JP6534997B2 - 神経変性疾患及び疼痛の予防及び治療における使用のための化合物 - Google Patents
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Description
発明の分野
本発明は、神経変性疾患もしくは疼痛、又は両方を予防し及び／又は治療する使用のための化合物に関する。
本発明は、神経変性疾患もしくは疼痛、又は両方を予防し及び／又は治療する使用のための化合物に関する。
発明の背景
米国特許出願公開第ＵＳ２０１２０２９５８６３は、神経変性疾患の予防及び治療のためのアデノシンＡ２Ａ受容体及びアデノシントランスポーターを標的とする二相作用化合物を開示する。ＣＧＳ２１６８０（略言すればＣＧＳ）という選択的Ａ2Aアデノシン受容体（Ａ2AＲ）アゴニストは、ユビキチン−プロテアソーム系の活性を高めることにより、トランスジェニックマウスモデルにおいてハンチントン病（ＨＤ）の症状を軽減し、ＨＤ疾患の尿素サイクル欠損症（ｕｒｅａ ｃｙｃｌｅ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）を救うことができるということを示した（Ｃｈｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．、２００９ Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ． １８：２９２９−２９４２； Ｃｈｏｕ ｅｔ ａｌ．、２００５ Ｊ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ． ９３：３１０−３２０）。しかしながら、ＣＧＳは強い免疫抑制効果及びその他の副作用をもたらすことで知られており、それゆえ臨床使用には適していない。
米国特許出願公開第ＵＳ２０１２０２９５８６３は、神経変性疾患の予防及び治療のためのアデノシンＡ２Ａ受容体及びアデノシントランスポーターを標的とする二相作用化合物を開示する。ＣＧＳ２１６８０（略言すればＣＧＳ）という選択的Ａ2Aアデノシン受容体（Ａ2AＲ）アゴニストは、ユビキチン−プロテアソーム系の活性を高めることにより、トランスジェニックマウスモデルにおいてハンチントン病（ＨＤ）の症状を軽減し、ＨＤ疾患の尿素サイクル欠損症（ｕｒｅａ ｃｙｃｌｅ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）を救うことができるということを示した（Ｃｈｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．、２００９ Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ． １８：２９２９−２９４２； Ｃｈｏｕ ｅｔ ａｌ．、２００５ Ｊ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ． ９３：３１０−３２０）。しかしながら、ＣＧＳは強い免疫抑制効果及びその他の副作用をもたらすことで知られており、それゆえ臨床使用には適していない。
ＵＳ２０１２０２９５８６３においてＴ１−１１として、また、Ａ2AＲアゴニストとしても示されるＮ6−（４−ヒドロキシベンジル）アデノシンは、神経変性疾患の治療における治療可能性を有することが示唆されてきた。しかしながら、Ｔ１−１１を経口摂取可能な薬剤として開発することは、その低い生物学的利用能（Ｆ＜５％）のため、いまだに困難である。経口生物学的利用能は、吸収及び代謝の後に体循環に到達する物質のパーセンテージを表すため、薬剤開発において重要な特性である。
発明の概要
一つの態様では、本発明は、式（Ｉ）又は（ＩＡ）：
一つの態様では、本発明は、式（Ｉ）又は（ＩＡ）：
（式中、Ｘはハロゲンである）
の化合物又はそれらの薬学的に許容される塩に関する。
の化合物又はそれらの薬学的に許容される塩に関する。
ハロゲン（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩ）は、式（Ｉ）の３−、４−又は５−位、あるいは式（ＩＡ）の２−、４−又は５−位に位置してもよい。
本発明の一実施形態では、当該化合物は、Ｎ6−［（３−ハロチエン−２−イル）メチル］アデノシン、Ｎ6−［（４−ハロチエン−２−イル）メチル］アデノシン、及びＮ6−［（５−ハロチエン−２−イル）メチル］アデノシンからなる群から選択される。
本発明の別の実施形態では、当該化合物は、Ｎ6−［（２−ハロチエン−３−イル）メチル］アデノシン、Ｎ6−［（４−ハロチエン−３−イル）メチル］アデノシン、及びＮ6−［（５−ハロチエン−３−イル）メチル］アデノシンからなる群から選択される。
さらに本発明の別の実施形態では、当該化合物は、Ｎ6−［（５−ブロモチエン−２−イル）メチル］アデノシン、Ｎ6−［（４−ブロモチエン−２−イル）メチル］アデノシン、Ｎ6−［（３−ブロモチエン−２−イル）メチル］アデノシン、Ｎ6−［（５−クロロチエン−２−イル）メチル］アデノシン、Ｎ6−［（４−クロロチエン−２−イル）メチル］アデノシン、及びＮ6−［（３−クロロチエン−２−イル）メチル］アデノシンからなる群から選択される。
本発明の別の実施形態では、当該化合物は、Ｎ6−［（２−ブロモチエン−３−イル）メチル］アデノシン、Ｎ6−［（４−ブロモチエン−３−イル）メチル］アデノシン、Ｎ6−［（５−ブロモチエン−３−イル）メチル］アデノシン、Ｎ6−［（２−クロロチエン−３−イル）メチル］アデノシン、Ｎ6−［（４−クロロチエン−３−イル）メチル］アデノシン、及びＮ6−［（５−クロロチエン−３−イル）メチル］アデノシンからなる群から選択される。
別の態様では、本発明は、前述の式（Ｉ）又は式（ＩＡ）の化合物を調製するための方法であって、以下の（Ｉ）又は（ＩＩ）のステップ：
（Ｉ）：
（ａ）６−クロロプリンリボフラノシドを塩基の存在下で、フッ素、塩素、臭素又はヨウ素で置換され、式３又は３Ａ：
（Ｉ）：
（ａ）６−クロロプリンリボフラノシドを塩基の存在下で、フッ素、塩素、臭素又はヨウ素で置換され、式３又は３Ａ：
を有する（チエニル）メタンアミンと反応させ、
式（Ｉ）又は（ＩＡ）の化合物を与えること；あるいは、
（ＩＩ）：
（ａ１）（２’，３’−Ｏ−イソプロピリデン）アデノシンを塩基の存在下で、水酸基保護剤と反応させ、水酸基の保護基を有する（２’，３’−Ｏ−イソプロピリデン）アデノシンの誘導体を与えること；
（ｂ）水酸基の保護基を有する（２’，３’−Ｏ−イソプロピリデン）アデノシンの誘導体をアミノ基保護剤と反応させ、水酸基の保護基及びアミン保護基を有する（２’，３’−Ｏ−イソプロピリデン）アデノシンの誘導体を与えること；
（ｃ）水酸基の保護基及びアミン保護基を有する（２’，３’−Ｏ−イソプロピリデン）アデノシンの誘導体を、式７又は７Ａ：
式（Ｉ）又は（ＩＡ）の化合物を与えること；あるいは、
（ＩＩ）：
（ａ１）（２’，３’−Ｏ−イソプロピリデン）アデノシンを塩基の存在下で、水酸基保護剤と反応させ、水酸基の保護基を有する（２’，３’−Ｏ−イソプロピリデン）アデノシンの誘導体を与えること；
（ｂ）水酸基の保護基を有する（２’，３’−Ｏ−イソプロピリデン）アデノシンの誘導体をアミノ基保護剤と反応させ、水酸基の保護基及びアミン保護基を有する（２’，３’−Ｏ−イソプロピリデン）アデノシンの誘導体を与えること；
（ｃ）水酸基の保護基及びアミン保護基を有する（２’，３’−Ｏ−イソプロピリデン）アデノシンの誘導体を、式７又は７Ａ：
（式中、ＸはＦ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩであり、かつ、ＹはＸ、ＯＨ、メタンスルホン酸（ＯＳＯ2ＣＨ3、ＯＭｓ）、ｐ−トルエンスルホン酸（ＯＳＯ2Ｃ6Ｈ4−ｐ−ＣＨ3、ＯＴｓ）、又はトリフルオロメタンスルホン酸（ＯＳＯ2ＣＦ3、ＯＴｆ）である）
の置換（チエニル）メチル基を含む化合物と反応させることにより、カップリング反応を行い、保護基及び置換（チエニル）メチル基を含む生成物を与えること；並びに
（ｄ）酸性条件下でステップ（ｃ）の生成物から保護基を除去し、式（Ｉ）又は（ＩＡ）の化合物を与えること、
を含む方法に関する。
の置換（チエニル）メチル基を含む化合物と反応させることにより、カップリング反応を行い、保護基及び置換（チエニル）メチル基を含む生成物を与えること；並びに
（ｄ）酸性条件下でステップ（ｃ）の生成物から保護基を除去し、式（Ｉ）又は（ＩＡ）の化合物を与えること、
を含む方法に関する。
本発明の一実施形態では、ステップ（ａ）の塩基はジイソプロピルエチルアミンであってもよい。水酸基保護剤は、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルクロリドであってもよい。アミノ基保護剤は二炭酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチルであってもよい。ステップ（ａ１）の塩基はイミダゾールであってもよい。
本発明の別の実施形態では、ステップ（Ｉ）（ａ）において、塩基はジイソプロピルエチルアミンであり、かつ、置換（チエニル）メタンアミンは：（ｉ）Ｎ6−［（５−ブロモチエン−２−イル）メチル］アデノシンを与える（５−ブロモチエン−２−イル）メタンアミン；又は（ｉｉ）Ｎ6−［（５−クロロチエン−２−イル）メチル］アデノシンを与える（５−クロロチエン−２−イル）メタンアミンである。
さらに本発明の別の実施形態では、カップリング反応をトリフェニルホスフィン及びアゾジカルボン酸ジイソプロピルの存在下で行う。置換（チエニル）メチル基を含む化合物は（５−ブロモチエン−２−イル）メタノールであってもよい。
さらに別の態様では、本発明は、以下、
（ａ）治療上有効量の前述の化合物又はそれらの薬学的に許容される塩；及び
（ｂ）薬学的に許容される担体、賦形剤又はビヒクル、
を含む組成物に関する。
（ａ）治療上有効量の前述の化合物又はそれらの薬学的に許容される塩；及び
（ｂ）薬学的に許容される担体、賦形剤又はビヒクル、
を含む組成物に関する。
もう一つの態様では、本発明は、神経変性疾患及び／又は疼痛の治療を必要とする患者の、当該治療をするための薬剤の製造における、前述の化合物の使用に関する。あるいは、本発明は、神経変性疾患及び／又は疼痛の治療を必要とする患者の、当該治療における使用のための、前述の化合物に関する。当該神経変性疾患はタンパク質ミスフォールディング病であってもよい。
本発明の一実施形態では、神経変性疾患は、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、プリオン病、ハンチントン病、及び脊髄小脳性運動失調症からなる群から選択される。脊髄小脳性運動失調症は、脊髄小脳性運動失調症２型、脊髄小脳性運動失調症３型、及び脊髄小脳性運動失調症７型からなる群から選択されてもよい。疼痛は、酸誘発性疼痛（ａｃｉｄ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｐａｉｎ）であってもよい。酸誘発性疼痛は、酸誘発性筋痛であってもよい。酸誘発性筋痛は酸誘発性慢性筋痛であってもよい。
本発明の一実施形態では、疼痛は、炎症性疼痛、がん性疼痛、胸痛、背痛、頚部痛、肩痛、片頭痛、頭痛、筋筋膜性疼痛、関節痛（ｊｏｉｎ ｐａｉｎ）、筋痛症候群、神経障害性疼痛、末梢性疼痛、交換神経性疼痛、術後疼痛、外傷後疼痛、及び多発性硬化症疼痛からなる群から選択される。
本発明の別の実施形態では、疼痛は機能障害性疼痛であってもよい。機能障害性疼痛は、線維筋痛、筋筋膜性疼痛、膀胱痛症候群、及び過敏性腸症候群により引き起こされる疼痛からなる群から選択されてもよい。
本開示の新規な概念の趣旨及び範囲から逸脱することなく、変形及び変更が本明細書中に与えられてもよいが、これら及びその他の態様は以下の図面と併せて、以下の好ましい実施形態の説明から明らかになるであろう。
添付の図面は本発明の１又は複数の実施形態を示し、明細書と共に本発明の原理を説明する役割を果たす。可能な限り、実施形態の同一又は類似の要素を参照するために図面を通して同一の参照番号を使用する。
発明の詳細な説明
定義
別段定義しない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が関連する当業者により一般に理解されるものと同一の意味を有する。矛盾する場合は、定義を含む本明細書が調節することになる。
定義
別段定義しない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が関連する当業者により一般に理解されるものと同一の意味を有する。矛盾する場合は、定義を含む本明細書が調節することになる。
用語「治療すること」又は「治療」は、有効量の治療薬を、それらを必要とする、神経変性疾患及び／又は疼痛を有し、あるいはそのような疾患及び／又は疼痛に対する症状又は素因を有する患者に、当該疾患及び／又は疼痛、その症状、あるいはそれに対する素因を治癒させ、緩和し、軽減し、矯正し、改善し、又は予防する目的で投与することをいう。そのような患者は医療専門家によって、任意の好適な診断方法による結果に基づいて特定され得る。
「有効量」とは、治療される患者に対して治療的効果を与えるために必要とされる活性化合物の量をいう。効果的な投与量は、当業者によって認識されるように、投与経路、賦形剤の使用、及びその他の治療的処置との併用（ｃｏ−ｕｓａｇｅ）の可能性に応じて変動することになる。
米国保健福祉省食品医薬品局により発行された、「成人健常志願者の治療学のための臨床試験における安全初回投与量を算定する、産業界及び審査官のためのガイダンス（Ｇｕｉｄａｎｃｅ ｆｏｒ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ ａｎｄ Ｒｅｖｉｅｗｅｒｓ Ｅｓｔｉｍａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｓａｆｅ Ｓｔａｒｔｉｎｇ Ｄｏｓｅ ｉｎ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｒｉａｌｓ ｆｏｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ｉｎ Ａｄｕｌｔ Ｈｅａｌｔｈｙ Ｖｏｌｕｎｔｅｅｒｓ）」は、「治療上有効量」が以下の式：
ＨＥＤ＝動物投与量のｍｇ／ｋｇ×（動物重量のｋｇ／ヒト重量のｋｇ）0.33
による計算によって得られ得ることを開示する。
ＨＥＤ＝動物投与量のｍｇ／ｋｇ×（動物重量のｋｇ／ヒト重量のｋｇ）0.33
による計算によって得られ得ることを開示する。
ＪＭＦ１９０７は化合物Ｎ6−［２−（インドール−３−イル）エチル］アデノシンを意味し、米国特許公開第２０１２０２９５８６３Ａ１に化合物６として開示された。
化学合成
１つの手法では、６−クロロプリンリボフラノシド（２）を塩基の存在下で、任意に置換された（チエニル）メタンアミン（３）により処理し、所望の式（Ｉ）の化合物を得た。
