KR20160086852A - 신경퇴행성 질환 및 통증의 예방 및 치료에 사용하기 위한 화합물 - Google Patents

신경퇴행성 질환 및 통증의 예방 및 치료에 사용하기 위한 화합물 Download PDF

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Abstract

본 발명에서는, 신경퇴행성 질환 및 통증의 예방 및 치료에서 사용하기 위한 화합물을 개시한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 상기 화합물은 N 6-[(3-할로티엔-2-일)메틸]아데노신, N 6-[(4-할로티엔-2-일)메틸]아데노신, 및 N 6-[(5-할로티엔-2-일)메틸]아데노신으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 본 발명의 또 다른 실시양태에서, 상기 화합물은 N 6-[(2-브로모티엔-3-일)메틸]아데노신, N 6-[(4-브로모티엔-3-일)메틸]아데노신, N 6-[(5-브로모티엔-3-일)메틸]아데노신, N 6-[(2-클로로티엔-3-일)메틸]아데노신, N 6-[(4-클로로티엔-3-일)메틸]아데노신, 및 N 6-[(5-클로로티엔-3-일)메틸]아데노신으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또한 이를 제조하는 방법 및 사용하는 방법이 개시되어 있다.

Description

신경퇴행성 질환 및 통증의 예방 및 치료에 사용하기 위한 화합물{COMPOUNDS FOR USE IN PREVENTION AND TREATMENT OF NEURODEGENERATIVE DISEASES AND PAIN}
본 발명은 신경퇴행성 질환 또는 통증을 예방 및/또는 치료하는 데 사용하기 위한 화합물에 관한 것이다.
미국 특허 공개공보 US20120295863에서는 신경퇴행성 질환의 예방 및 치료를 위한 아데노신 A2A 수용체 및 아데노신 수송체를 타게팅하는 이중 작용 화합물을 개시한다. CGS21680(약어 CGS)이라는 이름의 선택성 A2A 아데노신 수용체(A2AR) 작용제는 유전자 변이 마우스 모델에서 헌팅턴 병(HD) 증상을 완화시키고, 유비퀴틴-프로테아좀 시스템의 활성을 향상시킴으로써 HD 질환의 요소 회로 결핍을 구제할 수 있음을 보였다(Chiang et al., 2009 Hum Mol Genet. 18:2929-2942; Chou et al., 2005 J Neurochem. 93:310-320). 그러나, CGS는 강한 면역억제 효과 및 기타 부작용을 일으키는 것으로 공지되어 있으며, 따라서 임상 용도에는 적합하지 않다.
US20120295863에서 T1-11 및 또한 A2AR 작용제로 표기된 N 6-(4-히드록시벤질)아데노신은 신경 퇴행성 질환의 치료에서 치료 잠재성을 갖는 것이 시사되었다. 그러나, T1-11은 이의 낮은 생체이용율(F < 5%)로 인해 여전히 경구 이용 가능한 약물로서 개발되기 어렵다. 경구 생체이용율은 흡수 및 대사 후 체순환에 도달하는 물질의 백분율을 나타내기 때문에 약물 개발에서 중요한 특성이다.
한 양태에서, 본 발명은 화학식 (I) 또는 (IA)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염에 관한 것이다:
Figure pct00001
상기 식에서, X는 할로겐이다.
할로겐(F, Cl, Br 또는 I)는 화학식 (I) 중 3, 4 또는 5번 위치 또는 화학식 (IA) 중 2, 4 또는 5번 위치에 위치할 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에서, 화합물은 N 6-[(3-할로티엔-2-일)메틸]아데노신, N 6-[(4-할로티엔-2-일)메틸]아데노신, 및 N 6-[(5-할로티엔-2-일)메틸]아데노신으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 화합물은 N 6-[(2-할로티엔-3-일)메틸]아데노신, N 6-[(4-할로티엔-3-일)메틸]아데노신, 및 N 6-[(5-할로티엔-3-일)메틸]아데노신으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
추가로 본 발명의 또 다른 실시양태에서, 화합물은 N 6-[(5-브로모티엔-2-일)메틸]아데노신, N 6-[(4-브로모티엔-2-일)메틸]아데노신, N 6-[(3-브로모티엔-2-일)메틸]아데노신, N 6-[(5-클로로티엔-2-일)메틸]아데노신, N 6-[(4-클로로티엔-2-일)메틸]아데노신, 및 N 6-[(3-클로로티엔-2-일)메틸]아데노신으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 화합물은 N 6-[(2-브로모티엔-3-일)메틸]아데노신, N 6-[(4-브로모티엔-3-일)메틸]아데노신, N 6-[(5-브로모티엔-3-일)메틸]아데노신, N 6-[(2-클로로티엔-3-일)메틸]아데노신, N 6-[(4-클로로티엔-3-일)메틸]아데노신, 및 N 6-[(5-클로로티엔-3-일)메틸]아데노신으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 상기 언급된 바와 같은 화학식 (I) 또는 (IA)의 화합물을 제조하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 하기 단계 (I) 또는 (II)를 포함한다:
(I):
(a) 염기 존재 하에 6-클로로퓨린 리보퓨라노시드를 불소, 염소, 브롬 또는 요오드로 치환되고 하기 화학식 (3) 또는 (3A)를 갖는 (티에닐)메탄아민과 반응시켜, 화학식 (I) 또는 (IA)의 화합물을 얻는 단계:
Figure pct00002
; 또는
(II):
(a1) 염기 존재 하에 (2',3'-O-이소프로필리덴)아데닌을 히드록실기 보호제와 반응시켜, 히드록실 보호기를 갖는 (2',3'-O-이소프로필리덴)아데닌의 유도체를 얻는 단계;
(b) 히드록실 보호기를 갖는 (2',3'-O-이소프로필리덴)아데닌의 유도체를 아민기 보호제와 반응시켜, 히드록실 보호기 및 아민 보호기를 갖는 (2',3'-O-이소프로필리덴)아데닌의 유도체를 얻는 단계;
(c) 히드록실 보호기 및 아민 보호기를 갖는 (2',3'-O-이소프로필리덴)아데닌의 유도체를 하기 화학식 (7) 또는 (7A)의 치환된 (티에닐)메틸기 함유 화합물을 반응시킴으로써 커플링 반응을 수행하여, 보호기 및 치환된 (티에닐)메틸기를 함유하는 생성물을 얻는 단계:
Figure pct00003
상기 식에서, X는 F, Cl, Br, 또는 I이고, Y는 X, OH, 메탄술포네이트(OSO2CH3, OMs), p-톨루엔술포네이트(OSO2C6H4-p-CH3, OTs), 또는 트리플루오로메탄술포네이트(OSO2CF3, OTf)이고; 및
(d) 산성 조건에서 단계 (c)의 생성물로부터 보호기를 제거하여, 화학식 (I) 또는 (IA)의 화합물을 얻는 단계.
본 발명의 한 실시양태에서, 단계 (a)의 염기는 디이소프로필에틸아민일 수 있다. 히드록실기 보호제는 tert-부틸디메틸실릴 클로라이드일 수 있다. 아민기 보호제는 디-tert-부틸 디카보네이트일 수 있다. 단계 (a1)의 염기는 이미다졸일 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 단계 (I)(a)에서, 염기는 디이소프로필에틸아민이고, 치환된 (티에닐)메탄아민은: (i) N 6-[(5-브로모티엔-2-일)메틸]아데노신을 얻기 위해서는 (5-브로모티엔-2-일)메탄아민이거나; 또는 (ii) N 6-[(5-클로로티엔-2-일)메틸]아데노신을 얻기 위해서는 (5-클로로티엔-2-일)메탄아민이다.
추가로 본 발명의 또 다른 실시양태에서, 커플링 반응은 트리페닐포스핀 및 디이소프로필 아조디카르복실레이트의 존재 하에 수행된다. 치환된 (티에닐)메틸기 함유 화합물은 (5-브로모티엔-2-일)메탄올일 수 있다.
추가로 또 다른 양태에서, 본 발명은
(a) 치료적 유효량의 상기 언급된 바와 같은 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염; 및
(b) 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 비히클
을 포함하는 조성물에 관한 것이다.
한편 또 다른 양태에서, 본 발명은 신경퇴행성 질환 및/또는 통증의 치료가 필요한 대상에서 신경퇴행성 질환 및/또는 통증을 치료하는 데 사용하기 위한 약제의 제조에서 상기 언급된 바와 같은 화합물의 용도에 관한 것이다. 대안적으로, 본 발명은 신경퇴행성 질환 및/또는 통증의 치료가 필요한 대상에서 신경퇴행성 질환 및/또는 통증을 치료하는 데 사용하기 위한 상기 언급된 바와 같은 화합물에 관한 것이다. 신경퇴행성 질환은 단백질 미스폴딩 질환일 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에서, 신경퇴행성 질환은 알츠하이머 병, 파킨슨 병, 근위축성 측삭경화증, 프리온 병, 헌팅턴 병, 및 척수 소뇌 실조로 이루어진 군으로부터 선택된다. 척수 소뇌 실조는 척수 소뇌 실조 2형, 척수 소뇌 실조 3형, 및 척수 소뇌 실조 7형으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 통증은 산 유발성 통증일 수 있다. 산 유발성 통증은 산 유발성 근육통일 수 있다. 산 유발성 근육통은 산 유발성 만성 근육통일 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에서, 통증은 염증성 통증, 암 통증, 흉통, 배부통, 경부통, 어깨 통증, 편두통, 두통, 근막 통증, 관절 통증, 근육통 증후군, 신경병증성 통증, 말초성 통증, 교감신경 통증, 수술 후 통증, 외상 후 통증, 및 다발 경화증 통증으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 통증은 기능부전성 통증일 수 있다. 기능부전성 통증은 섬유근통, 근막 통증, 방광 통증 증후군, 및 과민성 대장 증후군에 의해 유발된 통증으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
상기 및 기타 양태들은, 이 안의 변형 및 변경이 본 개시내용의 신규한 사상의 취지 및 영역으로부터 벗어남 없이 실시될 수 있지만, 하기 도면과 연관된 하기의 바람직한 실시양태의 설명으로부터 명백해질 것이다.
