JP6595460B2 - 糖鎖クラスター及び抗菌剤としてのその医薬の使用 - Google Patents
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Description
本発明は、末端にガラクトース残基を有した糖鎖クラスター型の新規化合物(I)又は(II)に関する。かかる化合物は、緑膿菌(シュードモナス・エルギノーサ、Pseudomonas aeruginosa)の病原因子であるレクチン1と十分な親和性を示す。本発明は、これらの化合物を調製する簡単かつ効果的な方法を提供する。また、本発明は、緑膿菌による感染の阻害剤としての、具体的には緑膿菌による毒性の阻害剤としての、化合物(I)又は(II)の医薬の使用も対象とする。
緑膿菌(PA)は、院内感染に対するその影響とともに、嚢胞性線維症患者の死亡率に対する影響により、重大な公衆衛生問題である。緑膿菌(PA)は、グラム陰性で好気性のグルコース非発酵菌であり、極単毛(polar monotrichous flagellum)により移動性である。緑膿菌は、その長期間の生存能とともに、最小栄養要求及び環境変化に対する高い耐性により、院内感染に関係することが多い、臨床的に重要な日和見病原菌である。緑膿菌は、院内感染の10〜30%の原因である(Floret, N. et al., (2009), Pathol. Biol. 57, 9-12)。また、緑膿菌は、慢性炎症及び嚢胞性線維症患者の呼吸器官の低下を次第にもたらす、最も頻度の高い病原菌でもある(Lyczak, J. B. et al., (2002) Clinical Microbiology Reviews 15, 194-222)。現在、抗生物質の使用が、緑膿菌の感染に対して有効となり得る唯一の解決策である。しかしながら、この点で、バイオフィルム構造中の細菌増殖によって、病原体に選択的有利性をもたらすと考えられる(Stewart, P. S., and Costerton, J. W. (2001) Lancet 358, 135-138. Landry, R. M. et al., (2006) Mol. Microbiol. 59, 142-151)。
その結果、ほとんどの病原菌、特に緑膿菌の抗生物質に対する耐性の出現に関しては、耐性又は新しい作用形式のメカニズムを回避することができる新しい抗菌剤の開発が急務となっており、感染症を治療するか又は予防することが重大な研究課題である。したがって、緑膿菌に基づく感染に対処する代替戦略として、緑膿菌による毒性の阻害が提案されている。
いわゆるクラスター効果を利用する場合、PA‐ILの結合はナノモル範囲に達し得る(Lis, H., and Sharon, N. (1998) Chem. Rev. 98, 637-674; Lundquist, J. J., and Toone, E. J. (2002) Chem. Rev. 102, 555-578; Lee, Y. C., and Lee, R. T. (1995) Acc. Chem. Res. 28, 321-327)。多価炭水化物リガンドは、一価リガンドと比較して、炭水化物残基ごとの標的レクチンに対して結合の増強を示し得る。この増強の程度は、とりわけ、残基がレクチンの複数の部位に適合する必要があるので、トポロジーの関数である。
本発明の目的は、上述した欠点を少なくとも部分的に軽減することである。
nは、3、4、5、6、7、8、9、10から選択される整数であり、
Galは、次式に示す、ガラクトピラノシル、1‐チオガラクトピラノシル、1‐メチレンガラクトピラノシル、1‐N‐アセチル‐ガラクトピラノシルから選択される基を表し、
リン酸基の1若しくは2個の酸素原子は、共有結合によってL1リンカーアームに結合しており、
リン酸基若しくはチオリン酸基若しくはホスホルアミダート基Phoのいずれかは、以下の式(KI)に表されているように、同一の中心K’にすべて結合しており、
Phoの1個の酸素原子は、共有結合によってK’に結合しており、
xは1若しくは2であるか、
又は
リン酸基若しくはチオリン酸基若しくはホスホルアミダート基は、以下の式(KII)に表されているように、鎖を形成し
Eは、0〜12個の炭素原子と、0〜6個の酸素原子と、0〜6個の窒素原子と、対応する数の水素原子とを含む末端基を表し、
mは、2、3、4、5から選択される整数を表し、
Phoの2個の酸素原子は、共有結合によってK”基若しくはEに結合しており、
L1は、
1つ又は複数のエーテル架橋‐O‐を含む可能性がある、直鎖、分岐又は環状C1‐C18アルキルジラジカル、
2〜6つのエチレングリコール単位を含むポリ(エチレングリコール)ジラジカル、
2〜6つのプロピレングリコール単位を含むポリピレングリコール(polypyleneglycol)ジラジカル
から選択されるリンカーアームを表し、
Tは、
トリアゾールジラジカル
から選択される連結基を表し、
L2は、以下の式に表される式‐L21‐Ar‐L22‐に対応するリンカーアームを表す。
L21は、アミド架橋‐CO‐NH‐、エーテル架橋‐O‐、チオ架橋‐S‐、アミン架橋‐NH‐から選択される1個又は複数の基を含む可能性がある、直鎖、分岐又は環状C1‐C12アルキルジラジカルを表し、
Arは、必要に応じて1〜6個のヘテロ原子を含むC6‐C18芳香族ジラジカルを表し、
L22は共有結合を表すか、又は、Galがガラクトピラノシル、1‐チオガラクトピラノシルを表す場合、L22は‐CH2‐基であり得る。
式(I)に対応する分子であって、次に示す条件のうちの1つ又は複数が確認される分子。
Galが、β‐D‐ガラクトピラノシル基、又はβ‐D‐チオ‐1‐ガラクトピラノシル基を表し、β‐D‐ガラクトピラノシルを表すことが好ましく、
Tがトリアゾールジラジカルを表し、
L1が、直鎖C2‐C6アルキル鎖、1,1,1‐(トリスヒドロキシメチル)エタン、2〜4つのエチレングリコール単位を含むポリ(エチレングリコール)ジラジカルから選択されるリンカーアームを表し、
L21が、末端においてAr基に結合している1個のアミド官能基‐CO‐NH‐を含むC1‐C12直鎖アルキル鎖を表し、
ArがC6‐C12の芳香族ジラジカルを表し、Arは、フェニル、ナフタレニル、1,4‐ビフェニルから選択される基を表すことが好ましく、Arはフェニルであることが更により好ましく、
L22が共有結合を表す。
(DMCH‐PNMTzAcNPhe‐O‐Gal)3
(DMCH‐PNMTzAcNPhe‐O‐Gal)4
(DMCH‐PNMTzAcNPhe‐O‐Gal)5
Man(POProTzAcNPhe‐O‐Gal)4
Gal(POProTzAcNPhe‐O‐Gal)4
Glc(POProTzAcNPhe‐O‐Gal)4
Man(POEG2MTzAcNPhe‐O‐Gal)4
Man(POProTzAcNPhe‐O‐Gal)8
Man[POTHME(MTzAcNPhe‐O‐Gal)2]4
式中、DMCHはジメチルシクロヘキサンを表し、Manはマンノースを表し、Galはガラクトースを表し、Glcはグルコースを表し、
Proは1,3‐n‐プロピルを表し、Hexは1,6‐n‐ヘキシルを表し、EG2Mはジエチレングリコールメチレンを表し、THMEはトリス‐(ヒドロキシメチル)エタンを表し、
Tzはトリアゾール
EG2はジエチレングリコールを表し、
AcNPheはアセトアミドフェニル
Mはメチレンを表し、
Galはガラクトピラノシルを表し、
PNはホスホルアミダート結合を表し、
POはリン酸結合を表す。
K、n、Gal、T、L1、L2は請求項1と同じ定義を有し、yは、DNA配列又は蛍光色素などのマーカーを表す。
本発明は、次の式(I)に対応する分子を提供する。
