CN108367059A

CN108367059A - 针对肺炎链球菌血清型2的合成疫苗

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Publication number: CN108367059A
Application number: CN201680073724.6A
Authority: CN
Inventors: P·H·西伯戈尔; C·L·佩雷拉; C·安尼史; N·克汉; M·艾默迪
Original assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Current assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Priority date: 2015-12-17
Filing date: 2016-12-16
Publication date: 2018-08-03
Anticipated expiration: 2036-12-16
Also published as: KR20180091921A; US20200016257A1; BR112018012310A2; WO2017103211A1; AU2016372547A1; IL259289B; MX2018007367A; JP6630440B2; JP2019504017A; EP3331556B8; MX371087B; EP3331556B1; SG11201803881RA; US10864261B2; EP3331556A1; CN108367059B; IL259289A; PH12018501205A1; HK1256630B

Abstract

本发明涉及与肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)血清型2荚膜多糖有关的通式(I)的合成糖、其缀合物以及所述糖和缀合物用于在人和/或动物宿主中产生保护性免疫应答的用途。此外，通式(I)的合成糖可用作用于检测针对肺炎链球菌2型细菌的抗体的免疫学测定中的标志物。

Description

针对肺炎链球菌血清型2的合成疫苗

发明领域

发明背景

通常称为肺炎球菌或双球菌的肺炎链球菌是用荚膜多糖包封的人致病性革兰氏阳性菌。基于多糖胶囊的化学性质，肺炎球菌已被分类为90多种血清型。肺炎球菌是一种共生细菌，其无症状地定植于人的上呼吸道，并且导致肺炎、败血症、脑膜炎和中耳炎。肺炎球菌是全球<5岁以下儿童和老年人群中可接种疫苗可预防死亡的最常见原因。全球估计表明，5岁以下儿童死亡总数的18％是由于肺炎造成的。

荚膜多糖是导致肺炎球菌发病的主要毒力因子之一。虽然常见的血清型在全世界范围内一致性地得以鉴定，但流行的荚膜类型的范围随着年龄、时间和地理区域的不同而变化。全球约有20种血清型与所有年龄组中>80％的侵袭性肺炎球菌病发生相关；13种最常见的血清型导致儿童中至少70-75％的侵袭性疾病。目前可用的肺炎球菌疫苗是基于荚膜多糖的，并且设计用于覆盖与侵袭性肺炎球菌病最频繁相关的血清型。

可用的23-价多糖疫苗(23-PPV)对2岁以下的儿童无效，而7-价结合疫苗(7-PCV)对儿童有效，但血清型覆盖率有限。

为增加血清型覆盖率，将含有来自肺炎链球菌1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F型荚膜多糖与蛋白质D(一种不可分型流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)蛋白)、破伤风类毒素和白喉类毒素蛋白的缀合物的10-价结合疫苗以及含有来自肺炎链球菌1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F型荚膜多糖与白喉CRM₁₉₇蛋白的缀合物的13-价结合疫苗已被许可使用。

目前可用的结合疫苗对2岁以下的儿童非常有效，并且这些疫苗的应用已导致严重肺炎球菌疾病的显著减少。然而，新出现的抗生素耐药性和用非疫苗夹膜类型的血清型替换显示了未来的问题，并且需要解决疫苗领域需要改变的问题，而且其高成本降低了许多发展中国家的采购和可用性。

国际专利申请WO2007116028A2公开了来自与载体蛋白缀合的不同肺炎链球菌血清型的荚膜糖的9价或更高价的肺炎链球菌免疫原性组合物，其中该组合物包含缀合的荚膜糖18C，其具有小于80、70、60、50、40、30、20、15或10％的O-乙酰化。该申请教导了血清型18C的荚膜糖的去O-乙酰化可能有利于将免疫应答集中在主链表位上，这可能有利于产生针对高度O-乙酰化的18C菌株和较差O-乙酰化的那些菌株的保护性免疫应答。

国际专利申请WO2014097099A2公开了一种通过用稳定的硝酰基如四甲基哌啶-N-氧化物氧化糖并随后与载体蛋白的氨基偶联来制备包含与载体蛋白缀合的糖的糖缀合物的方法。所述糖可以是来源于肺炎链球菌的细菌荚膜多糖。

Pozsgay描述了几种寡糖抗原的蛋白质缀合物(Current Topics in MedicinalChemistry 2008，8，p.126-140)。其中有肺炎链球菌血清型3、6B和14的糖缀合物。

Joosten等人报告了血清型14的夹膜多糖的丁-、戊-和己糖片段的化学-酶合成(Carbohydrate Research 2003，338，p.2629-2651)。通过化学合成、随后酶半乳糖基化(galatosylation)合成直链中间体。

最近的研究显示，SAARC(南亚区域合作联盟(The South Asian Association forRegional Cooperation))国家出现了2型肺炎链球菌，这是一种目前商业上可用的疫苗尚未涵盖的血清型。肺炎链球菌2型在尼泊尔儿童中造成4.54％的侵袭性肺炎球菌病，而在孟加拉国儿童中8.9％为侵袭性肺炎球菌病(以医院为基础的研究)(生活在SAARC国家的儿童中肺炎链球菌血清型、疫苗覆盖率和抗菌药物敏感性模式的分布：系统评价(Distributionof Serotypes，Vaccine Coverage and Antimicrobial Susceptibility Pattern ofStreptococcus Pneumoniae in Children Living in SAARC Countries：A SystematicReview)Jaiswal，N.等人PLOS ONE 2014，9)。进一步的基于人群的有关肺炎球菌血清型分布的研究证实2型肺炎链球菌是孟加拉国最普遍的血清型，其导致12.2％的侵袭性肺炎球菌病(亚洲肺炎球菌血清型分布当前趋势(Current Trend in Pneumococcal SerotypeDistribution in Asia)，Le C.等人J Vaccines Vaccin 2011)。因此，高度需要提供针对2型肺炎链球菌的疫苗，所述肺炎链球菌2型是目前商业化疫苗未覆盖的血清型。

本发明的目的在于提供与肺炎链球菌血清型2荚膜多糖有关的通式(I)的糖，以及通式(I)的糖与免疫原性载体例如载体蛋白的缀合物。通式(I)的糖，且特别是所述糖与免疫原性载体的缀合物能够在人和/或动物宿主中产生针对肺炎链球菌血清型2的保护性免疫应答。因此，提供了包含通式(I)的糖和/或其缀合物的用于免疫2型肺炎链球菌的疫苗组合物。此外，通式(I)的合成糖在用于检测针对肺炎链球菌血清型2细菌的抗体的免疫学测定中可用作标志物。

通过独立权利要求的教导解决了本发明的目的。从本发明的从属权利要求、说明书附图和实施例中，本发明的其它有利特征、方面和细节是显而易见明显的。

本发明的描述

定义

如本文所用的术语“接头”涵盖能够任选地通过结合至少一个互连分子将糖的还原端单糖与免疫原性载体或固体支持物连接的分子片段。因此，接头本身或与互连分子一起的功能在于建立、保持和/或桥接还原端单糖与免疫原性载体或固体支持物之间的特定距离。更具体地，接头的一端与还原-端单糖的端基异构中心的环外氧原子相连，而另一端通过氮原子与互连分子连接，或直接与免疫原性载体或固体支持物连接。

如本文所用，术语“互连分子”是指包含官能团X和官能团Y的双官能团分子，其中官能团X能够与接头L上的末端氨基反应并且官能团Y能够与存在于免疫原性载体或固体支持物上的官能团反应。图1显示了商业上可用的互连分子的实例，但是并不将本发明使用的互连分子限制到本文显示的实例。

如本文所用，术语“佐剂”是指免疫佐剂，即用于疫苗组合物中的物质，其通过增强对疫苗中所含的指定抗原的免疫应答而在抗原方面不与其之相关地修饰或增强所述疫苗的作用。对于本领域技术人员而言，传统上公认的佐剂实例包括：

-含有矿物质的组合物，包括钙盐和铝盐(或其混合物)。钙盐包括磷酸钙。铝盐包括氢氧化物，磷酸盐，硫酸盐等，其盐呈任何适合的形式(例如凝胶，结晶，无定形物等)。对这些盐的吸附是优选的。也可以将含矿物质的组合物配制成金属盐颗粒。也可以使用称为氢氧化铝和磷酸铝的佐剂。本发明可以使用通常用作佐剂的任何“氢氧化物”或“磷酸盐”佐剂。称为“氢氧化铝”的佐剂典型地为羟基氧化铝盐，其通常为至少部分结晶的。称为“磷酸铝”的佐剂典型地为羟基磷酸铝，通常还含有少量硫酸盐(即羟基磷酸硫酸铝)。它们可以通过沉淀得到，并且沉淀期间的反应条件和浓度影响磷酸盐对盐中羟基的取代度。氢氧化铝和磷酸铝的混合物可用于本发明的制剂中；

-皂苷，其为甾醇糖苷和三萜糖苷的异源部分，可在广泛植物物种的树皮、叶、茎、根和甚至花中发现。来自Quillaia saponaria，Molina树皮的皂苷作为佐剂已被广泛研究。皂苷也可以从Smilax ornata(sarsaprilla)、Gypsophilla paniculata(brides veil)和石碱花(Saponaria oficianalis)(soap root)商购获得。皂苷佐剂制剂包括纯化的制剂如QS21以及脂质制剂如ISCOM。使用HPLC和RP-HPLC纯化皂苷组合物。已经鉴定了使用这些技术的特定纯化级分，包括QS7，QS17，QS18，QS21，QH-A，QH-B和QH-C。皂苷制剂还可以包含甾醇，例如胆固醇。皂苷和胆固醇的组合可用于形成称为免疫刺激复合物(ISCOM)的独特颗粒。ISCOM通常包括磷脂如磷脂酰乙醇胺或磷脂酰胆碱。任何已知的皂苷都可用于ISCOM。优选地，ISCOM包括QuilA、QHA和QHC中的一种或多种；

-由可生物降解且无毒的材料形成的微粒(即直径为100nm-150pm，更优选直径为200nm-30pm，或直径为500nm-10pm)的微粒。这类无毒且可生物降解的材料包括但不限于聚(α-羟基酸)，聚羟基丁酸，聚原酸酯，聚酐，聚己内酯；

-CD1d配体，例如α-糖基神经酰胺，含植物鞘氨醇的α-糖基神经酰胺，OCH，KRN7000[(2S,3S,4R)-1-O-(α-D-吡喃半乳糖基)-2-(N-二十六烷酰氨基)-1,3,4-十八烷三醇]，CRONY-101，3”-磺基-半乳糖基-神经酰胺；

-免疫刺激性寡核苷酸，例如含有CpG基元的寡核苷酸(含有通过磷酸键与鸟苷残基连接的非甲基化胞嘧啶残基的二核苷酸序列)或含有CpI基元的寡核苷酸(含有与肌苷连接的胞嘧啶的二核苷酸序列)或双链RNA或包含回文序列的寡核苷酸，或含有聚(dG)序列的寡核苷酸。免疫刺激性寡核苷酸可以包括核苷酸修饰物/类似物例如硫代磷酸修饰物并且可以是双链的或(除了RNA)单链的；

-含有与含磷酸盐的无环骨架连接的脂质的化合物，如TLR4拮抗剂E5564；

-油乳剂(例如弗氏佐剂)。

理论上，能够促进或扩大免疫事件级联中的特定情况、最终导致更显著的免疫应答的每一种分子或物质都可以被定义为佐剂。

原则上，通过在疫苗制剂中使用佐剂，人们可以

-指导和优化疫苗适合或期望的免疫应答；

-能够粘膜递送疫苗，即导致疫苗与粘膜表面如颊或胃或肺上皮细胞和相关淋巴组织接触的施用；

-促进细胞介导的免疫应答；

-增强较弱免疫原如高度纯化或重组抗原的免疫原性；

-减少提供保护性免疫所需的抗原量或免疫接种频率；和

-改善疫苗在具有减少或减弱的免疫应答的个体中的效能，如新生儿，老年人和免疫功能低下的疫苗接受者。

尽管对其作用方式知之甚少，但目前认为佐剂通过以下机制之一增强免疫应答：

-增加抗原的生物学或免疫学半衰期；

-改善抗原递送至抗原呈递细胞(APC)，以及通过APC进行的抗原加工和呈递，例如通过使抗原在由APC摄入抗原-佐剂复合物后交叉通过胞内体膜进入胞质溶胶；

-模拟来自应激或受损细胞的危险诱导信号，用于启动免疫应答；

-诱导免疫调节细胞因子的产生；

-将免疫应答偏向于免疫系统的特异性亚组；和

-阻断抗原攻击的快速分散。

本领域技术人员已知糖为TI-2(T细胞非依赖性-2)抗原和不良免疫原。因此，为了生产基于糖的疫苗，将所述糖与免疫原性载体缀合以提供与糖相比呈现增加的免疫原性的缀合物。在本文的上下文中，术语“免疫原性载体”被定义为与糖缀合以形成与糖本身相比呈现增加的免疫原性的缀合物的结构。因此，糖与免疫原性载体的缀合具有刺激针对所述糖的免疫应答的效果，而不诱导针对所述免疫原性载体的免疫应答。

令人惊奇地，发现本发明的纯的通式(I)的糖含有保护性免疫原性聚糖表位并且能够在人类和/或动物宿主中诱导针对肺炎链球菌血清型2细菌的保护性免疫应答。通式(I)的糖引发与肺炎链球菌血清型2荚膜多糖交叉反应的抗体(参见例如图5)，特异性识别肺炎链球菌血清型2细菌并调理它们被吞噬细胞杀死。

因此，本发明涉及通式(I)的糖

V*-U_x+3-U_x+2-U_x+1-U_x-O-L-NH₂

(I)

其中

x为选自1、2、3和4的整数；

V*-表示H-、H-U_x-、H-U_x+1-U_x-、H-U_x+2-U_x+1-U_x-或H-U_x+3-U_x+2-U_x+1-U_x-；

L表示接头；或其药学上可接受的盐。

-L-被定义为接头并且为片段-O-L-NH₂的组成部分。因此，接头-L-结合至氧原子和NH₂-基团的氮原子。优选接头的至少两个碳原子位于氧原子与NH₂-基团之间，如-O-C-C-NH₂。接头-L-可以为脂族链，其中该脂族链可以任选地包括插入其中的芳族链，或者杂原子的数量为0-10。

