JP6533773B2 - 抗体産生を抑制する組成物、及びザクロ種子エキスの製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、抗体産生を抑制する組成物、及びザクロ種子エキスの製造方法に関し、特に、ザクロ種子エキスを含有する抗体産生を抑制する組成物、及びザクロ種子エキスの製造方法に関する。

近年アレルギー患者数は急激に増加しており、なかでも気管支喘息やアレルギー性鼻炎を代表とするI型アレルギー患者数の増加は著しい。ザクロは果実全体に対して種子がかなりの割合を占める果実であるが、原則として、搾汁後に残る種子は廃棄されている。ザクロ種子を利用した少ない例として、ザクロ種子エキスを用いたサプリメント提案システムであって、提案サプリメント演算手段が、希望事項情報が美容の場合には、提案サプリメントとして、マルチビタミン、マルチミネラル、ビタミンＡ、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ６、ビタミンＢ１２、ビタミンＣ、ビタミンＥ、ビタミンＰ、ナイアシン、ビオチン、コラーゲン、エラスチン、ポリフェノール、パントテン酸、ヒアルロン酸、アセチルグルコサミン、イノシトール、コエンザイムＱ１０、αカロチン、βカロチン、大豆サポニン、ロイヤルゼリー、ツイントース、葉酸、バラ花弁エキス、ザクロ種子エキス、ブラックコホッシュエキス、大豆イソフラボン、葛イソフラボンスクワレン、ビール酵母、コロハエキス、カルシウム、マグネシウム、銅、鉄、亜鉛、マンガン、とから成る群の少なくとも１つを出力するサプリメント提案システムが知られている（特許文献１）。

特開２０１１-２３２９８９

しかしながら、現在のところ多くの場合、ザクロ種子は原則として、廃棄物として処理されており、前記特許文献以外は、有効に利用されていないのが現状である。一方で、廃棄物の有効利用が見直されており、アレルギー疾患の予防や改善に効果を示す機能性成分を有する食品の探索が望まれる。

したがって、本発明の目的は、廃棄されるザクロ種子の有効活用及び付加価値化をめざして抗アレルギー作用を有する組成物を提供することにある。

上記目的を達成するために、本発明者らは、ザクロ種子の有効活用について鋭意検討した結果、本発明を見出すに至った。

すなわち、本発明の抗体産生抑制用医薬組成物の製造方法は、リン酸ナトリウム緩衝液回転抽出されたザクロ種子エキスを含有することを特徴とする抗体産生抑制用医薬組成物の製造方法であって、ザクロ種子を粉砕して得た粉砕物をリン酸ナトリウム緩衝液からなる溶媒中に浸漬し、ザクロ種子エキスを回転抽出する工程を含む、ことを特徴とする。

また、本発明の抗体産生抑制用医薬組成物の製造方法の好ましい実施態様において、前記ザクロ種子エキスは、プニカ酸、又はエラグ酸を含むことを特徴とする。

また、本発明の抗体産生抑制用医薬組成物の製造方法の好ましい実施態様において、前記抗体は、IgE抗体であることを特徴とする。

また、本発明の化粧品の製造方法は、本発明の抗体産生抑制用医薬組成物の製造方法を含むことを特徴とする。

また、本発明の医薬部外品の製造方法は、本発明の抗体産生抑制用医薬組成物の製造方法を含むことを特徴とする。

また、本発明のザクロ種子エキスの製造方法は、ザクロ種子を粉砕して得た粉砕物を１００％エタノール又はリン酸ナトリウム緩衝液からなる溶媒中に浸漬した後、ローテーターにセットして回転させながら攪拌を行って抽出し、遠心分離後に、上清を分取し、３７〜４０℃の温浴上で蒸発乾固することを特徴とする。

また、本発明のザクロ種子エキスの製造方法の好ましい実施態様において、前記攪拌の時間は、１０〜４８時間であることを特徴とする。

本発明の抗体産生を抑制する組成物によれば、従来廃棄物として処理されていたザクロ種子を有効利用することが可能であるという有利な効果を奏する。また、本発明の抗体産生を抑制する組成物によれば、有効な抗アレルギー作用を有し、種々のアレルギー疾患に有効であるという有利な効果を奏する。