nは、3、4、5、6、7、8、9、10から選択される整数であり、
Galは、次式に示す、ガラクトピラノシル、1‐チオガラクトピラノシル、1‐メチレンガラクトピラノシル、1‐N‐アセチル‐ガラクトピラノシルから選択される基を表し、
リン酸基の1又は2個の酸素原子は、共有結合によってL1リンカーアームに結合しており、
第1の実施形態によれば、式(I)の分子はコアが中心にあるクラスターであり、
リン酸基又はチオリン酸基又はホスホルアミダート基Phoのいずれかは、以下の式(KI)に表されているように、同一の中心K’にすべて結合しており、
Phoの1個の酸素原子は、共有結合によってK’に結合している。
第2の実施形態によれば、式(I)の分子は櫛状クラスターであり、
リン酸基若しくはチオリン酸基若しくはホスホルアミダート基は、以下の式(KII)に表されているように、鎖を形成する。
Eは、0〜12個の炭素原子と、0〜6個の酸素原子と、0〜6個の窒素原子と、対応する数の水素原子とを含む末端基を表す。
EもHであってもよく、
mは、2、3、4、5、6、7、8、9から選択される整数を表し、
Phoの2個の酸素原子は、共有結合によってK”基又はEに結合しており、
Phoは次のものから選択され、
L1は、
1つ又は複数のエーテル架橋‐O‐を含む可能性がある、直鎖、分岐又は環状C1‐C18アルキルジラジカル、
2〜6つのエチレングリコール単位を含むポリ(エチレングリコール)ジラジカル、
2〜6つのプロピレングリコール単位を含むポリ(プロピレングリコール)ジラジカル
から選択されるリンカーアームを表し、
Tは、
トリアゾールジラジカル
から選択される連結基を表し、
L2は、以下の式に表される式‐L21‐Ar‐L22‐に対応するリンカーアームを表す。
L21は、アミド架橋‐CO‐NH‐、エーテル架橋‐O‐、チオ架橋‐S‐、アミン架橋‐NH‐から選択される1個又は複数の基を含む可能性がある、直鎖、分岐又は環状C1‐C12アルキルジラジカルを表し、
Arは、必要に応じて1〜6個のヘテロ原子を含むC6‐C18芳香族ジラジカルを表し、
L22は共有結合を表すか、又は、Galがガラクトピラノシル、1‐チオガラクトピラノシルを表す場合、L22は‐CH2‐基であり得る。
Kは、マンノース、ガラクトース、グルコース、アラビノース、キシロース、リボース及びラクトースからなる群より選択される炭水化物を表し、
Phoは、
式中、XはO又はSを表し、
リン酸基の1又は2個の酸素原子は、共有結合によってL1リンカーアームに結合しており、
L1は、
直鎖又は分岐C1‐C3アルキルジラジカル、直鎖、分岐又は環状C4‐C6アルキルジラジカル、1つ又は複数のエーテル架橋‐O‐を含む可能性がある、直鎖、分岐又は環状C7‐C12アルキルジラジカル、
2、3、4、5又は6つのエチレングリコール単位を含むポリ(エチレングリコール)ジラジカル、
2、3、4、5又は6つのプロピレングリコール単位を含むポリピレングリコールジラジカル、
からなる群より選択されるリンカーアームを表す。
Tは、
トリアゾ−ルジラジカル
L2は、
からなる群より選択されるリンカーアームを表し、
Arは、フェニル、ナフタレニル及び1,4‐ビフェニル
L3はO、S又は‐CH2を表し、
Galは、次式のβ‐D‐ガラクトピラノシル基を表す。
zは、1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10から選択される整数である。
(DMCH‐PNMTzAcNPhe‐O‐Gal)3
(DMCH‐PNMTzAcNPhe‐O‐Gal)4
(DMCH‐PNMTzAcNPhe‐O‐Gal)5
Man(POProTzAcNPhe‐O‐Gal)4
Gal(POProTzAcNPhe‐O‐Gal)4
Glc(POProTzAcNPhe‐O‐Gal)4
Man(POEG2MTzAcNPhe‐O‐Gal)4
Man(POEG3MTzAcNPhe‐O‐Gal)4
Man(POEG4MTzAcNPhe‐O‐Gal)4
Man(POProTzAcNPhe‐O‐Gal)8
Man(POEG2MTzAcNPhe‐O‐Gal)8
Man(POEG3MTzAcNPhe‐O‐Gal)8
Man[POTHME(MTzAcNPhe‐O‐Gal)2]4
Man(POProTzAcNPhe‐S‐Gal)4
Man(POEG2MTzAcNPhe‐S‐Gal)4
Man(POEG3MTzAcNPhe‐S‐Gal)4
Man(POEG4MTzAcNPhe‐S‐Gal)4
Man(POProTzAcNPhe‐CH2‐O‐Gal)4
Man(POEG2MTzAcNPhe‐CH2‐O‐Gal)4
Man(POEG3MTzAcNPhe‐CH2‐O‐Gal)4
Man(POEG4MTzAcNPhe‐CH2‐O‐Gal)4
Man(POProTzAcNPhe‐CH2‐S‐Gal)4
Man(POEG2MTzAcNPhe‐CH2‐S‐Gal)4
Man(POEG3MTzAcNPhe‐CH2‐S‐Gal)4
Man(POEG4MTzAcNPhe‐CH2‐S‐Gal)4
Man(PSProTzAcNPhe‐O‐Gal)4
Man(PSEG2MTzAcNPhe‐O‐Gal)4
Man(PSEG3MTzAcNPhe‐O‐Gal)4
Man(PSEG4MTzAcNPhe‐O‐Gal)4
Man(PSProTzAcNPhe‐S‐Gal)4
Man(PSEG2MTzAcNPhe‐S‐Gal)4
Man(PSEG3MTzAcNPhe‐S‐Gal)4
Man(PSEG4MTzAcNPhe‐S‐Gal)4
Man(PSProTzAcNPhe‐CH2‐O‐Gal)4
Man(PSEG2MTzAcNPhe‐CH2‐O‐Gal)4
Man(PSEG3MTzAcNPhe‐CH2‐O‐Gal)4
Man(PSEG4MTzAcNPhe‐CH2‐O‐Gal)4
Man(PSProTzAcNPhe‐CH2‐S‐Gal)4
Man(PSEG2MTzAcNPhe‐CH2‐S‐Gal)4
Man(PSEG3MTzAcNPhe‐CH2‐S‐Gal)4
Man(PSEG4MTzAcNPhe‐CH2‐S‐Gal)4
(DMCH‐POMTzAcNPhe‐O‐Gal)3
(DMCH‐POMTzAcNPhe‐O‐Gal)4
(DMCH‐POMTzAcNPhe‐O‐Gal)5
(DMCH‐POMTzAcNPhe‐S‐Gal)3
(DMCH‐POMTzAcNPhe‐S‐Gal)4
(DMCH‐POMTzAcNPhe‐S‐Gal)5
(DMCH‐POMTzAcNPhe‐CH2‐O‐Gal)3
(DMCH‐POMTzAcNPhe‐CH2‐O‐Gal)4
(DMCH‐POMTzAcNPhe‐CH2‐O‐Gal)5
(DMCH‐POMTzAcNPhe‐CH2‐S‐Gal)3
(DMCH‐POMTzAcNPhe‐CH2‐S‐Gal)4
(DMCH‐POMTzAcNPhe‐CH2‐S‐Gal)5
(DMCH‐PSMTzAcNPhe‐O‐Gal)3
(DMCH‐PSMTzAcNPhe‐O‐Gal)4
(DMCH‐PSMTzAcNPhe‐O‐Gal)5
(DMCH‐PSMTzAcNPhe‐S‐Gal)3
(DMCH‐PSMTzAcNPhe‐S‐Gal)4
(DMCH‐PSMTzAcNPhe‐S‐Gal)5
(DMCH‐PSMTzAcNPhe‐CH2‐O‐Gal)3
(DMCH‐PSMTzAcNPhe‐CH2‐O‐Gal)4
(DMCH‐PSMTzAcNPhe‐CH2‐O‐Gal)5
(DMCH‐PSMTzAcNPhe‐CH2‐S‐Gal)3
(DMCH‐PSMTzAcNPhe‐CH2‐S‐Gal)4
(DMCH‐PSMTzAcNPhe‐CH2‐S‐Gal)5