１つの手法では、６−クロロプリンリボフラノシド（２）を塩基の存在下で、任意に置換された（チエニル）メタンアミン（３）により処理し、所望の式（Ｉ）の化合物を得た。
例えば、塩基としてジイソプロピルエチルアミンを用いて、６−クロロプリンリボフラノシドの（５−ブロモチエン−２−イル）メタンアミンとの置換反応を、１−プロパノールの溶媒中で加熱することにより行い、Ｎ6−［（５−ブロモチエン−２−イル）メチル］アデノシン（ＪＭＦ３４６４、構造１）を得た。
別の手法では、（２’，３’−Ｏ−イソプロピリデン）アデノシン（４）を塩基イミダゾールの存在下で、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルクロリド（ＴＢＤＭＳＣｌ）により処理して、シリルエーテル誘導体（５）を得た。６−アミノ基を、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）置換基を有するカルバメート６として保護した。任意に置換した（チエニル）メチル基を導入し、酸性条件下ですべての保護基の除去後に所望の式（Ｉ）の化合物を得た。
例えば、化合物６の、（５−ブロモチエン−２−イル）メタノール（化合物７、式中Ｘ＝５−Ｂｒ、Ｙ＝ＯＨ）とのカップリング反応を、トリフェニルホスフィン及びアゾジカルボン酸ジイソプロピル（ＤＩＡＤ）を用いることにより促進し、化合物８を得た。化合物８のシリル、アセトニド及びＢｏｃ基の全体的な脱保護を酸性条件下で行い、化合物１を得た。
同一の化学的手法を用いて、化合物（ＩＡ）を得た。
経口生物学的利用能
試験化合物の経口生物学的利用能を測定するために、雄のＩＣＲマウス（６週齢；２０〜２５ｇ）から、試験化合物の経口（１０ｍｇ／ｋｇ）又は静脈内（１ｍｇ／ｋｇ）投与後に、血液試料を採取した。示された期間に採取した血液試料を０．１％のギ酸を含むメタノールで抽出し、その後、抽出された各試料の１０μＬを、定量化のためにＵＰＬＣ-ＭＳＭＳへと注入した。その結果（図１Ａ〜Ｂ）は、ＩＣＲマウスにおけるＴ１−１１及びＪＭＦ３４６４の経口生物学的利用能がそれぞれ２．８％及び１７．４％であったことを示し、ＪＭＦ３４６４の経口吸収がＴ１−１１の経口吸収よりも６倍超高かったということを示した。
試験化合物の経口生物学的利用能を測定するために、雄のＩＣＲマウス（６週齢；２０〜２５ｇ）から、試験化合物の経口（１０ｍｇ／ｋｇ）又は静脈内（１ｍｇ／ｋｇ）投与後に、血液試料を採取した。示された期間に採取した血液試料を０．１％のギ酸を含むメタノールで抽出し、その後、抽出された各試料の１０μＬを、定量化のためにＵＰＬＣ-ＭＳＭＳへと注入した。その結果（図１Ａ〜Ｂ）は、ＩＣＲマウスにおけるＴ１−１１及びＪＭＦ３４６４の経口生物学的利用能がそれぞれ２．８％及び１７．４％であったことを示し、ＪＭＦ３４６４の経口吸収がＴ１−１１の経口吸収よりも６倍超高かったということを示した。
ＪＭＦ３４６４のＡ2AＲ及びＥＮＴ１への結合、並びに神経細胞アポトーシスの防止
発明者らはまず、放射性リガンド結合アッセイを用いてＪＭＦ３４６４の薬理学的特性を明らかにした。表１は、Ｔ１−１１、ＪＭＦ１９０７、及びＪＭＦ３４６４の薬理学的特性を示す。示された化合物の、Ａ2Aアデノシン受容体（Ａ2AＲ）及びアデノシントランスポーター（ＥＮＴ１）への結合は、標準の結合手法を用いて明らかにされた。表１に示すように、ＪＭＦ３４６４はＡ2AＲ、及びアデノシントランスポーターである受動拡散型ヌクレオシドトランスポーター１に結合した。ＪＭＦ３４６４のＡ2AＲに対する親和性は、Ｔ１−１１及びＪＭＦ１９０７（Ｔ１−１１のアナログ）の親和性と類似していたが、一方で、ＥＮＴ１に対するその親和性は、Ｔ１−１１及びＪＭＦ１９０７の親和性よりもはるかに優れていた。発明者らの研究はまた、Ｎ6−［（５−クロロチエン−２−イル）メチル］アデノシン（ＪＭＦ３８１８）も血清除去により引き起こされるＰＣ１２細胞のアポトーシスを抑制したことを示した。ＪＭＦ３８１８は１０μＭで、Ａ2A受容体及びアデノシントランスポーター（ＥＮＴ１）をそれぞれ５４％及び９６％まで抑制した（図２）。
発明者らはまず、放射性リガンド結合アッセイを用いてＪＭＦ３４６４の薬理学的特性を明らかにした。表１は、Ｔ１−１１、ＪＭＦ１９０７、及びＪＭＦ３４６４の薬理学的特性を示す。示された化合物の、Ａ2Aアデノシン受容体（Ａ2AＲ）及びアデノシントランスポーター（ＥＮＴ１）への結合は、標準の結合手法を用いて明らかにされた。表１に示すように、ＪＭＦ３４６４はＡ2AＲ、及びアデノシントランスポーターである受動拡散型ヌクレオシドトランスポーター１に結合した。ＪＭＦ３４６４のＡ2AＲに対する親和性は、Ｔ１−１１及びＪＭＦ１９０７（Ｔ１−１１のアナログ）の親和性と類似していたが、一方で、ＥＮＴ１に対するその親和性は、Ｔ１−１１及びＪＭＦ１９０７の親和性よりもはるかに優れていた。発明者らの研究はまた、Ｎ6−［（５−クロロチエン−２−イル）メチル］アデノシン（ＪＭＦ３８１８）も血清除去により引き起こされるＰＣ１２細胞のアポトーシスを抑制したことを示した。ＪＭＦ３８１８は１０μＭで、Ａ2A受容体及びアデノシントランスポーター（ＥＮＴ１）をそれぞれ５４％及び９６％まで抑制した（図２）。
ＨＤのトランスジェニックマウスモデルにおいて、ハンチントン病（ＨＤ）の主要な症状に対しＪＭＦ３４６４が与える有利な効果
Ａ2AＲ及びＥＮＴ１は線条体に存在し、線条体機能に関与しているので、発明者らは、ＪＭＦ３４６４による長期治療はＨＤの進行を調節するであろうと仮定した。発明者らは、Ａ2AＲアゴニストが有利な効果を有していた、ＨＤのトランスジェニックマウスモデル（Ｒ６／２）におけるＪＭＦ３４６４の効果を試験した。７週齢からのマウスに対するＪＭＦ３４６４（０．１１ｍｇ／ｋｇ／日）の添加は、ロータロッドの成績により評価された進行性の運動協調性の低下を防いだ（図３Ａ）。Ｒ６／２マウスの短縮された寿命も、ＪＭＦ３４６４による持続的な（長期間の）治療によって改善された。
Ａ2AＲ及びＥＮＴ１は線条体に存在し、線条体機能に関与しているので、発明者らは、ＪＭＦ３４６４による長期治療はＨＤの進行を調節するであろうと仮定した。発明者らは、Ａ2AＲアゴニストが有利な効果を有していた、ＨＤのトランスジェニックマウスモデル（Ｒ６／２）におけるＪＭＦ３４６４の効果を試験した。７週齢からのマウスに対するＪＭＦ３４６４（０．１１ｍｇ／ｋｇ／日）の添加は、ロータロッドの成績により評価された進行性の運動協調性の低下を防いだ（図３Ａ）。Ｒ６／２マウスの短縮された寿命も、ＪＭＦ３４６４による持続的な（長期間の）治療によって改善された。
脊髄小脳性運動失調症２型（ＳＣＡ２）に対するＪＭＦ３４６４の有利な効果
プロテアソーム活性を賦活化することは、Ｒ６／２トランスジェニックマウスの変異Ｈｔｔ凝集又は挙動を抑える、Ａ2AＲ受容体のシグナル伝達経路のメカニズムであり得たので（Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．、２０１１ ＰＬｏＳ Ｏｎｅ． ６：ｅ２０９３４； Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．、２０１２ ＰＬｏＳ Ｏｎｅ． ７：ｅ３８８６５）、Ａ2AＲアゴニストはその他のポリグルタミン（ｐｏｌｙＱ）病、例えばＳＣＡ２を緩和するという利点も有し得る可能性がある。実際に、本発明者らのデータは、Ｔ１−１１が変異ＡＴＸＮ２凝集（図４Ａ）及びＳＣＡ２トランスジェニックマウス（ＡＴＡＸＮ２Q127）における挙動（図４Ｂ）の抑制に効果的であることを示し、上述の仮説を支持した。ＪＭＦ３４６４の生物学的利用能がＴ１−１１よりも有意に優れていることを考えれば、発明者らはＪＭＦ３４６４がＳＣＡ２に対する有利な効果ももたらすことになると推論した。
プロテアソーム活性を賦活化することは、Ｒ６／２トランスジェニックマウスの変異Ｈｔｔ凝集又は挙動を抑える、Ａ2AＲ受容体のシグナル伝達経路のメカニズムであり得たので（Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．、２０１１ ＰＬｏＳ Ｏｎｅ． ６：ｅ２０９３４； Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．、２０１２ ＰＬｏＳ Ｏｎｅ． ７：ｅ３８８６５）、Ａ2AＲアゴニストはその他のポリグルタミン（ｐｏｌｙＱ）病、例えばＳＣＡ２を緩和するという利点も有し得る可能性がある。実際に、本発明者らのデータは、Ｔ１−１１が変異ＡＴＸＮ２凝集（図４Ａ）及びＳＣＡ２トランスジェニックマウス（ＡＴＡＸＮ２Q127）における挙動（図４Ｂ）の抑制に効果的であることを示し、上述の仮説を支持した。ＪＭＦ３４６４の生物学的利用能がＴ１−１１よりも有意に優れていることを考えれば、発明者らはＪＭＦ３４６４がＳＣＡ２に対する有利な効果ももたらすことになると推論した。
脊髄小脳性運動失調３型（ＳＣＡ３）に対するＴ１−１１及びそのアナログの有利な効果
野生型マウスと比較して、ビヒクル処置された、ポリグルタミン伸長したアタキシン３−Ｑ７９を発現しているＳＣＡ３トランスジェニックマウスは、約３〜４ヶ月の発症年齢でロータロッドの成績の低下（図５Ａ及び６Ａ）を含む種々の失調症状を呈した。図５Ａ及び６Ａに示すように、Ｔ１−１１（１日当たり１ｍｇ）又はＪＭＦ１９０７（１日当たり１ｍｇ）の連日経口投与により処置された４ヶ月齢のＳＣＡ３トランスジェニックマウスは、有意に改善されたロータロッドの成績を示した。ＳＣＡ３患者と同様に、ＳＣＡ３トランスジェニックマウスの橋核には顕著な神経細胞死がみられた（図５Ｂ及び６Ｂ）。ロータロッドアッセイの結果に従って、Ｔ１−１１（図５Ｂ及び５Ｃ）又はＪＭＦ１９０７（図６Ｂ及び図６Ｃ）の連日経口治療は、ＳＣＡ３トランスジェニックマウスにおける橋神経細胞死を有意に緩和した（図５Ｂ、５Ｃ、６Ｂ及び図６Ｃ）。その結果は、Ｔ１−１１又はＪＭＦ１９０７の持続的な経口治療が、ＳＣＡ３トランスジェニックマウスの神経学的及び神経病理学的な表現型を改善するという証拠を与える。
野生型マウスと比較して、ビヒクル処置された、ポリグルタミン伸長したアタキシン３−Ｑ７９を発現しているＳＣＡ３トランスジェニックマウスは、約３〜４ヶ月の発症年齢でロータロッドの成績の低下（図５Ａ及び６Ａ）を含む種々の失調症状を呈した。図５Ａ及び６Ａに示すように、Ｔ１−１１（１日当たり１ｍｇ）又はＪＭＦ１９０７（１日当たり１ｍｇ）の連日経口投与により処置された４ヶ月齢のＳＣＡ３トランスジェニックマウスは、有意に改善されたロータロッドの成績を示した。ＳＣＡ３患者と同様に、ＳＣＡ３トランスジェニックマウスの橋核には顕著な神経細胞死がみられた（図５Ｂ及び６Ｂ）。ロータロッドアッセイの結果に従って、Ｔ１−１１（図５Ｂ及び５Ｃ）又はＪＭＦ１９０７（図６Ｂ及び図６Ｃ）の連日経口治療は、ＳＣＡ３トランスジェニックマウスにおける橋神経細胞死を有意に緩和した（図５Ｂ、５Ｃ、６Ｂ及び図６Ｃ）。その結果は、Ｔ１−１１又はＪＭＦ１９０７の持続的な経口治療が、ＳＣＡ３トランスジェニックマウスの神経学的及び神経病理学的な表現型を改善するという証拠を与える。
ＪＭＦ３４６４はよりいっそう高い生物学的利用能を有する。それゆえ、ＪＭＦ３４６４は、ＳＣＡ３トランスジェニックマウスにおける変異アタキシン３−Ｑ７９誘導性の運動失調及び神経変性に対する有利な効果ももたらすことが期待された。期待通り、ＪＭＦ３４６４（１日当たり０．３ｍｇ）の連日適用は、ＳＣＡ３トランスジェニックマウスの運動失調（図７Ａ）及び橋神経細胞死（図７Ｂ及び７Ｃ）を緩和した。
筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）に対するＪＭＦ１９０７及びＪＭＦ３４６４の有利な効果
図８Ａ〜Ｂに示すように、４つの異なる投与量（３．７、１．２５、０．５及び０．１ｍｇ／ｋｇ／日）でＪＭＦ１９０７を与えられたトランスジェニックマウスは、ロータロッド及び握力試験において、対照マウスよりも有意に優れた成績を収めた。１．２５ｍｇ／ｋｇの投与量は最も優れた利点を示した。これらのデータは運動機能の明らかな改善を示した。Ｔ１−１１及びＪＭＦ１９０７のアナログであるＪＭＦ３４６４は、よりいっそう高い生物学的利用能を有する。それゆえ、ＪＭＦ３４６４はＡＬＳマウスにおいて有利な効果をもたらすことが期待された。ＮＳＣ３４細胞をＪＭＦ３４６４で処理することは、ＡＭＰＫ活性化により引き起こされるＴＤＰ−４３の誤った非局在化を正常化し（図９）、そのことは、ＪＭＦ３４６４がＡＬＳ発症の初期段階を抑制することができるという考えを支持する。これらの発見は、ＪＭＦ３４６４がＡＬＳに対する有利な効果を示すということを支持する。
図８Ａ〜Ｂに示すように、４つの異なる投与量（３．７、１．２５、０．５及び０．１ｍｇ／ｋｇ／日）でＪＭＦ１９０７を与えられたトランスジェニックマウスは、ロータロッド及び握力試験において、対照マウスよりも有意に優れた成績を収めた。１．２５ｍｇ／ｋｇの投与量は最も優れた利点を示した。これらのデータは運動機能の明らかな改善を示した。Ｔ１−１１及びＪＭＦ１９０７のアナログであるＪＭＦ３４６４は、よりいっそう高い生物学的利用能を有する。それゆえ、ＪＭＦ３４６４はＡＬＳマウスにおいて有利な効果をもたらすことが期待された。ＮＳＣ３４細胞をＪＭＦ３４６４で処理することは、ＡＭＰＫ活性化により引き起こされるＴＤＰ−４３の誤った非局在化を正常化し（図９）、そのことは、ＪＭＦ３４６４がＡＬＳ発症の初期段階を抑制することができるという考えを支持する。これらの発見は、ＪＭＦ３４６４がＡＬＳに対する有利な効果を示すということを支持する。
疼痛に対するＪＭＦ３４６４の有利な効果
Ｔ１−１１（ｉ．ｐ．）は、線維筋痛の２つのマウスモデル（酸誘発性慢性広範痛及び間欠的寒冷ストレスモデル）に対して優れた鎮痛効果を示したが、その生物学的利用能は非常に低い。Ｔ１−１１（最大２ｍｇ／ｋｇまで）の経口投与は、マウスが筋肉内酸注射及びゲニステイン処置後に線維筋痛様の疼痛を発症した、酸誘発性慢性広範痛モデルに対して鎮痛効果を示さなかった（図１０Ａ）。Ｔ１−１１のアナログであるＪＭＦ３４６４は、マウスが間欠的寒冷ストレスで２日間処理された後に慢性広範痛を発症した、線維筋痛のマウスモデルに対する鎮痛効果を示した（図１０Ｂ）。その優れた生物学的利用能と一致して、ＪＭＦ３４６４（１ｍｇ／ｋｇ）の経口投与は間欠的寒冷ストレスモデルに対する鎮痛効果を示した（図１０Ｃ）。
Ｔ１−１１（ｉ．ｐ．）は、線維筋痛の２つのマウスモデル（酸誘発性慢性広範痛及び間欠的寒冷ストレスモデル）に対して優れた鎮痛効果を示したが、その生物学的利用能は非常に低い。Ｔ１−１１（最大２ｍｇ／ｋｇまで）の経口投与は、マウスが筋肉内酸注射及びゲニステイン処置後に線維筋痛様の疼痛を発症した、酸誘発性慢性広範痛モデルに対して鎮痛効果を示さなかった（図１０Ａ）。Ｔ１−１１のアナログであるＪＭＦ３４６４は、マウスが間欠的寒冷ストレスで２日間処理された後に慢性広範痛を発症した、線維筋痛のマウスモデルに対する鎮痛効果を示した（図１０Ｂ）。その優れた生物学的利用能と一致して、ＪＭＦ３４６４（１ｍｇ／ｋｇ）の経口投与は間欠的寒冷ストレスモデルに対する鎮痛効果を示した（図１０Ｃ）。
