JP6520440B2

JP6520440B2 - 新規化合物

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Publication number: JP6520440B2
Application number: JP2015120890A
Authority: JP
Inventors: 真吉多和田; チョンプージャムニアン
Original assignee: BIOSYSTEM CONSULTING LIMITED COMPANY; University of the Ryukyus
Current assignee: BIOSYSTEM CONSULTING LIMITED COMPANY; University of the Ryukyus
Priority date: 2014-06-16
Filing date: 2015-06-16
Publication date: 2019-05-29
Anticipated expiration: 2035-06-16
Also published as: JP2016020338A

Description

本発明は、ゲットウ抽出物由来の新規化合物に関し、更に詳細には、糖尿病モジュレーターの抑制、ラジカル生成阻害作用、低比重リポタンパク（ＬＤＬ、一般に悪玉コレステロールとも言われる）の抗酸化作用及びメラニン生成抑制作用を有する新規化合物に関する。

今日、先進国全体では糖尿疾患の発生率の上昇にともない、糖尿病を抑制する物質の研究が加速している。糖尿病モジュレーター（修飾因子）には、食後の高血糖を低下させるα‐グルコシダーゼ、消化酵素の一つであるトリプシン及び血管拡張物質である一酸化窒素などがあり、これらの因子に対して抑制効果を示す物質が望まれていた。

また、糖尿病とともに生活習慣病として知られる脂質異常症（高脂血症）は、血液中に含まれる脂質の量が過剰となる状態であり、特に、ＬＤＬの酸化型（酸化ＬＤＬ）が血管壁に溜まると、動脈硬化の原因となる。したがって、ＬＤＬの酸化を抑制したり、活性酸素種の生成を抑制する物質が望まれていた。

ところで、天然物中に生活習慣病の予防、治療等に対し有効な化合物が存在することが知られており、例えば、特許文献１には、糖尿病治療に効果を有するものとして、アブラヤシ属の果実から得られる抽出物がグルコース濃度やトリグリセリド濃度を調整することが記載されている。しかしながら、同抽出物はα‐グルコシダーゼやトリプシン等を抑制するものではなかった。

また、特許文献２には、マメ科植物であるカッシアアウリクラタ（Cassia auriculata）の葉部から水‐アセトン混合液を用いて抽出したフラバンダイマー化合物が、ラジカル消去作用を有することが記載されている。しかしながら、同フラバンダイマー化合物は、ＬＤＬの酸化を抑制するものではなかった。

糖尿病の主要な危険因子として肥満が知られているが、肥満はその他にも、心臓病、高血圧、脳卒中などにおける発症リスクとなる。世界保健機関は、少なくとも１０億人の大人が体重過剰で、このうち３億人が肥満体であるとし、そしてこれらの数は、医療介入なしでは更に上昇すると予想されることを報告している。昨今では、肥満の蔓延は子供にも影響しており、小児肥満の普及は過去３０年間で３倍になり、この影響されやすい人口における健康上の問題を引き起こすことが予想される。

現在、肥満症の治療方法には、食事療法、運動療法、行動療法、薬物療法等があるが、基本となるのは食事療法と運動療法で、これを同時に進めることが一般的である。この食事療法と運動療法の実施には、行動療法という食事と運動の生活指導が具体的に行なわれるが、一般に肥満患者では、強い意志をもってこれに堪えられる人が少なく、結局失敗に終わることが多いとされている。この行動療法では、まれに薬物療法が補助的に使われることがあるとされており、これらの方法で効果がない場合にだけ、胃を小さくする外科療法(手術)が行われることがある。

このように、現在の肥満症の治療においては、薬物療法は限られた範囲でしか使用されていないが、現在の肥満の蔓延を抑制するには、患者の意志に関わらず肥満を有効に抑制する医薬の開発が強く求められている。