Man(PSEG2MTzAcNPhe‐CH2‐Gal)4
Man(PSEG3MTzAcNPhe‐CH2‐Gal)4
Man(EG2MTzAcNPhe‐CH2‐Gal)4
Man(EG3MTzAcNPhe‐CH2‐Gal)4
Man(EG2MTzAcNPhe‐CH2‐SGal)4
Man(EG3MTzAcNPhe‐CH2‐SGal)4
Man(PSEG3MTzAcNPh‐Gal)4
Man(PSEG3MTzAcNPhe‐CH2‐SGal)4
Man(PSEG2MTzAcNPhe‐CH2‐SGal)4
Man(PSEG3MTzAcNPh‐SGal)4
Man(PSEG2MTzAcNPh‐Gal)4
Man(PSEG2MTzAcNPh‐SGal)4
Man(EG2MTzAcNPh‐SGal)4
Man(EG3MTzAcNPh‐SGal)4
Man(EG3MTzproNCONapht‐OGal)4
Man(EG3MTzproNCOBisphe‐OGal)4
Man(PSEG3MTzproNCOBisphe‐OGal)4
Man(PSEG2MTzproNCOBisphe‐OGal)4
Man(EG2MTz AcNPh‐Gal)4
Man(PSEG3MTzproNCONapht‐OGal)4
Man(EG3MTz AcNPh‐Gal)4
Man(PSEG2MTzproNCONapht‐OGal)4
Man(EG2MTzproNCOBisphe‐OGal)4
Man(EG2MTzproNCONapht‐OGal)4
(DMCH‐POProTzAcNPhe‐OGal)4
(DMCH‐PSProTzAcNPhe‐OGal)4
(DMCH‐PODMCHMTzAcNPhe‐OGal)4
(DMCH‐PSDMCHMTzAcNPhe‐OGal)4
(DMCH‐POProTzAcNPhe‐SGal)4
(DMCH‐PSProTzAcNPhe‐SGal)4
(DMCH‐PODMCHMTzAcNPhe‐SGal)4
(DMCH‐PSDMCHMTzAcNPhe‐SGal)4
(DMCH‐POProTzProNCOBisphe‐OGal)4
(DMCH‐PSProTzProNCOBisphe‐OGal)4
(DMCH‐PODMCHMTzProNCOBisphe‐OGal)4
(DMCH‐PSDMCHMTzProNCOBisphe‐OGal)4
(DMCH‐POProTzProNCOBisphe‐SGal)4
(DMCH‐PSProTzProNCOBisphe‐SGal)4
(DMCH‐PODMCHMTzProNCOBisphe‐SGal)4
(DMCH‐PSDMCHMTzProNCOBisphe‐SGal)4
(DMCH‐POProTzProNCONapht‐OGal)4
(DMCH‐PSProTzProNCONapht‐OGal)4
(DMCH‐PODMCHMTzProNCONapht‐OGal)4
(DMCH‐PSDMCHMTzProNCONapht‐OGal)4
(DMCH‐POProTzProNCONapht‐SGal)4
(DMCH‐PSProTzProNCONapht‐SGal)4
(DMCH‐PODMCHMTzProNCONapht‐SGal)4
(DMCH‐PSDMCHMTzProNCONapht‐SGal)4
式中、DMCHは1,4‐ジメチルシクロヘキシルを表し、Manはマンノースを表し、Glcはグルコースを表し、
Proは1,3‐n‐プロピルを表し、Hexは1,6‐n‐ヘキシルを表し、THMEはトリス‐(ヒドロキシメチル)エタンを表し、
Tzはトリアゾールを表し、
POはリン酸結合を表し、
PSはホスホロチオアート結合を表し、
EG2はジエチレングリコールを表し、
EG3はトリエチレングリコールを表し、
EG4はテトラエチレングリコールを表し、
AcNPheは次式のアセトアミドフェニルを表し、
‐O‐Galはガラクトピラノシルを表し、
S‐Galは1‐チオガラクトピラノシルを表し、
‐CH2‐O‐Galは、1‐メチレンガラクトピラノシルを表し、
‐CH2‐S‐Galは、1‐メチレンチオガラクトピラノシルを表し、
‐NAc‐Galは、1‐N‐アセチルガラクトピラノシルを表す。
式中、Gal*は、OH官能基上に保護基を有するGal残基を表す。詳細な操作方式は、図1及び実験の部に示されている。あるいは、保護基のないGal残基を用いることができる。トリアゾールTzは、次に示す置換基とのこの反応によって形成される。
式中、Gal*は、OH官能基上に保護基を有するGal残基を表す。あるいは、保護基のないGal残基を用いることができる。トリアゾールTzは、次に示す置換基とのこの反応によって形成される。
式中、Gal*は、OH官能基上に保護基を有するGal残基を表す。あるいは、保護基のないGal残基を用いることができる。トリアゾールTzは、次に示す置換基とのこの反応によって形成される。
K、n、Gal、T、L1、L2は、上述したものと同じ意味を有し、yはマーカーを表す。マーカーは、例えば、DNA配列又は蛍光色素であってもよい。
命名法:
実験の部に示されている糖鎖クラスターに用いられる命名法:糖鎖クラスターはそれぞれ、足場(K)と、第1のリンカー(L1)と、連結基(T)と、第2のリンカー(L2)と、ガラクトース誘導体(Gal):K‐(‐L1‐T‐L2‐Gal)nと、から構成される。
PNはホスホルアミダート結合を表し、
POはリン酸結合を表し、
PSはホスホロチオアート結合を表す。
L1:Pro(1,3‐n‐プロピル)、Hex(1,6‐ヘキシル)、EG2M(ジエチレングリコールメチレン)、EG3M(トリエチレングリコールメチレン)、EG4M(テトラエチレングリコールメチレン)、THME(トリス‐(ヒドロキシメチル)エタン)、
T:トリアゾールTz、
L2:Pro(1,3‐n‐プロピル)、EG2(ジエチレングリコール)、EG3(トリエチレングリコール)、DMCH(1,4‐ジメチルシクロヘキサン)、AcNPhe(アセトアミドフェニル(acetamidephenyl))、M(メチレン)、BuT(N3‐ブチル‐チミン)。
‐O‐Galはガラクトピラノシルを表し、
‐S‐Galは1‐チオガラクトピラノシルを表し、
‐CH2‐O‐Galは、1‐メチレンガラクトピラノシルを表し、
‐CH2‐S‐Galは、1‐メチレンチオガラクトピラノシルを表し、
‐NAc‐Galは、1‐N‐アセチルガラクトピラノシルを表す。
ホスホラミダイト1(Meyer, A. et al., (2010) J. Org. Chem. 75, 6689-6692)、2(Lietard, J. et al., (2008) J. Org. Chem. 73, 191-200; Lietard, J. et al., Meyer, A., Vasseur, J. J., and Morvan, F. (2007) Tetrahedron Lett. 48, 8795-8798)、1a及び1d(Gerland, B. et al., (2012) Bioconjugate Chem. 23, 1534-1547)、並びに、1e(Ligeour, C. et al., (2012) Eur. J. Org. Chem., 1851-1856)と、アジド固体支持体5(Pourceau, G. et al., (2009) J. Org. Chem. 74, 6837-6842)の合成は、過去に報告されている。炭水化物誘導体3(Hasegawa, T. et al., (2007) Org. Biomol. Chem. 5 (15), 2404-2412)、4a(Joosten, J. A. F. et al., (2004) J. Med. Chem. 47, 6499-6508)、4b(Szurmai, Z. et al., (1989) Acta Chimica Hungarica-Models in Chemistry 126, 259-269)、4c(Pourceau, G. et al., (2009) J. Org. Chem. 74, 1218-1222)、4d(Cecioni, S. et al., (2012) Chem. Eur. J. 18, 6250-6263)、4e(Szurmai, Z. et al., (1989))、6(Hasegawa, T., et al. (2007))、1‐プロパギル‐O‐ガラクトピラノース及びグルコピラノース(Mereyala, H. B., and Gurrala, S. R. (1998) Carbohydr. Res. 307, 351-354)は、文献に従って調製した。