接头L优选含有2-40个碳原子(包括任选的侧链的碳原子)，更优选2-30，更优选2-20，更优选2-14，更优选2-12，还更优选2-10个碳原子。

氧原子(即-O-L-NH₂-的氧)与NH₂-基团之间的最短原子链优选由2-14个原子，更优选2-12个原子，更优选2-10个原子，更优选2-8个原子组成。在最短链(其是异头中心处的氧与NH₂-基团之间的最短可能连接)由2-6个原子组成的情况下，这些优选为碳原子。在最短链由4-8个原子组成的情况下，所述链可以含有1、2或3个选自O、N和S的杂原子。在最短链由9-14个原子组成的情况下，所述链可以包含1、2、3、4、5或6个选自O、N和S的杂原子。

另外优选，接头-L-或最短链为完全或部分氟化的。接头-L-可以包含3-元或4-元或5-元或6-元饱和碳环或5-元部分不饱和(且不为芳族的)碳环或4-元或5-元或6-元饱和氧杂环或4-元或5-元或6-元饱和氮杂环或6-元芳族碳环。

接头-L-还可以包含酰胺(-NH-CO-、-CO-NH-)和/或脲(-NH-CO-NH-)残基且优选仅1个酰胺或脲残基。接头还可以包含取代基且优选2个取代基，例如R¹⁰和R¹¹或4个取代基例如R¹⁰、R¹¹、R¹⁵和R¹⁴，它们具有如本文所定义的含义并且优选选自：-F、-Cl、-CH₃、-C₂H₅、-C₃H₇、-C₅H₉、-C₆H₁₃、-OCH₃、-OC₂H₅、-CH₂F、-CHF₂、-CF₃、-C(O)-NH₂、-SCH₃、-SC₂H₅、-NHC(O)CH₃、-N(CH₃)₂和-N(C₂H₅)₂；

在接头-L-被氟化的情况下，优选2个以上取代基-F。

优选接头-L-选自：-CH₂-、-(CH₂)₂-、-(CH₂)₃-、-(CH₂)₄-、-(CH₂)₅-、-(CH₂)₆-、-(CH₂)₇-、-(CH₂)₈-、-(CH₂)₉-、-(CH₂)₁₀-、-CF₂-、-(CF₂)₂-、-(CF₂)₃-、-(CF₂)₄-、-(CF₂)₅-、-(CF₂)₆-、-(CF₂)₇-、-(CF₂)₈-、-(CF₂)₉-、-(CF₂)₁₀-、-(CH₂)₂-O-(CH₂)₂-、-CH₂-O-(CH₂)₃-、-(CH₂)₃-O-CH₂-、-CH₂-O-(CH₂)₂-、-(CH₂)₂-O-CH₂-、-(CH₂)₃-O-(CH₂)₂-、-(CH₂)₂-O-(CH₂)₃-、-(CH₂)₄-O-CH₂-、-CH₂-O-(CH₂)₄-、-L^a-、-L^a-L^e-、-L^a-L^b-L^e-、-L^a-L^b-L^d-L^c-L^e-、-L^a-L^d-L^e-；

其中

-L^a-选自：-(CH₂)_o-、-(CF₂)_o-、-(CH₂-CH₂-O)_o-C₂H₄-、-(CH₂-CH₂-O)_o-CH₂-、-(CR¹⁰R¹¹)_o-、

-L^b-和-L^c-彼此独立地选自：-O-、-NH-C(O)-NH-、-NH-C(S)-NH-、-NH-C(O)-、-C(O)-NH-、-NH-C(O)-O-、-NR⁹-、-NR¹⁸-、-SO₂-、

-L^d-表示-(CH₂)_q-、-(CF₂)_q-、-(CR¹²R¹³)_q-、-(CH₂-CH₂-O)_q-C₂H₄-、-(CH₂-CH₂-O)_q-CH₂-、

-L^e-选自：-(CH₂)_p1-、-(CF₂)_p1-、-C₂H₄-(O-CH₂-CH₂)_p1-、-CH₂-(O-CH₂-CH₂)_p1-、-(CH₂)_p1-O-(CH₂)_p2-、-(CR¹⁴R¹⁵)_p1-、-(CR¹⁴R¹⁵)_p1-O-(CR²¹R²²)_p2-、

R⁹和R¹⁸彼此独立地选自：-CH₃、-C₂H₅、-C₃H₇和-C(O)CH₃；

R¹⁰、R¹¹、R¹²、R¹³、R¹⁴、R¹⁵、R¹⁶、R¹⁷、R¹⁹、R²⁰、R²¹和R²²彼此独立地选自：-H、-F、-Cl、-CH₃、-C₂H₅、-C₃H₇、-C₅H₉、-C₆H₁₃、-OCH₃、-OC₂H₅、-CH₂F、-CHF₂、-CF₃、-C(O)-NH₂、-SCH₃、-SC₂H₅、-NHC(O)CH₃、-N(CH₃)₂和-N(C₂H₅)₂；

o、q、p1和p2彼此独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10的整数。

本发明的糖带有碱性和/或酸性取代基且他们可以与无机酸或无机碱或有机酸或有机碱成盐。

用于这种酸加成盐形成的适合的酸的实例是盐酸，氢溴酸，硫酸，磷酸，乙酸，柠檬酸，草酸，丙二酸，水杨酸，对氨基水杨酸，苹果酸，富马酸，琥珀酸酸，抗坏血酸，马来酸，磺酸，膦酸，高氯酸，硝酸，甲酸，丙酸，葡糖酸，乳酸，酒石酸，羟基马来酸，丙酮酸，苯乙酸，苯甲酸，对氨基苯甲酸，对羟基苯甲酸，甲磺酸，乙磺酸，亚硝酸，羟基乙磺酸，乙烯磺酸，对甲苯磺酸，萘磺酸，对氨基苯磺酸，樟脑磺酸，中国酸，扁桃酸，邻甲基扁桃酸，氢-苯磺酸，苦味酸，己二酸，d-o-甲苯基酒石酸，丙醇二酸，(邻，间，对)-甲苯酸，萘胺磺酸，以及本领域技术人员众所周知的其它无机酸或羧酸。通过使游离碱形式与足量的所需酸接触以通过常规方式产生盐来制备盐。

适合的无机碱或有机碱的实例为例如NaOH、KOH、NH₄OH、氢氧化四烷基铵、赖氨酸或精氨酸等。可以使用本领域公知的方法以常规方式制备盐，例如通过用选自上述组中的碱溶液处理通式(I)化合物的溶液。

碳水化合物化学领域的技术人员显而易见，通式(I)的糖不包含-O-O-键和或通过其异头或C-1碳相互连接或结合的糖片段(U_x、U_x+1、U_x+2、U_x+3)。本领域技术人员还清楚，糖苷键的立体化学是在式中糖片段的异头中心所示的立体化学。因此，糖片段U₁和U₅的异头中心的立体化学为α或β，糖片段U₂和U₆中的鼠李糖残基为α或β，糖片段U₃和U₇为β，糖片段U₄为β。

通式(I)的糖包含保护性免疫原性表位并且能够在人和/或动物宿主中诱导针对肺炎链球菌血清型2细菌的保护性免疫应答。通式(I)的糖引发与肺炎链球菌血清型8荚膜多糖交叉反应的抗体(参见例如图5)，特异性识别肺炎链球菌血清型2细菌并调理它们被吞噬细胞杀死。此外，本发明的糖具有这样的优点，即它们是纯合成的化合物，其可以按照GMP规定容易地制造。

因此，本发明的疫苗组合物最优选仅包含一种结合于免疫原性载体、优选载体蛋白且更优选CRM₁₉₇的单一通式(I)的化合物。因此，通式(I)的化合物可用于制备明确定义的、特征明确的纯疫苗，其仅含有一种合成制备的并且充分表征的己-、庚-、辛-、壬-、癸-、十一-或十二-糖，它们优选与免疫原性载体、优选载体蛋白且更优选CRM₁₉₇连接。因此，本发明的疫苗仅含有一种以合成方式合成的通式(I)化合物，其优选与免疫原性载体、优选载体蛋白且更优选CRM₁₉₇连接。

优选通式(I)的糖及其药学上可接受的盐，其中x表示1。因此，特别优选通式(I-a)的糖或其药学上可接受的盐，

其中L和V*具有如本文所定义的含义。

还优选通式(I)的糖及其药学上可接受的盐，其中x表示2、3或4。因此，还优选通式(I-b)、(I-c)或(I-d)的糖或其药学上可接受的盐，

其中L和V*具有如本文所定义的含义。

优选

因此，特别优选通式(I)、(I-a)、(I-b)、(I-c)或(I-d)的糖，其中糖片段U₂和U₆在鼠李糖部分的异头中心处具有立体化学β。

还优选

另外优选

因此，特别优选通式(I)、(I-a)、(I-b)、(I-c)或(I-d)的糖，其中糖片段U₁和/或U₅在其异头中心处具有立体化学β。

还优选

因此，特别优选通式(I)、(I-a)、(I-b)、(I-c)或(I-d)的糖，其中糖片段U₁和/或U₅在其异头中心处具有立体化学α。

优选V*-表示H-。因此，尤其优选通式(I)、(I-a)、(I-b)、(I-c)或(I-d)的糖，其中V*-表示H-。

优选接头-L-选自：-L^a-、-L^a-L^e-、-L^a-L^b-L^e-、-L^a-L^d-L^e-；其中

-L^a-选自：-(CH₂)_o-、-(CH₂-CH₂-O)_o-C₂H₄-、-(CH₂-CH₂-O)_o-CH₂-；

-L^b-表示-O-；

-L^d-选自：-(CH₂)_q-、-(CF₂)_q-、-(CH₂-CH₂-O)_q-C₂H₄-和-(CH₂-CH₂-O)_q-CH₂-；

-L^e-选自：-(CH₂)_p1-、-(CF₂)_p1-、-C₂H₄-(O-CH₂-CH₂)_p1-、-CH₂-(O-CH₂-CH₂)_p1-和-(CH₂)_p1-O-(CH₂)_p2-；

且o、q、p1和p2彼此独立地选自1、2、3、4、5和6的整数。

因此，尤其优选通式(I)、(I-a)、(I-b)、(I-c)或(I-d)的糖，其中

-L-选自：-L^a-、-L^a-L^e-、-L^a-L^b-L^e-和-L^a-L^d-L^e-；

-L^b-表示-O-；

且o、q、p1和p2彼此独立地选自1、2、3、4、5和6的整数。

特别优选通式(I)、(I-a)、(I-b)、(I-c)或(I-d)的糖，其中

-L-选自：-L^a-、-L^a-L^e-、-L^a-L^b-L^e-和-L^a-L^d-L^e-；

-L^b-表示-O-；

o、q、p1和p2彼此独立地选自1、2、3、4、5和6的整数；且V*-表示H-。

特别优选-L-表示-(CH₂)_o-，且o为选自2、3、4、5、6、7和8的整数。因此，特别优选的糖为通式(I)、(I-a)、(I-b)、(I-c)或(I-d)的糖，其中-L-表示-(CH₂)_o-，且o为选自2、3、4、5、6、7和8的整数。

甚至更优选通式(I)、(I-a)、(I-b)、(I-c)或(I-d)的糖，其中-L-表示-(CH₂)_o-，且o为选自2、3、4、5、6、7和8的整数，且V*-表示H-。

优选地，本发明的糖选自：5-氨基戊基β-L-吡喃鼠李糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-α-L-{α-D-吡喃葡萄糖基糖醛酸酯-(1→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)}吡喃鼠李糖基-(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖苷，4-氨基丁基β-L-吡喃鼠李糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-α-L-{α-D-吡喃葡萄糖基糖醛酸酯-(1→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)}吡喃鼠李糖基-(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖苷，

6-氨基己基β-L-吡喃鼠李糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-α-L-{α-D-吡喃葡萄糖基糖醛酸酯-(1→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)}吡喃鼠李糖基-(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖苷，

7-氨基庚基β-L-吡喃鼠李糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-α-L-{α-D-吡喃葡萄糖基糖醛酸酯-(1→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)}吡喃鼠李糖基-(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖苷，

3-氨基丙基β-L-吡喃鼠李糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-α-L-{α-D-吡喃葡萄糖基糖醛酸酯-(1→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)}吡喃鼠李糖基-(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖苷，

2-(2-氨基乙氧基)乙基β-L-吡喃鼠李糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-α-L-{α-D-吡喃葡萄糖基糖醛酸酯-(1→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)}吡喃鼠李糖基-(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖苷和

2-氨基乙基β-L-吡喃鼠李糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-α-L-{α-D-吡喃葡萄糖基糖醛酸酯-(1→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)}吡喃鼠李糖基-(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖苷。

化学合成

使用单糖1*、2*、3*和4*以及氨基-醇接头5*作为原料，可以有效地组装本发明通式(I)的糖(方案1)。

方案1：逆合成分析

在方案1中，P¹、P⁶-P⁹、P¹¹-P¹⁵表示保护基，而LG³-LG⁶表示离去基或暂时性的保护基。

如本文所用的术语“保护基”是指在有机合成中用于保护氨基和羟基的常用基团。适合的羟基保护基包括但不限于乙酰基，苄基，苯甲酰基，对甲氧基苄基，对甲氧基苯基，对溴苄甲基，对硝基苯基，烯丙基，异丙基，乙酰丙酰基(levulinoyl)，二甲氧基三苯甲基，三苯甲基，2-萘基甲基，新戊酰基(pyvaloyl)，三异丙基甲硅烷基，叔丁基二甲基甲硅烷基，叔丁基二苯基甲硅烷基，叔丁基甲氧基苯基甲硅烷基，三乙基甲硅烷基，三甲基甲硅烷基，2-三甲基甲硅烷基乙氧基甲基，吡啶甲酰基，9-芴基甲氧基羰基。

适合的氨基保护基包括但不限于叔丁氧基羰基，9-芴基甲氧基羰基，烯丙氧基羰基，2,2,2-三氯乙氧基羰基，苄氧基羰基；羰基如三氟乙酰基，三氯乙酰基，乙酰基或苯甲酰基和芳族烷基如苄基，对甲氧基苄基，对甲氧基苯基，对溴苄基，对硝基苯基或2-萘基甲基。