첨부된 도면은 본 발명의 하나 이상의 실시양태를 예시하며, 기재된 설명과 함께, 본 발명의 원리를 설명한다. 가능한 한, 도면 전체에서 동일한 참조 번호는 실시양태의 동일하거나 유사한 요소를 지칭하도록 사용되었다.
도 1은 T1-11 또는 JMF3464가 정맥내(1 mg/kg) 또는 경구(10 mg/kg) 투여된 ICR 마우스에서 T1-11(A) 및 JMF3464(B)의 혈중 농도를 나타낸다. T1-11 및 JMF3464의 경구 생체이용율은 각각 2.8% 및 17.4%로 추산되었다.
도 2는 혈청 고갈(serum deprivation) 유도된 세포 사멸에 대한 A2AR 작용제(CGS21680, T1-11, JMF3464, 및 JMF3818)의 효과를 나타낸다. 혈청 고갈된 PC12 세포를 24 시간 동안 기재한 시약(들)을 사용하거나 사용하지 않고 치료하였다. 세포 생존능은 혈청 함유 대조군의 평균과 비교한 MTT 기법으로부터의 결과의 백분율로서 표현하였다. 데이터 포인트는 평균 ± SEM (n=3~6)을 나타낸다.
도 3의 A-B는 운동 결핍 및 수명에 대한 JMF3464의 효과를 나타낸다. JMF3464(0.11 mg/마우스/일), JMF1907(0.11 mg/마우스/일) 또는 비히클(CON)을 6 주 동안 ALZET 삼투성 미니펌프(minipump)를 사용하여 기재된 7 주령의 마우스에 피하 투여하였다. 이 마우스들의 로타로드(Rotarod) 수행(A) 및 수명(B)을 평가하였다.* p < 0.05. *** p < 0.005.
도 4의 A-B는 SCA2 유전자 변이 마우스에서 돌연변이 SCA2 유전자 과다발현 유도된 단백질 응집을 예방하는 것 및 행동 수행에서 T1-11의 효과를 나타낸다. (A) pSCA2-22Q-EGFP 또는 pSCA2-104Q-EGFP-형질전환된 세포를 24 시간 동안 10 μM T1-11 또는 10 μM JMF1907(T1-11-유도된 A2A-R 작용제)를 사용하여 치료하였다. 세포를 수확하고 필터 지연 기법(filter retardation assay) 또는 화상 수집(image acquisition)으로 처리하였다. (B) 야생형(WT) 또는 유전자 변이 마우스(SCA2)가 T1-11가 있거나 없는 물을 마시게 하였다. 로타로드 수행을 사용하여 마우스의 행동 수행을 측정하였다.
도 5의 A-C는 T1-11이 SCA3 유전자 변이 마우스의 운동 기능장해(motor dysfunction) 및 뇌교(pontine) 신경세포 사멸을 개선함을 나타낸다. (A) SCA3 유전자 변이 마우스가 4주령에서 시작하여 비히클(0.2% DMSO) 또는 T1-11(0.1 mg/ml)을 함유하는 물을 마시게 하였다. 로타로드 시험은 야생형(WT) 마우스에 비해 비히클 치료된 4월령 아탁신(ataxin)-3-Q79 유전자 변이 마우스가 현저하게 짧은 낙하 지연시간(latency to fall) 및 운동 실조(motor incoordination)를 나타낸다는 것을 보였다. T1-11 치료된 4월령 SCA3 유전자 변이 마우스(1 mg/일)의 로타로드 수행은 동일한 나이에서 비히클 치료된 아탁신-3-Q79 마우스의 로타로드 수행보다 현저하게 우수했다. 각 포인트는 7-8 마우스의 평균 ± S.E.를 나타낸다. (B-C) 신경세포 마커 NeuN의 면역조직화학적 염색은 T1-11의 매일의 경구 투여(1 mg/일)가 4월령째의 SCA3 유전자 변이 마우스의 교뇌핵(pontine nuclei)에서의 신경세포 사멸을 현저하게 개선함을 나타내었다(SCA3 + T1-11). 스케일 바는 50 mm이다. 각 바는 7-8 마우스의 평균 ± S.E.을 나타낸다. * SAC3 유전자 변이 마우스에 비해 P < 0.01.
도 6의 A-C는 JMF1907이 SCA3 유전자 변이 마우스의 운동 실조 증상 및 뇌교 신경세포 사멸을 완화한다는 것을 보인다. (A) 로타로드 시험은 비히클 치료된 4월령 SCA3 유전자 변이 마우스에 비해 JMF1907 치료된 4월령 SCA3 마우스(1 mg/일)의 로타로드 수행이 현저하게 개선되었음을 나타낸다. 각 포인트는 6 마우스의 평균 + S.E.를 나타낸다. (B-C) NeuN의 면역세포화학적 염색은 JMF1907의 경구 투여(1 mg/일)가 4월령째 SCA3 마우스의 교뇌핵에서의 신경세포 사멸을 현저하게 예방함을 나타내었다(SCA3 + JMF1907). 스케일 바는 50 mm이다. 각 바는 6 마우스의 평균 ± S.E.을 나타낸다. * SCA3 마우스에 비한 P < 0.01.
도 7a-도 7c는 JMF3464가 SCA3 유전자 변이 마우스의 운동 실조 및 뇌교 신경세포 사멸을 개선함을 나타낸다. (도 7a) SCA3 유전자 변이 마우스는 손상된 로타로드 수행을 나타낸다. JMF3464의 매일의 투여(0.3 mg/일)는 4월령 SCA3 마우스의 로타로드 수행을 크게 개선시켰다. (도 7b-도 7c) 신경세포 마커 NeuN의 면역세포화학적 염색은 JMF3464의 매일의 경구 치료(0.3 mg/일)가 4월령째 SCA3 유전자 변이 마우스의 교뇌핵에서의 신경세포 사멸을 현저하게 개선한다는 것을 보인다. 각 바는 6 마우스의 평균 ± S.E.을 나타낸다. # SCA3 유전자 변이 마우스에 비한 P < 0.01.
도 8의 A-B는 JMF1907를 이용한 치료가 TDP-43 유전자 변이 마우스의 운동 기능을 개선한다는 것을 나타낸다. JMF1907의 4가지 상이한 용량(3.7, 1.25, 0.5, 0.1 mg/kg)을 시험하였다. CTL: DMSO로 치료된 유전자 변이 마우스. WT: DMSO로 치료된 야생형 마우스. 통계는 2원 변량분석(two-way ANOVA)으로 수행하였다. 로타로드에 대해서, 1.5mg/kg 및 0.5mg/kg의 모든 포인트에서, 0.1mg/kg의 12-21 주에서, 및 3.7mg/kg의 10-12주에서 통계적 유의성이 달성되었다. 악력에 대해서, 모든 시험된 용량의 모든 포인트에서 통계적 유의성이 달성되었다. N= 18 (CTL), 15 (WT), 15 (0.1), 15 (0.5), 15 (1.25), 5 (3.7).
도 9는 JMF3464를 이용한 치료가 NSC34 세포에서 TDP-43의 잘못된 국재화(mislocalization)를 감소시킴을 나타낸다. 세포를 1 시간 동안 JMF3464(30 mM)로 예비 처리하고, 이후 추가 24 시간 동안 JMF3464의 존재 하에 AICAR(1 mM, Al)로 처리하였다. TDP-43(적색) 국재화는 면역 염색으로 분석하였다. 핵의 위치는 Hochest(청색)으로 마킹하였다.
도 10의 A-C는 섬유근통의 마우스 모델에 대한 JMF3464의 진통 효과를 나타낸다. (A-1 및 A-2) T1-11의 경구 투여는 섬유근통의 마우스 모델에 대해 아무런 진통 효과도 보이지 않았으며, 여기서 마우스는 근육내 산 주사 및 제니스테인 치료 후 만성 근육통을 일으켰다. 흰색 화살표는 마우스가 산 주사를 제공받은 시각을 나타낸다. 검은색 화살표는 마우스가 T1-11(p.o.)를 제공받은 시각을 나타낸다. (B) JMF3464는 섬유근통의 마우스 모델에 대한 진통 효과를 나타냈으며, 여기서 마우스는 2일간의 간헐적인 저온 스트레스를 이용한 치료 후 넓은 부위의 통증(widespread pain)을 일으켰다. JMF3464의 진통 효과는 용량 의존적이었다. 효과적인 용량은 100 mg/kg(i.p.)부터 시작했다. (C) JMF3464의 경구 투여(1 mg/kg)는 간헐적인 저온 스트레스 모델에 대한 진통 효과를 나타냈다.
정의
달리 정의되지 않은 한, 본원에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 적합한 당업자에게 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 가진다. 충돌이 생기는 경우, 정의를 포함하여 본 문헌이 제어할 것이다.
용어 "치료하다" 또는 "치료"는, 신경퇴행성 질환 및/또는 통증을 갖거나 그러한 질환 및/또는 통증에 대한 증상 또는 소인을 갖는 치료제가 필요한 대상에게, 상기 질환 및/또는 통증, 그에 대한 증상, 또는 그에 대한 소인을 치유, 완화, 경감, 구제, 개선, 또는 예방하기 위한 목적으로, 유효량의 상기 치료제를 투여하는 것을 지칭한다. 이러한 대상은 임의의 적합한 진단법으로부터의 결과에 기초하여 보건 의료 전문가에 의해 식별될 수 있다.
"유효량"은 치료된 대상에게 치료 효과를 부여하는 데 필요한 활성 화합물의 양을 지칭한다. 유효한 용량은, 당업자에게 인식되는 바와 같이, 투여 경로, 부형제 용법, 및 다른 치료적 행위와의 병용 가능성에 따라 달라질 수 있다.
미국 보건복지부 식품의약국이 발행한 문헌[Guidance for Industry and Reviewers Estimating the Safe Starting Dose in Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers]에서는 "치료적 유효량"이 하기 식으로의 계산에 의해 얻어질 수 있음이 개시되어 있다:
HED = 동물 용량(mg/kg) × (동물 중량(kg)/인간 중량(kg))0.33.
JMF 1907은 화합물 N 6-[2-(인돌-3-일)에틸]아데노신을 지칭하며 미국 특허 공개공보 20120295863 A1에서 화합물 6으로서 개시되어 있다.
화학적 합성
한 접근법에서, 염기 존재 하에 6-클로로퓨린 리보퓨라노시드(2)는 임의로 치환된 (티에닐)메탄아민(3)과 처리되어 화학식 (I)의 소정 화합물을 제공한다.