N,O‐ビス(トリメチルシリル)アセトアミド(BSA)(1.5 mL、6.1 mmol)を、チミン(327 mg、2.6 mmol)の懸濁液、及びジクロロエタン(25 mL)中ガラクトースペンタ‐O‐アセテート(1.09g、2.56 mmol)に加えた。この混合物を、アルゴン下、常温で20分間撹拌した。TMSOTf(2.2 mL、12.1 mmol)を加えた後、この反応混合物を還流下で2時間30分加熱した。得られた混合物を常温まで冷却し、溶媒を減圧下で蒸発させ油を得て、これを酢酸エチル(100 mL)中で希釈し、NaHCO3(100 mL)の飽和水溶液及びブライン(100 mLで2回)によって洗浄した。Na2SO4によって乾燥させた後、ろ過し濃縮し、得られた油をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(EtOAc/シクロヘキサン、8:2、v/v)によって精製し、白い泡としての所望の化合物20(782 mg、67%)を得た。1H NMR 13C NMR及びHR-ESI-QToF MSが、その構造と一致している。
無水ジメチルホルムアミド(4 mL)中(2’,3’,4’,6’‐テトラ‐O‐アセチル‐β‐D‐ガラクトピラノシル)‐チミン20(350 mg、0.77 mmol)の溶液を、炭酸カリウム(318 mg、2.30 mmol)とともに、5分間撹拌した。次いで、1,4‐ジブロモブタン(919 μL、7.70 mmol)を加え、この混合物を、還流下で4時間及び70℃で一晩煮沸させた。その後、反応混合物を濃縮し油を得て、これをジクロロメタン(20 mL)中で希釈し、NaHCO3(20 mL)の飽和水溶液及びブライン(20 mLで2回)によって洗浄した。有機層を乾燥させ(Na2SO4)、ろ過し濃縮した。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(EtOAc/シクロヘキサン、4:6)によって精製し、淡黄色の泡として所望の化合物21(270 mg、59%)を得た。1H NMR 13C NMR及びHR-ESI-QToF MSが、その構造と一致している。
無水ジメチルホルムアミド(3 mL)中化合物21(231 mg、0.39mmol)の溶液を、アジ化ナトリウム(203 mg、3.12 mmol)とともに、100℃で24時間撹拌した。ジクロロメタン(10 mL)を加えた後、この反応物をブライン(20 mLで3回)によって洗浄した。有機層を乾燥させ(Na2SO4)、ろ過し濃縮し、無色の油として所望の生成物(214 mg、99%)を得た。1H NMR 13C NMR及びHR-ESI-QToF MSが、その構造と一致している。
1,3‐プロパンジオール固体支持体(1 μmol)から開始するH‐ホスホネート化学作用サイクルを用い、DNAシンセサイザー(ABI 394)で伸長を実行した。CH2Cl2中2.5% DCAとともに35秒間、脱トリチル化工程を実行した。次いで、ジメタノールシクロヘキサン(DMCH)H‐ホスホネートモノエステル9(Bouillon et al. (2006), J. Org. Chem. 71, 4700-4702)、又は市販チミジンH‐ホスホネートモノエステル(無水CH3CN/C5H5N 1:1 v/v中60 mM)、及び活性剤としての塩化ピバロイル(無水CH3CN/C5H5N 1:1 v/v中200 mM)を、カラムに6回又は5秒間(30モル過剰)通した。必要に応じてサイクルを繰り返し、2〜5つのDMCHモチーフ又は4つのdTモチーフを有する所望の足場を得た。
2つのシリンジを用いて、CCl4/C5H5N(1:1 v/v)中10%プロパルギルアミンの溶液2 mLにより30分間、固体支持H‐ホスホネートジエステル足場(1 μmol)を端から端まで処理した。CPGビーズを、C5H5N(2 mLで2回)及びCH3CN(2 mLで3回)によって洗浄し、次いで、アルゴンにより洗い流して乾燥させた。その後、上述したようにホスホラミダイト化学作用によって、オリゴヌクレオチドの伸長及びCy3による標識を実行した。
アジドD‐ガラクトース誘導体4a〜f導入の手順:5’‐蛍光‐3’‐アルキンオリゴヌクレオチド(100 μLのH2O中100 nmol)の溶液に、アジドガラクトース(azid galacose)4a〜f(アルキン官能基当たり3当量、MeOH中100 mM)、1 mgのCu(0)ナノ粉末、トリエチルアンモニウム酢酸緩衝液(0.1M、pH7.7)(25 μL)、水及びMeOHを加え、250 μLの最終量(水MeOH、1:1、v/v)を得た。得られた調製物を収容したチューブを密封し、Biotage社製のマイクロ波シンセサイザーイニシエーターに60℃で60分間(30秒間の予備混合時間)置いた。
4Å分子ふるいの存在下及びアルゴン下で、乾燥ジクロロメタン(20 mL)中3,6,9‐トリオキサドデカン‐11‐イン‐1‐オール31(376 mg、2 mmol)の溶液に、ジイソプロピルエチルアミン(520 μl、3 mmol)を加え、次いで、O‐(2‐シアノエチル)‐N,N‐ジイソプロピル‐クロロホスホラミダイト(480 μl、2 mmol)を滴下して加えた。室温で2時間撹拌した後、1 mLの水を加えた。10分後、溶液をジクロロメタン(40 mL)によって希釈した後、飽和NaHCO3水溶液(75 mL)によって洗浄した。有機層をジクロロメタン(100 mLで2回)によって抽出し、Na2SO4で脱水し、減圧下で蒸発させ乾燥させた。粗生成物をシリカゲル、4% Et3Nを含むシクロヘキサン中0〜50%酢酸エチル上でクロマトグラフィーにかけ、無色のシロップとして563 mg、73%の化合物33を得た。TLC:Rf=0.55シクロ/AcOEt/Et3N 5:4:1、v/v/v。1H-NMR (CDCl3, 300 MHz): δ1.14 (dd, 12H, J = 6.8 Hz, Isopropyl), 2.36 (t, 1H, J = 2.4 Hz, -CCH), 2.59 (t, 2H, J = 6.5 Hz, -CH2-CN), 3.5-3.81 (m, 16H, -CH-, -O-CH2-CH2-O-, -O-CH2-P), 4.14 (d, 2H, J = 2.5 Hz, HCC-CH2). 13C-NMR (CDCl3, 100 MHz): δ18.17, 18.26, 22.4, 22.4, 22.5, 22.6, 40.9, 41, 56.3, 56.5, 60.4, 60.6, 67, 68.3, 68.5, 68.6, 69, 69.2, 72.4, 77.5, 115.6. 31P-NMR (CDCl3, 121 MHz): δ148.67 ppm. HRMS TOF-ES positive mode calculated for C18H36N2O6P [M+H2O+H]+ 407.2311 found 407.2270。