保护基可以在“持久性保护基”和“暂时性保护基”中分化。持久性保护基是在整个合成过程中保持稳定并且可以在合成后期有效去除的保护基。临时性保护基通常是正交的(orthogonal)保护基，其可以在不同的合成水平下被选择性地除去，以释放羟基，用于随后引入不同的取代基，包括单糖，其它保护基或存在于分子上的其它残基。

保护基的巧妙选择使得可以方便地获得用氨基官能化的通式(I)的糖的文库，以便随后缀合至免疫原性载体或固体支持物。

为了方便地装配通式(I)的糖，保护基P¹、P²、P⁶、P⁷、P⁸和P⁹是持久性保护基，保护基P¹²、P¹³、P¹⁴和P¹⁵代表暂时性保护基，且保护基P¹¹是持久性保护基或暂时性持久性基团。

特别有利的是P¹、P⁶、P⁷和P⁹是苄基，P²是乙酰基或苯甲酰基，P⁸是苄氧基羰基，P¹¹是乙酰丙酰基或苯甲酰基，P¹²为任意的与P¹¹和P⁶正交的羟基保护基，P¹³为任意的与P¹正交的羟基保护基，P¹⁴为任意的与P¹正交的羟基保护基，且P¹⁵为任意的与P⁹正交的羟基保护基。因此，通式(I)的糖可以有利地从单糖1*-a、1*-b、2*-a、3*-a、3*-b、4*-a和氨基醇接头5*-a开始合成，其中P¹²为任意的与P¹¹和苄基正交的醇保护基，P¹³为任意的与苄基正交的醇保护基，P¹⁴为任意的与苄基和P²正交的醇保护基，并且P¹⁵为任意的与苄基正交的醇保护基(参见方案2)。

方案2：逆合成分析

LG³-LG⁶表示离去基，包括卤化物、硫醚、亚氨酸酯(imidate)、乙酸酯和磷酸酯或OP¹⁶，其中P¹⁶是与分子上其它保护基正交的暂时性保护基，例如对甲氧基苯基、三乙基甲硅烷基、三甲基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、乙氧基二甲基甲硅烷基(thexydimethylsilyl)和三甲基甲硅烷基乙基(Me₃SiCH₂CH₂)。

因此，由结构单元1*、2*、3*、4*和5*起始，但优选由结构单元1*-a、1*-b、2*-a、3*-a、3*-b、4*-a和5*-a起始，可以通过线性合成或通过模块合成，经糖基化、脱保护和/或保护基转化反应来合成任意的通式(I)的糖。

本发明的另一个方面涉及通式(I)的糖的合成方法

V*-U_x+3-U_x+2-U_x+1-U_x-O-L-NH₂

(I)

其中

V*-表示H-，x表示1，且接头L具有本文所定义的含义，

该方法包括下列步骤：

A)使通式(II)的二糖

其中P¹-P³表示保护基，且LG¹表示离去基，与通式(III)的二糖反应

其中P⁴-P⁸表示保护基，且L具有本文所定义的含义，得到通式(IV)的四糖

其中P¹-P⁸表示保护基；

并且

B)使通式(IV)的四糖进行选择性脱保护，得到通式(V)的化合物

其中P¹-P⁴、P⁶-P⁸表示保护基，且L具有本文所定义的含义；

并且

C)使通式(V)的二糖与通式(VI)的化合物反应，

其中P⁹和P¹⁰表示保护基，且LG²表示离去基，得到通式(VII)的己糖，

其中P¹-P⁴、P⁶-P¹⁰表示保护基，且L具有本文所定义的含义；

并且

D)除去通式(VII)化合物上的保护基P¹-P⁴、P⁶-P¹⁰。

可以由结构单元1*、2*、3*、4*和5*、但优选由结构单元1*-a、1*-b、2*-a、3*-a、3*-b、4*-a和5*-a组装用作本发明方法中的试剂的通式(II)、(III)和(VI)的二糖。例如，可以由单糖2*和3*起始且优选由单糖2*a和3*a或3*b起始合成通式(II)的二糖，可以由单糖1*和氨基-醇5*起始、但优选由单糖1*a和/或1*b和氨基-醇5*a起始合成通式(III)的二糖。

P¹-P¹⁰表示氨基、羟基和羧酸基团的保护基，而LG¹和LG²表示离去基。

适合的羟基保护基包括但不限于乙酰基、苄基、苯甲酰基、对甲氧基苄基、对甲氧基苯基、对溴苄基、对硝基苯基、烯丙基、异丙基、乙酰丙酰基(levulinyl)、二甲氧基三苯甲基、三苯甲基、2-萘基甲基、新戊酰基、三异丙基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、叔丁基甲氧基苯基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、三甲基甲硅烷基、2-三甲基甲硅烷基乙氧基甲基、吡啶甲酰基、9-芴基甲氧基羰基。

适合的氨基保护基包括但不限于叔丁基氧基羰基、9-芴基甲氧基羰基、烯丙氧基羰基、2,2,2-三氯乙氧基羰基、苄基氧基羰基(Cbz)、羰基如三氟乙酰基、三氯乙酰基、乙酰基或苯甲酰基和芳族烷基如苄基、对甲氧基苄基、对甲氧基苯基、对溴苄基、对硝基苯基或2-萘基甲基。

羧酸可以被保护为甲酯、乙酯、烯丙酯、异丙酯、叔丁酯、苯酯、苄酯或对甲氧基苄酯。因此，保护基P¹⁰可以为甲基、乙基、烯丙基、异丙基、叔丁基、苯基、苄基或对甲氧基苄基。

适合的离去基包括卤化物、硫醚、亚氨酸酯、乙酸酯和磷酸酯。

为了得到高反应收率且加速合成，有利的是保护基P¹、P⁶、P⁷、P⁹表示苄基，P⁸为苄氧基羰基，P²、P³和P⁴彼此独立地表示乙酰基或苯甲酰基，且P⁵为任意的与保护基P¹-P⁴、P⁶-P¹⁰正交的羟基保护基。另外优选保护基P⁵为乙酰丙酰基。

优选离去基LG¹和LG²选自-SCH₃、-SCH₂CH₃、-SPh、-OPO₃Bu₂

尤其优选离去基LG¹选自

在这类情况下，有利地在亚氨酸酯活化剂存在下在非极性溶剂中进行步骤A。优选的非极性溶剂是甲苯和卤代溶剂，例如氯仿和二氯甲烷。亚氨酸酯活化剂为路易斯酸，例如三氟甲磺酸甲硅烷基酯或三氟甲磺酸银。三氟甲磺酸甲硅烷基酯的实例包括但不限于三氟甲磺酸三甲基甲硅烷基酯、三氟甲磺酸叔丁基二甲基酯(tert-butyl dimethyltrifluoromethanesulfonate)、三氟甲磺酸三异丙基酯(triiospropyltrifluoromethanesulfonate)。优选地，使通式(II)的二糖与通式(III)的二糖在约-60℃至约0℃、更优选约-40℃至约0℃的温度下反应。

另外优选离去基LG²选自：-SCH₃、-SCH₂CH₃、

在这类情况下，有利地在硫醚活化剂的存在下在极性非质子溶剂和非极性溶剂的混合物中进行步骤C。硫醚活化剂包括但不限于：NIS/TfOH、NIS/TMSOTf、NIS/BF₃·Et₂O、NIS/AgOTf、DMTST/Tf₂O、IDPC、BSP/Tf₂O、Ph₂SO/Tf₂O。优选的极性非质子溶剂为四氢呋喃、乙醚和1,4-二噁烷。优选的非极性溶剂为甲苯、卤代溶剂例如氯仿和二氯甲烷。优选的非极性和极性非质子溶剂的混合物为：二氯甲烷/1,4-二噁烷、二氯甲烷/四氢呋喃、二氯甲烷/乙醚、甲苯/乙醚、甲苯/四氢呋喃。优选地，使通式(V)的四糖与通式(VI)的二糖在约-60℃至约30℃、更优选约-45℃至约15℃且甚至更优选-30℃至约0℃的温度下反应。

除去通式(VII)的化合物上的保护基P¹-P⁴、P⁶-P¹⁰牵涉首先通过用碱在极性非质子和极性质子溶剂的混合物中处理除去碱不稳定基团；其次裂解对氢化敏感的保护基。对于第一步，适合的非质子溶剂包括四氢呋喃、丙酮、N,N-二甲基甲酰胺、乙腈和N,N-二甲亚砜，将它们与适合的质子溶剂例如水和醇(包括甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇或叔丁醇)混合。

保护基的碱性裂解优选在0℃-室温的温度下进行。用于进行第一步的适合的碱包括氢氧化锂、氢氧化钠、氢氧化钾和甲醇钠。对氢化敏感的保护基的裂解通过在氢化催化剂存在下在极性质子和极性非质子溶剂的混合物中在室温下暴露于氢来进行。

中间体

本发明的另一个方面涉及通式(V)的中间体

其中P¹-P⁴、P⁶-P⁸表示保护基，且L具有本文所定义的含义，P¹-P⁴、P⁵和P⁶为羟基保护基，而P⁷和P⁸为氨基保护基。

适合的羟基保护基包括但不限于乙酰基、苄基、苯甲酰基、对甲氧基苄基、对甲氧基苯基、对溴苄基、对硝基苯基、烯丙基、异丙基、乙酰丙酰基、二甲氧基三苯甲基、三苯甲基、2-萘基甲基、新戊酰基、三异丙基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、叔丁基甲氧基苯基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、三甲基甲硅烷基、2-三甲基甲硅烷基乙氧基甲基、吡啶甲酰基、9-芴基甲氧基羰基。

适合的氨基保护基包括但不限于叔丁基氧基羰基、9-芴基甲氧基羰基、烯丙氧基羰基、2,2,2-三氯乙氧基羰基、苄氧基羰基；羰基如三氟乙酰基、三氯乙酰基、乙酰基或苯甲酰基和芳族烷基如苄基、对甲氧基苄基、对甲氧基苯基、对溴苄基、对硝基苯基或2-萘基甲基。

优选通式(V)的中间体，其中P¹、P⁶和P⁷表示苄基，P²、P³和P⁴彼此独立地选自苯甲酰基和乙酰基，且P⁸表示苄氧基羰基(Cbz)。这类中间体可以有效地与通式(VI)的二糖偶联，得到通式(VII)的己糖。

缀合物

本发明的另一方面涉及包含合成的通式(I)的糖的缀合物，所述糖通过-O-L-NH₂基团的氮原子与免疫原性载体共价结合或共价连接。换言之，本发明的另一方面涉及通过-O-L-NH₂基团与免疫原性载体缀合的通式(I)、(I-a)、(I-b)、(I-c)或(I-d)中的任一个的糖。本发明的缀合物包含通过-O-L-NH₂基团的氮原子与免疫原性载体共价结合或共价连接的通式(I)、(I-a)、(I-b)、(I-c)或(I-d)的合成糖，该缀合物也被定义为通过使通式(I)、(I-a)、(I-b)、(I-c)或(I-d)中任一个的糖与免疫原性载体反应获得的缀合物。所述缀合物被证明作为疫苗是有效的，其用于针对与肺炎链球菌血清型2细菌相关的疾病的免疫接种。

本领域技术人员已知糖类通常为TI-2(T细胞非依赖性-2)抗原和不良免疫原。TI-2抗原是仅由成熟的B细胞通过表面暴露的免疫球蛋白受体的交联识别的抗原。没有T细胞的帮助，不会产生免疫记忆，也不会产生从IgM到其它IgG亚类的同种型转换，也不会发生B细胞亲和力成熟。此外，由于与人类糖脂和糖蛋白的结构同源性，所以糖类在人类中被称为不良免疫原。由于它们的免疫原性差，所以糖表现出通过B细胞产生抗体以及形成记忆细胞的能力差，而这些是生产强效疫苗所必需的特征。

因此，为了产生有效的基于糖的疫苗，将通式(I)、(I-a)、(I-b)、(I-c)或(I-d)的糖与免疫原性载体缀合以提供与该糖相比呈现增加的免疫原性的缀合物。

所述缀合物由至少一种通式(I)、(I-a)、(I-b)、(I-c)或(I-d)的合成糖和与所述至少一种通式(I)、(I-a)、(I-b)、(I-c)或(I-d)的糖共价结合的免疫原性载体组成。

令人惊讶地，发现用根据本发明的缀合物进行免疫接种导致产生对本发明的糖的碳水化合物部分具有特异性的高滴度抗体。所述抗体与天然肺炎链球菌血清型2荚膜多糖交叉反应并呈现调理吞噬和杀菌活性，从而赋予针对肺炎链球菌血清型2细菌的保护作用。

在本文上下文中，术语“免疫原性载体”被定义为与糖缀合以形成与糖本身相比呈现增加的免疫原性的缀合物的结构。因此，通式(I)、(I-a)、(I-b)、(I-c)或(I-d)的糖与免疫原性载体的缀合具有刺激针对通式(I)、(I-a)、(I-b)、(I-c)或(I-d)的糖的免疫应答的效果，而不诱导针对所述免疫原性载体的免疫应答。

优选的免疫原性载体是具有免疫调节性质的载体蛋白或鞘糖脂。对于本领域技术人员而言，载体蛋白是选自如下的蛋白质：白喉类毒素，突变的白喉类毒素，修饰的白喉类毒素，突变和修饰的白喉类毒素，破伤风类毒素，修饰的破伤风类毒素，突变的破伤风类毒素，外膜蛋白(OMP)，牛血清白蛋白(BSA)，匙孔血蓝蛋白(KLH)，霍乱类毒素(CT)和蛋白D(不可分型的流感嗜血杆菌蛋白)。

如本文所用的术语“类毒素”是指细菌毒素(通常为外毒素)，其毒性已通过化学(福尔马林)或热处理灭活或抑制，而其它性质(典型地为免疫原性)得以维持。如本文所用的突变的类毒素是重组细菌毒素，其通过修改野生型氨基酸序列而已经修改为毒性更低乃至无毒性的。这类突变可以是一个或多个氨基酸的取代。这类突变的类毒素在其表面上呈现可与互连分子的官能团Y反应以提供修饰的类毒素的官能团。所述官能团是本领域技术人员已知的并且包括但不限于在还原剂存在下可与活化酯、异氰酸酯基团或醛反应的赖氨酸残基的伯氨基官能团、可以被碳二亚胺或半胱氨酸残基的硫醇官能团活化的谷氨酸或天冬氨酸残基的羧酸酯官能团。