また、皮膚が紫外線に曝露されると、皮膚内で発生する活性酸素、過酸化脂質等は、炎症を引き起こし、皮膚組織に大きな損傷を与える。皮膚や毛髪等に存在する色素であるメラニンは、このような紫外線による損傷から皮膚を保護する役割を有する。しかし、メラニンが過剰産生されると、低色素沈着あるいは色素沈着過剰などの皮膚異常を引き起こす他、シミ、ソバカスなどが生じるため、メラニンの生成を抑制することを目的として種々の美白剤が開発されている。メラニンは、メラノサイトにおいてチロシンがチロシナーゼによって酸化されることにより産生されるため、美白剤の多くはメラニン産生における鍵酵素であるチロシナーゼ活性阻害物質である。

チロシナーゼ活性阻害物質の代表的なものとして、コウジ酸やアルブチン、アスコルビン酸などがよく知られており、メラニンの生成および沈着を抑制する美白剤として利用されている（特許文献３〜５）。しかし、これらの中には活性が十分でないものもあり、天然物由来で強力かつ安全性の高いチロシナーゼ阻害剤がなお強く求められている。

特表２０１１−５１８１３１特開２００９−９１３１５特開昭５６−７７１０号公報特開昭６３−１７４９１０号公報特開昭５１−９５１４０号公報

従って、本発明の課題は、天然物中から従来知られていなかったα‐グルコシダーゼ等の糖尿病モジュレーターの抑制作用、ラジカル生成阻害作用やＬＤＬの抗酸化作用、チロシナーゼ活性阻害作用等の薬理活性を有する新規化合物を見出し、これを提供することである。

本発明者らは、従来から、沖縄県に自生する植物であるゲットウ（月桃）に着目し、この植物中に含まれる成分の薬理活性について研究を行っていたが、今回新たにゲットウ抽出物中から、次の式（Ｉ）で表される２，５−ビス（１Ｅ，３Ｅ，５Ｅ）−６−メトキシヘキサ−１，３，５−トリエン−１−イル−２，５−ジヒドロフラン(2,5-bis(1E,3E,5E)-6-methoxyhexa-1,3,5-trien-1-yl-2,5-dihydrofuran；以下「ＭＴＤ」という）及び次の式（II）で表される（Ｅ）−２，２，３，３−テトラメチル−８−メチレン−７−（オクト−６−エン−１−イル）オクタヒドロ−１Ｈ―キノリジン((E)-2,2,3,3-tetramethyl-8-methylene-7-(oct-6-en-1-yl)octahydro-1H-quinolizine；以下「ＴＭＯＱ」という）を分離し、これらが糖尿病モジュレーターの抑制、ラジカル生成阻害作用、ＬＤＬ酸化阻害活性、チロシナーゼ活性阻害作用等を有することを見出し、本発明を完成した。

すなわち本発明は、上記式（Ｉ）または式（ＩＩ）で表わされる新規化合物である。

また、本発明は、上記式（Ｉ）または式（ＩＩ）で表わされる新規化合物を有効成分として含有するα‐グルコシダーゼ、トリプシン、キサンチンオキシダーゼ及びチロシナーゼからなる群より選ばれる酵素活性阻害剤である。

更に、本発明は、上記式（Ｉ）または式（ＩＩ）で表わされる新規化合物を有効成分として含有する一酸化窒素生成阻害剤である。

また更に、本発明は、上記式（Ｉ）または式（ＩＩ）で表わされる新規化合物を有効成分として含有するラジカル生成阻害剤である。

そして更に、本発明は、上記式（Ｉ）または式（ＩＩ）で表わされる新規化合物を有効成分として含有するＬＤＬ酸化阻害剤である。

また本発明は、上記式（Ｉ）または式（ＩＩ）で表わされる新規化合物を有効成分として含有する抗肥満剤である。

また本発明は、上記式（Ｉ）または式（ＩＩ）で表わされる新規化合物を有効成分として含有するメラニン生成抑制剤または美白剤である。

本発明の式（Ｉ）および（ＩＩ）の化合物は、α‐グルコシダーゼ、トリプシン及びキサンチンオキシダーゼの活性を抑制し、また、一酸化窒素生成を抑制する。さらに、これらの化合物は、ラジカル生成を阻害し、またＬＤＬの酸化を抑制する作用を有するものである。