Cu(I)触媒アルキンアジド1,3‐双極環状付加によるプロパルギルマンノシドのアジド固体支持体35への固定。プロパルギルα‐マンノピラノシド347(100 mM、175 μL)の水溶液、CuSO4の新たに調製した水溶液(100 mM、14 μL)及びアスコルビン酸ナトリウムの新たに調製した水溶液(500 mM、14 μL)、水(147 μL)、並びにMeOH(350 μL)を、3.5 μmolのアジド固体支持体35.8に加えた。得られた混合物を、マイクロ波シンセサイザー(monowave 300、Anton Paar社製)を用いて60℃で45分間、封管中で加熱した。内部赤外線プローブによって温度をモニタリングした。溶液を除去し、CPGビーズを、H2O(2 mLで3回)、MeOH(2 mLで3回)及びCH3CN(2 mLで3回)によって洗浄し、乾燥させ、固体支持マンノシド36を得た。
アジド官能化D‐ガラクトシド誘導体1〜6導入の手順:5’‐蛍光‐3’‐アルキンオリゴヌクレオチド(100 μLのH2O中100 nmol)の溶液に、アジド官能化ガラクトシド1〜6(アルキン官能基当たり3当量、MeOH中100 mM)、〜0.1 mgのCu(0)ナノ粉末、トリエチルアンモニウム酢酸緩衝液(0.1M、pH7.7)(25 μL)、水及びMeOHを加え、250 μLの最終量(水MeOH、1:1、v/v)を得た。得られた調製物を収容したチューブを密封し、Anton Paar社製のマイクロ波シンセサイザーMonowave 300に60℃で60分間置いた。
EDTA(400 μL)を混合物に加え、遠心分離後、上清を回収しCu(0)を除去し、NAP10上でサイズ排除クロマトグラフィーによって脱塩した。蒸発後、5’‐蛍光‐3’‐アセチル擬似糖質オリゴヌクレオチドを水中に溶解し、逆相分取HPLCによって精製した。濃アンモニア水(3 mL)によって室温で2時間純粋な化合物を処理し、アセチル基を除去し、蒸発させ乾燥させた(純度97%超)。TEAAc緩衝液(pH7)中8%〜32%のアセトニトリル直線勾配を用いる逆相分取HPLCによって、20分間、最終化合物を再度精製した。後の分析のために残渣を水中に溶解した。
微細構造スライドの作製:微細構造スライドは、40平方ウェル(3 mmの幅、60±1 μmの深さ、それぞれのマイクロリアクター間で4.5 mmの間隔)が特徴である。フォトリソグラフィ及びウェットエッチング法によって、マイクロリアクターを平らなガラススライド上に作製した。これらの方法は、他に詳述されている(Mazurczyk, R. et al., (2008) Sens. Actuators, B 128, 552-559; Vieillard, J. et al., (2007) J. Chromatogr. B 845, 218-225)。
ハイブリダイゼーション工程:DNAタグを有するそれぞれの複合糖質の2μL溶液を、PBS1X(pH7.4)中1 μMで、対応するウェルの底部に入れ、水蒸気飽和室内で、室温で一晩ハイブリダイゼーションさせた。試料を塩水‐クエン酸ナトリウム中で2回(SSC2X)、SDS0.1%中で、51℃で1分間洗浄し、続いて、SSC2X中で、室温で更に5分間洗浄し、そして、脱イオン水によって洗い流した後、遠心分離によって乾燥させた。
PA‐ILレクチンのAlexa 647標識:PA‐ILレクチンを、Invitrogen社製のAlexa Fluor(登録商標)647マイクロスケールタンパク質標識キット(A30009)によって標識した。要約すると、1 mg/mlのPA‐IL溶液(MW:51 kDa、PA‐ILは、Anne Imberty博士(CERMAV、グルノーブル(Grenoble))により快く提供された。)をPBS1X(pH7.4)中で希釈し、この100 μlを、10 μLの1M重炭酸ナトリウム(pH8.3)と混合した。7.94 nmol/μLの反応性色素溶液の適切な量を、pH調整タンパク質を収容した反応チューブに移した。反応混合物を室温で15分間混合した後、スピンカラム(ゲル樹脂容器)上で精製し、反応しない色素から標識されたタンパク質を分離した。
インキュベーション溶液の調製:レクチンPA‐IL(最終濃度0.12 μM)、BSA(最終濃度2%)及びCaCl2(最終濃度1 μg/mL)を、PBS1X(pH=7.4)中で希釈した。それぞれのマイクロチューブ内に、所望の最終濃度(0;1.10−5;1.10−4;5.10−4;1.10−3;5.10−3;1.10−2;5.10−2;0.1;1;5;10;50;102;5.102;103;5.103;104;105;3.105)の阻害剤ラクトース乳糖を加えた。
Y=a+(b-a)/[1+10^(x-c)]
式中、a=FImin、b=FImax、x=log[PA-IL]及びc=log(IC50)。FImin/maxは、擬似ガラクトにおいてみられる最小/最大Alexa-647蛍光シグナルである。
II‐A 合成:
マンノースが中心にある糖鎖クラスター17a〜e及び18を合成し、PA‐ILへの認識に対する擬似糖質における6つの異なるリンカーの影響を検討した。種々の長さ(9〜14個の原子)及び溶媒和容量(solvation capacity)に及ぶ(spam)ように、リンカーを選択した(アルキル、芳香族又はエチレングリコール)(図1)。
直接蛍光走査によるDNAに基づくグリコアレイ(glycoarray)を用いて、PA‐ILへの擬似ガラクト17a〜e及び18の結合効率を決定/測定した(Chevolot, Y. et al., (2007) Angew. Chem. Int. Ed. 46, 2398-2402)。ガラクトクラスターに対するPA‐ILの特異的な結合を示す負の対照として、直鎖トリマンノシルクラスター(DMCH‐PNMTzEG3‐O‐Man)3(C1、Chevolotらの文献(2007)に開示)を用い、直鎖テトラガラクトシルクラスター(DMCH‐PNMTzEG‐O‐Gal)4(C2、Chevolot, Y. et al., (2011) Chem. Comm. 47, 8826-8828)を正の対照及び比較に用いた(図4)。本目的上、糖鎖クラスターをすべて、DNAタグによるDNA指向固定(DNA directed Immobilisation)(DDI)によってDNAアレイ上に固定した。次いで、alexa 647‐PA‐ILを加え、3時間インキュベートし、洗浄後、蛍光強度を635 nmで読み取り、結合強度についての相対的情報を得た(図5)。
直鎖トリマンノース(DMCH‐PNMTzEG3‐O‐Man)3 C1クラスターはPA‐ILに結合せず、選択的な認識、及びマイクロアレイ上での非特異結合の欠如を示した。直鎖テトラガラクトースクラスター(DMCH‐PNMTzEG‐O‐Gal)4 C2は、3100前後の任意単位(a.u.)の蛍光を示した。
一方では、種々の足場、2〜5個の残基(DMCH‐PNMTzAcNPhe‐O‐Gal)2‐5の存在を示すDMCH足場(化合物22〜25)などの直鎖足場、又は4個のガラクトース残基(dT‐PNMTzAcNPhe‐O‐Gal)4(図8)の存在を示すデオキシチミジン(desoxythymidine)足場(26)への導入に対する、AcNPhe‐O‐ガラクトース部分の影響を調査し、他方では、AcNPhe‐O‐ガラクトース部分を、ガラクトースが中心にある足場(27)及びグルコースが中心にある足場(28)(図9)に導入した。比較のために、ガラクトースが中心にある足場(29)及びグルコースが中心にある足場(30)(図9)に構築されたガラクトクラスターによるHexTzMガラクトース部分の影響も検討した。