活化酯包括但不限于N-(γ-马来酰亚氨基丁酰氧基)磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-GMBS)、琥珀酰亚胺基(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸酯(磺基-SIAB)、琥珀酰亚胺基-3-(溴乙酰氨基)丙酸酯(SBAP)、戊二酸二琥珀酰亚胺基酯(DSG)、己二酸二琥珀酰亚胺基酯(DSA)、2-吡啶基联硫基-四氧杂十四烷-N-羟基琥珀酰亚胺(PEG-4-SPDP)、己二酸双-(4-硝基苯基)酯和琥珀酰双-(4-硝基苯基)酯(参见图1)。优选的活化酯为己二酸二琥珀酰亚胺基酯(DSA)、戊二酸二琥珀酰亚胺基酯(DSG)、己二酸双-(4-硝基苯基)酯和琥珀酸双-(4-硝基苯基)酯。

可以将载体蛋白上的半胱氨酸残基转化成相应的脱氢丙氨酸，其可以进一步与适合的互连分子反应，得到修饰的载体蛋白，其表面上带有互连分子的官能团X。

尤其优选本文所述的本发明的糖与作为赖氨酸残基的伯胺官能团的官能团呈现的无毒性的突变的白喉毒素CRM₁₉₇缀合。

CRM₁₉₇如野生型白喉毒素是535个氨基酸(58kD)的单一多肽，其由通过具有谷氨酸取代甘氨酸的单一氨基酸取代的二硫键连接的两个亚单元组成。它用作针对疾病的大量经批准的结合疫苗中的载体蛋白，例如肺炎球菌结合菌苗。

因此，在本发明的一个优选的实施方案中，载体蛋白在其表面上呈现赖氨酸残基的伯氨基官能团，其能够与互连分子的官能团Y反应，得到修饰的载体蛋白，在其表面上具有互连分子的所述官能团X，其能够与使本发明的糖官能化的接头的末端氨基反应。

互连分子的所述官能团X选自：马来酰亚胺；α-碘代乙酰基；α-溴乙酰基；和N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)、醛、亚氨基酯、羧酸、磺酸烷基酯、磺酰氯、环氧化物、酸酐、碳酸酯(参见图2)。

优选通式(X)的缀合物

[V*-U_x+3-U_x+2-U_x+1-U_x-O-L-NH-W]_m-CRM₁₉₇

(X)

其中m为约2-约18；

-W-选自：

a表示1-10的整数；

b表示1-4的整数；且

V*、U_x+3、U_x+2、U_x+1、U_x、x和L具有本文所定义的含义。

正如本领域技术人员众所周知的，结构X中的“m”相当于每单元CRM₁₉₇蛋白中糖单元的平均载量，正如通过MALDI-TOF MS方法、使用CRM₁₉₇分子量作为参比测定的(参见，例如图4)。通过改变本发明糖偶联至CRM₁₉₇载体蛋白的反应条件，可以得到任意的结构X的缀合物，其中m为约2-约18。

优选地，接头-L-选自：-L^a-、-L^a-L^e-、-L^a-L^b-L^e-和-L^a-L^d-L^e-；

-L^b-表示-O-；

且o,、q、p1和p2彼此独立地选自1、2、3、4、5和6的整数。

另外尤其优选-W-表示且a是选自2、3、4、5和6的整数。

因此，尤其优选通式(X)的缀合物，其中

接头-L-选自：-L^a-、-L^a-L^e-、-L^a-L^b-L^e-和-L^a-L^d-L^e-；

-L^b-表示-O-；

o、q、p1和p2彼此独立地选自1、2、3、4、5和6的整数；

-W-表示且a是选自2、3、4、5和6的整数。

甚至更优选通式(X)的缀合物，其中x表示1。因此，通式(XI)的缀合物

其中m为约2-约18；

-W-选自：

a表示1-10的整数；

b表示1-4的整数；

V*-表示H-、H-U₁-、H-U₂-U₁-、H-U₃-U₂-U₁-或H-U₄-U₃-U₂-U₁-；

且L具有本文所定义的含义。

优选地，在通式(XI)中，接头-L-选自：-L^a-、-L^a-L^e-、-L^a-L^b-L^e-和-L^a-L^d-L^e-；

-L^b-表示-O-；

o、q、p1和p2彼此独立地选自1、2、3、4、5和6的整数；

-W-表示且a是选自2、3、4、5和6的整数。

尤其优选通式(X)或(XI)的缀合物，其中接头-L-表示-(CH₂)o-，

o是选自2、3、4、5、6、7和8的整数；

-W-表示且a是选自2、3、4、5和6的整数。

另外优选在通式(X)和(XI)中V*-表示H-。因此，特别优选通式(X)或(XI)的缀合物，其中V*-表示H-，接头-L-表示-(CH₂)_o-，

o是选自2、3、4、5、6、7和8的整数；

-W-表示且a是选自2、3、4、5和6的整数。

优选m为约2-约18，更优选约5-约15，甚至更优选约8-约12。

在另一个实施方案中，所述免疫原性载体优选为具有免疫调节性质的鞘糖脂，并且更优选(2S,3S,4R)-1-(α-D-吡喃半乳糖基)-2-二十六烷酰基氨基十八烷-3,4-二醇。如本文所用，术语具有免疫调节性质的鞘糖脂是指能够刺激免疫系统对靶抗原的应答但其本身不赋予如上所定义的免疫性的适合的鞘糖脂。

如本文所用的鞘糖脂是含有与鞘脂α-连接的碳水化合物部分的化合物。优选地，碳水化合物部分是吡喃己糖，且最优选是α-D-吡喃半乳糖。对于本领域技术人员而言，鞘脂是一类含有通过酰胺键与脂肪酸连接的C18氨基醇的脂质。C18氨基醇优选被羟基单取代、二取代或多取代。特别优选的是，C18氨基醇是植物鞘氨醇。脂肪酸优选为基于16-28且更优选18-26个碳数量的饱和烷基链的一元羧酸。具有免疫调节性质的鞘糖脂包括但不限于(2S,3S,4R)-1-(α-D-吡喃半乳糖基)-2-二十六烷酰基氨基十八烷-3,4-二醇，其可以刺激天然杀伤细胞(NK)活性和由天然杀伤T(NKT)产生细胞因子，并在体内表现出有效的抗肿瘤活性(Proc.Natl Acad.Sci.USA，1998，95，5690)。

本发明的糖与具有免疫调节性质的鞘糖脂的缀合物具有热稳定的优点。为了适合缀合，在具有免疫调节性质的鞘糖脂上引入了官能团。所述官能团倾向于直接与本发明接头的末端氨基反应以提供糖的缀合物或与互连分子的官能团Y反应以提供经修饰的具有免疫调节性质的鞘糖脂。

优选地，所述官能团在具有免疫调节性质的糖鞘脂的碳水化合物部分的C6上被引入。因此，具有免疫调节性质的鞘糖脂被官能团官能化，所述官能团易于与糖的末端氨基或互连分子的官能团Y反应。易于与氨基反应的官能团包括但不限于活性酯，异氰酸酯基，醛，环氧化物，亚氨酸酯，羧酸，烷基磺酸酯和磺酰氯。易于与互连分子的官能团Y反应以便提供具有呈现互连分子的官能团X的免疫调节性质的经修饰的鞘糖脂的官能团包括但不限于胺，醇，硫醇，活化酯，异氰酸酯基团，醛，环氧化物，乙烯基，亚氨酸酯，羧酸，烷基磺酸酯，磺酰氯，乙烯基基团，炔基和叠氮基。

优选地，在具有免疫调节性质的鞘糖脂的碳水化合物部分的C-6位引入的官能团选自胺，硫醇，醇，羧酸，乙烯基，马来酰亚胺，α-碘乙酰基，α-溴乙酰基，N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)，2-吡啶基二硫醇。

互连分子的所述官能团X选自马来酰亚胺，α-碘乙酰基，α-溴乙酰基，N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)，醛，羧酸，环氧化物(epoxyde)，磺酸烷基酯，磺酰氯，酸酐，碳酸酯。

优选地，己二酸二(N-琥珀酰亚胺基)酯或己二酸双(4-硝基苯基)酯首先与具有伯氨基的合成糖反应。活化的糖随后与鞘糖脂缩合，鞘糖脂在C-6位被具有末端氨基官能团的互连分子修饰以提供缀合物。

如本文所用，术语“互连分子”是指含有官能团X和官能团Y的双官能团分子，其中官能团X能够与接头-L-上的末端氨基反应并且官能团Y能够与存在于免疫原性载体上或固体支持物上的官能团反应。

发现通过-O-L-NH₂基团的氮原子将通式(I)、(I-a)、(I-b)、(I-c)和(I-d)的糖与免疫原性载体共价连接或共价结合(换言之，通过使通式(I)、(I-a)、(I-b)、(I-c)和(I-d)的糖与免疫原性载体反应获得的缀合物、特别是通式(X)和(XI)的缀合物在人类和/或动物宿主中引发保护性免疫应答，且由此用于预防和/或治疗由肺炎链球菌血清型2导致的疾病。这类疾病包括肺炎、脑膜炎、中耳炎、菌血症、和慢性支气管炎的急性加重、鼻窦炎、关节炎和结膜炎。

疫苗组合物

本发明的另一方面涉及疫苗组合物，其含有本发明的至少一种合成糖和/或其药学上可接受的盐和/或包含通过-O-L-NH₂基团的氮原子与免疫原性载体优选与CRM₁₉₇载体蛋白共价连接的本发明的糖的缀合物与至少一种药学上可接受的佐剂和/或赋形剂。

在一个优选的实施方案中，所述疫苗组合物还包含肺炎链球菌的荚膜多糖和/或肺炎链球菌的荚膜多糖片段和/或载体蛋白和肺炎链球菌的荚膜多糖或肺炎链球菌的荚膜多糖片段的缀合物中的至少一种，其中肺炎链球菌选自肺炎链球菌，其中肺炎链球菌选自肺炎链球菌4、6B、9V、14、18C、19F和23F型，或优选1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F型，且更优选血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、14、15B、17F、18C、19F、19A、20、22F、23F和33F型。这类疫苗组合物是特别有利的，因为它同时提供针对某些人群具有特异性的肺炎链球菌2型和其它血清型的保护。

如本文所用，术语“佐剂”是指免疫佐剂，即用于疫苗组合物中的物质，其通过增强疫苗中所含的给定抗原的免疫应答而不与其抗原相关地改变或增强所述疫苗的作用。对于本领域技术人员而言，免疫佐剂的经典认可的例子包括但不限于油乳剂(例如弗氏佐剂)，皂苷，铝或钙盐(例如明矾)，非离子嵌段聚合物表面活性剂等。

疫苗组合物优选为含水形式，特别是在施用点时，但它们也可以以非水液体形式或以干燥形式例如，如明胶胶囊或冻干物等呈现。

疫苗组合物可以包括一种或多种防腐剂，例如硫柳汞或2-苯氧乙醇。无汞组合物是优选的，且可以制备不含防腐剂的疫苗。

疫苗组合物可以包括生理盐，例如钠盐，例如控制张力。氯化钠(NaCl)是典型的并且可以以1-20mg/ml存在。其它可能存在的盐包括氯化钾，磷酸二氢钾，脱水磷酸二钠，氯化镁，氯化钙等。

疫苗组合物可以具有200mOsm/kg-400mOsm/kg的重量摩尔渗透压浓度。

疫苗组合物可以包括在普通水(例如w.f.i.)中的化合物(含或不含不溶性金属盐)，但通常包含一种或多种缓冲剂。典型的缓冲液包括：磷酸盐缓冲液；Tris缓冲液；硼酸盐缓冲液；琥珀酸盐缓冲液；组氨酸缓冲液(特别是含有氢氧化铝佐剂)；或柠檬酸盐缓冲液。缓冲盐典型地在5-20mM范围。

疫苗组合物典型地具有5.0-9.5、例如6.0-8.0的pH。

疫苗组合物优选为无菌的且不含谷蛋白。

疫苗组合物适合施用于动物(特别是人类)患者，因此包括人用和兽用用途。它们可以用于在患者中引起免疫应答的方法中，该方法包括将组合物施用于患者的步骤。

可以在受试者暴露于肺炎链球菌2型之前和/或受试者暴露于肺炎链球菌2型之后施用本发明的疫苗组合物。

可以将疫苗组合物制备成单位剂量形式。在一些实施方案中，单位剂量可以具有0.1-1.0mL的体积，例如约0.5mL。

可以将本发明的疫苗组合物制备成各种形式。例如，可以将疫苗组合物可以制备成液体溶液或混悬液形式的注射剂。也可以制备适合于在注射前溶解或悬浮于液体媒介物中的固体形式(例如冻干组合物或喷雾冷冻干燥组合物)。可以将该组合物制备成用于局部施用，例如，作为软膏，乳膏或粉末。可以将该组合物制备成用于口服施用，例如，作为片剂或胶囊，作为喷雾剂，或作为糖浆(可选地调味)。可以将该组合物制备成用于肺部施用，例如通过吸入器，使用细粉或喷雾。可以将该组合物制成栓剂。可以将该组合物制备成用于鼻腔，耳部或眼部施用，例如，作为喷雾剂或滴剂。典型的是用于肌内施用的注射剂。

药物组合物可以包含有效量的佐剂，即当以单剂量或作为系列的一部分施用于个体时有效增强对共同施用的肺炎链球菌2型抗原的免疫应答的量。该量可以根据待治疗个体的健康和身体状况，年龄，待治疗个体的分类群(例如非人灵长类动物，灵长类动物等)，个体免疫系统合成抗体的能力，期望的保护程度，疫苗的配方，治疗医生对医疗状况的评估以及其它相关因素的不同而改变。该量将落在可以通过常规试验确定的相对较宽的范围内。

用于配制和施用本发明疫苗的技术可以在“Remington's PharmaceuticalSciences”，Mack Publishing Co.，Easton PA中找到。

本发明的缀合物或通式(I)的糖的治疗有效剂量是指导致针对疾病的至少部分免疫的化合物的量。这些化合物的毒性和疗效可以通过细胞培养物或实验动物中的标准药学、药理学和毒理学方法来确定。毒性和治疗效果之间的剂量比是治疗指数。施用的组合物的实际量将取决于所治疗的受试者，受试者的体重，疾病的严重程度，施用方式和处方医师的判断。