図１は、本発明の一実施態様における組成物を用いた場合のU266に対する細胞毒性を示す図である。図の左側は、１００％エタノール抽出したものを、右側は、NaPB抽出したものを、それぞれ示す。縦軸は、細胞生存率を示し、横軸はサンプル濃度を示す。 図２は、本発明の一実施態様における組成物を用いた場合のIgE抗体産生抑制評価を示す図である。図の左側は、１００％エタノール抽出したものを示す。縦軸はヒトIgE(相対値)を示し、横軸はサンプル濃度を示す。図の右側は、NaPB抽出したものを示す。縦軸はヒトIgE(相対値)を示し、横軸はサンプル濃度を示す。 図３は、本発明の一実施態様における組成物を用いた場合の培養時間を、1日、2日、及び3日とした場合のIgE抗体産生抑制評価を示す図である。縦軸は、ヒトIgE産生量を示し、横軸は、培養時間を示す。

本発明の抗体産生を抑制する組成物は、ザクロ種子エキスを含有することを特徴とする。ザクロ種子エキスは、ザクロの種子由来のエキスである。本発明に適用するザクロ種子エキスは、ザクロの種子由来である限り、総てのザクロ種子エキスを対象とする。

また、対象となる細胞としては、特に限定されないが、免疫系、生殖系などの細胞のほか、皮膚など一般の細胞を挙げることができる。特に有効に作用するのは、皮膚の細胞である。したがって、本明細書において主として皮膚の細胞について説明するが、本発明は、これに限定される意図ではない。

また、本発明の抗体産生を抑制する組成物の好ましい実施態様において、前記ザクロ種子エキスは、プニカ酸、又はエラグ酸を含むことを特徴とする。

また、本発明の抗体産生を抑制する組成物の好ましい実施態様において、ザクロ種子を粉砕して得た粉砕物を、エタノール、メタノール、水、ヘキサンからなる群から選択される少なくとも1種の溶媒に浸漬して、上清を分取して前記ザクロ種子エキスを得たことを特徴とする。例えば、振とう抽出させることができる。振とう抽出において、例えば、約4℃等の低温室にてローテーターにセットして回転させながら抽出することができる。

また、本発明の抗体産生を抑制する組成物の好ましい実施態様において、IgE抗体はアレルギー性疾患の発症に深く関与するという観点から、前記抗体は、IgE抗体、IgG1抗体であることを特徴とする。

また、本発明のザクロ種子エキスの製造方法は、ザクロ種子を粉砕して得た粉砕物を溶媒中に浸漬した後、上清を分取することを特徴とする。

ここで、まず、ザクロ種子エキスの調製方法について説明する。まず、ザクロ種子を準備する。ザクロ種子は、必要に応じて洗浄し、乾燥する。乾燥は十分に行なうのが好ましい。後の粉砕を均質に行なうためである。

次に、ザクロ種子を粉砕する。粉砕の方法は特に限定されず、ボールミル、ハンマーミル、ローラーミル、ロッドミル、サンプルミル、スタンプミル、ディスインテグレーター、乳鉢、冷却装置付きブレンダーなどの公知の粉砕機を用いることができる。なお、粉砕時における発熱により、ザクロ種子組成物の分解等が発生することも考えられることより、粉砕時間を数秒とし、十数回繰り返すことができる。

次いで、ザクロ種子を粉砕し粉砕物を得た後、各種溶媒に前記粉砕物を浸漬する。この場合の溶媒は、特に限定されず、所望とする効果に対応して適宜溶媒を設定することができる。また、本発明のザクロ種子エキスの製造方法の好ましい実施態様において、溶媒が、エタノール、メタノール、ヘキサン、水からなる群から選択される少なくとも１種であることを特徴とする。溶媒としては、エタノール、メタノール、水、へキサン、酢酸エチル、クロロホルム、アセトンなどの極性、非極性溶媒を問わず挙げることができる。好ましくは、メタノール、エタノール、水等を挙げることができる。

浸漬は、緩やかな攪拌下で行なうことができる。各種溶媒に前記粉砕物を浸漬して各種溶液を得る。各種溶液について、溶液の状態に応じて攪拌を行い、場合によりそのまま溶液を放置しても良い。攪拌する場合には、特に限定されないが、１０時間〜４８時間、好ましくは、およそ1日（24時間）攪拌を持続させることができる。