活性剤として塩化ピバロイルを用いH‐ホスホネート化学作用によってDMCH H‐ホスホネートモノエステル(Chevolot, Y. et al., (2007) Angew. Chem. Int. Ed. 46, 2398-2402; Bouillon, C. et al, (2006) J. Org. Chem. 71, 4700-4702)が2〜5回結合した、プロパンジオール固体支持体から開始し、直鎖DMCHガラクトクラスターを合成した(図8)。得られたH‐ホスホネートジエステル結合を、アルキン官能基を導入可能なプロパルギルアミンの存在下で四塩化炭素によって酸化した。次いで、オリゴヌクレオチドを集め、ホスホラミダイト化学作用によってCy3標識した。アンモニア処理によって脱保護され固体支持体から放出された後、2〜5つのアルキンの存在を示す得られた修飾オリゴヌクレオチドを、CuAACによって4dと結合させた。HPLC精製後、アンモニアによってアセチル基を加水分解し、これによって、直鎖DMCHガラクトクラスター(DMCH‐PNMTzAcNPhe‐O‐Gal)2‐5(22〜25)に結合したオリゴヌクレオチドが生じた。固体支持体上に4回導入した市販DMTr‐チミジンH‐ホスホネートを用いて、デオキシチミジン足場(dT‐PNMTzAcNPhe‐O‐Gal)4(26)上に直鎖テトラ‐ガラクトースを同様に合成した。
‐試験1:
PA‐ILに対するこれらのガラクトクラスターの結合特性を、グリコアレイを提供するDDIを用いて検討した。チップ上にこれらを固定した後、alexa 647‐PA‐ILを加え、洗浄後、それぞれの糖鎖クラスターの蛍光強度を読み取った(図10)。Alexa 647蛍光シグナル(励起635 nm及び発光675 nm)は、PA‐IL結合に相関していた。
既に報告されている(Moni, L. et al., (2009) ChemBioChem 10, 1369-1378; Zhang, J. et al., (2009) Biosens. Bioelectron. 24, 2515-2521)ように、蛍光強度のダイナミックレンジは幾分限定されているので、阻害剤としてラクトースを用いて糖鎖クラスターのIC50値を決定し(表1)、効力を算出した。本例では、ラクトース濃度に対応するIC50値は、糖鎖クラスターからPA‐ILの50%を置換するのに必要である。したがって、最も高いIC50値は、PA‐ILに対して最も高い糖鎖クラスターの親和性である。よって、IC50値をIC50Lacと称した。
‐試験1:
直鎖DMCH糖鎖クラスターの蛍光シグナルは、ガラクトース残基の数とともに上昇し、結合効率に対する糖モチーフの増加という利益を示した。MTzEG3‐O‐Galモチーフを有するテトラクラスターは、TzAcNPhe‐O‐Galモチーフを有するその類似体よりも約5倍低い蛍光シグナルを示し、芳香族ガラクトースの良好な結合を確認した。DMCH又はチミジン足場を有する両方の四量体直鎖糖鎖クラスターは、DMCH三量体クラスターよりも高い結合を示したが、DMCHを有するクラスターが優位であった。ヘキソースが中心にあるテトラ‐ガラクトクラスターに関しては、データは、ヘキソースコアであればどれでも、HexTzM‐Galモチーフに対してProTzAcNPhe‐O‐Galモチーフの存在を示すガラクトクラスターの良好な結合を確認した。両方のファミリーでは、マンノースコア及びグルコースコアから構築された糖鎖クラスターは、同様の蛍光シグナルを示し、ガラクトースコアから構築されたものは低いシグナルを示した(図10)。
5及び16 mMのIC50Lac値をそれぞれ有する、モノガラクトースDMCH‐PNMTz‐EG3‐O‐Gal(Chevolot, Y. et al., (2007) Angew. Chem. Int. Ed. 46, 2398-2402)とDMCH‐PNMTzAcNPhe‐O‐Galの比較は、芳香族ガラクトース(項目1及び2)に対する結合が3.2倍の増加を示し、これは、酵素結合レクチンアッセイによりCeccioniらによって行われた観察(Cecioni, S. et al., (2012) Chem. Eur. J. 18, 6250-6263)に類似していた。直鎖ガラクトクラスターでは、2〜3個の残基間の閾値効果による残基の数の増加とともに、PA‐ILに対する良好な結合に対応するIC50Lac値の増加がみられた(表1、項目4及び5)。MTzEG3リンカーに対するPNMTzAcNArリンカーの利益が確認された((DMCH‐PNMTzEG3‐O‐Gal)4 C2、項目3:IC50Lac=773 μMに対して、(DMCH‐PNMTzAcNPhe‐O‐Gal)4 24、項目6:IC50Lac=1056 μM)。この傾向は、マンノースが中心にある糖鎖クラスターにおいて強調された(項目9:17d Man(POProTzAcNPhe‐O‐Gal)4においてIC50Lac=2826 μMに対して、項目8:G3 Man(POProTzEG3‐O‐Gal)4においてIC50Lac=29 μM)。結果は、マンノースが中心にあるトポロジーを有するTzAcNPhe‐O‐Galモチーフの優位性を示し、モノ芳香族ガラクトースと比較して177倍効力が増加し、EG3‐O‐ガラクトース(項目9)と比較して565倍効力が増加し、PA‐ILに対する高い結合を獲得した。これらの結果は、リンカーの性質と空間的配置の組合せが親和性に対して強い影響があることを示す。
一部の変化を伴い、マンノースコアとTzAcNPhe‐O‐Galモチーフとを含む化合物を調製した。一方では、ペンチニルのものの代わりに、ジエチレングリコール又はテトラエチレングリコールプロパルギルホスホラミダイト1a〜bを用いて、マンノースコアとトリアゾールとの間の長さ/柔軟性を増加させ、他方では、ビス‐ペンチニルホスホラミダイト1c、又は2,2‐(ビス‐プロパルギルオキシメチル)プロピルホスホラミダイト1d(図11)のいずれかを用いて、8個のアルキニル基を導入した。このように、マンノースが中心にある新しいテトラガラクトクラスター、Man(POEG2MTzAcNPhe‐O‐Gal)4(32)、及びMan(POEG4MTzAcNPhe‐O‐Gal)4(33)は、Man(POProTzAcNPhe‐O‐Gal)4 17dの13個の原子というリンカー長さの代わりに、17個の原子及び23個の原子というリンカー長さをそれぞれ示す。マンノースが中心にあるオクタガラクトクラスター、Man(POProTzAcNPhe‐O‐Gal)8(34)及びMan[POTHME(MTzAcNPhe‐O‐Gal)2]4(35)は、マンノースコアのそれぞれのヒドロキシル上に2個の残基の存在を示す(図12)。このため、結合特性に対するリンカー長さの影響及び残基の数の影響を評価することができた。比較のために、AcNPhe‐O‐GalモチーフがEG3‐Galモチーフに置換された類似体Man(POEG2MTzEG3‐O‐Gal)4(36)も合成した(図12)。
AcNPhe‐O‐Galモチーフの存在を示す新しい糖鎖クラスターを合成するために、プロパルギルジエチレングリコール(1a)若しくはテトラエチレングリコール(1b)ホスホラミダイト、ビス‐ペント‐4‐イニルホスホラミダイト(1c)又は2,2‐(ビス‐プロパルギルオキシメチル)プロピルホスホラミダイト(1d)によって、固体支持マンノース7をリン酸化した。そして、オリゴヌクレオチド伸長及び標識後、テトラ/オクタアルキン構造体(19a〜d)を化合物4dに結合させ、マンノースが中心にある予想されたテトラ/オクタガラクトクラスターオリゴヌクレオチド複合体、Man(POEG2MTzAcNPhe‐O‐Gal)4(32)、Man(POEG4MTzAcNPhe‐O‐Gal)4(33)、Man(POProTzAcNPhe‐O‐Gal)8(34)、及びMan[POTHME(MTzAcNPhe‐O‐Gal)2]4(35)をそれぞれ得た(図12)。同様に、プロパルギルジエチレンエチレングリコールリンカーを有するテトラアルキン19aも4eに結合させ、Man(POEG2MTzEG3‐O‐Gal)4(36)を得た。