免疫学测定

本发明的另一实施方案涉及本发明的糖作为免疫学测定中的标志物用于检测抗肺炎链球菌2型的抗体。此类测定法包括例如微阵列和ELISA。

因此，本发明的糖可以用于诊断由肺炎链球菌血清型2引起的疾病。根据本发明为诊断目的进行的测定可以是免疫学测定，如固相酶免疫学测定(EIA)，酶联免疫吸附测定(ELISA)，特别是“间接”ELISA或放射性免疫学测定(RIA)。优选地，本发明的糖通过互连分子共价连接在固体支持物上。因此，本发明的糖可以通过-O-L-NH₂基团的氮原子直接或间接共价连接在固体支持物上。固体支持物优选选自：玻璃载玻片，微量滴定板，试管，微球，纳米粒或珠。

特别优选的是固体支持物是载玻片或微量滴定板。微量滴定板或微孔板或微孔板是具有用作小试管的多个“孔”的平板。典型地，可以使用具有6、24、96、384乃至1536个样品孔的微量滴定板。微孔板由许多不同的材料制成，如用于PCR的微量滴定板的聚碳酸酯。最常见的是用于大多数光学检测微孔板的聚苯乙烯。通过添加用于光学吸光度或发光检测的二氧化钛染白色或通过添加用于荧光生物测定的碳来染黑色。

附图描述

图1：本发明的可商购的互连分子。

图2：本发明的互连分子的官能团X的实例。

图3：显示本发明的CRM₁₉₇缀合物。

图4：缀合物CRM₁₉₇-己糖2的表征。(A)使用用已知浓度的BSA绘制的标准曲线估计蛋白质的量。(B)缀合物CRM₁₉₇-己糖2与CRM₁₉₇一起在10％SDS-PAGE上解析并用考马斯亮蓝R250染色。(C)进行矩阵-辅助激光解吸/电离(MALDI)分析以测量缀合物的平均分子大小。将CRM₁₉₇用作标准品。

图5：聚糖微阵列分析。对用缀合物CRM₁₉₇-己糖2和明矾佐剂免疫接种的小鼠中产生的超免疫血清进行微阵列分析。(A)免疫接种模式。(B)使用从免疫接种和加强接种缀合物CRM₁₉₇-己糖2的小鼠(n＝3)收集的血清的代表性微阵列扫描。与收集的小鼠血清(按照1:100稀释于1％BSA-PBS中)和随后与抗-小鼠IgG Alexa Fluor 635(按照1:400稀释于1％BSA-PBS中)一起温育的微阵列载玻片在635nm处激发的荧光。(C)印刷有合成寡糖和多糖的微阵列载玻片的印刷图案。印刷的载玻片还包含19F型多糖、细胞壁多糖(CWPS)和印刷缓冲液。(D)如在载玻片上印刷的寡糖名称和位置。如图5B所示，用缀合物CRM₁₉₇-己糖2免疫接种诱导识别存在于肺炎链球菌血清型2中的核心聚糖结构的特异性抗体。产生的抗体对血清型2具有特异性的，因为它们与天然血清型2荚膜多糖交叉反应，但不与细菌细胞壁中含有的对照SP19F多糖或多糖反应。

图6：ELISA和调理吞噬杀伤测定(OPKA)。(A)用缀合物CRM₁₉₇-己糖2与明矾(1:1)和不与明矾一起免疫接种小鼠。采集免疫接种前和免疫接种后的血清，并通过ELISA分析终点滴度。在阴性对照小鼠中单独接受PBS和明矾。(B)调理吞噬细胞杀伤测定使用HL-60细胞进行，该细胞与调理前2型肺炎球菌菌株D39和从缀合物CRM₁₉₇-己糖2与明矾(1:1)和不与明矾一起产生的抗体一起温育。温育45min后评估存活率。基于相对于对照血清获得的活肺炎球菌菌落计算肺炎球菌杀伤百分比。使用PBS和PBS+明矾血清作为阴性对照。数据表示为一式三份的平均值±SD值。图6显示了在氢氧化铝存在下用缀合物CRM₁₉₇己糖2重复免疫接种(A)和显著杀伤免疫血清调理细菌(B)后小鼠中大量血清型2-特异性抗体滴度的诱导。在免疫接种方案期间，使用在不存在氢氧化铝的情况下诱导的血清也观察到明显可检测到的OPKA。这些结果显示含有缀合物CRM₁₉₇-己糖2的疫苗是高度免疫原性的并且在小鼠中诱导功能性抗体。

图7：用缀合物CRM₁₉₇-己糖2免疫接种在小鼠中诱导保护性免疫。用缀合物CRM₁₉₇-己糖2(有实心圆和菱形)与或不与明矾(有实心圆和菱形)一起皮下免疫接种雌性C57BL/6J小鼠(n＝11)。对照组接受PBS(乡绅)或PBS与明矾(三角形)。用1×10⁷cfu的菌株D39鼻内攻击所有组小鼠，并且每12h监测1次小鼠存活率。通过cfu计数三十六小时后分析保护。图7显示仅用缀合物CRM₁₉₇-己糖2进行免疫导致细菌菌落形成单位(CFU)显著减少，并因此导致用致病性肺炎链球菌血清型2菌株D39攻击后受保护小鼠的数目增加。在分析的感染小鼠的两个身体区室中，观察到攻击感染后肺(A)和血液(B)的部分(A)或完全细菌消除(B)。

包括以下实施例以说明本发明的优选实施方案。本领域的技术人员应当理解，在实施例中公开的技术代表发明人发现的在本发明的实践中发挥良好作用的技术，并且因此可以被视为构成其实践的优选模式。然而，根据本公开，本领域技术人员应当理解，可以在所公开的特定实施方案中做出许多改变，并且仍然获得相似或类似的结果。

鉴于本说明书，本发明的各个方面的进一步修改和替代实施例对于本领域技术人员将是显而易见的。因此，本说明书仅被解释为示例性的，并且目的在于教导本领域技术人员实施本发明的一般方式。应当理解，本文所示和描述的本发明的形式将被视为实施方案的实例。元素和材料可以代替本文所示例和描述的元素和材料，部分和过程可以颠倒，并且可以独立地利用本发明的某些特征，所有这些对于本领域技术人员而言在拥有本发明描述的益处后将是显而易见的。

实施例

A.化学合成

一般信息

除非另有说明，否则使用商品级溶剂。干溶剂从Waters Dry Solvent System获得。使用前蒸馏用于色谱的溶剂。敏感反应在加热干燥的玻璃器皿中和氩气氛下进行。在预涂有0.25mm厚硅胶的Kieselgel 60F254玻璃板上进行分析型薄层色谱(TLC)。通过用香草醛溶液[6％(w/v)香草醛和10％(v/v)硫酸的95％EtOH溶液]或Hanessian氏染料[5％(w/v)钼酸铵，1％(w/v)硫酸铈(II)和10％(v/v)硫酸的水溶液]染色使斑点显色。二氧化硅柱色谱在Fluka Kieselgel 60(230-400目)上进行。

¹H、¹³C和二维NMR光谱用Varian 400-MR，600-MR和Bruker Avance 700光谱仪在296K下测量。化学位移(δ)以相对于各自的残余溶剂峰百万分率(ppm)报告(CDCl₃：¹H中为δ7.26，¹³C NMR中为77.16；¹H NMR中D₂O：δ4.79)。以下缩写用于表示峰多重性：s单峰；d双峰；dd双重双峰；t三重峰；dt双重三重峰；q四重峰；m多重峰。偶合常数(J)以赫兹(Hz)报告。使用Agilent 6210ESI-TOF质谱仪在Free University Berlin，Mass Spectrometry CoreFacility上进行高分辨质谱(HRMS)。

缩写

Ac 乙酰基

AcOH 乙酸

Ac₂O 乙酸酐

BAIB 双乙酰基碘苯

Bn 苄基

^tBuOH 叔丁醇

Bz 苯甲酰基

CAN 硝酸高铈铵

Cbz 苄氧基羰基

Cu(OAc)₂ 乙酸铜(II)

DBU 1,8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯

DCC N,N'-二环己基碳二亚胺

DCM 二氯甲烷

DMAP N,N-二甲基氨基吡啶

DMF N,N'-二甲基甲酰胺

ESI 电喷雾电离

Et₃N 三乙胺

Et 乙基

EtOAc 乙酸乙酯

FmocCl 氯甲酸9-芴基甲酯

g 克

h 小时

HRMS 高分辨率质谱

Lev 乙酰丙酰基

min 分钟

mL 毫升

Me 甲基

MeI 碘甲烷

MeOH 甲醇

MP 对甲氧基苯基

MS 分子筛

NaHCO₃ 碳酸氢钠

NaOH 氢氧化钠

NaOMe 甲醇钠

NIS N-碘代琥珀酰亚胺

NMR 核磁共振

Pd/C 披钯碳

Ph 苯基

Pico 吡啶甲酰基

CPS 荚膜多糖

Py 吡啶

RT 室温

TCA 三氯乙酰胺

TEMPO 2,2,6,6-四甲基哌啶基氧基

TfOH 三氟甲磺酸

TMSOTf 三氟甲磺酸三甲基甲硅烷基酯

THF 四氢呋喃

Tol 对甲苯基

实施例A.1：二糖受体8的合成

结构单元14的合成

向澄清的13(Dhénin S.G.Y.等人，Org.Biomol.Chem.2009，7，5184)(6.7g，14.4mmol)在CH₂Cl₂(80mL)中的溶液中加入FmocCl(5.6g，21.62mmol)和吡啶(2.4mL，28.8mmol)，在室温搅拌12h。在原料完全耗尽后，用CH₂Cl₂(80mL)稀释该反应混合物，连续用1M HCl(60mL)、水(60mL)和饱和NaHCO₃水溶液(60mL)洗涤。用Na₂SO₄干燥有机层，过滤，浓缩。通过快速色谱法纯化粗产物，使用己烷和乙酸乙酯作为洗脱液(9:1)，得到期望的产物14，为白色泡沫体(9.3g，94％)。

H NMR(400MHz，CDCl₃)δ8.06(d，J＝7.7Hz，2H)，7.78-7.67(m，2H)，7.63(t，J＝7.5Hz，1H)，7.58-7.52(m，2H)，7.49(t，J＝7.6Hz，2H)，7.44-7.05(m，13H)，5.89(s，1H)，5.49(s，1H)，5.29(dd，J＝9.5，3.2Hz，1H)，4.87(d，J＝11.1Hz，1H)，4.71(d，J＝11.1Hz，1H)，4.61-4.48(m，1H)，4.41(dq，J＝12.2，6.5Hz，1H)，4.28(d，J＝6.0Hz，2H)，3.76(t，J＝9.6Hz，1H)，2.32(s，3H)，1.42(d，J＝6.1Hz，3H)；

¹³C NMR(101MHz，CDCl₃)δ165.6，154.3，143.7，143.2，141.4，141.3，138.2，137.9，133.6，132.7，130.1，130.0，129.7，129.6，128.6，128.5，128.1，128.0(2C)，127.9，127.3，127.2，125.5，125.2，120.1(2C)，86.2，78.8，76.8，75.4，72.1，70.4，69.1，46.8，21.3，18.1；

HRMS(ESI)：计算值C₄₂H₃₈O₇S[M+Na]⁺709.2236，测定值：709.2238。

结构单元12的合成

将化合物14(0.17g，0.25mmol)、氨基戊基接头15(0.16g，0.5mmol)和酸洗涤的分子筛(AWMS)(0.3g)在CH₂Cl₂(5mL)中的溶液在室温搅拌30min。将该溶液冷却至-20℃，加入NIS(62mg，0.28mmol)和TfOH(2.5μL，0.028mmol)。使该反应混合物逐步达到室温，历时2h。原料完全耗尽后，加入Et₃N(2mL)，将该反应混合物在室温再搅拌2h。用CH₂Cl₂(25mL)稀释反应混合物，用饱和Na₂S₂O₃水溶液(10mL)洗涤。用Na₂SO₄干燥分离的有机层，过滤，浓缩。通过快速色谱法纯化粗产物，使用己烷和乙酸乙酯作为洗脱液(4:1)，得到期望的产物12，为无色油状物(0.135g，82％)。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ8.06(d，J＝7.7Hz，2H)，7.59(q，J＝9.3，8.4Hz，1H)，7.47(t，J＝7.6Hz，2H)，7.42-7.13(m，15H)，5.32(s，1H)，5.18(d，J＝12.1Hz，2H)，4.86(d，J＝11.1Hz，1H)，4.83-4.79(m，1H)，4.75(d，J＝11.1Hz，1H)，4.51(d，J＝6.4Hz，2H)，4.21(s，1H)，3.78(d，J＝8.1Hz，1H)，3.62(d，J＝16.6Hz，1H)，3.46(t，J＝9.4Hz，1H)，3.42-3.13(m，2H)，2.16(s，1H)，1.70-1.42(m，6H)，1.39(d，J＝6.2Hz，3H)；

¹³C NMR(101MHz，CDCl₃)δ174.0，166.4，133.5，130.0，129.8，128.7，128.6，128.2，128.1，128.0，127.4，125.3，110.1，97.4，81.9，75.4，73.5，70.7，67.6，67.3，50.4，29.2，18.3；

HRMS(ESI)：计算值C₄₀H₄₅O₈N[M+K]⁺706.2782，测定值：706.2705。

结构单元11的合成

在0℃将吡啶(0.8mL，10.0mmol)滴加到搅拌的16(Rajput V.K.J.Org.Chem.2008，73，6924)(2.4g，6.6mmol)和FmocCl(1.8g，7.0mmol)在CH₂Cl₂(50mL)中的溶液中。将该混合物逐步加热至室温，历时2h，用CH₂Cl₂(100mL)稀释，连续用1M HCl(50mL)和水(50mL)洗涤。用Na₂SO₄干燥有机层，过滤，浓缩。通过快速色谱法纯化粗产物，使用己烷和乙酸乙酯作为洗脱液(10:1-4:1)，得到24a(0.92g，24％)和24b(1.3g，34％；回收20％的16)。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ7.78(d，J＝7.5Hz，2H)，7.71(t，J＝8.4Hz，2H)，7.42(t，J＝8.3Hz，4H)，7.38-7.28(m，7H)，7.13(d，J＝7.8Hz，2H)，5.39(d，J＝3.5Hz，1H)，4.86-4.71(m，3H)，4.56-4.42(m，2H)，4.36(t，J＝7.6Hz，1H)，3.88(dt，J＝8.2，3.6Hz，1H)，3.49(t，J＝9.2Hz，1H)，3.41(dd，J＝9.5，5.8Hz，1H)，2.34(s，3H)，1.46(d，J＝6.0Hz，3H)；