その後、上清を分取することによりザクロ種子エキスを得ることができる。必要に応じて、上清を蒸発乾固する。蒸発乾固は、エバポレーターを用いて、２０℃〜６０℃、好ましくは、３７℃〜４０℃の温浴上で行なうことができる。蒸発乾固することにより、ザクロ種子エキスを長期間保存することができる。

ザクロ種子中に含まれる成分は、ザクロ種子を極性の異なる溶媒を用いて抽出することにより、その物性により振り分けられる。したがって、使用した溶媒により、ザクロ種子エキスの成分の種類及び含有量は異なる。

また、本発明の化粧品は、本発明の抗体産生を抑制する組成物を有効成分とすることを特徴とする。本発明に適用可能な化粧品については、本発明の抗体産生を抑制する組成物を有効成分とする限り、特に限定されない。

また、本発明の医薬部外品は、本発明の抗体産生を抑制する組成物を有効成分とすることを特徴とする。本発明に適用可能な医薬部外品については、本発明の抗体産生を抑制する組成物を有効成分とする限り、特に限定されない。

＜有効量＞
本発明による組成物は、有効的な量のザクロ種子エキス、及び適当な投与形態の形で調製される。

本発明の組成物におけるザクロ種子エキスの投与量は、投与対象患者の病態及びその重篤度、投薬形態、選択した投与経路及び１日当たりの投与回数等により変更することができる。

本発明の組成物におけるザクロ種子エキスの投与量は、マウスで実施する時、1000 mg/kg/day投与量に設定することができ、ヒトにおいては感受性の相違等により、更に低い量であることが好ましい。

また、投与形態は、経口剤(タブレット、カプセル、被膜タブレット、顆粒、溶液、シロップ)、直腸投与用坐剤、注射等を挙げることができる。投与対象患者は、慢性疾患の場合が多く、長期投与の必要性、連用の容易性という観点から、好ましくは、口経剤である。

投与形態には、従来の他の成分、例えば、安定保存剤、甘味料、着色剤、芳香料などを含むことができる。

＜急性毒性試験＞
ザクロ種子エキスの含有成分については、リノレン酸も含まれる成分であるため毒性は認められないと考えられている。

以下では本発明の一実施例を説明するが、本発明は、下記の実施例に限定して解釈されるものではない。

実施例１
まず、溶媒として、エタノールを用いて、ザクロ種子エキスの調製を試みた。ザクロ種子を粉砕し、100%エタノールで振とう抽出した。これらを濃縮乾固して再溶解し、ザクロ種子エタノール抽出物として実験に供した。具体的には、以下の通りである。

＜サンプル調製＞
ザクロ種子（ミキサーで粉末化）3 gに100％エタノールを30mL加え、4℃で24時間回転抽出を行った。その後、3000回転、20分遠心を行い、上清を回収した。上清をエバポレーターで濃縮乾固し、重量を量り、25mg/mLの濃度になるよう100%エタノールで再溶解した。また、ザクロ種子（ミキサーで粉末化）3 gに10mM NaPB(リン酸ナトリウム緩衝液)を30mL加え、4℃で24時間回転抽出を行った。その後、3000回転、20分遠心を行い、上清を回収した。原液を以下の実験に用い、培養系総量のサンプルが占める割合を%で示した。

実施例２
次に、恒常的にIgE抗体産生能を有するヒト多発性骨髄腫U266細胞を用いて、様々な濃度でザクロ種子エタノール抽出物を添加し、無血清条件下で24時間培養することにより、本発明の組成物の抗アレルギー作用について調べた。また、培養上清を回収し、分泌されたヒトIgE抗体量をELISA法によって測定し、細胞毒性についてもWST-8法を用いて確認した。さらにザクロ種子エタノール抽出物を添加培養したU266細胞のIgE遺伝子の発現について検討した。具体的には、以下の通りである。

＜U266細胞の培養＞
96ウェルプレートに、ITES（インスリン、トランスフェリン、エタノールアミン、セレナイト）を加えたRPMI1640培地に懸濁したU266細胞を1×105 cells/mLの細胞密度で播き込んだ。U266細胞はヒトミエローマ細胞で、恒常的にヒトIgEを産生する。これにザクロ種子エタノール抽出物及びザクロ種子NaPB抽出物を様々な濃度で添加し、24時間培養した。