예를 들어, 디이소프로필에틸아민은 염기로서 사용되고, 6-클로로퓨린 리보퓨라노시드와 (5-브로모티엔-2-일)메탄아민과의 치환 반응은 1-프로판올의 용매에서의 가열로서 수행되어 N 6-[(5-브로모티엔-2-일)메틸]아데노신(JMF3464, 구조 1)을 얻는다.
반응식 1
Figure pct00004
반응식 2
Figure pct00005
다른 접근법에서, (2',3'-O-이소프로필리덴)아데닌(4)을 염기 이미다졸 존재 하에 tert-부틸디메틸실릴 클로라이드(TBDMSCl)와 처리하여 실릴 에테르 유도체(5)를 제공한다. 6-아미노기는 tert-부톡시카르보닐(Boc) 치환기를 보유하는 카르바메이트 6로서 보호된다. 임의로 치환된 (티에닐)메틸기가 도입되고, 산 조건에서 모든 보호기의 제거 후 화학식 (I)의 소정의 화합물이 얻어진다.
예를 들어, 화합물 6의 (5-브로모티엔-2-일)메탄올(화합물 7, 여기서 X = 5-Br, Y = OH)과의 커플링 반응은 트리페닐포스핀 및 디이소프로필 아조디카르복실레이트(DIAD)의 사용에 의해 촉진되어 화합물 8을 제공한다. 화합물 8에서의 실릴, 아세토나이드 및 Boc 기의 전체적 탈보호는 산 조건에서 달성되어 화합물 1을 제공한다.
동일한 화학적 접근법을 이용하여, 화합물 (IA)을 얻는다.
반응식 3
Figure pct00006
경구 생체이용율
시험 화합물의 경구 생체이용율을 측정하기 위해, 시험 화합물의 경구(10 mg/kg) 또는 정맥내(1 mg/kg) 투여 후 수컷 ICR 마우스(6 주령; 20-25g)로부터 혈액 샘플을 수집하였다. 기재된 기간에 수집된 혈액 샘플들을 0.1% 포름산 함유 메탄올로 추출한 후, 각 추출된 샘플 10 μL을 정량을 위해 UPLC-MSMS에 주입하였다. 결과(도 1의 A-B)는 ICR 마우스에서 T1-11 및 JMF34964의 경구 생체이용율이 각각 2.8% 및 17.4%임을 보였으며, JMF3464의 경구 흡수가 T1-11의 경구 흡수보다 6배 초과로 높음을 나타내었다.
A 2A R 및 ENT1 에의 JMF3464 결합 및 신경 세포 아폽토시스 보호
본 발명자들은 먼저 라디오리간드(radioligand) 결합 측정법을 이용하여 JMF3464의 약학적 특성을 특성화하였다. 하기 표 1에서는 T1-11, JMF1907, 및 JMF3464의 약학적 특성을 나타낸다. 나타낸 화합물의 A2A 아데노신 수용체(A2AR) 및 아데노신 수송체(ENT1)에 대한 결합은 표준 결합 프로토콜을 사용하여 특성화하였다. 표 1에 나타난 바와 같이, JMF3464는 A2AR 및 아데노신 수송체 - 평형성 뉴클레오시드 수송체(equilibrative nucleoside transporter) 1에 결합하였다. A2AR에 대한 JMF3464의 친화도는 T1-11 및 JMF1907(T1-11의 유사체)의 친화도와 유사했으며, 반면 ENT1에 대한 JMF3464의 친화도는 T1-11 및 JMF1907의 친화도보다 훨씬 우수했다. 본 발명자들의 연구는 또한 N 6-[(5-클로로티엔-2-일)메틸]아데노신(JMF3818)이 혈청 회수(serum withdrawal)에 의해 일어난 PC12 세포의 아폽토시스를 억제한다는 것도 나타내었다. 10 μM의 JMF3818은 각각 A2A 수용체 및 아데노신 수송체(ENT1)를 54% 및 96% 억제하였다.
Figure pct00007
헌팅턴 병( HD )의 유전자 변이 마우스 모델에서 헌팅턴 병( HD )의 주요 증상에 대한 유익한 효과를 가하는 JMF3464
A2AR 및 ENT1이 선조체(striatum)에 위치하고 선조체 기능에 영향을 주기 때문에, 본 발명자들은 JMF3464를 이용한 만성적 치료가 HD의 진행을 조절할 것이라는 가설을 세웠다. 본 발명자들은 A2AR 작용제가 유익한 효과를 갖는 HD의 유전자 변이 마우스 모델(R6/2)에서 JMF3464의 효과를 시험하였다. 7주령부터 마우스에의 JMF3464의 부가(0.11 mg/kg/일)는 로타로드 수행에 의해 평가된 바와 같이 운동 협응에서의 진행성 열화에 대항 작용하였다(도 3의 A). R6/2 마우스의 단축된 수명 또한 JMF3464를 사용한 지속적인(장기) 치료에 의해 개선되었다.
척수 소뇌 실조 2형( SCA2 )에 대한 JMF3464 의 유익한 효과
프로테아좀 활성을 활성화시키는 것이 R6/2 유전자 변이 마우스의 행동 수행 또는 돌연변이 Htt 응집 예방에서의 A2AR 수용체 신호 기전의 메커니즘일 수 있으므로(Huang et al., 2011 PLoS One. 6:e20934; Lee et al., 2012 PLoS One. 7:e38865), A2AR 작용제가 또한 다른 polyQ 질환, 예컨대 SCA2을 완화시키는 데 유익을 가질 수 있다는 것이 가능하다. 실제로, 본원의 데이터는 T1-11이 SCA2 유전자 변이 마우스 (ATAXN2 Q127 )에서 돌연변이 ATXN2 응집(도 4의 A) 및 행동 수행(도 4의 B)을 예방하는 데 효과적임을 나타내어, 상기 가설을 뒷받침하였다. JMF3464의 생체이용율이 T1-11보다 현저히 우수하다는 점을 고려하여, 본 발명자들은 JMF3464이 또한 SCA2에 대한 유익한 효과를 나타낼 것이라 추론하였다.
척수 소뇌 실조 3형( SCA3 )에 대한 T1 -11 및 이의 유사체의 유익한 효과
야생형 마우스에 비하여, 폴리글루타민 팽창(expanded) 아탁신-3-Q79를 발현하는 비히클 치료된 SCA3 유전자 변이 마우스는 시작 나이가 약 3-4 개월으로 손상된 로타로드 수행을 비롯한 다양한 운동 실조 증상(도 5의 A 및 도 6의 A)을 나타내였다. 도 5의 A 및 도 6의 A에 나타난 바와 같이, T1-11(1 mg/일) 또는 JMF1907(1 mg/일)의 매일의 경구 투여로 치료된 4월령 SCA3 유전자 변이 마우스는 현저하게 개선된 로타로드 수행을 나타내었다. SCA3 환자와 유사하게, SCA3 유전자 변이 마우스의 교뇌핵에서 두드러진 신경세포 사멸이 발견되었다(도 5의 B 및 도 6의 B). 로타로드 분석법의 결과에 부합하여, T1-11(도 5의 B 및 C) 또는 JMF1907(도 6의 B 및 C)의 매일의 경구 치료는 SCA3 유전자 변이 마우스에서 뇌교 신경세포 사멸을 현저하게 완화시켰다(도 5의 B 및 C 및 도 6의 B 및 C). 결과는 T1-11 또는 JMF1907의 지속적인 경구 치료가 SCA3 유전자 변이 마우스의 신경학적 및 신경병리학적 표현형을 개선한다는 증거를 제공하였다.
JMF3464는 훨씬 더 높은 생체이용율을 가진다. 따라서, JMF3464가 또한 SCA3 유전자 변이 마우스에서 돌연변이 아탁신-3-Q79 유발된 운동 실조 및 신경퇴행에 대한 유익한 효과를 가질 것으로 기대되었다. 기대한 바대로, JMF3464(0.3 mg/일)의 매일의 적용은 SCA3 유전자 변이 마우스의 운동 실조(도 7a) 및 뇌교 신경세포 사멸(도 7b 및 도 7c)을 완화하였다.
근위축성 측삭경화증( ALS )에 대한 JMF1907 및 JMF3464 의 유익한 효과
도 8의 A-B에 나타난 바와 같이, 4가지 상이한 용량(3.7 mg/kg/일, 1.25 mg/kg/일, 0.5 mg/kg/일 및 0.1 mg/kg/일)으로 JMF1907이 제공된 유전자 변이 마우스는 로타로드 및 악력 시험에서 대조군 마우스보다 현저히 우수하게 수행하였다. 1.25mg/kg의 용량이 가장 큰 유익을 나타내었다. 이러한 데이터는 운동 기능에 대한 분명한 개선을 나타낸다. T1-11의 유사체인 JMF3464 및 JMF1907는 훨씬 더 높은 생체이용율을 가진다. 따라서, JMF3464는 ALS 마우스에서 유익한 효과를 가질 것으로 기대되었다. JMF3464를 이용한 NSC34 세포의 치료는 AMPK 활성화에 의해 일어난 TDP-43의 잘못된 국재화를 정상화하였으며(도 9), 이는 JMF3464가 ALS 발병의 초기 단게를 예방할 수 있다는 개념을 뒷받침하였다. 이러한 발견들은 JMF3464가 ALS에 대한 유익한 효과를 나타낸다는 것을 뒷받침한다.
통증에 대한 JMF3464 의 유익한 효과
T1-11(i.p.)가 섬유근통(산 유발성 만성 넓은 부위 통증 및 간헐적인 저온 스트레스 모델)의 2 마우스 모델에 대해 아주 우수한 진통 효과를 나타냈으나, 이의 생체이용율은 매우 낮다. T1-11의 경구 투여(2 mg/kg 이하)는 산 유발성 만성 넓은 부위 통증 모델에 대해 아무런 진통 효과도 보이지 않았으며, 상기 마우스는 근육내 산 주사 및 제니스테인 치료 후 섬유근통 유사 통증을 일으켰다(도 10의 A). T1-11의 유사체인 JMF3464는 섬유근통의 마우스 모델에 대한 진통 효과를 나타내었으며, 상기 마우스는 2일간의 간헐적인 저온 스트레스를 이용하여 치료받은 후 만성적인 넓은 부위의 통증을 일으켰다(도 10의 B). 이의 우수한 생체이용율과 일치하여, JMF3464의 경구 투여(1 mg/kg)는 간헐적인 저온 스트레스 모델에 대한 진통 효과를 나타내었다(도 10의 C).