¹³C NMR(101MHz，CDCl₃)δ155.8，143.5，141.5，138.3，138.2，132.5，130.2，130.0，128.8，128.2(2C)，128.0，127.4，127.3，125.6，125.5，120.2，120.1，85.7，80.9，77.9，76.2，75.6，74.3，70.7，46.9，21.3，18.4；

HRMS(ESI)：计算值C₃₅H₃₄O₆S[M+Na]⁺605.1974，测定值：609.1993。

将乙酰丙酸酐(1.4g，6.69mmol)和吡啶(0.54mL，6.69mmol)加入到搅拌的24b(1.3g，2.23mmol)在CH₂Cl₂(20mL)中的溶液中。在室温搅拌2天后，用CH₂Cl₂(50mL)稀释反应混合物，连续用1M HCl(50mL)和饱和NaHCO₃水溶液(50mL)洗涤。用Na₂SO₄干燥有机层，过滤，浓缩。通过快速色谱法纯化粗产物，使用己烷和乙酸乙酯作为洗脱液(4:1)，得到11，为粘性油状物(1.04g，69％)。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ7.77(d，J＝7.6Hz，2H)，7.61(dd，J＝15.4，7.5Hz，2H)，7.45-7.27(m，11H)，7.12(d，J＝7.8Hz，2H)，5.62(dd，J＝3.2，1.6Hz，1H)，5.33(d，J＝1.6Hz，1H)，5.16(dd，J＝9.7，3.3Hz，1H)，4.83(d，J＝11.0Hz，1H)，4.67(d，J＝11.0Hz，1H)，4.51(dd，J＝10.3，6.7Hz，1H)，4.42-4.24(m，3H)，3.62(t，J＝9.5Hz，1H)，2.80-2.65(m，4H)，2.33(s，3H)，2.15(s，3H)，1.36(d，J＝6.2Hz，3H)；

¹³C NMR(101MHz，CDCl₃)δ206.1，171.8，154.1，143.6，143.1，141.3，141.2，138.1，137.8，132.6，129.9，129.5，128.4，127.9，127.8(2C)，127.2，127.1，125.2，125.1，120.1，120.0，85.8，78.6，76.3，75.3，71.7，70.1，68.9，46.7，37.9，29.8，28.0，21.1，17.8；

HRMS(ESI)：计算值C₄₀H₄₀O₈S[M+Na]⁺703.2342，测定值：703.2359。

二糖受体8的合成

将供体11(0.25g，0.37mmol)、受体12(0.165g，0.25mmol)和酸洗涤的分子筛(AWMS)(0.3g)在CH₂Cl₂(5mL)中的溶液在室温搅拌30min。将该溶液冷却至-20℃，加入NIS(83mg，0.37mmol)、TfOH(3.3μL，0.037mmol)。使该反应混合物逐步达到室温，历时2h。原料完全耗尽后，加入Et₃N(2mL)，将该反应混合物在室温再搅拌2h。用CH₂Cl₂稀释反应混合物，用Na₂S₂O₃洗涤饱和水溶液。用Na₂SO₄干燥有机层，过滤，浓缩。通过快速色谱法纯化粗产物，使用己烷和乙酸乙酯作为洗脱液(3:1)，得到期望的产物8，为无色油状物(0.18g，73％)。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ8.05(d，J＝7.7Hz，2H)，7.60(t，J＝7.4Hz，1H)，7.48(t，J＝7.6Hz，2H)，7.39-7.18(m，20H)，5.32(s，1H)，5.24-5.12(m，3H)，4.87(d，J＝10.8Hz，1H)，4.83-4.76(m，2H)，4.76-4.55(m，3H)，4.50(d，J＝4.8Hz，2H)，4.26-4.15(m，1H)，3.97(dd，J＝9.5，3.4Hz，1H)，3.77(dd，J＝9.7，6.0Hz，2H)，3.57(t，J＝9.4Hz，2H)，3.24(dd，J＝19.8，10.2Hz，4H)，2.75(q，J＝6.4，5.8Hz，2H)，2.60(qd，J＝16.7，8.1Hz，2H)，2.18(s，3H)，1.64-1.43(m，6H)，1.31(d，J＝6.2Hz，3H)，1.18(d，J＝6.2Hz，3H)；

¹³C NMR(101MHz，CDCl₃)δ207.1，172.2，166.0，138.4，138.0，133.4，129.9，129.8，128.6(2C)，128.5(2C)，128.51，128.4，128.3，128.0，127.7(2C)，127.3，99.5，97.0，81.4，80.5，77.9，77.4，75.7，74.1，73.0，69.9，68.3，67.8，67.3，50.6，50.3，47.2，46.3，38.3，29.9，29.2，28.3，23.5，18.2，17.9；

HRMS(ESI)：计算值C₅₈H₆₇O₁₄N[M+Na]⁺1024.4459，测定值：1024.4321。

实施例A.1描述的合成方法应用于接头结构单元15a、15b、15c和15d提供了二糖8a、8b、8c和8d。

实施例A.2：二糖供体7的合成

向搅拌的化合物17(Bourke J.Org.Biomol.Chem.2014，12，1114)(0.25g，0.55mmol)在CH₂Cl₂(2.5mL)中的溶液中加入吡啶甲酸(93mg，0.75mmol)、DCC(0.17g，0.8mmol)和DMAP(13.5mg，0.11mmol)。在室温搅拌2.5h后，用CH₂Cl₂(25mL)稀释该反应混合物，连续用冷水(10mL)和饱和NaHCO₃水溶液(10mL)洗涤。用Na₂SO₄干燥有机层，过滤，浓缩。通过快速色谱法纯化粗产物，使用己烷和乙酸乙酯作为洗脱液(3:1)，得到期望的产物9，为淡黄色油状物(0.307g，定量)。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ8.80(ddd，J＝4.7，1.8，0.9Hz，1H)，8.01(dt，J＝7.9，1.1Hz，1H)，7.81(td，J＝7.7，1.8Hz，1H)，7.49(ddd，J＝7.6，4.7，1.2Hz，1H)，7.32-7.27(m，2H)，7.25-7.17(m，4H)，7.17-7.09(m，4H)，5.43(dd，J＝9.5，3.4Hz，1H)，5.31(d，J＝1.7Hz，1H)，4.85(d，J＝11.1Hz，1H)，4.74-4.65(m，2H)，4.57(d，J＝12.3Hz，1H)，4.27-4.14(m，1H)，4.11(dd，J＝3.4，1.7Hz，1H)，3.90(t，J＝9.5Hz，1H)，2.74-2.51(m，2H)，1.38(d，J＝6.2Hz，3H)，1.27(t，J＝7.4Hz，3H)。

二糖18的合成

在-40℃将NIS(0.15g，0.65mmol)和TfOH(6.0μL，0.065mmol)加入到冷却的供体9(0.32g，0.64mmol)、受体10(Bundle D.R.等人ACSChem.Biol.2012，7，1754)(0.25g，0.43mmol)和酸洗涤的分子筛(AWMS)(2.0g)在CH₂Cl₂(20mL)中的溶液中。将反应混合物逐步温热至-20℃，历时1h，用CH₂Cl₂(30mL)稀释，用饱和Na₂S₂O₃(15mL)水溶液洗涤。用Na₂SO₄干燥有机层，过滤，浓缩。通过快速色谱法纯化粗产物，使用己烷和乙酸乙酯作为洗脱液(4:1-3:1)，得到期望的产物18，为淡黄色油状物(0.23g，53％)。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ8.88(d，J＝4.7Hz，1H)，8.15(d，J＝7.8Hz，2H)，8.05(d，J＝8.0Hz，1H)，7.87(t，J＝7.9Hz，1H)，7.64(t，J＝7.4Hz，1H)，7.59-7.44(m，3H)，7.42-7.17(m，20H)，7.04(d，J＝8.6Hz，2H)，6.77(d，J＝8.8Hz，2H)，5.59(t，J＝8.3Hz，1H)，5.09(d，J＝7.9Hz，1H)，5.03(dd，J＝9.8，3.2Hz，1H)，4.88-4.82(m，3H)，4.76-4.58(m，6H)，4.54(d，J＝10.4Hz，1H)，4.27(d，J＝10.4Hz，1H),4.11(d，J＝3.2Hz，1H)，4.00-3.79(m，4H)，3.77(s，3H)，3.39(dq，J＝11.9，6.2Hz，1H)，1.40(d，J＝6.0Hz，3H)；

¹³C NMR(101MHz，CDCl₃)δ165.3，164.0，155.4，151.5，150.2，147.7，138.7，138.4，138.0，137.0，133.4，129.8(2C)，128.9，128.6，128.4，128.3(3C)，128.1，128.0，127.8，127.6，127.5(2C)，127.0，125.2，118.6，114.5，100.8，100.5，83.2，78.6，75.8，75.7，75.3，74.8，74.0，73.5，71.7，70.0，55.6，17.9；

HRMS(ESI)：计算值C₆₀H₅₉O₁₃N[M+Na]⁺1024.3884，测定值：1024.3896。

二糖结构单元19的合成

将Cu(OAc)₂·H₂O(70mg，0.347mmol)加入到18(0.23g，0.23mmol)在CH₂Cl₂(6mL)和MeOH(3mL)中的溶液中。在室温搅拌1h后，通过C盐垫过滤反应混合物，浓缩滤液。将粗产物溶于CH₂Cl₂(5mL)，向其中加入Ac₂O(1mL)和甲基咪唑(0.2mL)。1h后，蒸发该反应混合物，通过快速色谱法纯化，使用己烷和乙酸乙酯作为洗脱液(6:1-5:1)，得到期望的产物19，为无色油状物(0.193g，90％)。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ8.01(d，J＝7.7Hz，2H)，7.51(t，J＝7.4Hz，1H)，7.39(t，J＝7.6Hz，2H)，7.33-7.01(m，20H)，6.89(d，J＝8.9Hz，2H)，6.64(d，J＝8.9Hz，2H)，5.42(t，J＝8.3Hz，1H)，4.93(d，J＝7.9Hz，1H)，4.71(t，J＝6.2Hz，2H)，4.65-4.43(m，7H)，4.39(d，J＝10.5Hz，1H)，4.15-4.07(m，1H)，3.83-3.67(m，4H)，3.65(s，3H)，3.63-3.41(m，2H)，3.19(dq，J＝12.1，6.2Hz，1H)，1.87(s，3H)，1.23(d，J＝6.1Hz，3H)；

¹³C NMR(101MHz，CDCl₃)δ170.2，165.3，155.4，151.6，138.7，138.6，138.2，137.1，133.4，129.9，129.8，128.8，128.7，128.6，128.5，128.4，128.3(2C)，128.0，127.9，127.8，127.6，127.5，118.7，114.5，100.8，100.6，83.1，78.7，77.4，76.0，75.79，75.76，75.4(2C)，75.3，74.9，74.0，73.5，71.8，70.1，55.7，29.8，21.1，17.9；

HRMS(ESI)：计算值C₅₆H₅₈O₁₃[M+Na]⁺961.3775，测定值：961.3841。

亚氨酸酯供体7的合成

将硝酸高铈铵(0.46g，0.85mmol)加入到19(0.16g，0.17mmol)在乙腈(5mL)和H₂O(1mL)中的溶液中。在室温搅拌1h后，向该反应混合物中加入Na₂SO₄，通过C盐垫过滤。浓缩滤液，通过快速色谱法纯化，使用己烷和乙酸乙酯作为洗脱液(4:1)，得到期望的半缩醛，为淡黄色油状物。

将得到的半缩醛溶于CH₂Cl₂(5mL)，向其中加入Cl₃CCN(0.17mL，0.17mmol)、DBU(5.2μL)。30min后，向该反应混合物中加入己烷(5mL)，通过快速色谱法纯化，使用己烷和乙酸乙酯作为洗脱液(5:1)，得到期望的产物7，为无色油状物(0.126g，76％，α/β＝9:1)。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ8.47(s，1H)，7.95(d，J＝7.8Hz，2H)，7.50(t，J＝7.5Hz，1H)，7.36(t，J＝7.7Hz，2H)，7.32-7.01(m，20H)，6.56(d，J＝3.5Hz，1H)，5.29(dd，J＝9.9，3.5Hz，1H)，4.76(s，1H)，4.70-4.49(m，7H)，4.43(dd，J＝23.8，11.2Hz，2H)，4.12(t，J＝9.3Hz，1H)，4.05-3.90(m，2H)，3.90-3.76(m，2H)，3.73(dd，J＝11.2，4.8Hz，1H)，3.51(t，J＝9.5Hz，1H)，3.19(dt，J＝12.1，6.2Hz，1H)，1.90(s，3H)，1.19(d，J＝4.9Hz，3H)；

¹³C NMR(101MHz，CDCl₃)δ170.2，165.5，160.6，138.5(2C)，138.2，137.2，133.6，129.9，129.3，128.8，128.7，128.6，128.5，128.4，128.3(2C)，127.9，127.8(2C)，127.6，127.5，101.2，94.1，91.3，79.6，78.7，76.0，75.9，75.9，75.3，75.0，74.8，73.4，73.3，72.9，71.8，68.6，29.8，21.2，17.9。

实施例A.3：四糖受体4的合成

四糖20的合成

在-40℃向供体7(60mg，0.06mmol)、受体8(40mg，0.04mmol)和酸洗涤的分子筛(AWMS)(100mg)在CH₂Cl₂(2mL)中的溶液中加入TMSOTf(1.5μL，8μmol)。将该反应混合物逐步温热至0℃，历时3h。在供体完全耗尽后，加入1滴Et₃N，真空除去溶剂。通过快速色谱法纯化粗产物，使用己烷和乙酸乙酯作为洗脱液(3:1-2:1)，得到期望的产物20，为淡黄色油状物(49mg，68％)。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ8.02(d，J＝7.6Hz，2H)，7.82(d，J＝7.7Hz，2H)，7.54-7.33(m，6H)，7.31-7.14(m，36H)，6.98-6.90(m，2H)，6.79-6.70(m，2H)，5.30(s，1H)，5.21(s，1H)，5.19-5.05(m，3H)，4.95(s，1H)，4.80(d，J＝10.5Hz，1H)，4.76-4.62(m，3H)，4.61-4.45(m，5H)，4.43-4.37(m，4H)，4.35-4.21(m，4H)，4.12-4.09(m，2H)，3.80-3.69(m，2H)，3.67-3.57(m，3H)，3.55-3.37(m，5H)，3.30-3.03(m，7H)，2.63(t，J＝7.0Hz，2H)，2.55-2.45(m，2H)，2.06(s，3H)，1.85(s，3H)，1.62-1.31(m，6H)，1.19(s，3H)，1.10(d，J＝6.1Hz，3H)，0.91(d，J＝6.1Hz，3H)；