実施例１
すべての試薬及び溶媒は試薬グレードであり、別段明示しない限りさらなる精製なしに用いられた。テトラヒドロフラン及びジエチルエーテルをＮａ／ベンゾフェノンで蒸留し、ＣＨ2Ｃｌ2をＣａＨ2で蒸留した。すべての空気感受性又は感湿性の実験はアルゴン下で行った。全てのガラスを２時間超、乾燥器で乾燥させ、デシケーター中で室温まで冷却した後に使用した。マイクロ波反応を、フォーカスドシングルモードマイクロ波装置（ＣＥＭディスカバー（ＣＥＭ Ｄｉｓｃｏｖｅｒ））を用いて行った。当該装置はオペレータが選択可能な電力出力で、連続的にフォーカスされるマイクロ波電力伝送システムからなる。
すべての試薬及び溶媒は試薬グレードであり、別段明示しない限りさらなる精製なしに用いられた。テトラヒドロフラン及びジエチルエーテルをＮａ／ベンゾフェノンで蒸留し、ＣＨ2Ｃｌ2をＣａＨ2で蒸留した。すべての空気感受性又は感湿性の実験はアルゴン下で行った。全てのガラスを２時間超、乾燥器で乾燥させ、デシケーター中で室温まで冷却した後に使用した。マイクロ波反応を、フォーカスドシングルモードマイクロ波装置（ＣＥＭディスカバー（ＣＥＭ Ｄｉｓｃｏｖｅｒ））を用いて行った。当該装置はオペレータが選択可能な電力出力で、連続的にフォーカスされるマイクロ波電力伝送システムからなる。
融点をヤナコマイクロ装置（Ｙａｎａｃｏ ｍｉｃｒｏ ａｐｐａｒａｔｕｓ）で記録した。旋光度を日本の日本分光株式会社（ＪＡＳＣＯ Ｃｏ．）のＤＩＰ−１０００のデジタル旋光計で測定した。［α］D値を１０-1ｄｅｇ ｃｍ2 ｇ-1の単位で示した。赤外（ＩＲ）スペクトルをＮｉｃｏｌｅｔ Ｍａｇｎａ ５５０−ＩＩで記録した。ＮＭＲスペクトルをＶａｒｉａｎ Ｕｎｉｔｙ Ｐｌｕｓ−４００（４００ ＭＨｚ）で得て、化学シフト（δ）を、ＣＨＣｌ3／ＣＤＣｌ3についてはδH ７．２４／ δC ７７．０（ｔの中心線）、（ＣＨ3）2ＣＯ／（ＣＤ3）2ＣＯについてはδH ２．０５／ δC ２９．９２、ＣＨ3ＯＨ／ＣＤ3ＯＤについてはδH ３．３１／ δC ４９．０、そして（ＣＨ3）2ＳＯ／（ＣＤ3）2ＳＯについてはδH ２．４９（ｍ）／δC ３９．５（ｍ）と比較して、百万分率（ｐｐｍ）で記録した。分裂パターンを、ｓ（シングレット）、ｄ（ダブレット）、ｔ（トリプレット）、ｑ（カルテット）、ｍ（マルチプレット）及びｂｒ（ブロード）として報告する。結合定数（Ｊ）をＨｚで示す。ＥＳＩ−ＭＳ実験をＢｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ ＢｉｏＴＯＦ ＩＩＩ高分解能質量分析計で行った。分析用薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を、Ｅ．メルク（Ｅ．Ｍｅｒｃｋ）のシリカゲル６０ Ｆ254プレート（０．２５ｍｍ）で行った。化合物をＵＶ、アニスアルデヒド又はニンヒドリンスプレーにより可視化した。カラムクロマトグラフィーを７０〜２３０メッシュのシリカゲルを充填したカラムで行った。
化合物の純度を、ＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ ＨＰ−１１００）により、２８０ｎｍの波長における検出で、≧９５％であると評価した。
２’，３’−Ｏ−イソプロピリデン−５’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）アデノシン（５）
氷浴中で冷却した、２’，３’−（Ｏ−イソプロピリデン）アデノシン（４、６１４ｍｇ、２．００ｍｍｏｌ）及びイミダゾール（４０８ｍｇ、６ｍｍｏｌ）の無水ＣＨ2Ｃｌ2（１２ｍＬ）溶液に、０℃、Ｎ2の雰囲気下で、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルクロリド（ＴＢＤＭＳＣｌ、４５２ｍｇ、３ｍｍｏｌ）を加えた。氷浴を除去し、混合物を１２時間室温で撹拌した。メタノール（４ｍＬ）を添加し、混合物をさらに１５分間撹拌し、その後、減圧下でロータリーエバポレーションにより濃縮した。固体残渣をＣＨ2Ｃｌ2に溶解させ、１ＭのＨＣｌ、脱イオン水及び飽和食塩水で連続的に洗浄した。有機層を回収し、ＭｇＳＯ4上で乾燥させて、ろ過した。ろ液を減圧下で濃縮して、化合物５を白色の固体として得た（８１９ｍｇ、１．５７ｍｍｏｌ、７８％収率）。
氷浴中で冷却した、２’，３’−（Ｏ−イソプロピリデン）アデノシン（４、６１４ｍｇ、２．００ｍｍｏｌ）及びイミダゾール（４０８ｍｇ、６ｍｍｏｌ）の無水ＣＨ2Ｃｌ2（１２ｍＬ）溶液に、０℃、Ｎ2の雰囲気下で、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルクロリド（ＴＢＤＭＳＣｌ、４５２ｍｇ、３ｍｍｏｌ）を加えた。氷浴を除去し、混合物を１２時間室温で撹拌した。メタノール（４ｍＬ）を添加し、混合物をさらに１５分間撹拌し、その後、減圧下でロータリーエバポレーションにより濃縮した。固体残渣をＣＨ2Ｃｌ2に溶解させ、１ＭのＨＣｌ、脱イオン水及び飽和食塩水で連続的に洗浄した。有機層を回収し、ＭｇＳＯ4上で乾燥させて、ろ過した。ろ液を減圧下で濃縮して、化合物５を白色の固体として得た（８１９ｍｇ、１．５７ｍｍｏｌ、７８％収率）。
６−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−２’，３’−Ｏ−イソプロピリデン−５’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）アデノシン（６）
化合物５（８１９ｍｇ、１．５７ｍｍｏｌ）及び４−（ジメチルアミノ）ピリジン（ＤＭＡＰ、触媒量）の無水ＴＨＦ（１０ｍＬ）溶液を２分間、Ｎ2下で撹拌した。該溶液を氷浴中で冷却し、二炭酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（（Ｂｏｃ）2Ｏ、１．０８ｍＬ、４．７１ｍｍｏｌ）を滴下した。氷浴を除去し、混合物を１２時間室温で撹拌した。反応が完了した後、混合物を減圧下でロータリーエバポレーションにより濃縮した。粗生成物をＣＨ2Ｃｌ2に溶解させ、１ＭのＨＣｌ、脱イオン水及び飽和食塩水で首尾よく洗浄した。有機層を回収し、ＭｇＳＯ4上で乾燥させ、ろ過した。ろ液を減圧下で濃縮して、ビス−Ｂｏｃ化合物を淡黄色の泡沫としてを得た（８５９ｍｇ、１．３８ｍｍｏｌ、８７％収率）。
化合物５（８１９ｍｇ、１．５７ｍｍｏｌ）及び４−（ジメチルアミノ）ピリジン（ＤＭＡＰ、触媒量）の無水ＴＨＦ（１０ｍＬ）溶液を２分間、Ｎ2下で撹拌した。該溶液を氷浴中で冷却し、二炭酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（（Ｂｏｃ）2Ｏ、１．０８ｍＬ、４．７１ｍｍｏｌ）を滴下した。氷浴を除去し、混合物を１２時間室温で撹拌した。反応が完了した後、混合物を減圧下でロータリーエバポレーションにより濃縮した。粗生成物をＣＨ2Ｃｌ2に溶解させ、１ＭのＨＣｌ、脱イオン水及び飽和食塩水で首尾よく洗浄した。有機層を回収し、ＭｇＳＯ4上で乾燥させ、ろ過した。ろ液を減圧下で濃縮して、ビス−Ｂｏｃ化合物を淡黄色の泡沫としてを得た（８５９ｍｇ、１．３８ｍｍｏｌ、８７％収率）。
ビス−Ｂｏｃ化合物（４００ｍｇ、０．６４ｍｍｏｌ）のメタノール（８ｍＬ）溶液に、メチルアミン（０．２５ｍＬの４０％メタノール溶液、２．５４ｍｍｏｌ）を添加した。混合物をＴＬＣ分析が出発物質の完全な消費を示すまで、室温で２０時間撹拌した。混合物を減圧下でロータリーエバポレーションにより濃縮した。粗生成物を、ＥｔＯＡｃ／ヘキサン（０：１から２：１のグラジエント）の溶出を用いたシリカゲルカラムのクロマトグラフィーによって精製して、化合物６を淡黄色の油として得た（３００ｍｇ、０．５７ｍｍｏｌ、８８％収率）。
６−Ｎ−（５−ブロモチエン−２−イル）メチル−６−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−２’，３’−Ｏ−イソプロピリデン−５’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）アデノシン（８、Ｘ＝５−Ｂｒ）
化合物６（３００ｍｇ、０．５７ｍｍｏｌ）、（５−ブロモチエン−２−イル）メタノール（１６４ｍｇ、０．８５ｍｍｏｌ）、及びトリフェニルホスフィン（２２６ｍｇ、０．８５ｍｍｏｌ）の、無水ＴＨＦ（９ｍＬ）溶液を４５℃で２分間、Ｎ2の雰囲気下で撹拌した。アゾジカルボン酸ジイソプロピル（ＤＩＡＤ、０．１６８ｍＬ、０．８５ｍｍｏｌ）を滴下した。ＴＬＣ分析が化合物６の消失を示すまで、混合物をさらに４５分間撹拌した。混合物を減圧下でロータリーエバポレーションにより濃縮した。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン＝１：９）により精製して、化合物８（Ｘ＝５−Ｂｒ）を淡黄色の油として得た。
化合物６（３００ｍｇ、０．５７ｍｍｏｌ）、（５−ブロモチエン−２−イル）メタノール（１６４ｍｇ、０．８５ｍｍｏｌ）、及びトリフェニルホスフィン（２２６ｍｇ、０．８５ｍｍｏｌ）の、無水ＴＨＦ（９ｍＬ）溶液を４５℃で２分間、Ｎ2の雰囲気下で撹拌した。アゾジカルボン酸ジイソプロピル（ＤＩＡＤ、０．１６８ｍＬ、０．８５ｍｍｏｌ）を滴下した。ＴＬＣ分析が化合物６の消失を示すまで、混合物をさらに４５分間撹拌した。混合物を減圧下でロータリーエバポレーションにより濃縮した。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン＝１：９）により精製して、化合物８（Ｘ＝５−Ｂｒ）を淡黄色の油として得た。
Ｎ6−［（５−ブロモチエン−２−イル）メチル］アデノシン（ＪＭＦ３４６４）
方法Ａ：脱イオン水（５ｍＬ）及びＴＨＦ（１ｍＬ）中の、化合物８の懸濁液（Ｘ＝５−Ｂｒ、１３８ｍｇ、０．１９ｍｍｏｌ）を撹拌し、氷浴中で冷却した。トリフルオロ酢酸（Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｔｅｔｉｃ ａｃｉｄ）（５ｍＬ）を０℃で滴下した。混合物を１０分間撹拌し、氷浴を除去して、混合物をさらに３０分間撹拌した。混合物を減圧下でロータリーエバポレーションにより濃縮した。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（ＭｅＯＨ／ＥｔＯＡｃ＝１：４９）により精製して、ＪＭＦ３４６４（化合物１）を白色の粉末として得た。
方法Ａ：脱イオン水（５ｍＬ）及びＴＨＦ（１ｍＬ）中の、化合物８の懸濁液（Ｘ＝５−Ｂｒ、１３８ｍｇ、０．１９ｍｍｏｌ）を撹拌し、氷浴中で冷却した。トリフルオロ酢酸（Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｔｅｔｉｃ ａｃｉｄ）（５ｍＬ）を０℃で滴下した。混合物を１０分間撹拌し、氷浴を除去して、混合物をさらに３０分間撹拌した。混合物を減圧下でロータリーエバポレーションにより濃縮した。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（ＭｅＯＨ／ＥｔＯＡｃ＝１：４９）により精製して、ＪＭＦ３４６４（化合物１）を白色の粉末として得た。
方法Ｂ：１−プロパノール（２０ｍＬ）中の、（５−ブロモチエン−２−イル）メタンアミン（７６８ｍｇ、４ｍｍｏｌ）、６−クロロプリンリボフラノシド（１４３ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）、及びジイソプロピルエチルアミン（２ｍＬ、１２ｍｍｏｌ）の混合物を７０℃で７時間加熱した。所望の生成物及び未反応の（５−ブロモチエン−２−イル）メタンアミンを含む混合物を室温で２時間、ＴＨＦ（６ｍＬ）中の二炭酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（０．９２ｍＬ、４ｍｍｏｌ）、及びＮａＨＣＯ3（６７２ｍｇ、８ｍｍｏｌ）により処理した。混合物をロータリーエバポレーションにより濃縮し、フラッシュクロマトグラフィーにより精製した（シリカゲル、ＭｅＯＨ／ＥｔＯＡｃ＝１：９）。所望の生成物ＪＭＦ３４６４（５９ｍｇ、２７％収率）をＭｅＯＨからの再結晶によって得た。５０％の含水ＭｅＯＨのグラジエントの溶出を用いたＨＣ−Ｃ１８カラム（アジレント（Ａｇｉｌｅｎｔ）、４．６×２５０ｍｍ、５μｍ）のＨＰＬＣによって示されるように、生成物の純度は９６％であった。
方法Ｃ：封管（１５ｍＬ）に、ＥｔＯＨ（８ｍＬ）中、（５−ブロモチエン−２−イル）メタンアミン（３８４ｍｇ、２ｍｍｏｌ）、６−クロロプリンリボフラノシド（２８７ｍｇ、１ｍｍｏｌ）、及びジイソプロピルエチルアミン（３ｍＬ、１７ｍｍｏｌ）を加えた。封管を、フォーカスドモノモードマイクロ波反応装置（ＣＥＭ Ｄｉｓｃｏｖｅｒ）のキャビティ内に置き、２０分間８０℃、１００Ｗで照射した。溶媒をロータリーエバポレーションにより除去した。残渣をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＭｅＯＨ／ＥｔＯＡｃ＝１：９）により精製し、ＭｅＯＨから再結晶して、所望の生成物ＪＭＦ３４６４を得た（１５９ｍｇ、３６％収率）。
Ｃ15Ｈ16ＢｒＮ5Ｏ4Ｓ；黄色粉末； ｍｐ １４１．４-１４１．７ ℃； ［α］25 D＝-４３．０（ＤＭＳＯ、ｃ＝１．０）； ＴＬＣ（２−プロパノール／ヘキサン（２：３））Ｒf＝０．３８； 1Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6、４００ ＭＨｚ）δ ８．５５（１ Ｈ、ｂｒ ｓ）、８．４０（１ Ｈ、ｓ）、８．２９（１ Ｈ、ｂｒ ｓ）、７．０３（１ Ｈ、ｄ、Ｊ＝３．６ Ｈｚ）、６．７８（１ Ｈ、ｄ、Ｊ＝４．０ Ｈｚ）、５．９０（１ Ｈ、ｄ、Ｊ＝６．０ Ｈｚ）、５．４５（１ Ｈ、ｄ、Ｊ＝６．０ Ｈｚ）、５．３４-５．３２（１ Ｈ、ｍ）、５．１９（１ Ｈ、ｄ、Ｊ＝４．４ Ｈｚ）、４．７６（２ Ｈ、ｓ）、４．６３-４．５９（１ Ｈ、ｍ）、４．１５-４．１４（１ Ｈ、ｍ）、３．９６-３．９５（１ Ｈ、ｍ）、３．６９-３．６５（１ Ｈ、ｍ）、３．５７-３．５２（１ Ｈ、ｍ）、13Ｃ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6、１００ ＭＨｚ）δ １５３．９、１５２．２、１４８．５、１４５．０、１４０．２、１２９．６、１２６．３、１２０．０、１０９．７、８７．９、８５．８、７３．５、７０．６、６１．６、４２．９、ＥＳＩ−ＭＳ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ15Ｈ17ＢｒＮ5Ｏ4Ｓ：４４２．０１８５、ｆｏｕｎｄ：ｍ／ｚ ４４２．０１８９ ［Ｍ ＋ Ｈ］+。
Ｎ6−（チエン−３−イル−メチル）アデノシン（ＪＭＦ３４６１）