실시예 1
모든 시약 및 용매는 시약 등급이었으며 달리 명시되지 않은 한 추가 정제 없이 사용하였다. 테트라히드로퓨란 및 디에틸 에테르를 Na/벤조페논으로부터 증류하고 CH2Cl2를 CaH2로부터 증류하였다. 모든 공기 또는 수분 민감성 실험을 아르곤 하에 수행하였다. 모든 유리를 2시간 이상 오븐에서 건조시키고 데시케이터에서 실온으로 냉각한 후 사용하였다. 마이크로파 반응은 집속(focused) 단일 모드 마이크로파 유닛(CEM Discover)을 이용하여 실시하였다. 기계는 조작자 선택 가능(operator-selectable) 동력 아웃풋을 갖는 연속 집속 마이크로파 동력 전달 시스템으로 이루어졌다.
융점은 Yanaco 마이크로 장치(micro apparatus)에서 기록하였다. 선광도는 일본 JASCO Co. DIP-1000의 디지털 선광계에서 측정하였다. [a]D 값은 10-1deg cm2 g-1 단위로 제공된다. 자외선(IR) 스펙트럼은 Nicolet Magna 550-II에서 기록하였다. NMR 스펙트럼은 Varian Unity Plus-400(400 MHz)에서 얻었으며 화학 시프트(δ)는 CHCl3/CDCl3에 대해 δH 7.24/ δC 77.0(t의 중심선), (CH3)2CO/(CD3)2CO에 대해 δH 2.05/ δC 29.92, CH3OH/CD3OD에 대해 δH 3.31/ δC 49.0, 및 (CH3)2SO/(CD3)2SO에 대해 δH 2.49 (m) /δC 39.5 (m)에 대한 백만분율(ppm) 단위로 기록하였다. 분할 패턴(splitting pattern)은 s(단일선), d(이중선), t(삼중선), q(사중선), m(다중선) 및 br(브로드)로 기록하였다. 결합 상수(J)는 Hz로 제공한다. ESI-MS 실험을 Bruker Daltonics BioTOF III 고해상도 질량 분광계에서 수행하였다. 분석용 박막 크로마토그래피(TLC)를 E. Merck 실리카 겔 60 F254 플레이트(0.25 mm)에서 수행하였다. 화합물을 UV, 아니스알데히드 또는 닌히드린 스프레이로 시각화하였다. 컬럼 크로마토그래피를 70-230 메쉬 실리카 겔로 패킹된 컬럼에서 수행하였다.
화합물의 순도를 280 nm 파장에서의 검출을 이용하는 HPLC(Agilent HP-1100)에 의해 ≥ 95% 으로 평가하였다.
2',3'- O - 이소프로필리덴 -5'- O -( tert - 부틸디메틸실릴 )아데노신(5)
얼음조에서 냉각한, 무수 CH2Cl2(12 mL) 중 2',3'-(O-이소프로필리덴)아데노신(4, 614 mg, 2.00 mmol) 및 이미다졸(408 mg, 6 mmol)의 용액에, N2 분위기 하에 0℃에서 tert-부틸디메틸실릴 클로라이드(TBDMSCl, 452 mg, 3 mmol)를 첨가하였다. 얼음조를 제거하고, 혼합물을 실온에서 12 시간 동안 교반하였다. 메탄올(4 mL)을 첨가하고, 혼합물을 추가 15분 동안 교반한 후, 회전 증발에 의해 감압 하에 농축시켰다. 고형 잔여물을 CH2Cl2에 용해시키고, 1 M HCl, 탈이온수 및 염수(brine)로 연속하여 세척하였다. 유기층을 수집하고, MgSO4 상에서 건조한 후 여과하였다. 여과액을 감압 하에 농축시켜 백색 고형물로서 화합물 5(819 mg, 1.57 mmol, 78% 수율)를 얻었다.
6- N - tert - 부톡시카르보닐 -2',3'- O - 이소프로필리덴 -5'- O -( tert - 부틸디메틸실릴 )아데노신 (6)
무수 THF(10 mL) 중 화합물 5(819 mg, 1.57 mmol) 및 4-(디메틸아미노)피리딘 (DMAP, 촉매량)의 용액을 N2 하에 2 분 동안 교반하였다. 용액을 얼음조에서 냉각하고, 디-tert-부틸 디카보네이트((Boc)2O, 1.08 mL, 4.71 mmol)를 드롭 방식으로 첨가하였다. 얼음조를 제거하고, 혼합물을 실온에서 12 시간 동안 교반하였다. 반응이 완료된 후, 혼합물을 회전 증발에 의해 감압 하에 농축시켰다. 미정제 생성물을 CH2Cl2에 용해시키고, 1 M HCl, 탈이온수 및 염수로 연속하여 세척하였다. 유기층을 수집하고, MgSO4 상에서 건조한 후 여과하였다. 여과액을 감압 하에 농축시켜 엷은 황색 발포물로서 비스-Boc 화합물(859 mg, 1.38 mmol, 87% 수율)을 얻었다.
메탄올(8 mL) 중 비스-Boc 화합물(400 mg, 0.64 mmol)의 용액에, 메틸아민(메탄올 중 40% 용액 0.25 mL, 2.54 mmol)을 첨가하였다. TLC 분석이 출발 물질의 완전 소모를 나타내기까지 혼합물을 20시간 동안 실온에서 교반하였다. 혼합물을 회전 증발에 의해 감압 하에 농축시켰다. 미정제 생성물을 EtOAc/헥산(0:1 내지 2:1 구배)의 용리를 이용하는 실리카 겔 컬럼 상의 크로마토그래피에 의해 정제하여 엷은 황색 오일로서 화합물 6(300 mg, 0.57 mmol, 88% 수율)을 얻었다.
6- N -(5- 브로모티엔 -2-일) 메틸 -6- N - tert - 부톡시카르보닐 -2',3'- O - 이소프로필리덴 -5'- O - ( tert - 부틸디메틸실릴 )아데노신 (8, X = 5-Br)
무수 THF(9 mL) 중 화합물 6(300 mg, 0.57 mmol), (5-브로모티엔-2-일)메탄올(164 mg, 0.85 mmol) 및 트리페닐포스핀(226 mg, 0.85 mmol)의 용액을 N2 분위기 하에 2 분 동안 45℃에서 교반하였다. 디이소프로필 아조디카르복실레이트(DIAD, 0.168 mL, 0.85 mmol)를 드롭 방식으로 첨가하였다. TLC 분석이 화합물 6의 소진을 나타내기까지 혼합물을 추가 45 분 동안 교반하였다. 혼합물을 회전 증발에 의해 감압 하에 농축시켰다. 미정제 생성물을 플래시 크로마토그래피(EtOAc/헥산 = 1:9)로 정제하여 엷은 황색 오일로서 화합물 8(X = 5-Br)을 얻었다.
N 6 -[(5- 브로모티엔 -2-일) 메틸 ]아데노신( JMF3464 )
방법 A: 탈이온수(5 mL) 및 THF(1 mL) 중 화합물 8(X = 5-Br, 138 mg, 0.19 mmol)의 현탁액을 교반하고 얼음조에서 냉각하였다. 트리플루오로아세트산(5 mL)을 0℃에서 드롭 방식으로 첨가하였다. 혼합물을 10 분 동안 교반하고, 얼음조를 제거한 후, 혼합물을 추가 30 분 동안 교반하였다. 혼합물을 회전 증발에 의해 감압 하에 농축시켰다. 미정제 생성물을 플래시 크로마토그래피(MeOH/EtOAc = 1:49)로 정제하여 백색 분말로서 JMF3464(화합물 1)을 얻었다.
방법 B: 1-프로판올(20 mL) 중 (5-브로모티엔-2-일)메탄아민(768 mg, 4 mmol), 6-클로로퓨린 리보퓨라노시드(143 mg, 0.5 mmol), 및 디이소프로필에틸아민(2 mL, 12 mmol)의 혼합물을 7 시간 동안 70℃에서 가열하였다. 원하는 생성물 및 미반응한 (5-브로모티엔-2-일)메탄아민을 함유하는 혼합물을 2 시간 동안 실온에서 THF(6 mL) 중 디-tert-부틸 디카보네이트(0.92 mL, 4 mmol) 및 NaHCO3(672 mg, 8 mmol)으로 처리하였다. 혼합물을 회전 증발에 의해 농축하고, 플래시 크로마토그래피(실리카 겔, MeOH/EtOAc = 1:9)에 의해 정제하였다. 원하는 화합물 JMF3464(59 mg, 27% 수율)을 MeOH로부터 재결정에 의해 얻었다. 생성물의 순도는 50% 수성 MeOH 구배의 용리를 이용한 HC-C18 컬럼(Agilent, 4.6 × 250 mm, 5 μM) 상의 HPLC에 의해 나타난 바와 같이 96%였다.
방법 C: 밀봉관(15 mL)에 EtOH(8 mL) 중 (5-브로모티엔-2-일)메탄아민(384 mg, 2 mmol), 6-클로로퓨린 리보퓨라노시드 (287 mg, 1 mmol), 및 디이소프로필에틸아민(3 mL, 17 mmol)을 첨가하였다. 밀봉관을 집속 모노모드 마이크로파 반응기(CEM Discover)의 공동 내에 위치시키고 80℃에서 20 분 동안 100 W에서 조사하였다. 용매를 회전 증발에 의해 제거하였다. 잔여물을 플래시 크로마토그래피(실리카 겔, MeOH/EtOAc = 1:9)에 의해 정제하고, MeOH로부터 재결정하여 원하는 생성물인 JMF3464(159 mg, 36% 수율)을 얻었다.