試験1:
得られた9つの糖鎖クラスターのPA‐ILに対する結合を、上述したように、DDIマイクロアレイによって決定した(II‐Bを参照)。
結合特性についての十分な理解のために、糖鎖クラスターのIC50Lac値を測定した(表1、項目15〜18に報告されている結果)。
試験1の結果は図14に示されており、ProからEG2Mまでのリンカー長さの増加によって、芳香族モチーフ(TzAcNPhe‐O‐Gal)を有する糖鎖クラスターに対する良好な親和性を常に有する、TzEG3‐O‐GalモチーフとTzAcNPhe‐O‐Galモチーフの両方によって親和性が増加した。これとは対照的に、EG2MからEG4Mまでのリンカー長さの増加によって、低い蛍光シグナルを有する糖鎖クラスターがもたらされ、このことは、非常に高い柔軟性を有し非常に長いリンカーが、PA‐ILに対する結合に悪影響を及ぼすことを示唆していた。
表1の項目15〜18に示されているように、それぞれのガラクトクラスターの効力を、モノ‐EG3‐O‐ガラクトース及びモノ‐芳香族ガラクトースによって算出した。IC50Lac値は、直接蛍光走査によってみられた傾向を確認し、TzEG3‐O‐GalからTzAcNPhe‐O‐Galモチーフ(項目16に対して項目15)が良好な結合であり、ProからEG2Mがリンカーの伸長により良好な結合であり(項目15に対する項目8、及び項目16に対する項目9)、ProTzAcNPhe‐O‐Galモチーフを有するオクタ糖鎖クラスターに対する結合が最も高かった(IC50Lac=6803、項目17)。第2のオクタガラクトクラスターは、低いIC50Lac値である1807 μMを示し(項目18)、空間的配置が結合に対して強い効果を有することを示した。
生物物理学及び生物学研究のために、優位な糖鎖クラスターG1及びG2、並びに、分子を含有する非芳香族のものとして、DNAタグのない擬似ガラクトに相当するMan(POProTzEG3Gal)4 G3を、〜100 mg規模により溶液中で合成した(図15)。血球凝集抑制アッセイ(HIA)、酵素結合レクチンアッセイ(Enzyme Linked Lectin Assay)(ELLA)、等温熱量測定(ITC)、表面プラズモン共鳴(SPR)及びDDIグリコアレイを用いて、PA‐ILに対するこれらの特性を評価した。これらのうち最も強力なものについて、上皮細胞系NCI‐H292(ATCC CRL 1848)に対するPA接着のこれらの阻害も決定した。
糖鎖クラスターG1(Man(POProTzAcNPhe‐O‐Gal)4)、G2(Man(POEG2MTzAcNPhe‐O‐Gal)4)、及びG3(Man(POProTzEG3‐O‐Gal)4)の合成
1‐O‐メチル‐α‐D‐マンノース:メタノール(30 mL)中α‐D‐マンノース(2.0g)の溶液を、DOWEX‐50W X8樹脂、H+形態(4.0g)の存在下で、還流下で27時間煮沸させた。ろ過し濃縮して乾燥させた後、粗生成物をエタノール中で再結晶させ、白色の固体として1‐O‐メチル‐α‐D‐マンノース(1.58g、73%)を得た。分析データは文献のデータ(Cadotte, J. E. et al., (1952) J. Am. Chem. Soc.74, 1501-1504)と一致していた。
無水ジメチルホルムアミド/アセトニトリル(1:1.5、v/v)中1‐O‐メチル‐α‐D‐マンノース(50 mg、0.26 mmol、1当量)の溶液を、分子ふるい(3Å)とともに1時間30分撹拌した。次いで、アルキンホスホラミダイト46a〜b(1.30 mmol、5当量)、及びテトラゾール溶液(無水CH3CN中0.4M、6.4 mL、2.60 mmol、10当量)を加えた。この混合物を30℃で2時間撹拌し、H2Oによって反応を停止した。A26(IO4 −)樹脂(1.0g、2.50 mmol、9.6当量)を加え、この混合物を2時間撹拌した。樹脂をろ過し、ジクロロメタン(40 mL)を加えた後、この反応物を、NaHCO3(60 mL)の飽和水溶液及びブライン(60 mL)によって洗浄した。有機層を乾燥させ(Na2SO4)、ろ過し濃縮し、所望のテトラアルキンマンノース誘導体47a〜bを得た。
アルキン官能化化合物(47a若しくは47b)1.0当量、及びアジドテトラアセチルガラクトース誘導体48a(Bouillon, C. et al., (2006) J. Org. Chem.71, 4700-4702)又は化合物48b(4〜4.8当量)を、トリエチルアンモニウム酢酸緩衝液(175 μL、0.1M、pH7.7)及びナノ粉末銅(2 mg)を含むジオキサン中に溶解した。得られた混合物を70℃で一晩撹拌した。次いで、この反応物をCH2Cl2(15 mL)中に希釈し、ブライン(15 mLで3回)によって洗浄した。有機層を乾燥させ(Na2SO4)、ろ過し濃縮し乾燥させた。得られた生成物をアセトン(5 mL)中に溶解し、濃アンモニア溶液(30%)を加えた(20 mL)。この混合物を室温で1時間撹拌した。蒸発後、粗生成物をミリQ水中に溶解し、この溶液を、DOWEX‐50W X8樹脂、Na+形態を充填したカラムに通した。濃縮後、残渣を、C18フラッシュカラムクロマトグラフィー(40g)(水(eau)/CH3CN/トリエチルアンモニウム酢酸緩衝液(0.1M、pH7.7)、97/0/3〜47/50/3)によって精製し、所望の複合糖質を得た。
ウサギ赤血球に対するPA‐IL結合のガラクトクラスターによる阻害能(血球凝集抑制アッセイ、HIA)、又は、表面プラズモン共鳴(SPR)、酵素結合アッセイ(ELLA)のいずれかによる、表面結合ガラクトシル修飾ポリアクリルアミドに対するPA‐IL結合のガラクトクラスターによる阻害能として、ガラクトクラスターに対するPA‐ILの結合を調査した。阻害を競合アッセイによって測定した。HIA実験では、最小阻止濃度(MIC)は、レクチンの存在下でウサギ赤血球の血球凝集を抑制する、ガラクトクラスターの最小濃度である。低いMICでは、レクチンに対するガラクトクラスターの結合が最も高かった。IC50値を決定するのにSPR及びELLAを用いた。IC50は、表面結合gal‐PAAに対するPA‐ILの結合を50%阻害する、ガラクトクラスターの濃度である。SPR(SPRIC50)及びELLA(ELLAIC50)によって決定されるように、低いIC50値では、ガラクトクラスターに対するPA‐ILの結合が最も高かった。
マイクロアレイの作製
他に詳述されている(Mazurczyk, R. et al., (2008) Sens. Actuators, B128, 552-559; Vieillard, J. et al., (2007) J. Chromatogr. B845, 218-225; Vieillard, J. et al., (2008) Microelectron. Eng.85, 465-469)標準フォトリソグラフィ及びウェットエッチング法を用いて、微細構造ホウケイ酸ガラススライド(NexterionガラスD、Schott社(ドイツ)製)を作製した。微細構造スライドは、40平方ウェル(3 mmの幅、60±1 μmの深さ)が特徴であった。