＜U266細胞に対する毒性＞
上記の細胞培養を行った後、WST-8キット（キシダ化学）を用い、細胞毒性、増殖を測定した。図１は、U266に対する細胞毒性を示す図である。図の左側は、１００％エタノール抽出したものを、右側は、NaPB抽出したものを、それぞれ示す。縦軸は、細胞生存率を示し、横軸はサンプル濃度を示す。一般的に高濃度では細胞毒性が認められ、ザクロ種子エタノール抽出物では125μg/mL以上で細胞毒性が認められる傾向が現れた。同様にNaPB抽出液では、0.063%以上に毒性が認められた。すなわち、図1の結果から、細胞の減少によってIgE抗体量が少なくなっているのではないことが分かる。

＜IgE抗体産生抑制評価（Dose-response）＞
ヒトIgE抗体はELISA法によって定量した。Human IgE ELISA Quantitation Set（Bethyl社）を使用した。図２は、IgE抗体産生抑制評価を示す図である。図の左側は、１００％エタノール抽出したものを示す。縦軸はヒトIgE(相対値)を示し、横軸はサンプル濃度を示す。図の右側は、NaPB抽出したものを示す。縦軸はヒトIgE(相対値)を示し、横軸はサンプル濃度を示す。

その結果、100％エタノール抽出物では、濃度依存的にIgE産生が抑制された。NaPB抽出物でも、若干ではあるが、濃度依存性を伴うIgE産生抑制が認められた。

＜IgE抗体産生抑制評価（Time-course）＞
ザクロ種子エタノール抽出物は添加24時間でIgE産生抑制効果が認められたが、抑制効果の持続性を検討するため、培養時間を24時間、48時間、72時間とし、各時間の培養上清に分泌されたIgE量をELISA法によって定量した。

図３は、各種濃度（１００μｇ/ｍＬ、５０μｇ/ｍＬ）のザクロ種子エタノール抽出物について、培養時間を、24時間、48時間、及び72時間とした場合のIgE抗体産生抑制評価を示す図である。縦軸は、ヒトIgE産生量を示し、横軸は、培養時間を示す。その結果、ザクロ種子エタノール抽出物は24時間だけでなく、48時間及び72時間においてもIgE産生を抑制効果が維持されることが明らかとなった。

以上の結果、様々な濃度のザクロ種子エタノール抽出物をU266細胞に添加培養したところ、IgE抗体の産生量は濃度依存的に減少することが明らかとなった。最も効果が認められた125μg/mlでは、コントロール(滅菌水)と比較してIgE産生を約70%抑制した。

ザクロ種子エタノール抽出物は、I型アレルギーの発症に深く関与するIgE抗体の産生量を濃度依存的に抑制することが明らかとなった。本実施例の結果から、ザクロ種子に含まれる何らかの成分、おそらく、プニカ酸、又はエラグ酸等の成分がIgE産生阻害活性を示し、生体においても抗アレルギー作用を示す可能性が示唆された。

本発明によると、医療、美容業界の分野への貢献はもとより、廃棄物の有効利用等、社会的貢献度が高く、広範囲において利用価値が高い。

Claims (7)

1. リン酸ナトリウム緩衝液回転抽出されたザクロ種子エキスを含有することを特徴とする抗体産生抑制用医薬組成物の製造方法であって、ザクロ種子を粉砕して得た粉砕物をリン酸ナトリウム緩衝液からなる溶媒中に浸漬し、ザクロ種子エキスを回転抽出する工程を含む、ことを特徴とする抗体産生抑制用医薬組成物の製造方法。
2. 前記ザクロ種子エキスは、プニカ酸、又はエラグ酸を含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
3. 前記抗体は、IgE抗体であることを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
4. 請求項１〜３のいずれか1項に記載の抗体産生抑制用医薬組成物の製造方法を含むことを特徴とする化粧品の製造方法。
5. 請求項１〜３のいずれか1項に記載の抗体産生抑制用医薬組成物の製造方法を含むことを特徴とする医薬部外品の製造方法。
6. ザクロ種子を粉砕して得た粉砕物をリン酸ナトリウム緩衝液からなる溶媒中に浸漬した後、ローテーターにセットして回転させながら攪拌を行って抽出し、遠心分離後に、上清を分取し、３７〜４０℃の温浴上で蒸発乾固することを特徴とするザクロ種子エキスの製造方法。
7. 前記攪拌の時間は、１０〜４８時間であることを特徴とする請求項６記載の方法。