C15H16BrN5O4S; 황색 분말; mp 141.4-141.7℃; [α]25 D = -43.0 (DMSO, c = 1.0); TLC (2-프로판올/헥산 (2:3)) R f = 0.38; 1H NMR (DMSO-d 6 , 400 MHz) δ 8.55 (1 H, br s), 8.40 (1 H, s), 8.29 (1 H, br s), 7.03 (1 H, d, J = 3.6 Hz), 6.78 (1 H, d, J = 4.0 Hz), 5.90 (1 H, d, J = 6.0 Hz), 5.45 (1 H, d, J = 6.0 Hz), 5.34-5.32 (1 H, m), 5.19 (1 H, d, J = 4.4 Hz), 4.76 (2 H, s), 4.63-4.59 (1 H, m), 4.15-4.14 (1 H, m), 3.96-3.95 (1 H, m), 3.69-3.65 (1 H, m), 3.57-3.52 (1 H, m), 13C NMR (DMSO-d 6 , 100 MHz) δ 153.9, 152.2, 148.5, 145.0, 140.2, 129.6, 126.3, 120.0, 109.7, 87.9, 85.8, 73.5, 70.6, 61.6, 42.9, ESI-MS calcd for C15H17BrN5O4S: 442.0185, found: m/z 442.0189 [M + H]+.
N 6 -(티엔-3-일- 메틸 )아데노신 ( JMF3461 )
1-프로판올(25 mL) 중 3-(아미노메틸)티오펜(0.25 mL, 2.5 mmol), 6-클로로퓨린 리보퓨라노시드(143 mg, 0.5 mmol), 및 디이소프로필에틸아민(2 mL, 12 mmol)의 혼합물을 6 시간 동안 80℃에서 가열하였다. 혼합물은 회전 증발에 의해 농축시키고, MeOH로부터 재결정하여 원하는 생성물 JMF3461(136 mg, 75% 수율)을 수득하였다. 생성물의 순도는 50% 수성 MeOH 구배의 용리를 이용한 HC-C18 컬럼(Agilent, 4.6 × 250 mm, 5 μM) 상의 HPLC에 의해 나타난 바와 같이 99%였다. C15H17N5O4S; 황색 분말; mp 134.3-135.1℃; [α]24 D = -58.6 (DMSO, c = 1.0); TLC (2-프로판올/헥산, (2:3)) R f = 0.33; 1H NMR (DMSO-d 6 , 400 MHz) δ 8.36 (2 H, br s), 8.22 (1 H, s), 7.43 (1 H, dd, J = 3, 5 Hz), 7.28 (1 H, d, J = 1.6 Hz), 7.09 (1 H, d, J = 4.8 Hz), 5.88 (1 H, d, J = 6.4 Hz), 5.43 (1 H, d, J = 6.0 Hz), 5.38 (1 H, q, J = 4.6 Hz), 5.17 (1 H, d, J = 4.4 Hz), 4.69 (2 H, s), 4.63-4.16 (1 H, m), 4.14-4.13 (1 H, m), 3.97-3.95 (1 H, m), 3.69-3.64 (1 H, m), 3.57-3.52 (1 H, m), 13C NMR (DMSO-d 6 , 100 MHz) δ 154.4, 152.3, 148.5, 140.8, 139.9, 127.9, 125.1, 120.0, 119.8, 87.9, 85.9, 73.5, 70.7, 61.7, 42.9; ESI-MS calcd for C15H18N5O4S: 364.1080, found: m/z 364.1079 [M + H]+.
N 6 -(티엔-2-일- 메틸 )아데노신( JMF3462 )
1-프로판올(25 mL) 중 2-(아미노메틸)티오펜(0.25 mL, 2.5 mmol), 6-클로로퓨린 리보퓨라노시드(143 mg, 0.5 mmol), 및 디이소프로필에틸아민(2 mL, 12 mmol)의 혼합물을 7 시간 동안 80℃에서 가열하였다. 혼합물을 회전 증발에 의해 농축시키고, MeOH로부터 재결정하여 원하는 생성물 JMF3462(154 mg, 85% 수율)을 수득하였다. 생성물의 순도는 50% 수성 MeOH 구배의 용리를 이용한 HC-C18 컬럼(Agilent, 4.6 × 250 mm, 5 μM) 상의 HPLC에 의해 나타난 바와 같이 99%였다. C15H17N5O4S; 백색 분말; mp 149.2-149.7℃; [α]25 D = -68.2 (DMSO, c = 1.0); TLC (2-프로판올/헥산, (2:3)) R f = 0.35; 1H NMR (DMSO-d 6 , 400 MHz) δ 8.51 (1 H, br s), 8.39 (1 H, s), 8.27 (1 H, br s), 7.32 (1 H, d, J = 5.2 Hz), 7.28 (1 H, d, J = 3.2 Hz), 6.93 (1 H, dd, J = 1.8, 2.6 Hz), 5.89 (1 H, d, J = 6.0 Hz), 5.46-5.45 (1 H, m), 5.36 (1 H, q, J = 4.6 Hz), 5.20-5.18 (1 H, m), 4.64 (2 H, s), 4.16-4.13 (1 H, m), 3.97-3.95 (1 H, m), 3.70-3.65 (1 H, m), 3.58-3.52 (1 H, m), 3.57-3.52 (1 H, m), 13C NMR (DMSO-d 6 , 100 MHz) δ 154.1, 152.2, 148.5, 142.9, 140.0, 126.5, 125.3, 124.7, 120.0, 87.9, 85.9, 73.5, 70.6, 61.6, 42.9; ESI-MS calcd for C15H18N5O4S: 364.1080, found: m/z 364.1081 [M + H]+.
N 6 -[(4- 브로모티엔 -2-일) 메틸 ]아데노신
1-프로판올(30 mL) 중 (4-브로모티엔-2-일)메탄아민(1152 mg, 6 mmol), 6-클로로퓨린 리보퓨라노시드(214 mg, 0.75 mmol), 및 디이소프로필에틸아민(3 mL, 18 mmol)의 혼합물을 7 시간 동안 70℃에서 가열하였다. 원하는 생성물 및 미반응한 (3-브로모티엔-2-일)메탄아민을 함유하는 혼합물을 2 시간 동안 실온에서 THF(8 mL) 중 디-tert-부틸 디카보네이트(1.4 mL, 6 mmol) 및 NaHCO3(1 g, 1.2 mmol)로 처리하였다. 혼합물을 회전 증발에 의해 농축시키고 플래시 크로마토그래피(실리카 겔, MeOH/EtOAc = 1:9)로 정제하여 N 6-[(4-브로모티엔-2-일)메틸]아데노신을 얻었다.
N 6 -[(3- 브로모티엔 -2-일) 메틸 ]아데노신
밀봉관(15 mL)에 EtOH(10 mL) 중 (3-브로모티엔-2-일)메탄아민(576 mg, 3 mmol), 6-클로로퓨린 리보퓨라노시드(430 mg, 1.5 mmol), 및 디이소프로필에틸아민(4.5 mL, 15.5 mmol)을 첨가하였다. 밀봉관을 집속 모노모드 마이크로파 반응기(CEM Discover)의 공동에 위치시키고 80℃에서 20 분 동안 100 W에서 조사하였다. 용매를 회전 증발에 의해 제거하였다. 잔여물을 플래시 크로마토그래피(실리카 겔, MeOH/EtOAc = 1:9)에 의해 정제하여 N 6-[(3-브로모티엔-2-일)메틸]아데노신을 얻었다.
N 6 -[(2- 브로모티엔 -3-일) 메틸 ]아데노신
밀봉관(15 mL)에 EtOH(8 mL) 중 (2-브로모티엔-3-일)메탄아민(384 mg, 2 mmol), 6-클로로퓨린 리보퓨라노시드(287 mg, 1 mmol), 및 디이소프로필에틸아민(3 mL, 17 mmol)을 첨가하였다. 밀봉관을 집속 모노모드 마이크로파 반응기(CEM Discover)의 공동에 위치시키고 80℃에서 20 분 동안 100 W에서 조사하였다. 용매를 회전 증발에 의해 제거하였다. 잔여물을 플래시 크로마토그래피(실리카 겔, MeOH/EtOAc = 1:9)에 의해 정제하여 N 6-[(2-브로모티엔-3-일)메틸]아데노신을 얻었다.
N 6 -[(4- 브로모티엔 -3-일) 메틸 ]아데노신
1-프로판올(20 mL) 중 (4-브로모티엔-3-일)메탄아민(768 mg, 4 mmol), 6-클로로퓨린 리보퓨라노시드(143 mg, 0.5 mmol), 및 디이소프로필에틸아민(2 mL, 12 mmol)의 혼합물을 7 시간 동안 70℃에서 가열하였다. 원하는 생성물 및 미반응한 (4-브로모티엔-3-일)메탄아민을 함유하는 혼합물을 2 시간 동안 실온에서 THF(6 mL) 중 디-tert-부틸 디카보네이트(0.92 mL, 4 mmol) 및 NaHCO3(672 mg, 8 mmol)으로 처리하였다. 혼합물을 회전 증발에 의해 농축시키고 플래시 크로마토그래피(실리카 겔, MeOH/EtOAc = 1:9)에 의해 정제하여 N 6-[(4-브로모티엔-3-일)메틸]아데노신을 얻었다.
6- N -(5- 브로모티엔 -3-일) 메틸 -6- N - tert - 부톡시카르보닐 -2',3'- O - 이소프로필리덴 -5'- O -( tert - 부틸디메틸실릴 )아데노신
무수 THF(10 mL) 중 화합물 6(360 mg, 0.68 mmol), (5-브로모티엔-3-일)메탄올(197 mg, 1.02 mmol) 및 트리페닐포스핀(271 mg, 1.02 mmol)의 용액을 N2 분위기 하에 2 분 동안 45℃에서 교반하였다. 디이소프로필 아조디카르복실레이트(DIAD, 0.20 mL, 1.02 mmol)를 드롭 방식으로 첨가하였다. TLC 분석이 화합물 6의 소진을 나타내기까지 혼합물을 교반하였다. 혼합물을 회전 증발에 의해 감압 하에 농축시켰다. 미정제 생성물을 플래시 크로마토그래피(EtOAc/헥산 = 1:9)로 정제하여 6-N-(5-브로모티엔-3-일)메틸-6-N-tert-부톡시카르보닐-2',3'-O-이소프로필리덴-5'-O- (tert-부틸디메틸실릴)아데노신을 얻었다.