１−プロパノール（２５ｍＬ）中の、３−（アミノメチル）チオフェン（０．２５ｍＬ、２．５ｍｍｏｌ）、６−クロロプリンリボフラノシド（１４３ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）、及びジイソプロピルエチルアミン（２ｍＬ、１２ｍｍｏｌ）の混合物を８０℃で６時間加熱した。混合物をロータリーエバポレーションにより濃縮し、ＭｅＯＨから再結晶して、所望の生成物ＪＭＦ３４６１を得た（１３６ｍｇ、７５％収率）。５０％の含水ＭｅＯＨのグラジエントの溶出を用いたＨＣ−Ｃ１８カラム（アジレント、４．６×２５０ｍｍ、５μｍ）のＨＰＬＣによって示されるように、生成物の純度は９９％であった。Ｃ15Ｈ17Ｎ5Ｏ4Ｓ；黄色粉末； ｍｐ １３４．３-１３５．１ ℃； ［α］24 D＝-５８．６（ＤＭＳＯ、ｃ＝１．０）； ＴＬＣ（２−プロパノール／ヘキサン，（２：３））Ｒf＝０．３３； 1Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6、４００ ＭＨｚ）δ ８．３６（２ Ｈ、ｂｒ ｓ）、８．２２（１ Ｈ、ｓ）、７．４３（１ Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝３、５ Ｈｚ）、７．２８（１ Ｈ、ｄ、Ｊ＝１．６ Ｈｚ）、７．０９（１ Ｈ、ｄ、Ｊ＝４．８ Ｈｚ）、５．８８（１ Ｈ、ｄ、Ｊ＝６．４ Ｈｚ）、５．４３（１ Ｈ、ｄ、Ｊ＝６．０ Ｈｚ）、５．３８（１ Ｈ、ｑ、Ｊ＝４．６ Ｈｚ）、５．１７（１ Ｈ、ｄ、Ｊ＝４．４ Ｈｚ）、４．６９（２ Ｈ、ｓ）、４．６３-４．１６（１ Ｈ、ｍ）、４．１４-４．１３（１ Ｈ、ｍ）、３．９７-３．９５（１ Ｈ、ｍ）、３．６９-３．６４（１ Ｈ、ｍ）、３．５７-３．５２（１ Ｈ、ｍ）、13Ｃ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6、１００ ＭＨｚ）δ １５４．４、１５２．３、１４８．５、１４０．８、１３９．９、１２７．９、１２５．１、１２０．０、１１９．８、８７．９、８５．９、７３．５、７０．７、６１．７、４２．９； ＥＳＩ−ＭＳ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ15Ｈ18Ｎ5Ｏ4Ｓ：３６４．１０８０、ｆｏｕｎｄ：ｍ／ｚ ３６４．１０７９ ［Ｍ ＋ Ｈ］+。
１−プロパノール（２５ｍＬ）中の、３−（アミノメチル）チオフェン（０．２５ｍＬ、２．５ｍｍｏｌ）、６−クロロプリンリボフラノシド（１４３ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）、及びジイソプロピルエチルアミン（２ｍＬ、１２ｍｍｏｌ）の混合物を８０℃で６時間加熱した。混合物をロータリーエバポレーションにより濃縮し、ＭｅＯＨから再結晶して、所望の生成物ＪＭＦ３４６１を得た（１３６ｍｇ、７５％収率）。５０％の含水ＭｅＯＨのグラジエントの溶出を用いたＨＣ−Ｃ１８カラム（アジレント、４．６×２５０ｍｍ、５μｍ）のＨＰＬＣによって示されるように、生成物の純度は９９％であった。Ｃ15Ｈ17Ｎ5Ｏ4Ｓ；黄色粉末； ｍｐ １３４．３-１３５．１ ℃； ［α］24 D＝-５８．６（ＤＭＳＯ、ｃ＝１．０）； ＴＬＣ（２−プロパノール／ヘキサン，（２：３））Ｒf＝０．３３； 1Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6、４００ ＭＨｚ）δ ８．３６（２ Ｈ、ｂｒ ｓ）、８．２２（１ Ｈ、ｓ）、７．４３（１ Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝３、５ Ｈｚ）、７．２８（１ Ｈ、ｄ、Ｊ＝１．６ Ｈｚ）、７．０９（１ Ｈ、ｄ、Ｊ＝４．８ Ｈｚ）、５．８８（１ Ｈ、ｄ、Ｊ＝６．４ Ｈｚ）、５．４３（１ Ｈ、ｄ、Ｊ＝６．０ Ｈｚ）、５．３８（１ Ｈ、ｑ、Ｊ＝４．６ Ｈｚ）、５．１７（１ Ｈ、ｄ、Ｊ＝４．４ Ｈｚ）、４．６９（２ Ｈ、ｓ）、４．６３-４．１６（１ Ｈ、ｍ）、４．１４-４．１３（１ Ｈ、ｍ）、３．９７-３．９５（１ Ｈ、ｍ）、３．６９-３．６４（１ Ｈ、ｍ）、３．５７-３．５２（１ Ｈ、ｍ）、13Ｃ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6、１００ ＭＨｚ）δ １５４．４、１５２．３、１４８．５、１４０．８、１３９．９、１２７．９、１２５．１、１２０．０、１１９．８、８７．９、８５．９、７３．５、７０．７、６１．７、４２．９； ＥＳＩ−ＭＳ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ15Ｈ18Ｎ5Ｏ4Ｓ：３６４．１０８０、ｆｏｕｎｄ：ｍ／ｚ ３６４．１０７９ ［Ｍ ＋ Ｈ］+。
Ｎ6−（チエン−２−イル−メチル）アデノシン（ＪＭＦ３４６２）
１−プロパノール（２５ｍＬ）中の、２−（アミノメチル）チオフェン（０．２５ｍＬ、２．５ｍｍｏｌ）、６−クロロプリンリボフラノシド（１４３ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）、及びジイソプロピルエチルアミン（２ｍＬ、１２ｍｍｏｌ）の混合物を８０℃で７時間加熱した。混合物をロータリーエバポレーションにより濃縮し、ＭｅＯＨから再結晶して、所望の生成物ＪＭＦ３４６２を得た（１５４ｍｇ、８５％収率）。５０％の含水ＭｅＯＨのグラジエントの溶出を用いたＨＣ−Ｃ１８カラム（アジレント、４．６×２５０ｍｍ、５μｍ）のＨＰＬＣによって示されるように、生成物の純度は９９％であった。Ｃ15Ｈ17Ｎ5Ｏ4Ｓ；白色粉末； ｍｐ １４９．２-１４９．７ ℃； ［α］25 D＝-６８．２（ＤＭＳＯ、ｃ＝１．０）； ＴＬＣ（２−プロパノール／ヘキサン，（２：３））Ｒf＝０．３５； 1Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6、４００ ＭＨｚ）δ ８．５１（１ Ｈ、ｂｒ ｓ）、８．３９（１ Ｈ、ｓ）、８．２７（１ Ｈ、ｂｒ ｓ）、７．３２（１ Ｈ、ｄ、Ｊ＝５．２ Ｈｚ）、７．２８（１ Ｈ、ｄ、Ｊ＝３．２ Ｈｚ）、６．９３（１ Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝１．８、２．６ Ｈｚ）、５．８９（１ Ｈ、ｄ、Ｊ＝６．０ Ｈｚ）、５．４６-５．４５（１ Ｈ、ｍ）、５．３６（１ Ｈ、ｑ、Ｊ＝４．６ Ｈｚ）、５．２０-５．１８（１ Ｈ、ｍ）、４．６４（２ Ｈ、ｓ）、４．１６-４．１３（１ Ｈ、ｍ）、３．９７-３．９５（１ Ｈ、ｍ）、３．７０-３．６５（１ Ｈ、ｍ）、３．５８-３．５２（１ Ｈ、ｍ）、３．５７-３．５２（１ Ｈ、ｍ）、13Ｃ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6、１００ ＭＨｚ）δ １５４．１、１５２．２、１４８．５、１４２．９、１４０．０、１２６．５、１２５．３、１２４．７、１２０．０、８７．９、８５．９、７３．５、７０．６、６１．６、４２．９； ＥＳＩ−ＭＳ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ15Ｈ18Ｎ5Ｏ4Ｓ：３６４．１０８０、ｆｏｕｎｄ：ｍ／ｚ ３６４．１０８１ ［Ｍ ＋ Ｈ］+。
１−プロパノール（２５ｍＬ）中の、２−（アミノメチル）チオフェン（０．２５ｍＬ、２．５ｍｍｏｌ）、６−クロロプリンリボフラノシド（１４３ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）、及びジイソプロピルエチルアミン（２ｍＬ、１２ｍｍｏｌ）の混合物を８０℃で７時間加熱した。混合物をロータリーエバポレーションにより濃縮し、ＭｅＯＨから再結晶して、所望の生成物ＪＭＦ３４６２を得た（１５４ｍｇ、８５％収率）。５０％の含水ＭｅＯＨのグラジエントの溶出を用いたＨＣ−Ｃ１８カラム（アジレント、４．６×２５０ｍｍ、５μｍ）のＨＰＬＣによって示されるように、生成物の純度は９９％であった。Ｃ15Ｈ17Ｎ5Ｏ4Ｓ；白色粉末； ｍｐ １４９．２-１４９．７ ℃； ［α］25 D＝-６８．２（ＤＭＳＯ、ｃ＝１．０）； ＴＬＣ（２−プロパノール／ヘキサン，（２：３））Ｒf＝０．３５； 1Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6、４００ ＭＨｚ）δ ８．５１（１ Ｈ、ｂｒ ｓ）、８．３９（１ Ｈ、ｓ）、８．２７（１ Ｈ、ｂｒ ｓ）、７．３２（１ Ｈ、ｄ、Ｊ＝５．２ Ｈｚ）、７．２８（１ Ｈ、ｄ、Ｊ＝３．２ Ｈｚ）、６．９３（１ Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝１．８、２．６ Ｈｚ）、５．８９（１ Ｈ、ｄ、Ｊ＝６．０ Ｈｚ）、５．４６-５．４５（１ Ｈ、ｍ）、５．３６（１ Ｈ、ｑ、Ｊ＝４．６ Ｈｚ）、５．２０-５．１８（１ Ｈ、ｍ）、４．６４（２ Ｈ、ｓ）、４．１６-４．１３（１ Ｈ、ｍ）、３．９７-３．９５（１ Ｈ、ｍ）、３．７０-３．６５（１ Ｈ、ｍ）、３．５８-３．５２（１ Ｈ、ｍ）、３．５７-３．５２（１ Ｈ、ｍ）、13Ｃ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6、１００ ＭＨｚ）δ １５４．１、１５２．２、１４８．５、１４２．９、１４０．０、１２６．５、１２５．３、１２４．７、１２０．０、８７．９、８５．９、７３．５、７０．６、６１．６、４２．９； ＥＳＩ−ＭＳ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ15Ｈ18Ｎ5Ｏ4Ｓ：３６４．１０８０、ｆｏｕｎｄ：ｍ／ｚ ３６４．１０８１ ［Ｍ ＋ Ｈ］+。
Ｎ6−［（４−ブロモチエン−２−イル）メチル］アデノシン
１−プロパノール（３０ｍＬ）中の、（４−ブロモチエン−２−イル）メタンアミン（１１５２ｍｇ、６ｍｍｏｌ）、６−クロロプリンリボフラノシド（２１４ｍｇ、０．７５ｍｍｏｌ）、及びジイソプロピルエチルアミン（３ｍＬ、１８ｍｍｏｌ）の混合物を７０℃で７時間加熱した。所望の生成物及び未反応の（３−ブロモチエン−２−イル）メタンアミンを含む混合物を室温で２時間、ＴＨＦ（８ｍＬ）中の二炭酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（１．４ｍＬ、６ｍｍｏｌ）、及びＮａＨＣＯ3（１ｇ、１．２ｍｍｏｌ）により処理した。混合物をロータリーエバポレーションにより濃縮し、フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＭｅＯＨ／ＥｔＯＡｃ＝１：９）により精製して、Ｎ6−［（４−ブロモチエン−２−イル）メチル］アデノシンを得た。
１−プロパノール（３０ｍＬ）中の、（４−ブロモチエン−２−イル）メタンアミン（１１５２ｍｇ、６ｍｍｏｌ）、６−クロロプリンリボフラノシド（２１４ｍｇ、０．７５ｍｍｏｌ）、及びジイソプロピルエチルアミン（３ｍＬ、１８ｍｍｏｌ）の混合物を７０℃で７時間加熱した。所望の生成物及び未反応の（３−ブロモチエン−２−イル）メタンアミンを含む混合物を室温で２時間、ＴＨＦ（８ｍＬ）中の二炭酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（１．４ｍＬ、６ｍｍｏｌ）、及びＮａＨＣＯ3（１ｇ、１．２ｍｍｏｌ）により処理した。混合物をロータリーエバポレーションにより濃縮し、フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＭｅＯＨ／ＥｔＯＡｃ＝１：９）により精製して、Ｎ6−［（４−ブロモチエン−２−イル）メチル］アデノシンを得た。
Ｎ6−［（３−ブロモチエン−２−イル）メチル］アデノシン
封管（１５ｍＬ）に、ＥｔＯＨ（１０ｍＬ）中、（３−ブロモチエン−２−イル）メタンアミン（５７６ｍｇ、３ｍｍｏｌ）、６−クロロプリンリボフラノシド（４３０ｍｇ、１．５ｍｍｏｌ）、及びジイソプロピルエチルアミン（４．５ｍＬ、１５．５ｍｍｏｌ）を加えた。封管を、フォーカスドモノモードマイクロ波反応装置（ＣＥＭ Ｄｉｓｃｏｖｅｒ）のキャビティ内に置き、２０分間８０℃、１００Ｗで照射した。溶媒をロータリーエバポレーションにより除去した。残渣をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＭｅＯＨ／ＥｔＯＡｃ＝１：９）により精製して、Ｎ6−［（３−ブロモチエン−２−イル）メチル］アデノシンを得た。
封管（１５ｍＬ）に、ＥｔＯＨ（１０ｍＬ）中、（３−ブロモチエン−２−イル）メタンアミン（５７６ｍｇ、３ｍｍｏｌ）、６−クロロプリンリボフラノシド（４３０ｍｇ、１．５ｍｍｏｌ）、及びジイソプロピルエチルアミン（４．５ｍＬ、１５．５ｍｍｏｌ）を加えた。封管を、フォーカスドモノモードマイクロ波反応装置（ＣＥＭ Ｄｉｓｃｏｖｅｒ）のキャビティ内に置き、２０分間８０℃、１００Ｗで照射した。溶媒をロータリーエバポレーションにより除去した。残渣をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＭｅＯＨ／ＥｔＯＡｃ＝１：９）により精製して、Ｎ6−［（３−ブロモチエン−２−イル）メチル］アデノシンを得た。
Ｎ6−［（２−ブロモチエン−３−イル）メチル］アデノシン
封管（１５ｍＬ）に、ＥｔＯＨ（８ｍＬ）中、（２−ブロモチエン−３−イル）メタンアミン（３８４ｍｇ、２ｍｍｏｌ）、６−クロロプリンリボフラノシド（２８７ｍｇ、１ｍｍｏｌ）、及びジイソプロピルエチルアミン（３ｍＬ、１７ｍｍｏｌ）を加えた。封管を、フォーカスドモノモードマイクロ波反応装置（ＣＥＭ Ｄｉｓｃｏｖｅｒ）のキャビティ内に置き、２０分間８０℃、１００Ｗで照射した 溶媒をロータリーエバポレーションにより除去した。残渣をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＭｅＯＨ／ＥｔＯＡｃ＝１：９）により精製して、Ｎ6−［（２−ブロモチエン−３−イル）メチル］アデノシンを得た。
封管（１５ｍＬ）に、ＥｔＯＨ（８ｍＬ）中、（２−ブロモチエン−３−イル）メタンアミン（３８４ｍｇ、２ｍｍｏｌ）、６−クロロプリンリボフラノシド（２８７ｍｇ、１ｍｍｏｌ）、及びジイソプロピルエチルアミン（３ｍＬ、１７ｍｍｏｌ）を加えた。封管を、フォーカスドモノモードマイクロ波反応装置（ＣＥＭ Ｄｉｓｃｏｖｅｒ）のキャビティ内に置き、２０分間８０℃、１００Ｗで照射した 溶媒をロータリーエバポレーションにより除去した。残渣をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＭｅＯＨ／ＥｔＯＡｃ＝１：９）により精製して、Ｎ6−［（２−ブロモチエン−３−イル）メチル］アデノシンを得た。
Ｎ6−［（４−ブロモチエン−３−イル）メチル］アデノシン
