JP6120397B2 - キトサン及びヒアルロナンを含むナノ粒子の製造方法 - Google Patents
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皮膚の角層細胞層は、外界からの異物の侵入を防ぐためにバリア機能を有しており、有効成分が角層細胞層内に到達しにくい。
特に、有効成分が高分子化合物である場合には、高分子化合物が低浸透性であるため角層細胞層内に浸透しにくく、有効成分が皮膚表面で凝集してしまう。
特許文献1には、核酸、オリゴ核酸、又はその誘導体;カチオン性ポリマー又はカチオン性脂質若しくはそれを含む集合体;及びアニオン性ポリマーを含む複合体の凍結乾燥体が記載されている。
d)前記b)およびc)において得られた溶液を撹拌混合し、自然発生的にナノ粒子を得ることを含んでおり、前記a)、b)またはc)において得られた溶液のうち1つに、あるいは前記d)において得られたナノ粒子の懸濁液に、前記活性成分を溶解させ、ナノ粒子に吸着させる、方法が記載されている。
そこで、本発明は、キトサン及びヒアルロナンを含むナノ粒子を製造する方法であって、新規な方法を提供することを課題とする。
即ち、本発明は、以下のとおりである。
このような製造方法を用いることにより、製造される複合粒子の粒径を小さくすることが可能となる。
特に、大きな分子量のヒアルロナンを用いた場合にも、効率的にナノサイズの複合粒子(ナノ粒子)、例えば160nm以下、好ましくは100nm以下の複合粒子を製造することが可能となる。
このような工程で、複合粒子を製造することにより、粒子の凝集を防ぎ、より小さい粒径の複合粒子を安定的に製造することが可能となる。
pH7.0以下のクエン酸緩衝液を用いることにより、容易に小さい粒径の複合粒子を製造することが可能となる。
クエン酸緩衝液のクエン酸濃度を0.1〜10mMとすることにより、容易に小さい粒径の複合粒子を製造することが可能となる。
このような比率で、ヒアルロナンとキトサンを複合化することにより、容易に小さい粒径の複合粒子を製造することが可能となる。
本発明の複合粒子は、それ自体を有効成分として、又は皮膚の角質層内に他の有効成分を送達するためのキャリアとして、使用することが可能である。
まず、複合粒子を形成する各成分について説明する。
本発明で用いられるヒアルロナンは、D−グルクロン酸およびD−N−アセチルグルコサミンの二糖を繰り返し単位とする多糖である。
後に詳述する本発明の方法を用いることにより、600kDa以上の大きい分子量のヒアルロナンを用いても、100nm以下のナノ粒子を形成することが可能である。
ヒアルロン酸塩を形成する塩としては、ナトリウム、カリウム、カルシウム、アンモニウム、マグネシウム、塩基性アミノ酸塩などが挙げられる。
ヒアルロナンは、市販品を用いることが可能である。
キトサンは、キチンの脱アセチル化により得られ、グルコサミンを繰り返し単位とする多糖である。キトサンの脱アセチル化度は、例えば50〜98%程度である。
本発明で用いられるキトサンの分子量は制限されないが、例えば1〜500kDa、好ましくは10〜300kDa、さらに好ましくは19〜110kDaのものを用いることができる。
キトサンは、市販品を用いることが可能である。
また、本発明においては、製造される複合粒子の保存安定性を高める目的で、複合粒子の成分として、ヒアルロナン以外のアニオン性ポリマーをさらに組み合わせることが好ましい。
アニオン性ポリマーとしては、ヒアルロナンよりもキトサンに親和性が高いものであればよい。
たとえば、コンドロイチン硫酸、デキストラン硫酸、ヘパラン硫酸、デルマタン硫酸、フコイダン、ケラタン硫酸、ヘパリンなどの硫酸化多糖や、硫酸化ポリビニルアルコールなどの強酸性ポリマーや、ポリアクリル酸、ポリアルギン酸、ポリアスパラギン酸などのカルボキシル基高含有ポリマーなどが挙げられる。
本発明では、ヒアルロナンとキトサンを、クエン酸緩衝液の存在下で複合することにより複合粒子を製造する点に特徴を有する。
クエン酸緩衝液のpHは、好ましくは7.0以下、さらに好ましくは6.8以下、より好ましくは6.5以下である。また、pHの下限値は特に制限されないが、例えば皮膚外用剤などに用いる場合には、皮膚への刺激性の観点などから、pH5.5程度を下限とすることが好ましい。
(1)ヒアルロナン溶液の調製
溶媒として、クエン酸緩衝液(pH6.5)を用い、ヒアルロナン溶液を調製する。