N 6 -[(5- 브로모티엔 -3-일) 메틸 ]아데노신
탈이온수(5 mL) 및 THF(1 mL) 중 6-N-(5-브로모티엔-3-일)메틸-6-N-tert-부톡시카르보닐-2',3'-O-이소프로필리덴-5'-O-(tert-부틸디메틸실릴)아데노신(138 mg, 0.19 mmol)의 현탁액을 교반하고 얼음조에서 냉각하였다. 트리플루오로아세트산(5 mL)을 0℃에서 드롭 방식으로 첨가하였다. 혼합물을 10 분 동안 교반하고, 얼음조를 제거한 후, 혼합물을 추가 30 분 동안 교반하였다. 혼합물을 회전 증발에 의해 감압 하에 농축시켰다. 미정제 생성물을 플래시 크로마토그래피(MeOH/EtOAc = 1:49)에 의해 정제하여 N 6-[(5-브로모티엔-3-일)메틸]아데노신을 얻었다.
(5- 클로로티엔 -2-일) 메탄아민
THF(13 mL) 중 2-(아미노메틸)티오펜(1 mL, 10 mmol), 디-tert-부틸 디카보네이트(2.5 mL, 11 mmol), 및 NaHCO3(840 mg, 10 mmol)의 혼합물을 3 시간 동안 실온에서 교반하여 엷은 황색 고형물을 함유하는 현탁액을 제공하였다. 혼합물을 감압 하에 농축시키고, 잔여물을 CH2Cl2 및 H2O로 추출하였다. 유기상을 MgSO4 상에서 건조하고 여과한 후, EtOAc/헥산(1:20)의 용리를 이용한 실리카 겔 컬럼 상의 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하여 tert-부틸 (티엔-2-일)메틸 카르바메이트(C10H15NO2S, 1.62 g, 76% 수율)을 얻었다.
벤젠(0.3 mL) 중 tert-부틸 (티엔-2-일)메틸 카르바메이트(106 mg, 0.5 mmol), N-클로로숙신이미드(73 mg, 0.55 mmol)의 혼합물을 80℃에서 교반하였다. 2 시간 후, 아세트산(0.3 mL, 5 mmol)을 첨가하고 추가 21 시간 동안 반응시켰다. 혼합물을 CH2Cl2 및 H2O로 추출하였다. 유기상을 MgSO4 상에서 건조하고 여과한 후, EtOAc/헥산(1:20)의 용리를 이용한 실리카 겔 컬럼 상의 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하여 tert-부틸 (5-클로로티엔-2-일)메틸 카르바메이트(C10H14ClNO2S, 82.6 mg, 67% 수율)을 얻었다.
CH2Cl2(1 mL) 중 상기 제조된 화합물(65 mg, 0.26 mmol) 및 TFA(1 mL, 13 mmol)의 혼합물을 실온에서 3 시간 동안 교반하였다. 용액을 감압 하에 농축시켜 (5-클로로티엔-2-일)메탄아민(~100% 수율)을 얻었다. C5H6NSCl; 엷은 황색 고형물; 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 7.07 (1 H, d, J = 4.0 Hz), 6.95 (1 H, d, J = 3.6 Hz), 4.26 (2 H, s); 13C NMR (100 MHz, CD3OD) δ 134.9, 132.8, 130.7, 128.0, 38.8; ESI-HRMS calcd for C5H7ClNS: 147.9988, found: m/z 147.9995 [M + H]+.
N 6 -[(5- 클로로티엔 -2-일) 메틸 ]아데노신 ( JMF3818 )
EtOH(1 mL) 중 (5-클로로티엔-2-일)메탄아민 (35.4 mg, 0.24 mmol), 6-클로로퓨린 리보퓨라노시드 (0.12 mmol) 및 디이소프로필에틸아민(0.36 mL, 2 mmol)의 혼합물을 30분 동안 마이크로파 조사에 의해 80℃의 밀봉관에서 교반하였다. 혼합물을 실온으로 냉각하고, 감압 하에 농축시켜 엷은 황색 오일을 얻었으며, 이를 H2O 및 MeOH로 연속하여 세척하여 표제 화합물 JMF3818을 얻었다. C15H16ClN5O4S; 백색 고형물; 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 8.29 (1 H, s), 8.27 (1 H, s), 6.88 (1 H, d, J = 3.6 Hz), 6.79 (1 H, d, J = 3.6 Hz), 5.96 (1 H, d, J = 6.8 Hz), 4.74-4.77 (1 H, m), 4.32-4.34 (1 H, m), 4.17 (1 H, d, J = 2.8 Hz), 3.89 (1 H, dd, J = 12.4, 2.0 Hz), 3.75 (1 H, dd, J = 12.4, 2.8 Hz); 13C NMR (100 MHz, CD3OD) δ 156.0, 153.6, 142.8, 142.0, 129.9, 127.0, 126.6, 121.7, 91.5, 88.4, 75.6, 72.9, 63.7, 40.4; ESI-HRMS calcd for C15H17ClN5O4S: 398.0690, found: m/z 398.0692 [M + H]+.
약동학 연구. 화합물을 생리식염수 중 수용액으로 투여하였다. 수컷 ICR 마우스를 BioLASCO Taiwan Co., Ltd사로부터 구입하였다. 시험 화합물(T1-11 및 JMF3464)의 경구 생체이용율을 측정하기 위해, 시험 화합물의 경구(10 mg/kg) 또는 정맥내(1 mg/kg) 투여 후 수컷 ICR 마우스(6 주령; 20-25g)로부터 혈액 샘플을 수집하였다. T1-11에 대하여, 혈액 샘플을 정맥내 투여 후 2, 10, 30, 60, 120, 360 분째에 수집하고, 경구 투여 후 15, 30, 45, 60, 120, 360 분째에 수집하였다. JMF3464에 대하여, 혈액 샘플을 정맥내 투여 후 2, 10, 30, 60, 120, 240, 360, 480 분째에 수집하고, 경구 투여 후 15, 30, 60, 90, 120, 240, 360, 480째에 수집하였다. 혈액 샘플을 0.1% 포름산을 갖는 메탄올로 추출한 후, 10 μL의 추출된 샘플을 정량을 위해 UPLC-MSMS에 주입하였다.
비구획 모델에 데이터를 적합화하는 약동학 프로그램 WinNonlin을 사용하여 약동학 파라미터를 얻었다. 최종 샘플링 시각까지의 혈장 농도 대 시간 곡선 하 면적(AUC)(AUC0 -120), 시간 무한대까지의 AUC(AUC0 -∞), 종결 단계 반감기(terminal-phase half-life)(T1 /2), 혈장 중 화합물 최대 농도(Cmax), Cmax 시각(Tmax), 및 곡선의 종결부와 연관된 1차속도 상수(k)를 비롯한 약동학 파라미터를 시간 대 로그 농도의 선형 회귀를 통해 추산하였다. 총 혈장 청소율(CL)을 용량/AUCi .v.으로 계산하였다. 경구 투여에 의한 시험 화합물의 경구 생체이용율(F)을 경구 용량의 AUC0 -∞를 i.v. 용량의 AUC0 -∞으로 나누어 계산하였다.
실시예 2
라디오리간드 결합 측정법. 표준 결합 프로토콜을 사용하여 MDS Pharma Services Taiwan(대만 타이페이)에 의해 라디오리간드 결합 측정을 수행하였다. A2AR 결합 측정법에 대하여, 인간 A2AR을 과다발현하는 HEK293 세포로부터 수집한 막 단백질을 25℃에서 90 분 동안 3H-CGS21680(50 nM)을 함유하는 반응 버퍼[50 mM Tris-HCl(pH 7.4), 10 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 및 2 U/mL 아데노신 데아미나아제]에서 배양하였다. 비특이적 결합을 50 μM 아데노신-5'-N-에틸카르복사미드의 존재 하에 평가하였다. A3R에 대한 T1-11의 결합 친화도를 측정하기 위해, 인간 A3R을 과다 발현하는 중국 햄스터 난소(CHO)-K1 세포로부터 수집한 막 단백질을, 25 mM HEPES(pH 7.4), 5 mM MgC2, 1 mM CaCl., 및 0.1% 소 혈청 알부민을 함유하는 반응 버퍼 중 25 ℃에서 60 분 동안 3H-AB-MECA (0.5 nM)로 배양하였다. 비특이적 결합은 1 μM IB-MECA(Tocris Bioscience, 미국 미주리주 엘리스빌)의 존재 하에 평가하였다. 아데노신 수송체에 대한 결합 측정법은 상기 기술된 바와 같이 수행하였다. 덩컨 하틀리(Duncan Hartley) 유래 기니 피그의 대뇌 피질로부터 수집된 막 분획을 50 mM Tris-HCl(pH 7.4) 함유 배양 버퍼 중 25℃에서 30 분 동안 3H-라벨링된 6-[(4-니트로벤질)티오]-9-β-D-리보퓨라노실퓨린(NBTI, 0.5 nM)으로 배양하였다. 비특이적 결합을 평형성 뉴클레오시드 수송체의 효과적인 억제제인 5 μM NBTI 존재 하에 평가하였다. NBTI가 ENT1의 고친화도 억제제이며, 0.5 nM에서 인간 (h)ENT1 만을 억제한다는 점에 유의한다. 반응을 GF/B 유리 섬유 상의 여과 및 반응 버퍼로의 세척에 의해 종결시켰다.
세포 배양 및 일시적 형질전환
American Type Culture Collection(ATCC; 미국 버지니아주 마나서스)로부터 구입한 래트 PC12 세포를 10% 말 혈청 및 5% FBS 보충된 DMEM에서 유지하고 37℃ CO2 배양기(5%)에서 배양하였다. LIPOFECTAMINETM 2000(Invitrogen)를 비히클로서 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 세포 내에 플라스미드를 도입하였다. 플라스미드는 미국 유타대학교 신경과 펄스트 박사(Dr. Pulst)가 친절히 제공해주었다. 통상적으로, 5 μL의 LIPOFECTAMINE™ 2000과 조합된 5 ㎍의 DNA를 6웰 플레이트의 각 웰에 가하였다. 플레이팅 수(plating number)는 (1~1.5) x 106 세포/웰이었다. 6 시간 동안의 형질전환 후, 세포를 추가 24 시간 동안 시약으로 처리하였다. 영상을 Zeiss Axiovert 200M 역 형광 현미경(독일 괴팅겐)으로 취하였다.