１−プロパノール（２０ｍＬ）中、（４−ブロモチエン−３−イル）メタンアミン（７６８ｍｇ、４ｍｍｏｌ）、６−クロロプリンリボフラノシド（１４３ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）、及びジイソプロピルエチルアミン（２ｍＬ、１２ｍｍｏｌ）の混合物を７０℃で７時間加熱した。所望の生成物及び未反応の（４−ブロモチエン−３−イル）メタンアミンを含む混合物を室温で２時間、ＴＨＦ（６ｍＬ）中の二炭酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（０．９２ｍＬ、４ｍｍｏｌ）、及びＮａＨＣＯ3（６７２ｍｇ、８ｍｍｏｌ）により処理した。混合物をロータリーエバポレーションにより濃縮し、フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＭｅＯＨ／ＥｔＯＡｃ＝１：９）により精製して、Ｎ6−［（４−ブロモチエン−３−イル）メチル］アデノシンを得た。
１−プロパノール（２０ｍＬ）中、（４−ブロモチエン−３−イル）メタンアミン（７６８ｍｇ、４ｍｍｏｌ）、６−クロロプリンリボフラノシド（１４３ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）、及びジイソプロピルエチルアミン（２ｍＬ、１２ｍｍｏｌ）の混合物を７０℃で７時間加熱した。所望の生成物及び未反応の（４−ブロモチエン−３−イル）メタンアミンを含む混合物を室温で２時間、ＴＨＦ（６ｍＬ）中の二炭酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（０．９２ｍＬ、４ｍｍｏｌ）、及びＮａＨＣＯ3（６７２ｍｇ、８ｍｍｏｌ）により処理した。混合物をロータリーエバポレーションにより濃縮し、フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＭｅＯＨ／ＥｔＯＡｃ＝１：９）により精製して、Ｎ6−［（４−ブロモチエン−３−イル）メチル］アデノシンを得た。
６−Ｎ−（５−ブロモチエン−３−イル）メチル−６−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−２’，３’−Ｏ−イソプロピリデン−５’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）アデノシン
化合物６（３６０ｍｇ、０．６８ｍｍｏｌ）、（５−ブロモチエン−３−イル）メタノール（１９７ｍｇ、１．０２ｍｍｏｌ）、及びトリフェニルホスフィン（２７１ｍｇ、１．０２ｍｍｏｌ）の、無水ＴＨＦ（１０ｍＬ）溶液を４５℃で２分間、Ｎ2の雰囲気下で撹拌した。アゾジカルボン酸ジイソプロピル（ＤＩＡＤ、０．２０ｍＬ、１．０２ｍｍｏｌ）を滴下した。混合物をＴＬＣ分析が化合物６の消失を示すまで撹拌した。混合物を減圧下でロータリーエバポレーションにより濃縮した。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン＝１：９）により精製して、６−Ｎ−（５−ブロモチエン−３−イル）メチル−６−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−２’，３’−Ｏ−イソプロピリデン−５’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）アデノシンを得た。
化合物６（３６０ｍｇ、０．６８ｍｍｏｌ）、（５−ブロモチエン−３−イル）メタノール（１９７ｍｇ、１．０２ｍｍｏｌ）、及びトリフェニルホスフィン（２７１ｍｇ、１．０２ｍｍｏｌ）の、無水ＴＨＦ（１０ｍＬ）溶液を４５℃で２分間、Ｎ2の雰囲気下で撹拌した。アゾジカルボン酸ジイソプロピル（ＤＩＡＤ、０．２０ｍＬ、１．０２ｍｍｏｌ）を滴下した。混合物をＴＬＣ分析が化合物６の消失を示すまで撹拌した。混合物を減圧下でロータリーエバポレーションにより濃縮した。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン＝１：９）により精製して、６−Ｎ−（５−ブロモチエン−３−イル）メチル−６−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−２’，３’−Ｏ−イソプロピリデン−５’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）アデノシンを得た。
Ｎ6−［（５−ブロモチエン−３−イル）メチル］アデノシン
脱イオン水（５ｍＬ）及びＴＨＦ（１ｍＬ）中、６−Ｎ−（５−ブロモチエン−３−イル）メチル−６−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−２’，３’−Ｏ−イソプロピリデン−５’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）アデノシン（１３８ｍｇ、０．１９ｍｍｏｌ）の懸濁液を撹拌し、氷浴中で冷却した。トリフルオロ酢酸（５ｍＬ）を０℃で滴下した。混合物を１０分間撹拌し、氷浴を除去して、混合物をさらに３０分間撹拌した。混合物を減圧下でロータリーエバポレーションにより濃縮した。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（ＭｅＯＨ／ＥｔＯＡｃ＝１：４９）により精製して、Ｎ6−［（５−ブロモチエン−３−イル）メチル］アデノシンを得た。
脱イオン水（５ｍＬ）及びＴＨＦ（１ｍＬ）中、６−Ｎ−（５−ブロモチエン−３−イル）メチル−６−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−２’，３’−Ｏ−イソプロピリデン−５’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）アデノシン（１３８ｍｇ、０．１９ｍｍｏｌ）の懸濁液を撹拌し、氷浴中で冷却した。トリフルオロ酢酸（５ｍＬ）を０℃で滴下した。混合物を１０分間撹拌し、氷浴を除去して、混合物をさらに３０分間撹拌した。混合物を減圧下でロータリーエバポレーションにより濃縮した。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（ＭｅＯＨ／ＥｔＯＡｃ＝１：４９）により精製して、Ｎ6−［（５−ブロモチエン−３−イル）メチル］アデノシンを得た。
（５−クロロチエン−２−イル）メタンアミン
ＴＨＦ（１３ｍＬ）中、２−（アミノメチル）チオフェン（１ｍＬ、１０ｍｍｏｌ）、二炭酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（２．５ｍＬ、１１ｍｍｏｌ）、及びＮａＨＣＯ3（８４０ｍｇ、１０ｍｍｏｌ）の混合物を室温で３時間撹拌して、淡黄色の固体を含む懸濁液を得た。混合物を減圧下で濃縮し、残渣をＣＨ2Ｃｌ2及びＨ2Ｏで抽出した。有機相をＭｇＳＯ4上で乾燥させ、ろ過し、ＥｔＯＡｃ／ヘキサン（１：２０）の溶出を用いたシリカゲルカラムのフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、ｔｅｒｔ−ブチル（チエン−２−イル）メチルカルバメートを得た（Ｃ10Ｈ15ＮＯ2Ｓ、１．６２ ｇ、７６％収率）。
ＴＨＦ（１３ｍＬ）中、２−（アミノメチル）チオフェン（１ｍＬ、１０ｍｍｏｌ）、二炭酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（２．５ｍＬ、１１ｍｍｏｌ）、及びＮａＨＣＯ3（８４０ｍｇ、１０ｍｍｏｌ）の混合物を室温で３時間撹拌して、淡黄色の固体を含む懸濁液を得た。混合物を減圧下で濃縮し、残渣をＣＨ2Ｃｌ2及びＨ2Ｏで抽出した。有機相をＭｇＳＯ4上で乾燥させ、ろ過し、ＥｔＯＡｃ／ヘキサン（１：２０）の溶出を用いたシリカゲルカラムのフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、ｔｅｒｔ−ブチル（チエン−２−イル）メチルカルバメートを得た（Ｃ10Ｈ15ＮＯ2Ｓ、１．６２ ｇ、７６％収率）。
ベンゼン（０．３ｍＬ）中、ｔｅｒｔ−ブチル（チエン−２−イル）メチルカルバメート（１０６ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）、Ｎ−クロロスクシンイミド（７３ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ）の混合物を８０℃で撹拌した。２時間後、酢酸（０．３ｍＬ、５ｍｍｏｌ）を添加し、さらに２１時間反応させた。混合物をＣＨ2Ｃｌ2及びＨ2Ｏで抽出した。有機相をＭｇＳＯ4上で乾燥させ、ろ過し、ＥｔＯＡｃ／ヘキサン（１：２０）の溶出を用いたシリカゲルカラムのフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、ｔｅｒｔ−ブチル（５−クロロチエン−２−イル）メチルカルバメートを得た（Ｃ10Ｈ14ＣｌＮＯ2Ｓ、８２．６ｍｇ、６７％収率）。
ＣＨ2Ｃｌ2（１ｍＬ）中、上述の調製した化合物（６５ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）及びＴＦＡ（１ｍＬ、１３ｍｍｏｌ）の混合物を３時間室温で撹拌した。該溶液を減圧下で濃縮して、（５−クロロチエン−２−イル）メタンアミンを得た（〜１００％収率）。Ｃ5Ｈ6ＮＳＣｌ； 淡黄色の固体； 1Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ、ＣＤ3ＯＤ）δ ７．０７（１ Ｈ、ｄ、Ｊ＝４．０ Ｈｚ）、６．９５（１ Ｈ、ｄ、Ｊ＝３．６ Ｈｚ）、４．２６（２ Ｈ、ｓ）； 13Ｃ ＮＭＲ（１００ ＭＨｚ、ＣＤ3ＯＤ）δ １３４．９、１３２．８、１３０．７、１２８．０、３８．８； ＥＳＩ-ＨＲＭＳ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ5Ｈ7ＣｌＮＳ：１４７．９９８８、ｆｏｕｎｄ：ｍ／ｚ １４７．９９９５ ［Ｍ ＋ Ｈ］+。
Ｎ6−［（５−クロロチエン−２−イル）メチル］アデノシン（ＪＭＦ３８１８）
ＥｔＯＨ（１ｍＬ）中、（５−クロロチエン−２−イル）メタンアミン（３５．４ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ）、６−クロロプリンリボフラノシド（０．１２ｍｍｏｌ）、及びジイソプロピルエチルアミン（０．３６ｍＬ、２ｍｍｏｌ）の混合物を、封管中、８０℃で３０分間のマイクロ波照射により撹拌した。混合物を室温まで冷却し、減圧下で濃縮して、淡黄色の油を得た。それをＨ2Ｏ及びＭｅＯＨで連続的に洗浄し、表題の化合物ＪＭＦ３８１８を得た。Ｃ15Ｈ16ＣｌＮ5Ｏ4Ｓ；白色固体； 1Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ、ＣＤ3ＯＤ）δ ８．２９（１ Ｈ、ｓ）、８．２７（１ Ｈ、ｓ）、６．８８（１ Ｈ、ｄ、Ｊ＝３．６ Ｈｚ）、６．７９（１ Ｈ、ｄ、Ｊ＝３．６ Ｈｚ）、５．９６（１ Ｈ、ｄ、Ｊ＝６．８ Ｈｚ）、４．７４-４．７７（１ Ｈ、ｍ）、４．３２-４．３４（１ Ｈ、ｍ）、４．１７（１ Ｈ、ｄ、Ｊ＝２．８ Ｈｚ）、３．８９（１ Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝１２．４、２．０ Ｈｚ）、３．７５（１ Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝１２．４、２．８ Ｈｚ）； 13Ｃ ＮＭＲ（１００ ＭＨｚ、ＣＤ3ＯＤ）δ １５６．０、１５３．６、１４２．８、１４２．０、１２９．９、１２７．０、１２６．６、１２１．７、９１．５、８８．４、７５．６、７２．９、６３．７、４０．４； ＥＳＩ-ＨＲＭＳ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ15Ｈ17ＣｌＮ5Ｏ4Ｓ：３９８．０６９０、ｆｏｕｎｄ：ｍ／ｚ ３９８．０６９２ ［Ｍ ＋ Ｈ］+。
ＥｔＯＨ（１ｍＬ）中、（５−クロロチエン−２−イル）メタンアミン（３５．４ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ）、６−クロロプリンリボフラノシド（０．１２ｍｍｏｌ）、及びジイソプロピルエチルアミン（０．３６ｍＬ、２ｍｍｏｌ）の混合物を、封管中、８０℃で３０分間のマイクロ波照射により撹拌した。混合物を室温まで冷却し、減圧下で濃縮して、淡黄色の油を得た。それをＨ2Ｏ及びＭｅＯＨで連続的に洗浄し、表題の化合物ＪＭＦ３８１８を得た。Ｃ15Ｈ16ＣｌＮ5Ｏ4Ｓ；白色固体； 1Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ、ＣＤ3ＯＤ）δ ８．２９（１ Ｈ、ｓ）、８．２７（１ Ｈ、ｓ）、６．８８（１ Ｈ、ｄ、Ｊ＝３．６ Ｈｚ）、６．７９（１ Ｈ、ｄ、Ｊ＝３．６ Ｈｚ）、５．９６（１ Ｈ、ｄ、Ｊ＝６．８ Ｈｚ）、４．７４-４．７７（１ Ｈ、ｍ）、４．３２-４．３４（１ Ｈ、ｍ）、４．１７（１ Ｈ、ｄ、Ｊ＝２．８ Ｈｚ）、３．８９（１ Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝１２．４、２．０ Ｈｚ）、３．７５（１ Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝１２．４、２．８ Ｈｚ）； 13Ｃ ＮＭＲ（１００ ＭＨｚ、ＣＤ3ＯＤ）δ １５６．０、１５３．６、１４２．８、１４２．０、１２９．９、１２７．０、１２６．６、１２１．７、９１．５、８８．４、７５．６、７２．９、６３．７、４０．４； ＥＳＩ-ＨＲＭＳ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ15Ｈ17ＣｌＮ5Ｏ4Ｓ：３９８．０６９０、ｆｏｕｎｄ：ｍ／ｚ ３９８．０６９２ ［Ｍ ＋ Ｈ］+。
薬物動態試験
本化合物を生理食塩水の水溶液として投与した。雄のＩＣＲマウスを台湾バイオラスコ社（ＢｉｏＬＡＳＣＯ Ｔａｉｗａｎ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．）から購入した。試験化合物（Ｔ１−１１及びＪＭＦ３４６４）の経口生物学的利用能を測定するために、試験化合物の経口（１０ｍｇ／ｋｇ）又は静脈内（１ｍｇ／ｋｇ）投与後に、血液試料を雄のＩＣＲマウス（６週齢；２０〜２５ｇ）から採取した。Ｔ１−１１については、静脈内投与後２、１０、３０、６０、１２０、３６０分において、及び経口投与後１５、３０、４５、６０、１２０、３６０分において、血液試料を採取した。ＪＭＦ３４６４については、静脈内投与後２、１０、３０、６０、１２０、２４０、３６０、４８０分において、及び経口投与後１５、３０、６０、９０、１２０、２４０、３６０、４８０分において、血液試料を採取した。該血液試料を０．１％のギ酸を加えたメタノールで抽出し、その後、抽出された試料の１０μＬを定量化のためにＵＰＬＣ-ＭＳＭＳへと注入した。