ヒアルロナン溶液におけるヒアルロナンの濃度は、好ましくは200〜5000μg/mL、さらに好ましくは500〜3000μg/mL、より好ましくは1000〜2000μg/mLである。
このような濃度に調節しておくことにより、後の工程でキトサン溶液と混合した際に、粒子の不要な凝集を回避することができる。
溶媒として、上述したクエン酸緩衝液を用い、キトサン溶液を調製する。
キトサン溶液におけるキトサンの濃度は、好ましくは200〜5000μg/mL、さらに好ましくは500〜3000μg/mL、より好ましくは1000〜2000μg/mLである。
このような濃度に調節しておくことにより、後の工程でヒアルロナン溶液と混合した際に、粒子の不要な凝集を回避することができる。
アニオン性ポリマー溶液におけるアニオン性ポリマーの濃度は、好ましくは200〜5000μg/mL、さらに好ましくは500〜3000μg/mL、より好ましくは1000〜2000μg/mLである。
続いて、調製したヒアルロナン溶液とキトサン溶液を混合する。
両者の混合割合は、例えば以下を基準として決定することが好ましい。
キトサン由来のアミノ基の数1に対して、ヒアルロナン由来のカルボキシル基の数が、0.1以上、好ましくは0.2〜5、より好ましくは0.5〜1である。
混合後の溶液に対するヒアルロナンの濃度が、好ましくは1〜2000μg/mL、さらに好ましくは10〜1000μg/mLである。
混合後の溶液に対するキトサンの濃度が、好ましくは1〜1000μg/mL、さらに好ましくは10〜500μg/mLである。
混合の方法としては、両溶液を一度に混合する方法、一方の溶液に、もう一方の溶液を滴下する方法などが挙げられる。いずれも、溶液を撹拌しながら混合を行うことが、凝集を回避する観点から好ましい。
また、一方の溶液に、もう一方の溶液を滴下する方法においては、ヒアルロナン溶液をキトサン溶液に滴下する方法が、より小さな粒径の粒子を作製する観点から好ましい。
また、アニオン性ポリマー溶液をさらに加える場合は、一度に混合しても良いし、予めキトサン溶液と混合しておいて、後にヒアルロナン溶液を滴下しても良い。
ヒアルロン酸ナトリウム(発酵法由来、平均分子量480kDa)MRCポリサッカライド社製
ヒアルロン酸ナトリウム(トサカ由来、平均分子量600kDa)生化学工業社製
ヒアルロン酸ナトリウム(発酵法由来、平均分子量800kDa)MRCポリサッカライド社製
ヒアルロン酸ナトリウム(発酵法由来、平均分子量910kDa)MRCポリサッカライド社製
ヒアルロン酸ナトリウム(発酵法由来、平均分子量1300kDa)MRCポリサッカライド社製
キトサン(平均分子量34.3kDa)焼津水産化学社製
表1に示す割合で、種々の分子量のヒアルロン酸ナトリウムとキトサン(34.3kD
a)を用いて、複合粒子を作製した。
すなわち、溶媒として、クエン酸緩衝液(クエン酸濃度が1mM、pH6.5)、PBS(pH6.5、PBSの組成は、[KCl]=2.7mM、[KH2PO4]=1.5mM、[NaH2PO4・7(H2 O)]=8.1mM、[NaCl]=137mM)、又はMOPS(10mM、pH6.5)を用いて、ヒアルロン酸ナトリウム溶液とキトサン溶液を調製し、キトサン溶液を撹拌しながら、キトサン溶液にヒアルロン酸溶液を滴下した。
表1に、得られた複合粒子の粒子径と、複合粒子の表面電荷を示す。
複合粒子の平均粒子径は、Zetasizer Nano-ZS ZEN3600, Malvern社(動的光散乱法)を用いて測定した。
複合粒子の表面電荷は、Zetasizer Nano-ZS ZEN3600, Malvern社(レーザードップラー法)を用いて測定した。
なお、溶媒としてMOPSを用いた場合でも、ヒアルロナン濃度とキトサン濃度を小さくすることにより(No.5〜10)、粒子径を小さくすることが可能であった。
一方、溶媒としてクエン酸緩衝液を用いて、No.1〜4と同様のヒアルロナン濃度とキトサン濃度で作製したNo.16と18は、平均粒子径が有意に50nm程度小さくなった。また、高濃度の溶液を用いて作製したNo.15も、150nm以下の微粒子であった。さらに、No.11〜14を見るとわかるように、クエン酸緩衝液を用いることにより、ヒアルロン酸ナトリウムの分子量が大きくなっても、作製される複合粒子の粒子径はほとんど増大しないことが分かった。