従ってこれら化合物は、糖尿病モジュレーター（修飾因子）を抑制するものであり、これを含有する医薬品あるいは飲食品は、糖尿病の予防や治療に有用である。

また肥満では、脂肪組織において、例えばスーパーオキシドアニオンラジカル、ヒドロキシラジカル等のラジカルや過酸化水素、一重項酸素等の活性酸素種（ＲＯＳ）生成が促進し、酸化ストレスが亢進する。ＲＯＳは脂肪細胞の分化に重要な役割を果たしており、酸化ストレス下で脂肪組織が増加すると考えられる。本発明の式（Ｉ）および（ＩＩ）の化合物は、脂肪細胞におけるＲＯＳ及び一酸化窒素（ＮＯ）の生成を有効に抑制し、さらに活性酸素産生酵素であるキサンチンオキシダーゼ阻害活性を有するため、肥満の治療・予防に有効である。

さらに本発明の式（Ｉ）および（ＩＩ）の化合物は、優れたチロシナーゼ阻害活性を有し、メラニン生成を有効に抑制するため、低色素沈着あるいは色素沈着過剰などの皮膚異常疾患に対する治療・予防に有効であり、またシミ、ソバカス等を防ぎ、美白効果に優れ、さらに安全性も高いものである。

ゲットウ根茎から単離されたＭＴＤを含む画分を示す図面である。ゲットウ種子から単離されたＴＭＯＱを含む画分を示す図面である。ＭＴＤ及びＴＭＯＱの有するα−グルコシダーゼ活性阻害作用を示す図面である。なお、カテキン及びケルセチンは陽性コントロールであり、Ｒ１（「ＤＤＫ」ともいう）は、ゲットウ抽出物から単離されたジヒドロ−５，６−デヒドロカワインである。以下同じ。ＭＴＤ及びＴＭＯＱの有するトリプシン活性阻害作用を示す図面である。ＭＴＤ及びＴＭＯＱの有する一酸化窒素生成阻害作用を示す図面である。ＭＴＤ及びＴＭＯＱの有するキサンチンオキシダーゼ活性阻害作用を示す図面である。なお、Ｌ−ＮＡＭＥ（ＮＧ-ニトロアルギニンメチルエステル）は陽性コントロールである。ＤＫは、ゲットウ抽出物から単離された５，６−デヒドロカワインであり、ラブダジエンは、同抽出物から単離された８（１７），１２−ラブダジエン−１５，１６−ジアールである。以下、同じ。ＭＴＤ及びＴＭＯＱの有するＬＤＬの酸化阻害作用を示す図面である。ＭＴＤ及びＴＭＯＱの有するＯ_２ ^・−生産の抑制を示す図面である。ＭＴＤ及びＴＭＯＱの３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞生存性に対する影響を示す図面である。ＭＴＤ及びＴＭＯＱの有する細胞内ＲＯＳ生成抑制作用を示す図面である。ＭＴＤ及びＴＭＯＱの有する細胞内一酸化窒素生成阻害作用を示す図面である。ＭＴＤ及びＴＭＯＱのＢ１６Ｆ１０メラノーマ細胞生存性に対する影響を示す図面である。ＭＴＤ及びＴＭＯＱの有するメラニン生成抑制作用を示す図面である。ＭＴＤ及びＴＭＯＱの有するチロシナーゼ活性阻害作用を示す図面である。

本発明の式（Ｉ）および（ＩＩ）で表されるＭＴＤおよびびＴＭＯＱは、ゲットウ（月桃）（学名：Alpinia zerumbet）を水、低級アルコールなどの溶媒で抽出したゲットウ抽出物中から、単離、精製することにより取得することができる。

このゲットウは、ショウガ科ハナミョウガ属（アルピニア属）の多年草で、熱帯から亜熱帯アジアに分布し、日本では沖縄県から九州南部に分布する。ゲットウの葉から取った精油が甘い香を放つので、アロマオイルや香料として使用されており、また、その葉や茎は抗菌剤や防虫剤としても知られているものである。