¹³C NMR(101MHz，CDCl₃)δ206.9，171.7，170.1，166.1，165.0，139.1，138.6，138.5，138.2，138.1，138.0，136.7，133.3，130.1，129.9，129.7，129.6，128.7，128.6(2C)，128.5(2C)，128.4，128.3(2C)，128.2(2C)，128.0，127.9(2C)，127.8，127.7，127.3，127.2，127.1，126.7，101.1，100.9，99.29，97.0，83.1，80.4，80.1，78.6，78.0，77.4，76.0，75.8，75.6，75.3，75.2，74.8，74.7，74.1，74.0，73.1，73.0，72.4，71.6，69.3，68.3，67.8，67.5，67.2，62.4，60.5，50.6，50.3，47.2，46.2，38.3，29.8，29.2，28.3，28.0，27.6，25.0，23.4，22.8，22.3，21.2，21.1，18.1，17.7，17.6；

HRMS(ESI)：计算值C₁₀₇H₁₁₇O₂₅N[M+Na]⁺1839.7846，测定值：1839.7621。

四糖受体4的合成

在0℃将肼溶液[310μL，预混合的H₂NNH₂·H₂O(50μL)、吡啶(0.6mL)、AcOH(0.4mL)溶液]加入到搅拌的化合物20(57mg，0.03mmol)在CH₂Cl₂(2.0mL)和吡啶(2mL)中的溶液中。在0℃搅拌1h后，用CH₂Cl₂(10mL)稀释该反应混合物，并连续用1M HCl(5mL)和饱和NaHCO₃水溶液(5mL)洗涤。用Na₂SO₄干燥有机层，过滤，浓缩。通过快速色谱法纯化粗产物，使用己烷和乙酸乙酯作为洗脱液(3:1-2.5:1)，得到期望的产物4，为无色油状物(49mg，90％)。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ7.98(d，J＝7.7Hz，2H)，7.81(d，J＝7.8Hz，2H)，7.52-7.32(m，6H)，7.31-7.13(m，28H)，7.12-6.94(m，10H)，6.77(d，J＝7.3Hz，2H)，5.24(dd，J＝14.9，6.1Hz，2H)，5.09(d，J＝9.9Hz，2H)，4.90(s，1H)，4.81-4.67(m，3H)，4.65-4.38(m，10H)，4.36-4.21(m，3H)，4.20-3.96(m，4H)，3.85-3.63(m，5H)，3.60-3.39(m，6H)，3.35-3.07(m，7H)，1.86(s，3H)，1.56-1.38(m，6H)，1.23(d，J＝6.2Hz，3H)，1.19(d，J＝6.2Hz，3H)，0.85(d，J＝6.4Hz，3H)；

¹³C NMR(101MHz，CDCl₃)δ170.2，165.9，165.2，138.6，138.5，138.4，138.3，138.1，138.0，136.9，133.3，133.2，130.2，129.9，129.8，129.5，128.8，128.7，128.6，128.5(3C)128.4(3C)，128.3，128.1，127.9(3C)，127.8(2C)，127.6，127.4，127.2，127.1，101.2，100.9，100.5，97.1，83.0，82.1，80.2，79.2，78.6，78.3，77.4，76.0，75.7，75.6，75.5，75.3，74.8，74.4，74.3，73.6，73.5，72.9，71.7，70.1，69.5，68.1，68.0，67.6，67.3，50.7，50.3，47.2，46.3，21.1，18.2，17.9，17.7；

HRMS(ESI)：计算值C₁₀₂H₁₁₁O₂₃N[M+Na]⁺1741.7478，测定值：1741.7240。

实施例A.4：二糖供体3的合成

葡糖醛酸结构单元22的合成

将BAIB(4.34g，13.47mmol)和TEMPO(0.17g，1.08mmol)加入到21(Z.Guan等人J.Org.Chem.2012，77，8888)(3g，5.39mmol)在CH₂Cl₂(15mL)和H₂O(7.5mL)中的溶液中。将该反应混合物在室温搅拌2h，用饱和Na₂S₂O₃水溶液(150mL)猝灭。用EtOAc(3x100mL)萃取水相，用Na₂SO₄干燥。浓缩后，通过快速色谱法纯化残余物，用环己烷和乙酸乙酯作为洗脱液(洗脱液中7:1和0.5％甲酸)，得到酸，为白色固体(2.92g，95％)。

向搅拌的酸(2.92g，5.12mmol)在DMF(25mL)中的溶液中加入MeI(1.45g，10.23mmol)和K₂CO₃(1.7g，12.3mmol)。将该溶液在室温搅拌10h，通过添加MeOH(20mL)猝灭。用EtOAc(80mL)稀释该反应混合物，用H₂O(50mL)洗涤。用Na₂SO₄干燥有机层，浓缩。通过快速色谱法纯化粗产物，使用己烷和乙酸乙酯作为洗脱液(9:1-6:1)，得到期望的产物22，为白色固体(2.7g，90％)。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ7.49-7.42(m，2H)，7.40-7.27(m，13H)，7.22(m，2H)，7.15-7.09(m，2H)，4.91-4.67(m，5H)，4.61(m，2H)，3.90(m，1H)，3.81(t，J＝9.3Hz，1H)，3.73(s，3H)，3.70(t，J＝8.8Hz，1H)，3.49(dd，J＝9.7，8.7Hz，1H)，2.34(s，3H)；¹³C NMR(101MHz，CDCl₃)δ168.9，138.2(2C)，138.0，137.8，133.0，129.9，129.4，128.6，128.5(3C)，128.3，128.1，128.0(2C)，127.9(2C)，127.7，88.7，86.0，80.4，79.4，78.1，76.0，75.6，75.2，52.6，21.3；

HRMS(ESI)：计算值C₃₅H₃₆O₆S[M+Na]⁺607.2130，测定值：607.2140。

亚氨酸酯供体5的合成

在0℃将NIS(92mg，0.41mmol)和TfOH(3μL，0.34mmol)加入到22(0.2g，0.34mmol)在丙酮(2mL)和水(1mL)中的溶液中。在0℃搅拌4h后，用Et₃N(0.5mL)使该反应混合物猝灭。用CH₂Cl₂(15mL)稀释该反应混合物，用饱和Na₂S₂O₃水溶液(5mL)洗涤。用Na₂SO₄干燥分离的有机层，过滤，浓缩。通过快速色谱法纯化粗产物，使用己烷和乙酸乙酯作为洗脱液(4:1-3:1)，得到半缩醛，为淡黄色液体(0.164g)。

在0℃将DBU(5μL，0.034mmol)和Cl₃CCN(0.34mL，3.42mmol)加入到冷却的半缩醛(0.164g，0.342mmol)在CH₂Cl₂(2mL)中的溶液中。在0℃搅拌1h后，用旋转器蒸发该反应混合物，通过快速色谱法纯化粗产物，使用己烷和乙酸乙酯作为洗脱液(5:1-4:1)，得到产物5，为无色油状物(0.183g，86％，α/β＝2.7/1)。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ8.60(s，1H)，7.33-7.08(m，15H)，6.45(d，J＝3.5Hz，1H)，5.00-4.50(m，5H)，4.36(d，J＝10.1Hz，1H)，4.11-3.95(m，1H)，3.82-3.66(m，3H)，3.65(s，3H)；

¹³C NMR(101MHz，CDCl₃)δ169.3，161.1，138.4，138.0，137.8，137.7，129.2，128.6，128.5(3C)，128.4，128.3，128.2，128.1，128.0(2C)，127.9，127.8(2C)，125.4，94.0，91.1，83.7，80.8，78.9，78.8，75.9，75.7，75.5，75.2，73.2，72.6，52.7；

HRMS(ESI)：计算值C₃₀H₃₀O₇NCl₃[M+Na]⁺644.0986，测定值：644.1014。

二糖3的合成

在-20℃将TMSOTf(4μL，0.02μmol)加入到供体5(0.14g，0.22mmol)和受体21(90mg，0.16mmol)在溶剂甲苯(2mL)和二噁烷(6mL)的混合物中的溶液中。将该反应混合物逐步温热至0℃，历时2h。加入1滴Et₃N，真空除去溶剂。通过快速色谱法纯化粗产物，使用己烷和乙酸乙酯作为洗脱液(7:1-5:1)，得到期望的产物3，为淡黄色油状物(0.12g，73％，α/β＝3.5:1)。

¹H NMR(400MHz，CDCl_3，α-端基异构体)δ7.43(d，J＝7.8Hz，2H)，7.40-7.18(m，30H)，7.06(d，J＝7.8Hz，2H)，5.08(d，J＝3.5Hz，1H)，4.94(d，J＝10.9Hz，1H)，4.88-4.60(m，9H)，4.58-4.47(m，3H)，4.29(d，J＝10.0Hz，1H)，3.95(t，J＝9.3Hz，1H)，3.86(dd，J＝12.1，4.3Hz，1H)，3.82-3.69(m，3H)，3.67(d，J＝4.9Hz，3H)，3.64-3.54(m，2H)，3.39(dd，J＝9.7，3.9Hz，1H)，3.17(t，J＝9.3Hz，1H)，2.21(s，3H)；

¹³C NMR(101MHz，CDCl₃)δ170.4，138.6，138.3，138.2，138.1(2C)，138.0，133.2，129.9，128.6(2C)，128.5(3C)，128.4(3C)，128.3，128.1(2C)，128.0，127.9，127.8，127.7，127.6(2C)，98.0，88.6，86.7，81.1，81.0，79.8，79.6，78.9，77.3，75.9，75.7，75.6，75.2，75.1，72.6，70.4，66.5，52.5，21.2；

HRMS(ESI)：计算值C₆₂H₆₄O₁₁S[M+Na]⁺1039.4067，测定值：1039.4091。

实施例A.5：己糖2的合成

己糖23的合成

在-30℃将NIS(12mg，0.05mmol)和TfOH(1μL)加入到冷却的供体3(52mg，0.05mmol)、受体4(45mg，0.026mmol)和酸洗涤的分子筛(AWMS)(0.2g)在CH₂Cl₂(1mL)和二噁烷(1mL)的混合物中的溶液中。将反应混合物逐步温热至-10℃，历时1h，用CH₂Cl₂(10mL)稀释，用饱和Na₂S₂O₃水溶液(5mL)洗涤。用Na₂SO₄干燥分离的有机层，过滤，浓缩。通过快速色谱法纯化粗产物，使用己烷和乙酸乙酯作为洗脱液(4:1-3:1)，得到期望的产物23，为无色油状物(45mg，66％)。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ8.05(d，J＝7.7Hz，2H)，7.78(d，J＝7.8Hz，2H)，7.50-7.32(m，8H)，7.30-7.01(m，63H)，6.98-6.89(m，3H)，6.86-6.83(m，2H)，5.25(s，1H)，5.19-5.12(m，2H)，5.07(d，J＝4.5Hz，2H)，4.90-4.45(m，20H)，4.42-4.08(m，12H)，4.06-3.52(m，16H)，3.50(d，J＝4.1Hz，3H)，3.48-2.95(m，13H)，1.87(s，3H)，1.58-1.36(m，6H)，1.14(d，J＝6.2Hz，3H)，1.07(d，J＝6.1Hz，3H)，0.88(d，J＝6.2Hz，3H)；

¹³C NMR(101MHz，CDCl₃)δ170.6，170.2，166.2，164.6，139.4，139.3，138.9(2C)，138.8，138.7，138.5，138.3，138.2，137.0，133.3，133.0，130.2，130.0，129.9，128.8，128.6(2C)，128.5(3C)，128.4(3C)，128.3，128.2(3C)，128.1，128.0，127.9(3C)，127.8，127.7，127.6，127.5，127.4，127.3，127.2，127.1，126.6，101.4，100.7，99.3，98.1，97.0，95.9，83.2，81.7，81.0，80.7，80.4，80.2，79.8，79.6，78.7，77.5，77.4，77.3，77.2，76.8，76.1，75.7，75.2，75.1，75.0，74.7，73.8，73.7，73.3，73.1，72.7，71.8，71.5，71.3，70.4，67.6，67.3，66.9，58.6，53.6，52.3，31.1，29.8，21.1，18.6，18.1，17.8，17.6；

HRMS(ESI)：计算值C₁₅₇H₁₆₇O₃₄N[M+Na]⁺2634.1301，测定值：2634.0912。

5-氨基戊基β-L-吡喃鼠李糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-α-L-{α-D-吡喃葡萄糖基糖醛酸酯-(1→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)}吡喃鼠李糖基-(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖苷(2)的合成

向搅拌的己糖23(6mg，2.3μmol)在THF(0.5mL)和MeOH(0.5mL)中的溶液中加入NaOH水溶液(15％，100μL)。在室温搅拌1h后，加入NaOMe(6mg)，允许搅拌12h。原料完全耗尽后，用Amberlite 120H⁺树脂中和该反应混合物，过滤，浓缩。通过快速柱色谱法纯化粗物质，用己烷和乙酸乙酯作为洗脱液(1:1-1:2)，得到期望的去酰化产物，为白色固体。将得到的去酰化产物溶于CH₂Cl₂(0.5mL)、^tBuOH(1mL)和水(0.5mL)。向该溶液中加入Pd/C(50mg)在^tBuOH(1mL)和水(0.5mL)的混合物中的混悬液，在氢气气氛中搅拌36h。然后过滤反应混合物，浓缩，通过C18柱纯化，得到期望的产物2(0.7mg，30％)，为白色固体。