なお、PBSを用いたNo.19は、凝集が起こり、複合粒子が形成されなかった。
これにより、クエン酸緩衝液を用いてヒアルロナンとキトサンの複合粒子を製造することにより、小さな径の複合粒子を製造することができることが分かった。特に、高分子量のヒアルロナンを用いて、ナノサイズの複合粒子を製造することができることが分かった。
また、クエン酸緩衝液を用いることにより、他の緩衝液を用いる場合に比べて高濃度のヒアルロナン及びキトサンを含む溶液から複合粒子を製造することができるため、用いる溶媒の量を低減でき、製造効率の向上、コスト削減の観点からも効果的であることが分かった。
さらにクエン酸緩衝液の効果を検証するため、ヒアルロナンとキトサンの比率を変えた以外は、試験例1と同様にして複合粒子を作製した。結果を表2に示す。
これにより、クエン酸緩衝液を用いてヒアルロナンとキトサンを用いることにより、大きな負電荷を有する複合粒子が形成され、これが凝集を引き起こさず複合粒子の形成に寄与することが分かった。
次に、クエン酸緩衝液におけるクエン酸濃度と、複合粒子の粒子径について検討した。
表3に結果を示す。
これより、クエン酸緩衝液のクエン酸濃度は、1〜2mM程度が特に好ましいことが分かった。
次に、ヒアルロナンとキトサンとの二元複合体と、ヒアルロナン(HA)、キトサン、コンドロイチン硫酸(CS)の三元複合体を作製した。
ヒアルロナン:480kDa、ヒアルロナン濃度34.3μg/mL(混合前の調製時濃度は103μg/mL、保存用の溶液の作製濃度は1mg/mL)
キトサン:34.3kDa、キトサン濃度16.7μg/mL(調製時濃度は50μg/mL、保存用の溶液の作製濃度は1mg/mL)
コンドロイチン硫酸:22kDa、2.0μg/mL(調製時濃度は6.0μg/mL、保存用の溶液の作製濃度は1mg/mL)
クエン酸緩衝液(pH6.5):クエン酸濃度1mM
すなわち、1mg/mL HAクエン酸溶液、1mg/mLキトサンクエン酸溶液、1mg/mL CSクエン酸溶液にクエン酸緩衝液(pH6.5)を所定量加え希釈し、室温で15分間静置した。希釈したHA溶液とCS溶液を十分混合した後、希釈したキトサン溶液を加えて室温で15分間静置することで、HA/キトサン/CS三元複合体ナノ粒子を作製した。混合比は、キトサンのアミノ基(N)、HAのカルボキシル基(c)、コンドロイチン硫酸のカルボキシル基と硫酸基の和(−)の電荷比N:C:(−)に基づいて設定した。
二元複合体、三元複合体を、製造に用いたクエン酸緩衝液中、低温条件(4℃)で保存した。
結果を表4に示す。
次に、試験例4で用いた二元複合体及び三元複合体を、調製時および保存時のキトサン濃度は変えずに、室温で保存した。
その結果、二元複合体及び三元複合体のいずれにおいても、作製直後と作製1週間後で平均粒子径はほとんど変化しなかった。
試験例4の結果と併せて、三元複合体は、二元複合体に比べて、低温保存時の粒子の安定性に大きく優れていることが分かった。
次に、試験例4で用いた二元複合体及び三元複合体を、調製時および保存時のキトサン濃度を251μg/mL、ヒアルロナン濃度を416μg/mLとして、4℃及び室温でそれぞれ保存した。
その結果、二元複合体及び三元複合体のいずれにおいても、作製直後と作製1週間後で平均粒子径はほとんど変化しなかった。
試験例4の結果と併せて、三元複合体は、二元複合体に比べて、高濃度、低温保存時の粒子の安定性に大きく優れていることが分かった。
Claims (5)
- ヒアルロナンとキトサンの複合粒子の製造方法であって、
ヒアルロナン、及びキトサンを、クエン酸緩衝液の存在下で複合化することを特徴とする、複合粒子の製造方法。 - ヒアルロナンをクエン酸緩衝液中に溶解する工程と、
キトサンをクエン酸緩衝液中に溶解する工程と、
ヒアルロナン溶液と、キトサン溶液とを混合撹拌する工程と、
を含む、請求項1に記載の複合粒子の製造方法。 - 前記クエン酸緩衝液のpHが、7.0以下である、請求項1又は2に記載の複合粒子の製造方法。
- 前記クエン酸緩衝液におけるクエン酸濃度が、0.1〜10mMである、請求項3に記載の複合粒子の製造方法。
- アミノ基とカルボキシル基の比率が1:0.1〜1:5となるように、ヒアルロナンとキトサンを複合化することを特徴とする、請求項1〜4のいずれかに記載の複合粒子の製造方法。
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