本化合物を生理食塩水の水溶液として投与した。雄のＩＣＲマウスを台湾バイオラスコ社（ＢｉｏＬＡＳＣＯ Ｔａｉｗａｎ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．）から購入した。試験化合物（Ｔ１−１１及びＪＭＦ３４６４）の経口生物学的利用能を測定するために、試験化合物の経口（１０ｍｇ／ｋｇ）又は静脈内（１ｍｇ／ｋｇ）投与後に、血液試料を雄のＩＣＲマウス（６週齢；２０〜２５ｇ）から採取した。Ｔ１−１１については、静脈内投与後２、１０、３０、６０、１２０、３６０分において、及び経口投与後１５、３０、４５、６０、１２０、３６０分において、血液試料を採取した。ＪＭＦ３４６４については、静脈内投与後２、１０、３０、６０、１２０、２４０、３６０、４８０分において、及び経口投与後１５、３０、６０、９０、１２０、２４０、３６０、４８０分において、血液試料を採取した。該血液試料を０．１％のギ酸を加えたメタノールで抽出し、その後、抽出された試料の１０μＬを定量化のためにＵＰＬＣ-ＭＳＭＳへと注入した。
薬物動態プログラムＷｉｎＮｏｎｌｉｎを用いて、データをノンコンパートメントモデルにあてはめて、薬物動態パラメータを得た。最終採血時間まで（ＡＵＣ0-120）、無限大時間まで（ＡＵＣ0-∞）の血漿中濃度対時間曲線下面積（ＡＵＣ）、消失半減期（Ｔ1/2）、化合物の最高血漿中濃度（Ｃmax）、Ｃmaxの時間（Ｔmax）、及び曲線の終末部に関連する一次速度定数（ｋ）を含む薬物動態パラメータを、時間対ｌｏｇ濃度の線形回帰によって算定した。総血漿クリアランス（ＣＬ）を投与量／ＡＵＣi.v.として算出した。経口投与による試験化合物の経口生物学的利用能（Ｆ）をｉ．ｖ．投与量のＡＵＣ0-∞で割った経口投与量のＡＵＣ0-∞から算出した。
実施例２
放射性リガンド結合アッセイ
放射性リガンド結合アッセイを、ＭＤＳファーマサービス台湾（ＭＤＳ Ｐｈａｒｍａ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ Ｔａｉｗａｎ）（台北、台湾）により標準の結合手法を用いて行った。Ａ2AＲ結合アッセイについては、ヒトＡ2AＲを過剰発現したＨＥＫ２９３細胞から採取した膜タンパク質を、3Ｈ−ＣＧＳ２１６８０（５０ｎＭ）を含む反応バッファー［５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．４）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、１ｍＭ ＥＤＴＡ、及び２ Ｕ／ｍＬ アデノシンデアミナーゼ］中で、９０分間２５℃でインキュベートした。非特異的結合を、５０μＭのアデノシン−５′−Ｎ−エチルカルボキサミドの存在下で評価した。Ｔ１−１１のＡ3Ｒに対する結合親和性を測定するために、ヒトＡ3Ｒを過剰発現したチャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ）−Ｋ１細胞から採取した膜タンパク質を、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ ７．４）、５ｍＭのＭｇＣ2、１ｍＭのＣａＣｌ及び０．１％のウシ血清アルブミンを含む反応バッファー中、3Ｈ−ＡＢ−ＭＥＣＡ（０．５ｎＭ）とともに６０分間２５℃で、インキュベートした。１μＭのＩＢ−ＭＥＣＡ（トクリス・バイオサイエンス（Ｔｏｃｒｉｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、エリスヴィル、ミズーリ州、アメリカ合衆国）の存在下で非特異的結合を評価した。アデノシントランスポーターについての結合アッセイを先に記載のとおり行った。ダンカン・ハートレー（Ｄｕｎｃａｎ Ｈａｒｔｌｅｙ）由来のモルモットの大脳皮質から採取した膜分画を、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．４）を含むインキュベーションバッファー中で、3Ｈ標識した６−［（４−ニトロベンジル）チオ］−９−β−Ｄ−リボフラノシルプリン（ＮＢＴＩ、０．５ｎＭ）とともに、３０分間２５℃でインキュベートした。非特異的結合を、５μＭの、受動拡散型ヌクレオシドトランスポーターの効果的なインヒビターであるＮＢＴＩの存在下で評価した。ＮＢＴＩはＥＮＴ１の高親和性インヒビターであり、０．５ｎＭでヒト（ｈ）ＥＮＴ１のみを抑制するということに留意されたい。ＧＦ／Ｂガラス繊維によるろ過、及び反応バッファーによる洗浄によって、反応を終了する。
放射性リガンド結合アッセイ
放射性リガンド結合アッセイを、ＭＤＳファーマサービス台湾（ＭＤＳ Ｐｈａｒｍａ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ Ｔａｉｗａｎ）（台北、台湾）により標準の結合手法を用いて行った。Ａ2AＲ結合アッセイについては、ヒトＡ2AＲを過剰発現したＨＥＫ２９３細胞から採取した膜タンパク質を、3Ｈ−ＣＧＳ２１６８０（５０ｎＭ）を含む反応バッファー［５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．４）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、１ｍＭ ＥＤＴＡ、及び２ Ｕ／ｍＬ アデノシンデアミナーゼ］中で、９０分間２５℃でインキュベートした。非特異的結合を、５０μＭのアデノシン−５′−Ｎ−エチルカルボキサミドの存在下で評価した。Ｔ１−１１のＡ3Ｒに対する結合親和性を測定するために、ヒトＡ3Ｒを過剰発現したチャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ）−Ｋ１細胞から採取した膜タンパク質を、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ ７．４）、５ｍＭのＭｇＣ2、１ｍＭのＣａＣｌ及び０．１％のウシ血清アルブミンを含む反応バッファー中、3Ｈ−ＡＢ−ＭＥＣＡ（０．５ｎＭ）とともに６０分間２５℃で、インキュベートした。１μＭのＩＢ−ＭＥＣＡ（トクリス・バイオサイエンス（Ｔｏｃｒｉｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、エリスヴィル、ミズーリ州、アメリカ合衆国）の存在下で非特異的結合を評価した。アデノシントランスポーターについての結合アッセイを先に記載のとおり行った。ダンカン・ハートレー（Ｄｕｎｃａｎ Ｈａｒｔｌｅｙ）由来のモルモットの大脳皮質から採取した膜分画を、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．４）を含むインキュベーションバッファー中で、3Ｈ標識した６−［（４−ニトロベンジル）チオ］−９−β−Ｄ−リボフラノシルプリン（ＮＢＴＩ、０．５ｎＭ）とともに、３０分間２５℃でインキュベートした。非特異的結合を、５μＭの、受動拡散型ヌクレオシドトランスポーターの効果的なインヒビターであるＮＢＴＩの存在下で評価した。ＮＢＴＩはＥＮＴ１の高親和性インヒビターであり、０．５ｎＭでヒト（ｈ）ＥＮＴ１のみを抑制するということに留意されたい。ＧＦ／Ｂガラス繊維によるろ過、及び反応バッファーによる洗浄によって、反応を終了する。
細胞培養及び一過性トランスフェクション
アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ；マナサス、バージニア州、アメリカ合衆国）から購入したラットのＰＣ１２細胞を、１０％のウマ血清及び５％のＦＢＳを添加したＤＭＥＭ中で維持し、ＣＯ2インキュベーター（５％）中、３７℃でインキュベートした。リポフェクタミン（ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ）（商標）２０００（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））をビヒクルとして用いて、製造者のプロトコルに従い、プラスミドを細胞に導入した。プラスミドはＤｒ． Ｐｕｌｓｔ（神経内科学科、ユタ大学、アメリカ合衆国）によって快く提供された。通常、５μＬのリポフェクタミン（商標）２０００と組み合わせた５μｇのＤＮＡを、６ウェルプレートの各ウェルに注いだ。播種数は（１〜１．５）ｘ１０6細胞／ウェルであった。６時間のトランスフェクション後、細胞を試薬でさらに２４時間処理した。画像をＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｅｒｔ ２００Ｍ倒立型蛍光顕微鏡（ゲッティンゲン（Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ）、ドイツ）で取得した。
アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ；マナサス、バージニア州、アメリカ合衆国）から購入したラットのＰＣ１２細胞を、１０％のウマ血清及び５％のＦＢＳを添加したＤＭＥＭ中で維持し、ＣＯ2インキュベーター（５％）中、３７℃でインキュベートした。リポフェクタミン（ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ）（商標）２０００（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））をビヒクルとして用いて、製造者のプロトコルに従い、プラスミドを細胞に導入した。プラスミドはＤｒ． Ｐｕｌｓｔ（神経内科学科、ユタ大学、アメリカ合衆国）によって快く提供された。通常、５μＬのリポフェクタミン（商標）２０００と組み合わせた５μｇのＤＮＡを、６ウェルプレートの各ウェルに注いだ。播種数は（１〜１．５）ｘ１０6細胞／ウェルであった。６時間のトランスフェクション後、細胞を試薬でさらに２４時間処理した。画像をＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｅｒｔ ２００Ｍ倒立型蛍光顕微鏡（ゲッティンゲン（Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ）、ドイツ）で取得した。
ＭＴＴアッセイ
３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）代謝アッセイによって、生存を評価した。端的には、処理後にＭＴＴを培地に加え（０．５ｍｇ／ｍｌ）、３７℃で２〜３時間インキュベートした。播種数は９６ウェルプレートに１ｘ１０4細胞／ウェルであった。培地を除去した後に、ＤＭＳＯをウェルに加えて、ホルマザン結晶を溶解し、各ウェルの５７０及び６３０ｎｍにおける吸光度を、マイクロ酵素結合免疫吸着アッセイ（ｍｉｃｒｏ−ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）（ＥＬＩＳＡ）リーダーにより測定した。
３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）代謝アッセイによって、生存を評価した。端的には、処理後にＭＴＴを培地に加え（０．５ｍｇ／ｍｌ）、３７℃で２〜３時間インキュベートした。播種数は９６ウェルプレートに１ｘ１０4細胞／ウェルであった。培地を除去した後に、ＤＭＳＯをウェルに加えて、ホルマザン結晶を溶解し、各ウェルの５７０及び６３０ｎｍにおける吸光度を、マイクロ酵素結合免疫吸着アッセイ（ｍｉｃｒｏ−ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）（ＥＬＩＳＡ）リーダーにより測定した。
実施例３
動物及び薬剤投与
雄のＲ６／２マウス（Ｍａｎｇｉａｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．、１９９６ Ｃｅｌｌ． ８７：４９３−５０６）及び同腹仔の対照を最初にジャクソン・ラボラトリーズ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（バー・ハーバー、メイン州、アメリカ合衆国）から得て、雌の対照マウス（Ｂ６ＣＢＡＦＩ／Ｊ）と交配した。仔マウスを、導入遺伝子に存在するプライマー（５’−ＣＣＧＣＴＣＡＧＧＴＴＣＴＧＣＴＴＴＴＡ−３’；配列番号１、及び５’−ＧＧＣＴＧＡＧＧＡＡＧＣＴＧＡＧＧＡＧ−３’；配列番号２）を用いて、尾部組織から抽出したゲノムＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）遺伝子型決定手法により特定して、ＣＡＧリピート数がおよそ１５０にとどまることを確認した。動物を生物医学動物飼養施設研究所（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙ）で、１２／１２時間の明／暗周期下に収容した。マウスの体重を１日１回記録した。アカデミア・シニカの施設内動物管理利用委員会（Ａｃａｄｅｍｉａ Ｓｉｎｉｃａ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）、台北、台湾、による承認を受けた手順の下で動物実験を行った。
動物及び薬剤投与
雄のＲ６／２マウス（Ｍａｎｇｉａｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．、１９９６ Ｃｅｌｌ． ８７：４９３−５０６）及び同腹仔の対照を最初にジャクソン・ラボラトリーズ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（バー・ハーバー、メイン州、アメリカ合衆国）から得て、雌の対照マウス（Ｂ６ＣＢＡＦＩ／Ｊ）と交配した。仔マウスを、導入遺伝子に存在するプライマー（５’−ＣＣＧＣＴＣＡＧＧＴＴＣＴＧＣＴＴＴＴＡ−３’；配列番号１、及び５’−ＧＧＣＴＧＡＧＧＡＡＧＣＴＧＡＧＧＡＧ−３’；配列番号２）を用いて、尾部組織から抽出したゲノムＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）遺伝子型決定手法により特定して、ＣＡＧリピート数がおよそ１５０にとどまることを確認した。動物を生物医学動物飼養施設研究所（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙ）で、１２／１２時間の明／暗周期下に収容した。マウスの体重を１日１回記録した。アカデミア・シニカの施設内動物管理利用委員会（Ａｃａｄｅｍｉａ Ｓｉｎｉｃａ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）、台北、台湾、による承認を受けた手順の下で動物実験を行った。
ロータロッドの成績
ロータロッド装置（ウゴ・バジレ（ＵＧＯ ＢＡＳＩＬＥ）、コメーリオ、イタリア）を使用して、一定の速度（１２ｒｐｍ）で２分の期間にわたって運動協調性を評価した（Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．、１９９９ Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． １９：３２４８−３２５７）。マウスにロータロッド装置についてよく理解させるため、全てのマウスを４週齢で２日間訓練した。動物をその後、４〜１２週齢において１週間に３回試験した。各試験について、回転の開始前に動物を装置に乗せた。落下潜時は自動的に記録された。各マウスは各試行につき最大２分間、３度の試行が与えられた。