¹H NMR(400MHz，D₂O)δ5.07(s，1H)，5.02-4.94(m，2H)，4.91(d，J＝3.7Hz，1H)，4.73(d，J＝1.5Hz，1H)，4.63(d，J＝7.9Hz，1H)，4.35-4.18(m，3H)，4.05(m，4H)，3.96-3.81(m，3H)，3.80-3.61(m，8H)，3.61-3.40(m，8H)，3.38-3.25(m，3H)，3.24-3.13(m，1H)，2.96(t，J＝7.6Hz，2H)，1.66(dt，J＝15.9，8.0Hz，4H)，1.43(p，J＝7.8，7.3Hz，2H)，1.33-1.19(m，9H)；

HRMS(ESI)：计算值C₄₁H₇₁O₂₉N[M+Na]⁺1064.4009，测定值：1064.4067。

实施例A.5的合成方法应用于二糖15a、15b、15c和15d分别提供了己糖2a、2b、2c和2d。

实施例A.6：缀合物的合成和表征

通用方法合成

对硝基苯基(PNP)酰胺的形成

向在玻璃小瓶中的通式(I)的糖(1当量)和己二酸二苯酯(7当量)中加入吡啶和DMSO(1:1)的混合物，将该混合物保持搅拌5分钟用于完全增溶。然后加入三乙胺(0.83μL，6μmol，10当量)，保持搅拌20分钟。TLC显示原料完全耗尽。真空除去溶剂。用二氯甲烷(3×1mL)洗涤残余物以除去过量的PNP酯，真空干燥得到的白色固体。

PNP酯衍生的糖与CRM₁₉₇的缀合

将40当量的冻干CRM₁₉₇溶于0.4mL无菌0.1M磷酸钠，pH 8.0，转入10,000Da微孔离心滤器(0.5mL)的上层室。用3×0.4mL无菌0.1M磷酸钠，pH 8.0冲洗玻璃小瓶，转入相同的离心滤器。以10,000rpm离心6-8min。如果需要，延长最终离心步骤，使得上层室中的体积为80-100μL。然后将CRM₁₉₇溶液转入包含冻干的PNP酯衍生的糖的1.5mL试管中，在室温下缓慢振摇(约180-200rpm)18-24h。用0.1M磷酸钠，pH 8.0将缀合物洗涤1次，用去离子高压灭菌水、应用10,000Da微孔离心滤器洗涤2-3次。取出小样用于MALDI分析，将缀合物转入PBS。如果需要，则延长最终离心步骤，使得上层室中的体积为约250μL。将上层室内容物转入新的1.5mL埃彭道夫管，储存在4℃下。

糖缀合物的表征

A.MALDI分析：通过Matrix-辅助的激光解吸/电离(MALDI)分析，使用CRM₁₉₇作为标准品测定缀合物的平均分子大小并且计算每个CRM₁₉₇分子中的平均寡糖连接。

B.SDS-PAGE：通过SDS-PAGE(10％)在变性条件下解析缀合物。用6X SDS-PAGE样品加载染料制备样品。在120V和25mA下在电极缓冲液中进行电泳1h 30min并且用考马斯亮蓝R250染色凝胶。

蛋白质估计

使用Micro BCA蛋白质测定试剂盒(Thermo-scientific，USA)，按照制造商的说明估计蛋白质浓度。用PBS制备样品并且与等体积的试剂混合物(B:C:A：24:1:25)混合。将板在37℃下温育并且在560nm测定吸光度。用试剂盒提供的已知浓度的BSA绘制标准曲线。

缀合物CRM₁₉₇-己糖2的合成

按照上述方法，合成缀合物CRM₁₉₇-己糖2。使用已知量的BSA估计缀合物作为标准品(slandered)，并且通过10％SDS-PAGE证实，显示与未缀合的CRM₁₉₇相比向更高质量的糖缀合物移动(图4A和B)。MALDI-TOF质谱分析原因测定寡糖-与-CRM₁₉₇的摩尔比(图4C)。缀合物CRM₁₉₇-己糖2的质量分析揭示出一个CRM₁₉₇分子上载有平均为己糖2的7-8个分子。

B.生物学评估

实施例B.1：小鼠免疫接种和多克隆血清的生成

材料和方法

Mice：6-8周龄雌性C57BL/6J近交系小鼠得自Charles River，Sulzfeld(Germany)。根据Institutional Animal Ethics指导原则安置和操作动物。

小鼠免疫接种和多克隆血清的生成

简言之，用1:1(v/v)明矾(氢氧化铝)佐剂乳化的缀合物CRM₁₉₇-己糖2(每剂量3μg糖)皮下免疫接种3只C57BL/6J雌性6-8周龄近交小鼠的组。在第14和28天，小鼠接受加强注射相同量的用1:1(v/v)明矾乳化的抗原。一组小鼠也用缀合物CRM₁₉₇-己糖2(每剂量3μg糖)免疫接种仅用于检查免疫原性。每周使用无菌一次性血液采血针给小鼠下颌下放血。对照组小鼠仅接受明矾中的PBS和PBS。通过聚糖微阵列和ELISA在两种血清中测定抗体应答。

微阵列载玻片的制备：通过使用配备4型涂覆的喷嘴的S3压电微阵列印刷机(Scienion)，在印刷缓冲液(50mM磷酸钠，pH 8.5)中两种不同浓度(100μM和200μM)的合成聚糖和天然多糖点样CodeLink NHS活化的载玻片(Surmodics)。将点样室的相对湿度始终维持在65％。将点样的载玻片在室温下在加湿室中温育过夜。将载玻片上的非反应性基团在室温下用50mM磷酸钠、100mM乙醇胺pH9.0封闭1小时。随后将载玻片用水洗涤3次，历时5min，通过以300g离心5min干燥(CombiSlide系统，Eppendorf)并在4℃下储存直至使用。

微阵列结合测定：将印刷的载玻片用PBS-BSA(1％)在室温封闭1h，并用PBS洗涤3次。使用前将载玻片以1200rpm离心5min干燥。将FlexWell 64(Grace Bio-Labs，Bend，OR，USA)网格应用于微阵列载玻片。将载玻片与在小鼠中针对缀合物CRM₁₉₇-己糖2产生的多克隆血清一起以多种稀释度温育，在1％BSA的PBS(w/v)中稀释并且在室温下在加湿室中温育1h。用PBST(PBS中的0.1％Tween-20)洗涤载玻片3次并通过离心(300xg，5min)干燥。将载玻片与在PBS中的1％BSA(w/v)稀释的荧光标记的山羊抗小鼠二次抗体(Life Technologies)一起在加湿室中在室温下温育1h，用PBST洗涤3次，用去离子水冲洗并在用GenePix 4300A微阵列扫描仪(Molecular Devices，Sunnyvale，CA，USA)扫描之前通过离心(300xg，5min)干燥。使用GenePix Pro 7软件(Molecular Devices)进行图像分析。调整光电倍增管(PMT)电压，使得扫描不含饱和信号。

结果：

为了分析针对缀合物CRM₁₉₇-己糖2的抗体应答，将用缀合物CRM₁₉₇-己糖2免疫接种的小鼠中产生的超免疫血清以不同稀释度接触印刷有合成寡糖和多糖的微阵列载玻片。微阵列数据证实，缀合物CRM₁₉₇-己糖2在小鼠中是免疫原性的，并且表现出强烈的抗体应答，如通过每周在免疫接种之前和之后进行的分析所示(图4B)。有意义地，免疫接种后己糖2特异性血清抗体水平逐渐升高，在加强免疫后观察到强烈的诱导并显示与天然多糖的反应性。己糖2特异性抗体也与印刷在载玻片上的其它己糖2片段交叉反应(图4B)。因此，微阵列分析证明己糖2在小鼠中具有免疫原性并诱导交叉反应性抗体。

实施例B.2：抗体交叉反应性的评估

ELISA：通过ELISA用肺炎链球菌血清型2的荚膜多糖(CPS)分析用缀合物CRM₁₉₇-己糖2免疫接种的小鼠中产生的抗体的交叉反应性。将96孔聚苯乙烯微量滴定板(Corning，NY)在4℃下用磷酸盐缓冲盐水(pH7.4)中的CPS(50μl的10μg/ml/孔)包被过夜。将平板用含有0.1％Tween-20的PBS(PBST)洗涤3次，并在室温下用含有2％BSA的PBS封闭1h。用PBST洗涤3次后，将平板与混合的血清一起以两倍稀释度从室温下500倍稀释1倍开始温育1h。将板用PBST洗涤4至5次，并进一步与辣根过氧化物酶(HRP)缀合的山羊抗小鼠Ig抗体(在含有0.5％BSA的PBS中以1:10000稀释)温育，然后在室温下温育1h。将平板用PBST充分洗涤并使用1-步Ultra TMB(ThermoFisher Sci.USA)显色。通过加入2％H₂SO₄终止反应，并且在450nm记录吸光度。

结果：

ELISA数据启示，与仅用缀合物CRM₁₉₇-己糖2免疫接种或用PBS(PBS+明矾或仅PBS)免疫接种的小鼠相反(图6A)，具有明矾的缀合物CRM₁₉₇-己糖2诱导了高效价的CPS特异性抗体。

实施例B.3：调理性吞噬细胞杀伤测定

将肺炎链球菌血清型2菌株39(NCTC 7466)用超免疫血清在37℃下预先调理15min并与分化的HL-60细胞(DSMZ编号：AC3)以1：400比例(细菌：HL-60个细胞)一起温育。使用幼兔补体(Cedarlane，Canada；cat#CL3441-S)作为补体来源。将整个混合物在37℃下振荡温育45min。通过将混合物保持在冰上20min来终止吞噬活性，并通过在具有5％绵羊血板的Columbia琼脂上铺板来评估存活率。基于相对于对照血清获得的活肺炎球菌菌落计算肺炎球菌杀伤百分比。

结果启示，与对照组相比，抗-缀合物CRM₁₉₇-己糖2抗体表现出非常高的杀菌活性(图6B)。这些结果支持以下理念：缀合物CRM₁₉₇-己糖2诱导了功能性免疫应答，且由此促进了体外杀伤肺炎球菌。

实施例B.4：用缀合物CRM₁₉₇-己糖2免疫接种提供针对鼻内肺炎链球菌攻击的小鼠中的完全保护

在第0、14和28天，用含或不含在PBS中的氢氧化铝(125mg Al)的缀合物CRM₁₉₇-己糖2(每剂量2.2μg糖)皮下免疫接种7周龄雌性C57BL/6J小鼠(n＝11)。2个对照组(n＝11)仅接受PBS和PBS加氢氧化铝(125mg Al)。另一个假拟组(n＝11)仅注射PBS以减去背景。第二次加强免疫后一周，每只小鼠用1×10⁷cfu的D39型菌株对小鼠鼻内攻击。假拟组仅通过鼻内接受PBS。每12h监测一次动物。攻击后36小时，将小鼠用氯胺酮/噻拉嗪麻醉并在无菌条件下安乐死。分析在肺和血液中细菌载量。将冲洗的肺匀浆并在注射器的帮助下制备单细胞悬液。通过在血琼脂平板上铺板来枚举来自肺泡和血液的肺炎球菌。

菌落形成单位数据(CFU)表明，与PBS注射的小鼠相比，用缀合物CRM₁₉₇-己糖2免疫接种的小鼠显著降低了针对鼻内攻击的CFU的数量(参见图7A和B)，表明抗体介导的针对鼻内攻击的保护在主动保护模型中实现。

Claims

1.通式(I)的糖

V*-U_x+3-U_x+2-U_x+1-U_x-O-L-NH₂

(I)

其中

x是选自1、2、3和4的整数；

L表示接头；

或其药学上可接受的盐。

2.权利要求1的糖或其药学上可接受的盐，其中x表示1。

3.权利要求1或2的糖或其药学上可接受的盐，其中

4.权利要求1-3任一项的糖或其药学上可接受的盐，其中

5.合成权利要求1的通式(I)的糖的方法，其中x表示1，V*-表示H-，且

且

该方法包括下列步骤：

A)使通式(II)的二糖，

其中P¹-P³表示保护基，且LG¹表示离去基，与通式(III)的二糖反应，

其中P⁴-P⁸表示保护基，且L具有如权利要求1中所定义的含义，得到通式(IV)的四糖，

其中P¹-P⁸表示保护基；

并且

B)使通式(IV)的四糖进行选择性脱保护，得到通式(V)的四糖，

其中P¹-P⁴、P⁶-P⁸表示保护基，且L具有权利要求1中所定义的含义；

并且

C)使通式(V)的四糖与通式(VI)的二糖反应，

其中P¹-P⁴、P⁶-P¹⁰表示保护基，且L具有权利要求1中所定义的含义；

并且

D)除去通式(VII)的化合物上的保护基P¹-P⁴、P⁶-P¹⁰。

6.通式(V)的中间体

其中P¹-P⁴、P⁶-P⁸表示保护基，且L具有权利要求1中所定义的含义。

7.权利要求6的通式(V)的中间体，其中P¹、P⁶和P⁷表示苄基，P²、P³和P⁴彼此独立地选自苯甲酰基和乙酰基，且P⁸表示苄氧基羰基。

8.缀合物，其包含权利要求1-4任一项的通式(I)的糖，所述糖通过-O-L-NH₂基团的氮原子与免疫原性载体共价连接。

9.权利要求7的缀合物，具有通式(X)

[V*-U_x+3-U_x+2-U_x+1-U_x-O-L-NH-W]_m-CRM₁₉₇

(X)

其中m为约2至约18；

-W-选自：

a表示1-10的整数；

b表示1-4的整数；且

V*、U_x+3、U_x+2、U_x+1、U_x、x和L具有如权利要求1-4任一项中所定义的含义。

10.权利要求1-4任一项的糖或权利要求8或9的缀合物，用于在人和/或动物宿主中产生保护性免疫应答。

11.权利要求1-4任一项的糖或权利要求8或9的缀合物，用于预防和/或治疗由肺炎链球菌2型导致的疾病。

12.疫苗，包含权利要求1-4任一项的糖和/或其药学上可接受的盐和/或权利要求8或9的缀合物与至少一种药学上可接受的佐剂和/或赋形剂。

13.权利要求12的疫苗组合物，还至少包含肺炎链球菌荚膜多糖和/或肺炎链球菌荚膜多糖片段和/或载体蛋白和肺炎链球菌荚膜多糖或肺炎链球菌荚膜多糖片段的缀合物，其中肺炎链球菌选自肺炎链球菌1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19F、19A、20、22F、23F和33F型。

14.权利要求1-4任一项的糖，用作用于检测针对肺炎链球菌2型的抗体的免疫学测定中的标志物。