MTT 기법. 생존을 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐 테트라졸륨 브로마이드 (MTT) 대사 기법으로 평가하였다. 간략하게는, 처리 후에, MTT를 배지(0.5mg/ml)에 첨가하고 2~3 시간 동안 37℃에서 배양하였다. 플레이팅 수는 96웰 플레이트에서 1x104 세포/웰이었다. 배지를 폐기한 후, DMSO를 웰에 가하여 포마르잔 결정(formazan crystal)을 용해시키고, 각 웰에서 570 nm 및 630 nm에서의 흡광도를 마이크로 효소 면역 측정법(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) 판독기 상에서 측정하였다.
실시예 3
동물 및 약물 투여. 수컷 R6/2 마우스(Mangiarini et al., 1996 Cell. 87:493-506) 및 한배새끼 대조군을 처음에 Jackson Laboratories(미국 메인주 바 하버)로부터 얻어, 암컷 대조군 마우스(B6CBAFI/J)과 교배시켰다. 새끼들을, CAG 반복의 수가 약 150으로 유지되도록 전이유전자 (5'-CCGCTCAGGTTCTGCTTTTA-3'; 서열번호: 1, 및 5'-GGCTGAGGAAGCTGAGGAG-3'; 서열번호: 2)에 위치한 프라이머를 사용하여 꼬리 조직으로부터 추출된 유전체 DNA의 중합효소 연쇄 반응(PCR) 유전형질 분석 기법(genotyping technique)으로 식별하였다. 동물들을 12/12 시간 명암 주기 하에 의생명과학 동물 사육 시설 기관(Institute of Biomedical Sciences Animal Care Facility)에서 사육하였다. 마우스의 체중을 하루 1회 기록하였다. 동물 실험은 아카데미아 시니카 동물 사육 기관 및 이용 위원회(대만 타이페이)에 의해 승인된 프로토콜 하에 수행하였다.
로타로드 수행. 운동 협응을 2 분의 기간 동안 일정한 속도(12 rpm)에서 로타로드 기구(UGO BASILE, 이탈리아 코메리오)를 사용하여 평가하였다(Carter et al., 1999 J Neurosci. 19:3248-3257). 모든 마우스는 로타로드 기구에 익숙해지도록 4주령째 2일 동안 훈련하였다. 이후 동물들을 4~12주령째 주당 3회 시험하였다. 각 시험에 대해, 동물들은 회전 시작 전에 기구에 위치되었다. 낙하 지연시간을 자동적으로 기록하였다. 각 마우스는 각 시도에 대해 최대 2분의 3회의 시도가 주어졌다.
실시예 4
동물. C57BL/6 마우스를 국립 실험 동물 센터(대만)에서 구입하였다. 유전자 변이 마우스(ATAXN2 Q127 )는 닥터 펄스트에 의해 제공되었다. 마우스를 12/12 시간 명암 주기 및 조절된 온도(22±2℃) 하에 방음실에서 유지하였다. 먹이와 물은 자유식으로 공급하였다. NIH 실험동물의 관리와 사용에 관한 지침(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)의 원리 및 지침에 따라, 사용된 동물의 수 및 이들의 통증 및 불편을 최소화하는 모든 노력을 다하였다. 이 실험들은 또한 중국 국립 의약 연구소(National Research Institute of Chinese Medicine)의 동물 사육 기관 및 이용 위원회의 검수 및 승인을 받았다(승인 번호: 100-15).
필터 지연 기법. 본 방법은 몇 가지 변경된 문헌[Wanker et al. (1999 Methods Enzymol. 309:375-386)]에 기술된 바에 따랐다. 간략하게 말하자면, 수확된 세포를 용균 버퍼(50 mM Tris-HCl (pH 8.8), 100 mM NaCl, 5.0 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 및 1x 프로테아제 억제제 칵테일 함유 0.5%(w/v) IPGEAL (Roche Diagnostics, 미국 인디애나주 인디아나폴리스))에 재현탁하고 10 초(1 펄스/s) 동안 초음파 처리하였다. 각 그룹당 동일한 단백질 농도(15~20 ㎍/웰)를 Bio-Dot SF 장치(Bio-Rad, 미국 캘리포니아주 헐큘러스)를 사용하여 2% 나트륨 도데실술페이트 (SDS)-예비평형화된 셀룰로오스-아세테이트 막(0.2 μM; Whatman, 영국 켄트주 메이드스톤)을 통해 여과하였다. 흡인 중에, 각 웰을 200 μL 0.1% SDS로 2회 세척하였다. 블롯(blot)을 1 시간 동안 3% 탈지 분유 함유 TBS(100 mM Tris-HC1 및 150 mM NaC1; pH 7.4)로 블로킹한 후 0.02% NaN3를 갖는 3% 소 혈청 알부민 (BSA) 중 항-폴리글루타민(1:5000; MAB1574) 항체와 함께 배양하여(4℃ 밤새) 정상 및 돌연변이 ATAXN2를 탐지하였다. 후속 방법은 상기 기술된 바와 같았다.
로타로드 수행. 5 주령째의 야생형 및 유전자 변이 마우스를 이 연구에서 사용하였다. 운동 협응을 5 분의 기간 동안 가속된 속도(10~28 rpm)에서 로타로드 기구(UGO BASILE, 이탈리아 코메리오)를 사용하여 평가하였다. 모든 마우스는 로타로드 기구에 익숙해지도록 5주령째 2일 동안 훈련하였다. 한편, 상기 주간 유전자 변이 마우스의 일부는 그의 매일 마시는 물에 용해된 T1-11를 섭취하는 것을 시작하였다. 이후 동물들을 6주령으로부터 주당 2회 공식 시험하였다. 각 시험에 대해, 동물들은 회전 시작 전에 장치에 위치되었다. 낙하 지연시간을 자동적으로 기록하였다. 각 마우스는 각 시도에 대해 최대 2분의 3회의 시도가 주어졌다. 마우스는 시도들 사이에 20~30 분의 휴식이 허용되었다.
실시예 5
행동 시험. 마우스의 균형 및 협응 기능을 로타로드 시험을 수행함으로써 측정하였다. 마우스를 로타로드 기구(가속 모델, Ugo Basile Biological Research Apparatus)의 움직이는 드럼 상에 위치시켰으며, 이를 마우스가 드럼으로부터 플레이트로 낙하하여 타이머를 정지시키기까지 가속하였다. 낙하 지연시간을 4 일에 걸쳐 4회의 매일의 시도로 측정하였다.
면역조직화학적 염색. 야생형 또는 SCA3 유전자 변이 마우스를 마취시키고 PBS 중 4% 파라포름알데히드로 경심 관류(perfused transcardially)하였다. 뇌를 Tissue-Tek 포매 배지로 평형화하고 액체 질소로 냉동시켰다. 동결절편(cryostat sectioning)을 0.1 % Triton X-100에 투과화시킴으로써 관상면(Coronal section)(20 μM)을 제조하고, 희석된 항-NeuN 단일클론 항혈청(Chemicon)으로 48 시간 동안 4℃에서 배양하였다. 이어서, 절편을 세척하고 바이오티닐화 말 항-마우스 IgG로 배양하고 이어서 아비딘-바이오틴-호스래디시(horseradish) 퍼록시다아제 복합체로 배양하였다. 이후 절편을 세척하고 디아미노벤지딘 용액에서 성장시켰다. StereoInvestigator 소프트웨어(MBF Bioscience)의 도움으로 Retiga-2000R CCD 카메라(QImaging) 및 3축 컴퓨터 제어 MAC 600 구동 스테이지(Ludl Electronics)가 구비된 Leica DM2500 현미경으로 NeuN 양성 신경세포를 시각화하고 계수하였다. 각 분석은 마우스당 15 뇌 절편의 프로세싱을 포함하였다.
실시예 6
동물 및 약물 투여. 유전자 변이 마우스 B6SJL-Tg(Prnp-TARDBP)4Jlel/J를 Jackson Laboratory(미국 메인주 바 하버)로부터 구입하고, 대만 타이난의 국립 실험 동물 센터에서 사육하였다. 유전자 변이 마우스를 포워드 프라이머 5'-GGT GGT GGG ATG AAC TTT GG-3' (서열번호: 3) 및 리버스 프라이머 5'-GTG GAT AAC CCC TCC CCC AGC CTA GAC-3' (서열번호: 4)를 사용하는 PCR로 스크리닝하였다. 야생형 마우스는 비 유전자 변이 한배새끼들이었다. 6주령의 마우스는, 복부의 외측 복측(ventral lateral) 측면에 피하 매립되도록, 나타난 바와 같이 DMSO 또는 JMF1907를 포함하는 ALZET 마이크로-삼투성 펌프 모델 1004(DURECT Corporation, 미국 캘리포니아주 쿠퍼티노)를 보유하도록 수술을 받았다. 펌프는 매 28 일마다 교체되었다.
악력. 악력은 악력계(TSE Systems, Inc., 미국 미주리주)로 측정하였다. 간략하게는, 마우스를 꼬리를 잡고 손으로 들어올리고 힘 센서에 장착된 높이 조절 가능한 손잡이를 붙잡을 수 있게 하였다. 당기는 힘이 마우스의 꼬리에 의해 마우스에 가해졌다. 마우스가 그 손잡이를 놓을 때 연결된 제어 유닛의 디지털 디스플레이 패널에 최대 힘이 표시되었다. 각 마우스는 3회 반복적으로 시험되었다.
로타로드 수행. 야생형 및 유전자 변이 마우스의 운동 협응을 120 초 동안 일정한 속도(40 rpm)에서 장치(UGO BASILE, 이탈리아 코메리오)를 사용하여 평가하였다. 모든 마우스는 2주 동안 주당 2일씩 훈련하였다. 이후 마우스를 9주령으로부터 주당 2회 공식 시험하였다. 각 시험에 대해, 동물들은 회전 시작 전에 장치에 위치되었다. 낙하 지연시간을 자동적으로 기록하였다. 각 마우스는 시간당 3회의 시도가 주어졌다. 마우스는 시도들 사이에 20 분의 휴식이 허용되었다.
세포 배양 및 형질전환. 운동 신경세포주(NSC34)는 네일 캐시맨(Neil Cashman) 박사(캐나다 브리티쉬 콜롬비아 대학 뇌 연구 센터)로부터의 감사한 선물이었으며, 5% CO2 하에 37℃에서 10% 소 태아 혈청(FCS), 2 mM L-글루타민, 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(Invitrogen GibcoBRL, 미국 캘리포니아주 칼스바드)을 함유하는 고 글루코스 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium)에서 배양하였다.