ロータロッド装置（ウゴ・バジレ（ＵＧＯ ＢＡＳＩＬＥ）、コメーリオ、イタリア）を使用して、一定の速度（１２ｒｐｍ）で２分の期間にわたって運動協調性を評価した（Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．、１９９９ Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． １９：３２４８−３２５７）。マウスにロータロッド装置についてよく理解させるため、全てのマウスを４週齢で２日間訓練した。動物をその後、４〜１２週齢において１週間に３回試験した。各試験について、回転の開始前に動物を装置に乗せた。落下潜時は自動的に記録された。各マウスは各試行につき最大２分間、３度の試行が与えられた。
実施例４
動物
Ｃ５７ＢＬ／６マウスを国家実験動物センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｎｔｅｒ）（台湾）から購入した。トランスジェニックマウス（ＡＴＡＸＮ２Q127）はＤｒ． Ｐｕｌｓｔより提供された。マウスを防音室内で、１２／１２時間の明／暗周期、及び管理された温度（２２±２℃）下で飼育した。餌及び水は自由に得られた。ＮＩＨの実験動物の管理及び使用に関するガイド（Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ）の原則及び指示に従って、使用される動物の数ならびに動物の疼痛及び苦痛を最小限にするための全ての努力が成された。これらの実験はまた、国家中医薬研究所の動物実験委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）により審査され、承認された（承認番号：１００−１５）。
動物
Ｃ５７ＢＬ／６マウスを国家実験動物センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｎｔｅｒ）（台湾）から購入した。トランスジェニックマウス（ＡＴＡＸＮ２Q127）はＤｒ． Ｐｕｌｓｔより提供された。マウスを防音室内で、１２／１２時間の明／暗周期、及び管理された温度（２２±２℃）下で飼育した。餌及び水は自由に得られた。ＮＩＨの実験動物の管理及び使用に関するガイド（Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ）の原則及び指示に従って、使用される動物の数ならびに動物の疼痛及び苦痛を最小限にするための全ての努力が成された。これらの実験はまた、国家中医薬研究所の動物実験委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）により審査され、承認された（承認番号：１００−１５）。
フィルター遅延アッセイ
本方法はいくつかの変更とともに、Ｗａｎｋｅｒら（１９９９ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ３０９：３７５−３８６）により記述された方法に従った。端的には、回収した細胞を、溶解バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８．８）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５．０ｍＭ ＭｇＣｌ2、１ｍＭ ＥＤＴＡ、及び、１ｘのプロテアーゼインヒビターカクテル（ロシュ・ダイアグノスティックス（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、インディアナポリス、インディアナ州、アメリカ合衆国）を含む０．５％（ｗ／ｖ）のＩＰＧＥＡＬ）中で再懸濁し、１０秒間超音波処理した（１パルス／秒）。Ｂｉｏ−Ｄｏｔ ＳＦ装置（バイオ−ラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、ハーキュリーズ、カリフォルニア州、アメリカ合衆国）を使用し、２％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）で事前に平衡化したセルロースアセテートメンブレン（０．２μｍ；ワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）、メードストン、ケント州、イギリス）を通して、各群において等しいタンパク質濃度（１５〜２０μｇ／ウェル）をろ過した。吸着中に、各ウェルを２００μＬの０．１％ＳＤＳで２回洗浄した。ブロットを、３％の脱脂粉乳を含むＴＢＳ（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ１及び１５０ｍＭ ＮａＣ１； ｐＨ ７．４）で、１時間室温でブロッキングし、その後、０．０２％のＮａＮ3を含む３％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）中で、抗ポリグルタミン（１：５０００；ＭＡＢ１５７４）抗体と共にインキュベートして（４℃、一晩）、正常及び変異ＡＴＡＸＮ２を調べた。その後の方法は上述の方法と同一であった。
本方法はいくつかの変更とともに、Ｗａｎｋｅｒら（１９９９ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ３０９：３７５−３８６）により記述された方法に従った。端的には、回収した細胞を、溶解バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８．８）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５．０ｍＭ ＭｇＣｌ2、１ｍＭ ＥＤＴＡ、及び、１ｘのプロテアーゼインヒビターカクテル（ロシュ・ダイアグノスティックス（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、インディアナポリス、インディアナ州、アメリカ合衆国）を含む０．５％（ｗ／ｖ）のＩＰＧＥＡＬ）中で再懸濁し、１０秒間超音波処理した（１パルス／秒）。Ｂｉｏ−Ｄｏｔ ＳＦ装置（バイオ−ラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、ハーキュリーズ、カリフォルニア州、アメリカ合衆国）を使用し、２％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）で事前に平衡化したセルロースアセテートメンブレン（０．２μｍ；ワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）、メードストン、ケント州、イギリス）を通して、各群において等しいタンパク質濃度（１５〜２０μｇ／ウェル）をろ過した。吸着中に、各ウェルを２００μＬの０．１％ＳＤＳで２回洗浄した。ブロットを、３％の脱脂粉乳を含むＴＢＳ（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ１及び１５０ｍＭ ＮａＣ１； ｐＨ ７．４）で、１時間室温でブロッキングし、その後、０．０２％のＮａＮ3を含む３％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）中で、抗ポリグルタミン（１：５０００；ＭＡＢ１５７４）抗体と共にインキュベートして（４℃、一晩）、正常及び変異ＡＴＡＸＮ２を調べた。その後の方法は上述の方法と同一であった。
ロータロッドの成績
本試験には５週齢の野生型及びトランスジェニックマウスを使用した。ロータロッド装置（ウゴ・バジレ、コメーリオ、イタリア）を使用し、加速度（１０〜２８ｒｐｍ）で、５分間にわたって運動協調性を評価した。マウスにロータロッド装置についてよく理解させるために、全てのマウスを５週齢のうちに２日間訓練した。加えて、その週にトランスジェニックマウスの一部は、マウスの日常飲用水に溶解したＴ１−１１の摂取を開始した。動物をその後、６週齢から１週間に２回、正式に試験した。各試験について、回転の開始前に動物を装置に乗せた。落下潜時は自動的に記録された。各マウスは１回あたり２度の試行が与えられた。マウスは試行の間に２０〜３０分間休憩することが許された。
本試験には５週齢の野生型及びトランスジェニックマウスを使用した。ロータロッド装置（ウゴ・バジレ、コメーリオ、イタリア）を使用し、加速度（１０〜２８ｒｐｍ）で、５分間にわたって運動協調性を評価した。マウスにロータロッド装置についてよく理解させるために、全てのマウスを５週齢のうちに２日間訓練した。加えて、その週にトランスジェニックマウスの一部は、マウスの日常飲用水に溶解したＴ１−１１の摂取を開始した。動物をその後、６週齢から１週間に２回、正式に試験した。各試験について、回転の開始前に動物を装置に乗せた。落下潜時は自動的に記録された。各マウスは１回あたり２度の試行が与えられた。マウスは試行の間に２０〜３０分間休憩することが許された。
実施例５
行動試験
マウスの平衡及び協調機能を、ロータロッド試験を実施することにより測定した。ロータロッド装置（加速モデル、ウゴ・バジレ バイオロジカルリサーチアパラタス（Ｕｇｏ Ｂａｓｉｌｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ａｐｐａｒａｔｕｓ））の動いているドラムにマウスを乗せ、その後マウスがドラムからプレート上へ落下し、タイマーが止まるまで、装置を加速させた。１日４回の試行で４日間にわたって落下潜時を測定した。
行動試験
マウスの平衡及び協調機能を、ロータロッド試験を実施することにより測定した。ロータロッド装置（加速モデル、ウゴ・バジレ バイオロジカルリサーチアパラタス（Ｕｇｏ Ｂａｓｉｌｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ａｐｐａｒａｔｕｓ））の動いているドラムにマウスを乗せ、その後マウスがドラムからプレート上へ落下し、タイマーが止まるまで、装置を加速させた。１日４回の試行で４日間にわたって落下潜時を測定した。
免疫組織化学染色
野生型又はＳＣＡ３トランスジェニックマウスを麻酔し、４％のパラホルムアルデヒドのＰＢＳで経心的に灌流した。脳をＴｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ包埋剤で平衡化し、液体窒素で凍結した。クライオスタットの切片作成器（ｃｒｙｏｓｔａｔ ｓｅｃｔｉｏｎｉｎｇ）により調製した冠状切片（２０μｍ）を０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で透過処理し、希釈した抗ＮｅｕＮモノクローナル抗血清（ケミコン（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ））とともに４℃で４８時間インキュベートした。その後、切片を洗浄し、ビオチン化ウマ抗マウスＩｇＧとともにインキュベートして、アビジン−ビオチン西洋わさびペルオキシダーゼ複合体とのインキュベーションに続く。切片をその後洗浄し、ジアミノベンジジン溶液で発色させた。Ｒｅｔｉｇａ−２０００Ｒ ＣＣＤカメラ（Ｑイメージング（ＱＩｍａｇｉｎｇ））及び３軸コンピュータ制御のＭＡＣ ６００電動ステージ（リュドル・エレクトロニクス（Ｌｕｄｌ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ））を備えたＬｅｉｃａ ＤＭ２５００顕微鏡により、ＳｔｅｒｅｏＩｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒソフトウェア（ＭＢＦバイオサイエンス（ＭＢＦ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ））を用いて、ＮｅｕＮ陽性の神経細胞を可視化して数えた。各分析はマウス当たり１５枚の脳切片の処理を含む。
野生型又はＳＣＡ３トランスジェニックマウスを麻酔し、４％のパラホルムアルデヒドのＰＢＳで経心的に灌流した。脳をＴｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ包埋剤で平衡化し、液体窒素で凍結した。クライオスタットの切片作成器（ｃｒｙｏｓｔａｔ ｓｅｃｔｉｏｎｉｎｇ）により調製した冠状切片（２０μｍ）を０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で透過処理し、希釈した抗ＮｅｕＮモノクローナル抗血清（ケミコン（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ））とともに４℃で４８時間インキュベートした。その後、切片を洗浄し、ビオチン化ウマ抗マウスＩｇＧとともにインキュベートして、アビジン−ビオチン西洋わさびペルオキシダーゼ複合体とのインキュベーションに続く。切片をその後洗浄し、ジアミノベンジジン溶液で発色させた。Ｒｅｔｉｇａ−２０００Ｒ ＣＣＤカメラ（Ｑイメージング（ＱＩｍａｇｉｎｇ））及び３軸コンピュータ制御のＭＡＣ ６００電動ステージ（リュドル・エレクトロニクス（Ｌｕｄｌ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ））を備えたＬｅｉｃａ ＤＭ２５００顕微鏡により、ＳｔｅｒｅｏＩｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒソフトウェア（ＭＢＦバイオサイエンス（ＭＢＦ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ））を用いて、ＮｅｕＮ陽性の神経細胞を可視化して数えた。各分析はマウス当たり１５枚の脳切片の処理を含む。
実施例６
動物及び薬物送達
トランスジェニックマウスＢ６ＳＪＬ−Ｔｇ（Ｐｒｎｐ−ＴＡＲＤＢＰ）４Ｊｌｅｌ／Ｊを、ジャクソン・ラボラトリー（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）（バーハーバー、メイン州、アメリカ合衆国）から購入し、台湾の国家実験動物センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｎｔｅｒ）で飼育した。トランスジェニックマウスをＰＣＲにより、フォワードプライマー５’−ＧＧＴ ＧＧＴ ＧＧＧ ＡＴＧ ＡＡＣ ＴＴＴ ＧＧ−３’（配列番号３）及びリバースプライマー５’−ＧＴＧ ＧＡＴ ＡＡＣ ＣＣＣ ＴＣＣ ＣＣＣ ＡＧＣ ＣＴＡ ＧＡＣ−３’（配列番号４）を用いてスクリーニングした。野生型マウスは非トランスジェニックの同腹仔であった。６週齢のマウスは、示したとおりＤＭＳＯ又はＪＭＦ１９０７を含み、腹部の腹側側面の皮下に埋め込まれる、アルゼットマイクロ浸透圧ポンプ・モデル１００４（デュレクト・コーポレーション（ＤＵＲＥＣＴ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、クパチーノ、カリフォルニア州、アメリカ合衆国）を有する手術を受けた。ポンプは２８日毎に交換した。
