を表すチャートを示し、図５と図６に検量線を示す。
・分析装置：ＲＦ−ＡＸＬ
・カラム：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ Ｄｉｏｌ−３００、３００×８．０ｍｍｌ．Ｄ．，Ｓ−５μｍ，３０ｎｍ
・移動相：１０ｍＭ 酢酸アンモニウム／メタノール＝８０／２０
・流速：１．０ｍＬ／分
・温度：４０℃
・波長：λ_ｅｘ＝４９４ｎｍ，λ_ｅｍ＝５２１ｎｍ

試験例１の（３）に記載した方法により、実施例１と比較例５の乳化組成物で処理した皮膚を回収し、皮膚表層の余剰製剤を数回のテープストリップで除去した後、５０％メタノール水溶液中でホモジナイズした後、遠心分離した（１５４００×ｇ、２５℃、５分）。この上清について上述の条件でＨＰＬＣ分析を行い、皮膚中に含まれるＦＬ−ＨＡを定量した。ＨＰＬＣ分析により得られたチャートを図７に示し、その結果を図５及び図６の検量線に当てはめて算出したＦＬ−ＨＡ濃度を表す棒グラフを図８に示す。

図８に示す結果は、比較例５の乳化組成物を適用した皮膚では全くＦＬ−ＨＡが検出されなかった一方、実施例１の乳化組成物を適用した皮膚中にはＦＬ−ＨＡが含まれていることを示している。
この結果は、ヒアルロナン及び／又はその塩を含む複合粒子と、ＬｏｇＰ値が５以下の油剤を含む乳化組成物によれば、ヒアルロナンを効率よく皮膚へ浸透させることができることを示している。

また、図７に示すように、実施例１の乳化組成物を適用した皮膚についてＨＰＬＣ分析を行うと、溶出時間約６分の時点にシグナルピークが見られる。これは、図４に示した複合粒子を形成していないＦＬ−ＨＡのシグナルピークが観察される溶出時間と一致している。
この結果は、本発明の乳化組成物は微粒子化した複合粒子の形態でヒアルロナン及び／又はその塩を皮膚に適用するものであるが、皮膚への浸透後においては、ヒアルロナン及び／又はその塩は微粒子化されていない状態で存在することを示している。つまり、本発明によれば、内在性のヒアルロナンと同じ状態のヒアルロナンを皮膚内部に導入することができ、皮膚のバリア機能を向上させることができることを示している。

＜試験例３＞ｉｎ ｖｉｖｏ試験
試験例１の方法で調製した複合粒子を用いて、表３に示す処方で実施例２の乳化組成物を作製した。また、複合粒子水溶液に代えて、それぞれＦＬ−ＨＡ水溶液（０．９ｍＭ）、精製水を含む比較例６及び比較例７の乳化組成物を作製した。

７日間予備飼育を行った雄性ヘアレスマウス（Ｈｏｓ：ＨＲ−１、７週齢）の背部皮膚にＵＶＢを照射した（６０ｍＪ／ｃｍ^２）。その後、実施例２、比較例６及び比較例７の乳化組成物をそれぞれ塗布した。このＵＶＢの照射と乳化組成物の塗布を一日１回、合計４日間にわたって行った。最後のＵＶＢ照射と乳化組成物の塗布から一日後に、ＶＡＰＯ ＳＣＡＮ ＡＳーＶＴ１００ ＲＳ（アサヒバイオメッド社製）を用いて、マウスの背部皮膚におけるＴＥＷＬ（Ｔｒａｎｓｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｗａｔｅｒ ｌｏｓｓ、経皮水分蒸散量）を計測した。対象実験としてＵＢＶの照射及び乳化組成物の塗布を行っていないマウスの背部皮膚におけるＴＥＷＬも計測した。その結果を図９に示す。

図９に示すように、ＵＶＢ照射の後に、比較例６及び比較例７の乳化組成物を塗布したマウス背部皮膚においては、何も処置をしていないマウスの背部皮膚に比してＴＥＷＬが３倍以上上昇していた。
一方、ＵＶＢ照射の後に実施例２の乳化組成物を塗布したマウス背部皮膚のＴＥＷＬは、何も処置をしていないマウスの背部皮膚のＴＥＷＬに対して２倍程度の上昇にとどまっていた。つまり、比較例６及び比較例７を適用した場合に比べて、実施例１の乳化組成物を適用した場合では、ＵＶＢ照射によるＴＥＷＬの上昇の程度が有意に低い。
この結果は、本発明の乳化組成物を適用することにより、ＵＶＢの照射による皮膚バリア機能の低下を抑制することができることを示している。

本発明は化粧料に応用することができる。

Claims (6)

1. ヒアルロナン及びカチオン性ポリマーを含む複合粒子と、ＬｏｇＰ値が５以下である油剤を含有し、
   複合粒子の平均粒子径が１０００ｎｍ以下であり、
   前記油剤がジカルボン酸エステルであり、
   前記カチオン性ポリマーが、プロタミン、ポリリジン、キトサンから選ばれる１又は２以上であることを特徴とする乳化組成物。
2. 水中油型であることを特徴とする、請求項１に記載の乳化組成物。
3. 前記油剤がアジピン酸ジイソプロピル及び／又はセバシン酸ジイソプロピルであることを特徴とする、請求項１又は２に記載の乳化組成物。
4. 前記複合粒子がヒアルロナン以外のアニオン性ポリマーを含み、該アニオン性ポリマーは、前記カチオン性ポリマーに対する親和性がヒアルロナンに比して高いことを特徴とする、請求項１〜３の何れか一項に記載の乳化組成物。
5. 高分子乳化剤を含有することを特徴とする、請求項１〜４の何れか一項に記載の乳化組成物。
6. ＬｏｇＰ値が５以下である油剤の油相における含有量が５０〜１００質量％であることを特徴とする、請求項１〜５の何れか一項に記載の乳化組成物。