실시예 7
마우스. 8-12 주령의 암컷 C57BL6N 마우스를 BioLASCO(대만 이란)으로부터 구입하였다.
산 유발성 만성 넓은 부위 통증 모델. 섬유근통 모델은 슬루카 그룹(Sluka's group)에 의해 확립된 산 유발성 만성 통증 모델으로부터 변경하였다(Sluka et al., 2003 Pain. 106:229-239). 마우스를 2% 기화 이소플루란으로 간단히 마취하고 좌측 비복근 근육에 20 mL 제니스테인(1 mM)의 i.m. 주사를 놓았다. 3 분 후, 동일 부위에 20 mL 산 염수(pH 4.0) 주사를 놓았다. 이후 마우스는 2주 이상 동안 장기적인 기계적 통각과민을 일으켰다. T1-11(0.9-mm /7-cm 위관(gavage)을 이용한 p.o.)의 진통 효과를 마우스가 기계적 통각과민을 일으킨 4일 후 시험하였다. 기계적 통각과민은 0.2-mN 폰 프라이 필라멘트 자극(von Frey filament stimulation)에 대한 마우스의 뒷발의 철회 반응(withdrawal response)을 시험함으로써 분석하였다.
간헐적인 저온 스트레스 모델. 섬유근통 모델은 우에다 그룹(Ueda's group)에 의해 개발되었으며, 여기서 마우스는 2 일 동안 간헐적인 저온 스트레스로 처리된다(Nishiyori and Ueda, 2008 Mol Pain. 4:52). 간헐적인 저온 스트레스로 처리된 마우스는 장기적인 (>2 주) 기계적 및 열적 통각과민을 일으킨다. JMF3464(i.p. 또는 p.o.)의 진통 효과를 간헐적인 저온 스트레스 5일 후 상기 마우스에서 시험하였다. 기계적 통각과민은 0.2-mN 폰 프라이 필라멘트 자극에 대한 마우스 뒷발의 철회 반응을 시험함으로써 분석하였다.
상기 본 발명의 예시적인 실시양태들의 설명은 예시 및 설명의 목적으로만 제시되었으며 한정적이거나 본 발명을 개시된 정확한 형태로 제한하고자 하는 의도가 아니다. 상기 교시의 관점에서 다수의 변경 및 변형이 가능하다.
상기 실시양태 및 실시예는 본 발명의 원리 및 이의 실질적인 적용을 설명하도록 선택 및 기술되어 당업자가 고려된 특정 용도가 적합한 것과 같은 본 발명 및 다양한 실시양태 및 다양한 변경을 이용할 수 있도록 한다. 대안적인 실시양태들은 당업자에게 본 발명의 취지 및 범위를 벗어나지 않으면서 적합한 것으로 명백할 것이다.
본 명세서에서 인용 및 논의된 모든 참고문헌들은 본원에 그 전체가 및 각 참고문헌이 개별적으로 참고 인용된 것과 동일한 정도로 참고로 인용되어 있다.
SEQUENCE LISTING <110> Academia Sinica <120> COMPOUNDS FOR USE IN PREVENTION AND TREATMENT OF NEURODEGENERATIVE DISEASES AND PAIN <130> 10011-029PCT <150> 61894699 <151> 2013-10-23 <160> 4 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for CAG repeats <400> 1 ccgctcaggt tctgctttta 20 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for CAG repeats <400> 2 ggctgaggaa gctgaggag 19 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for transgene Prnp-TARDBP <400> 3 ggtggtggga tgaactttgg 20 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for transgene Prnp-TARDBP <400> 4 gtggataacc cctcccccag cctagac 27

Claims (20)

  1. 화학식 (I) 또는 (IA)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염:
    Figure pct00008
    ,
    상기 식에서, X는 할로겐이다.
  2. 제1항에 있어서, N 6-[(3-할로티엔-2-일)메틸]아데노신, N 6-[(4-할로티엔-2-일)메틸]아데노신, 및 N 6-[(5-할로티엔-2-일)메틸]아데노신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 화합물.
  3. 제2항에 있어서, N 6-[(5-브로모티엔-2-일)메틸]아데노신, N 6-[(4-브로모티엔-2-일)메틸]아데노신, N 6-[(3-브로모티엔-2-일)메틸]아데노신, N 6-[(5-클로로티엔-2-일)메틸]아데노신, N 6-[(4-클로로티엔-2-일)메틸]아데노신, 및 N 6-[(3-클로로티엔-2-일)메틸]아데노신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 화합물.
  4. 제1항에 있어서, N 6-[(2-할로티엔-3-일)메틸]아데노신, N 6-[(4-할로티엔-3-일)메틸]아데노신, 및 N 6-[(5-할로티엔-3-일)메틸]아데노신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 화합물.
  5. 제4항에 있어서, N 6-[(2-브로모티엔-3-일)메틸]아데노신, N 6-[(4-브로모티엔-3-일)메틸]아데노신, N 6-[(5-브로모티엔-3-일)메틸]아데노신, N 6-[(2-클로로티엔-3-일)메틸]아데노신, N 6-[(4-클로로티엔-3-일)메틸]아데노신, 및 N 6-[(5-클로로티엔-3-일)메틸]아데노신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 화합물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 하나의 항에 따른 화학식 (I) 또는 (IA)의 화합물을 제조하는 방법으로서, 하기 단계 (I) 또는 (II)를 포함하는 제조 방법:
    (I):
    (a) 염기 존재 하에 6-클로로퓨린 리보퓨라노시드를 하기 화학식 (3) 또는 (3A)를 갖는 치환된 (티에닐)메탄아민과 반응시켜, 화학식 (I) 또는 (IA)의 화합물을 얻는 단계:
    Figure pct00009

    (상기 식에서, X는 불소, 염소, 브롬 또는 요오드임); 또는
    (II):
    (a1) 염기 존재 하에 (2',3'-O-이소프로필리덴)아데닌을 히드록실기 보호제와 반응시켜, 히드록실 보호기를 갖는 (2',3'-O-이소프로필리덴)아데닌의 유도체를 얻는 단계;
    (b) 히드록실 보호기를 갖는 (2',3'-O-이소프로필리덴)아데닌의 유도체를 아민기 보호제와 반응시켜, 히드록실 보호기 및 아민 보호기를 갖는 (2',3'-O-이소프로필리덴)아데닌의 유도체를 얻는 단계;
    (c) 히드록실 보호기 및 아민 보호기를 갖는 (2',3'-O-이소프로필리덴)아데닌의 유도체를 하기 화학식 (7) 또는 (7A)의 치환된 (티에닐)메틸기 함유 화합물과 반응시킴으로써 커플링 반응을 수행하여, 보호기 및 치환된 (티에닐)메틸기를 함유하는 생성물을 얻는 단계:
    Figure pct00010

    (상기 식에서, X는 F, Cl, Br, 또는 I이고, Y는 X, OH, 메탄술포네이트(OSO2CH3, OMs), p-톨루엔술포네이트(OSO2C6H4-p-CH3, OTs), 또는 트리플루오로메탄술포네이트(OSO2CF3, OTf)임); 및
    (d) 산성 조건에서 단계 (II)(c)의 생성물로부터 보호기를 제거하여, 화학식 (I) 또는 (IA)의 화합물을 얻는 단계.
  7. 제6항에 있어서, 단계 (I)(a)에서, 염기는 디이소프로필에틸아민이고, 치환된 (티에닐)메탄아민은
    (i) N 6-[(5-브로모티엔-2-일)메틸]아데노신을 얻기 위해서는 (5-브로모티엔-2-일)메탄아민이거나; 또는
    (ii) N 6-[(5-클로로티엔-2-일)메틸]아데노신을 얻기 위해서는 (5-클로로티엔-2-일)메탄아민
    인 제조 방법.
  8. 제6항에 있어서, 단계 (II)(c)에서, 커플링 반응은 트리페닐포스핀 및 디이소프로필 아조디카르복실레이트의 존재 하에 수행되는 것인 제조 방법.
  9. 제8항에 있어서, 단계 (II)(c)에서, 치환된 (티에닐)메틸기 함유 화합물은 (5-브로모티엔-2-일)메탄올인 제조 방법.
  10. (a) 치료적 유효량의 제1항 내지 제5항 중 어느 하나의 항에 따른 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염; 및
    (b) 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 비히클
    을 포함하는 조성물.
  11. 신경퇴행성 질환 및/또는 통증의 치료가 필요한 대상에서 신경퇴행성 질환 및/또는 통증을 치료하기 위한 약제의 제조에서의 제1항 내지 제5항 중 어느 하나의 항에 따른 화합물의 용도.
  12. 제11항에 있어서, 신경퇴행성 질환은 알츠하이머 병, 파킨슨 병, 근위축성 측삭경화증, 프리온 병, 헌팅턴 병, 및 척수 소뇌 실조로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 용도.
  13. 제12항에 있어서, 척수 소뇌 실조는 척수 소뇌 실조 2형, 척수 소뇌 실조 3형, 및 척수 소뇌 실조 7형으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 용도.
  14. 제11항에 있어서, 통증은 산 유발성 통증인 용도.
  15. 제14항에 있어서, 산 유발성 통증은 산 유발성 근육통인 용도.
  16. 제15항에 있어서, 산 유발성 근육통은 산 유발성 만성 근육통인 용도.
  17. 제11항에 있어서, 통증은 기능부전성 통증인 용도.
  18. 제17항에 있어서, 기능부전성 통증은 섬유근통, 근막 통증, 방광 통증 증후군, 및 과민성 대장 증후군에 의해 유발된 통증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 용도.
  19. 제11항에 있어서, 통증은 염증성 통증, 암 통증, 흉통, 배부통, 경부통, 어깨 통증, 편두통, 두통, 근막 통증, 관절 통증, 근육통 증후군, 신경병증성 통증, 말초성 통증, 교감신경 통증, 수술 후 통증, 외상 후 통증, 및 다발 경화증 통증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 용도.
  20. 제11항에 있어서, 신경퇴행성 질환은 단백질 미스폴딩 질환인 용도.
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