細菌及び細胞培養。ヒト肺粘液性類表皮癌由来の上皮細胞系NCI‐H292(ATCC CRL 1848)を、10%ウシ胎児血清(Boehringer社製)を添加し抗生物質を含まないRPMI 1640培地(Gibco)を収容した25 cm2組織培養フラスコ(Nunc)中に維持した。以下、この培地を維持培地と称する。細胞を1:6の分裂比で毎週2回継代した。すべての細胞培養物を、5%のCO2を含む雰囲気下で、37℃でインキュベートした。トリパンブルー染色後に光学顕微鏡によって、細胞数及び生存率を決定した。緑膿菌参照株PAO1を、37℃で16時間、Luria‐Bertani培地中で増殖させた。細胞を、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)溶液中で2回洗浄し、これを希釈し、およそ5.106 CFU/mLの細胞密度を得た。
HIAアッセイでは、G2 Man(POEG2MTzAcNPhe‐O‐Gal)4は、擬似化合物のうち最も低いMICを示し、Man(POProTzEG3‐O‐Gal)4 G3は最も高いMICを示した。擬似化合物G1 Man(POProTzAcNPhe‐O‐Gal)4は、中間MICを有していた(表3)。GalOMeに対する擬似化合物G1、G2及びG3の相対的効力はそれぞれ、128、513及び4である。したがって、Man(POProTzEG3‐O‐Gal)4 G3の増加は、依然として制限される。実際に、ガラクトース残基当たりのMICは同じである。これとは対照的に、擬似化合物G1及びG2は、ガラクトース残基とマンノースコアとの間に最も長いリンカーを有するG2の顕著な利益によって、大きな効力の増加を示す。擬似化合物G1及びG2の16及び65のGal‐OArNO2に対する算出された効力はそれぞれ、4及び16の残基当たりの増加によって、糖鎖クラスター効果を明らかに示していた。したがって、効力の増加は、芳香環の存在だけでなく、多価効果にも関連している。
宿主組織のPAコロニー形成、及びバイオフィルム形成によって、抗生物質治療に対して細菌に選択的有利性が提供される。PA‐ILは、PA接着に関与することが疑われる病原因子である。多価のガラクトシル化分子によるPA‐IL阻害は、PA接着を阻害する手段として予測される。本明細書において、PA‐ILに対するガラクトースクラスターの親和性を、5つの異なる方法を用いて評価した。最終的に、5つの方法は、擬似ガラクトG1(Man(POProTzAcNPhe‐O‐Gal)4)がPA‐ILに対して強い結合を有することを実証した。100 μM未満のIC50によって、NCI‐H292へのPA接着を阻害することができた。
Claims (12)
- 次の式(II)に対応する分子であって、
Kは、マンノース、ガラクトース、グルコース、アラビノース、キシロース、リボース及びラクトースからなる群より選択される炭水化物を表し、
Phoは、
式中、XはO又はSを表し、
リン酸基の1又は2個の酸素原子は、共有結合によってL1リンカーアームに結合しており、
L1は、
直鎖又は分岐C1‐C3アルキルジラジカル、直鎖、分岐又は環状C4‐C6アルキルジラジカル、1つ又は複数のエーテル架橋‐O‐を含む可能性がある、直鎖、分岐又は環状C7‐C12アルキルジラジカル、
2、3、4、5又は6つのエチレングリコール単位を含むポリ(エチレングリコール)ジラジカル、
2、3、4、5又は6つのプロピレングリコール単位を含むポリピレングリコールジラジカル、
からなる群より選択されるリンカーアームを表す。)、
Tは、
トリアゾ−ルジラジカル
L2は、
からなる群より選択されるリンカーアームを表し、
Arは、フェニル、ナフタレニル及び1,4‐ビフェニル
L3はO、S又は‐CH2を表し、
Galは、次式のβ‐D‐ガラクトピラノシル基を表し、
- Kが、D‐マンノピラノシル形態下のマンノースを表すことを特徴とする、請求項1に記載の分子。
- L1が、Pro(1,3‐n‐プロピル)基、EG2M(ジエチレングリコールメチレン)、EG3M(トリエチレングリコールメチレン)、EG4M(テトラエチレングリコールメチレン)を表すことを特徴とする、請求項1又は2に記載の分子。
- Arがフェニル基であることを特徴とする、請求項1〜3のうちのいずれか1項に記載の分子。
- zが3又は4であることを特徴とする、請求項1〜4のうちのいずれか1項に記載の分子。
- Man(POProTzAcNPhe‐O‐Gal)4
Gal(POProTzAcNPhe‐O‐Gal)4
Glc(POProTzAcNPhe‐O‐Gal)4
Man(POEG2MTzAcNPhe‐O‐Gal)4
Man[PO(ProTzAcNPhe‐O‐Gal)2]4
Man[POTHME(MTzAcNPhe‐O‐Gal)2]4
Man(PSEG2MTzAcNPhe‐CH2‐O‐Gal)4
Man(PSEG3MTzAcNPhe‐CH2‐O‐Gal)4
Man(POEG2MTzAcNPhe‐CH2‐O‐Gal)4
Man(POEG3MTzAcNPhe‐CH2‐O‐Gal)4
Man(POEG2MTzAcNPhe‐CH2‐S‐Gal)4
Man(POEG3MTzAcNPhe‐CH2‐S‐Gal)4
Man(PSEG3MTzAcNPhe‐O‐Gal)4
Man(PSEG3MTzAcNPhe‐CH2‐S‐Gal)4
Man(PSEG2MTzAcNPhe‐CH2‐S‐Gal)4
Man(PSEG3MTzAcNPhe‐S‐Gal)4
Man(PSEG2MTzAcNPhe‐O‐Gal)4
Man(PSEG2MTzAcNPhe‐S‐Gal)4
Man(POEG2MTzAcNPhe‐S‐Gal)4
Man(POEG3MTzAcNPhe‐S‐Gal)4
Man(PSEG3MTzProNH−C(=O)−BisPhe‐OGal)4
Man(PSEG2MTzProNH−C(=O)−BisPhe‐OGal)4
Man(PSEG3MTzProNH−C(=O)−Napht‐OGal)4
Man(PSEG2MTzProNH−C(=O)−Napht‐OGal)4
(式中、Manはマンノースを表し、Galはガラクトースを表し、Glcはグルコースを表し、Pheはフェニルを表し、Naphtはナフチルを表し、BisPheはビフェニルを表し、POはホスホジエステルを表し、PSはホスホロチオアートを表し、Proは1,3‐n‐プロピルを表し、THMEはトリス‐(ヒドロキシメチル)エタンを表し、Tzはトリアゾール:
EG2はジエチレングリコールを表し、EG3はトリエチレングリコールを表し、AcNPheはアセトアミドフェニル:
からなる群より選択されることを特徴とする、請求項1〜5のうちのいずれか1項に記載の分子。 - 請求項1〜6のうちのいずれか1項に記載の少なくとも1つの分子、又は医薬として許容し得るその塩と、医薬として許容し得る担体及び/又は賦形剤と、を含むことを特徴とする医薬組成物。
- 呼吸器官内に吸入又は滴下されるように製剤化されることを特徴とする、請求項7に記載の医薬組成物。
- 少なくとも1つ以上の他の抗菌剤、又は1つ以上の他の抗病原性剤、又は宿主の先天免疫を強化する1つ以上の薬剤を更に含むことを特徴とする、請求項7又は8に記載の医薬組成物。
- 微生物病原体、具体的には病原菌による感染の予防、遅延、弱化及び治療的処置に用いることを特徴とする、請求項7〜9のうちのいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)からの感染を治療するか、遅延させるか、弱化させるか又は予防するための、請求項10に記載の医薬組成物。
- 緑膿菌を捕捉することが可能な材料に用いることを特徴とする、請求項1〜6のうちのいずれか1項に記載の少なくとも1つの分子を含む組成物。
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