動物及び薬物送達
トランスジェニックマウスＢ６ＳＪＬ−Ｔｇ（Ｐｒｎｐ−ＴＡＲＤＢＰ）４Ｊｌｅｌ／Ｊを、ジャクソン・ラボラトリー（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）（バーハーバー、メイン州、アメリカ合衆国）から購入し、台湾の国家実験動物センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｎｔｅｒ）で飼育した。トランスジェニックマウスをＰＣＲにより、フォワードプライマー５’−ＧＧＴ ＧＧＴ ＧＧＧ ＡＴＧ ＡＡＣ ＴＴＴ ＧＧ−３’（配列番号３）及びリバースプライマー５’−ＧＴＧ ＧＡＴ ＡＡＣ ＣＣＣ ＴＣＣ ＣＣＣ ＡＧＣ ＣＴＡ ＧＡＣ−３’（配列番号４）を用いてスクリーニングした。野生型マウスは非トランスジェニックの同腹仔であった。６週齢のマウスは、示したとおりＤＭＳＯ又はＪＭＦ１９０７を含み、腹部の腹側側面の皮下に埋め込まれる、アルゼットマイクロ浸透圧ポンプ・モデル１００４（デュレクト・コーポレーション（ＤＵＲＥＣＴ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、クパチーノ、カリフォルニア州、アメリカ合衆国）を有する手術を受けた。ポンプは２８日毎に交換した。
握力
握力をＧｒｉｐ Ｓｔｒｅｎｇｔｈ−Ｍｅｔｅｒ（ＴＳＥシステムズ インク（ＴＳＥ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ．）、ミズーリ州、アメリカ合衆国）を用いて測定した。簡潔には、マウスの尾を手でつまみ、力センサに乗せた高さ調節可能なグリップを握らせた。マウスの尾に引っ張り力を加えた。マウスがそのグリップを離した時に、接続された制御装置のデジタル表示版に最大力が表示された。各マウスを３回繰り返して試験した。
握力をＧｒｉｐ Ｓｔｒｅｎｇｔｈ−Ｍｅｔｅｒ（ＴＳＥシステムズ インク（ＴＳＥ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ．）、ミズーリ州、アメリカ合衆国）を用いて測定した。簡潔には、マウスの尾を手でつまみ、力センサに乗せた高さ調節可能なグリップを握らせた。マウスの尾に引っ張り力を加えた。マウスがそのグリップを離した時に、接続された制御装置のデジタル表示版に最大力が表示された。各マウスを３回繰り返して試験した。
ロータロッドの成績
野生型及びトランスジェニックマウスの運動協調性を装置（ウゴ・バジレ、コメーリオ、イタリア）を用いて、一定の速度（４０ｒｐｍ）で１２０秒間評価した。全てのマウスを１週間に２日間、２週間訓練した。マウスをその後、９週齢から１週間に２回、正式に試験した。各試験について、回転の開始前に動物を装置に乗せた。落下潜時は自動的に記録された。各マウスは１回当たり３度の試行が与えられた。マウスは試行の間に２０分間休憩することが許された。
野生型及びトランスジェニックマウスの運動協調性を装置（ウゴ・バジレ、コメーリオ、イタリア）を用いて、一定の速度（４０ｒｐｍ）で１２０秒間評価した。全てのマウスを１週間に２日間、２週間訓練した。マウスをその後、９週齢から１週間に２回、正式に試験した。各試験について、回転の開始前に動物を装置に乗せた。落下潜時は自動的に記録された。各マウスは１回当たり３度の試行が与えられた。マウスは試行の間に２０分間休憩することが許された。
細胞培養及びトランスフェクション
運動ニューロン細胞株（ＮＳＣ３４）はＤｒ．Ｎｅｉｌ Ｃａｓｈｍａｎ（脳研究センター（Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｒｅ）、ブリティッシュコロンビア大学、カナダ）からの惜しみない贈与であり、１０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）、２ｍＭのＬ−グルタミン、及び１％のペニシリン／ストレプトマイシン（インビトロジェン・ギブコＢＲＬ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＧｉｂｃｏＢＲＬ）、カールスバッド、カリフォルニア州、アメリカ合衆国）を含む、高グルコースのダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で、３７℃、５％ＣＯ2下において培養された。
運動ニューロン細胞株（ＮＳＣ３４）はＤｒ．Ｎｅｉｌ Ｃａｓｈｍａｎ（脳研究センター（Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｒｅ）、ブリティッシュコロンビア大学、カナダ）からの惜しみない贈与であり、１０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）、２ｍＭのＬ−グルタミン、及び１％のペニシリン／ストレプトマイシン（インビトロジェン・ギブコＢＲＬ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＧｉｂｃｏＢＲＬ）、カールスバッド、カリフォルニア州、アメリカ合衆国）を含む、高グルコースのダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で、３７℃、５％ＣＯ2下において培養された。
実施例７
マウス
８〜１２週齢の雌のＣ５７ＢＬ６Ｎマウスをバイオラスコ（宜蘭、台湾）から購入した。
マウス
８〜１２週齢の雌のＣ５７ＢＬ６Ｎマウスをバイオラスコ（宜蘭、台湾）から購入した。
酸誘発性慢性広範痛モデル
線維筋痛モデルを、Ｓｌｕｋａのグループにより確立された酸誘発性慢性疼痛モデル（Ｓｌｕｋａ ｅｔ ａｌ．， ２００３ Ｐａｉｎ． １０６：２２９−２３９）から改変した。マウスは２％の気化イソフルランで一時的に麻酔され、左の腓腹筋に２０μＬのゲニステイン（１μＭ）の筋肉内注射を受けた。３分後、同じ部位に２０μＬの酸食塩水（ｐＨ ４．０）の注射を行った。マウスはその後２週間超、持続性機械痛覚過敏を発症した。マウスが機械痛覚過敏を発症した４日後に、Ｔ１−１１の鎮痛効果（０．９−ｍｍ／７−ｃｍの経管栄養とともにｐ．ｏ．）を試験した。０．２−ｍＮのｖｏｎ Ｆｒｅｙ ｆｉｌａｍｅｎｔ刺激に対するマウスの後肢の引っ込め反応を試験することによって機械痛覚過敏を評価した。
線維筋痛モデルを、Ｓｌｕｋａのグループにより確立された酸誘発性慢性疼痛モデル（Ｓｌｕｋａ ｅｔ ａｌ．， ２００３ Ｐａｉｎ． １０６：２２９−２３９）から改変した。マウスは２％の気化イソフルランで一時的に麻酔され、左の腓腹筋に２０μＬのゲニステイン（１μＭ）の筋肉内注射を受けた。３分後、同じ部位に２０μＬの酸食塩水（ｐＨ ４．０）の注射を行った。マウスはその後２週間超、持続性機械痛覚過敏を発症した。マウスが機械痛覚過敏を発症した４日後に、Ｔ１−１１の鎮痛効果（０．９−ｍｍ／７−ｃｍの経管栄養とともにｐ．ｏ．）を試験した。０．２−ｍＮのｖｏｎ Ｆｒｅｙ ｆｉｌａｍｅｎｔ刺激に対するマウスの後肢の引っ込め反応を試験することによって機械痛覚過敏を評価した。
間欠的寒冷ストレスモデル
マウスを間欠的寒冷ストレスで２日間処理した、線維筋痛モデルはＵｅｄａのグループにより開発された（Ｎｉｓｈｉｙｏｒｉ ａｎｄ Ｕｅｄａ， ２００８ Ｍｏｌ Ｐａｉｎ． ４：５２）。間欠的寒冷ストレスで処理したマウスは、持続性（＞２週間）機械及び熱痛覚過敏を発症した。ＪＭＦ３４６４（ｉ．ｐ．又はｐ．ｏ．）の鎮痛効果を間欠的寒冷ストレスの５日後にそれらマウスについて試験した。０．２−ｍＮのｖｏｎ Ｆｒｅｙ ｆｉｌａｍｅｎｔ刺激に対するマウスの後肢の引っ込め反応を試験することにより、機械痛覚過敏を評価した。
マウスを間欠的寒冷ストレスで２日間処理した、線維筋痛モデルはＵｅｄａのグループにより開発された（Ｎｉｓｈｉｙｏｒｉ ａｎｄ Ｕｅｄａ， ２００８ Ｍｏｌ Ｐａｉｎ． ４：５２）。間欠的寒冷ストレスで処理したマウスは、持続性（＞２週間）機械及び熱痛覚過敏を発症した。ＪＭＦ３４６４（ｉ．ｐ．又はｐ．ｏ．）の鎮痛効果を間欠的寒冷ストレスの５日後にそれらマウスについて試験した。０．２−ｍＮのｖｏｎ Ｆｒｅｙ ｆｉｌａｍｅｎｔ刺激に対するマウスの後肢の引っ込め反応を試験することにより、機械痛覚過敏を評価した。
本発明の代表的な実施形態の前述の説明は、図示及び説明の目的のためだけに示されたものであり、網羅的であること又は、開示されたそのものの形態に本発明を制限することを意図するものではない。上述の教示を考慮すると、多くの変更及び変形が可能である。
実施形態及び実施例は、他の当業者が本発明及び種々の実施形態を、意図された特定の使用に適合するような種々の変更と共に活用することができるよう、本発明の原理及びそれらの実用的な応用を説明するために選択され、記載された。本発明がその趣旨及び範囲から逸脱することなく関連する代替の実施形態は当業者にとって明らかになるであろう。
本明細書中で引用され、議論された全ての文献は、各文献が個々に参照により援用されるかのように、その全体及び同一の範囲までが参照により本明細書に援用される。
Claims (20)
- 式（Ｉ）又は（ＩＡ）：
の化合物又はそれらの薬学的に許容される塩。 - Ｎ6−［（３−ハロチエン−２−イル）メチル］アデノシン、Ｎ6−［（４−ハロチエン−２−イル）メチル］アデノシン、及びＮ6−［（５−ハロチエン−２−イル）メチル］アデノシンからなる群から選択される、請求項１に記載の化合物。
- Ｎ6−［（５−ブロモチエン−２−イル）メチル］アデノシン、Ｎ6−［（４−ブロモチエン−２−イル）メチル］アデノシン、Ｎ6−［（３−ブロモチエン−２−イル）メチル］アデノシン、Ｎ6−［（５−クロロチエン−２−イル）メチル］アデノシン、Ｎ6−［（４−クロロチエン−２−イル）メチル］アデノシン、及びＮ6−［（３−クロロチエン−２−イル）メチル］アデノシンからなる群から選択される、請求項２に記載の化合物。
- Ｎ6−［（２−ハロチエン−３−イル）メチル］アデノシン、Ｎ6−［（４−ハロチエン−３−イル）メチル］アデノシン、及びＮ6−［（５−ハロチエン−３−イル）メチル］アデノシンからなる群から選択される、請求項１に記載の化合物。
- Ｎ6−［（２−ブロモチエン−３−イル）メチル］アデノシン、Ｎ6−［（４−ブロモチエン−３−イル）メチル］アデノシン、Ｎ6−［（５−ブロモチエン−３−イル）メチル］アデノシン Ｎ6−［（２−クロロチエン−３−イル）メチル］アデノシン、Ｎ6−［（４−クロロチエン−３−イル）メチル］アデノシン、及びＮ6−［（５−クロロチエン−３−イル）メチル］アデノシンからなる群から選択される、請求項４に記載の化合物。
- １から５のいずれか一項に記載の、式（Ｉ）又は（ＩＡ）の化合物を調製するための方法であって、以下の（Ｉ）又は（ＩＩ）のステップ：
（Ｉ）
（ａ）６−クロロプリンリボフラノシドを塩基の存在下で、式３又は３Ａ：
を有する置換（チエニル）メタンアミンと反応させ、
式（Ｉ）又は（ＩＡ）の化合物を与えること；あるいは、
（ＩＩ）
（ａ１）（２’，３’−Ｏ−イソプロピリデン）アデノシンを塩基の存在下で、水酸基保護剤と反応させ、水酸基の保護基を有する（２’，３’−Ｏ−イソプロピリデン）アデノシンの誘導体を与えること；
（ｂ）水酸基の保護基を有する（２’，３’−Ｏ−イソプロピリデン）アデノシンの誘導体をアミノ基保護剤と反応させ、水酸基の保護基及びアミン保護基を有する（２’，３’−Ｏ−イソプロピリデン）アデノシンの誘導体を与えること；
（ｃ）水酸基の保護基及びアミン保護基を有する（２’，３’−Ｏ−イソプロピリデン）アデノシンの誘導体を、式７又は７Ａ：
の置換（チエニル）メチル基を含む化合物と反応させることにより、カップリング反応を行い、保護基及び置換（チエニル）メチル基を含む生成物を与えること；並びに
（ｄ）酸性条件下でステップ（ＩＩ）（ｃ）の生成物から保護基を除去し、式（Ｉ）又は（ＩＡ）の化合物を与えること、
を含む、方法。 - ステップ（Ｉ）（ａ）の塩基がジイソプロピルエチルアミンであり、置換（チエニル）メタンアミンが：
（ｉ）（５−ブロモチエン−２−イル）メタンアミンであり、Ｎ6−［（５−ブロモチエン−２−イル）メチル］アデノシンを与え；又は
（ｉｉ）（５−クロロチエン−２−イル）メタンアミンであり、Ｎ6−［（５−クロロチエン−２−イル）メチル］アデノシンを与える、
請求項６に記載の方法。 - ステップ（ＩＩ）（ｃ）のカップリング反応を、トリフェニルホスフィン及びアゾジカルボン酸ジイソプロピルの存在下で行う、請求項６に記載の方法。
- ステップ（ＩＩ）（ｃ）の置換（チエニル）メチル基を含む化合物が、（５−ブロモチエン−２−イル）メタノールである、請求項８に記載の方法。
- 以下：
（ａ）治療上有効量の、請求項１から５のいずれか一項に記載の化合物又はそれらの薬学的に許容される塩；及び
（ｂ）薬学的に許容される担体、賦形剤、又はビヒクル、
を含む組成物。 - 神経変性疾患及び／又は疼痛の治療を必要とする患者の、当該治療をするための薬剤の製造における、請求項１から５のいずれか一項に記載の化合物の使用。
- 前記神経変性疾患が、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、プリオン病、ハンチントン病、及び脊髄小脳性運動失調症からなる群から選択される、請求項１１に記載の使用。
- 前記脊髄小脳性運動失調症が、脊髄小脳性運動失調症２型、脊髄小脳性運動失調症３型、及び脊髄小脳性運動失調症７型からなる群から選択される、請求項１２に記載の使用。
- 前記疼痛が酸誘発性疼痛（ａｃｉｄ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｐａｉｎ）である、請求項１１に記載の使用。
- 前記酸誘発性疼痛が酸誘発性筋痛である、請求項１４に記載の使用。
- 前記酸誘発性筋痛が酸誘発性慢性筋痛である、請求項１５に記載の使用。
- 前記疼痛が機能障害性疼痛である、請求項１１に記載の使用。
- 前記機能障害性疼痛が、線維筋痛、筋筋膜性疼痛、膀胱痛症候群、及び過敏性腸症候群により引き起こされる疼痛からなる群から選択される、請求項１７に記載の使用。
- 前記疼痛が、炎症性疼痛、がん性疼痛、胸痛、背痛、頚部痛、肩痛、片頭痛、頭痛、筋筋膜性疼痛、関節痛（ｊｏｉｎ ｐａｉｎ）、筋痛症候群、神経障害性疼痛、末梢性疼痛、交換神経性疼痛、術後疼痛、外傷後疼痛、及び多発性硬化症疼痛からなる群から選択される、請求項１１に記載の使用。
- 前記神経変性疾患がタンパク質ミスフォールディング病である、請求項１１に記載の使用。
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