式（Ｉ）および（ＩＩ）をゲットウから得るには、抽出物の原料として、ゲットウの根茎や種子を用いる。このゲットウの根茎や種子は、収穫したものをそのまま使用しても良いし、乾燥させたものを使用しても良い。この抽出原料は、好ましくは、風乾した後、適切な大きさに細断ないし粉砕し、次の抽出行程において使用する。

次いで、上記のように準備した抽出原料に対し、その５ないし１００重量倍の抽出溶媒を加えた後、２０分ないし４８時間程度抽出を行う。抽出に用いる抽出溶媒としては、水や、エタノール等の低級アルコール、アセトン、酢酸エチル等の溶媒、あるいはこれらの混液等の溶媒（以下、「水性溶媒」という）が好ましい。上記水性溶媒のうち、混液としては、例えば、１０ないし９６％程度の、任意の割合のエタノール−水混液のような混合溶媒であっても良い。

上記の抽出に当たっての抽出温度は室温が好ましく、抽出中、必要により連続あるいは間欠的に攪拌すればよい。

ＭＴＤおよびＴＭＯＱの単離、精製は、周知の単離、精製方法により行うことができる。

すなわち、例えば、前記したゲットウ抽出物からカラムクロマトグラフィーを用い、例えば、勾配溶離を行うことにより、ＭＴＤおよびＴＭＯＱを単離精製することができる。

このようにして得られた、ＭＴＤおよびＴＭＯＱは、α−グルコシダーゼ、トリプシン、キサンチンオキシダーゼ及びチロシナーゼの活性阻害作用を有し、また、一酸化窒素生成の阻害作用も有する。さらに、ＭＴＤおよびＴＭＯＱは、ラジカル生成阻害作用及びＬＤＬ酸化阻害作用を有するものであり、特に脂肪細胞における活性酸素種（ＲＯＳ）及び一酸化窒素の生成を抑制し得る。

以上のようにして得られる本発明のＭＴＤやＴＭＯＱは、上記のような効果を有するため、飲食品、医薬品及び医薬部外品等に利用可能である。特に、糖尿病及び動脈硬化を治療又は予防するための飲食品、医薬品、医薬部外品として用いることができる。また肥満やメタボリックシンドロームを治療又は予防するための飲食品、医薬品、医薬部外品として利用し得る。さらに低色素沈着あるいは色素沈着過剰などの皮膚異常疾患用の医薬品や美白用の医薬部外品、化粧料等とすることが可能である。

本発明の化合物を配合成分とした医薬の製造は、これを薬学的に許容される担体や添加剤と組み合わせ、軟膏剤、クリーム剤、乳剤、ゲル剤、ローション剤、貼付剤等の形態に調製すればよい。医薬品、医薬部外品の形態で使用する場合の投与形態は、経口であっても非経口であっても良い。経口投与による場合は、通常の経口投与製剤、例えば、錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤等の固形剤；水剤；油性懸濁剤；又はシロップ剤もしくはエリキシル剤等の液剤のいずれかの剤形としても用いることができる。非経口投与による場合には、水性又は油性懸濁注射剤として用いることができる。

なお、本発明のＭＴＤやＴＭＯＱを飲食品に配合する形態や、経口医薬品などとして使用する形態とする場合の、その配合量は、特に制約はないが成人１日当たりの投与量として５〜２００ｍｇ程度、好ましくは５０〜１００ｍｇ程度が適当である。

一方、本発明のＭＴＤやＴＭＯＱを配合して美白化粧料とする場合には、例えば、公知の化粧料基剤にＭＴＤやＴＭＯＱを０．０００１〜１０質量％程度配合し、常法に従って、溶液状、可溶化状、乳化状、粉末状、ペースト状、ムース状、ジェル状の形態とすることにより製造され、化粧水、乳液、クリーム、パック、軟膏等として提供される。

また、上記美白化粧料の製造にあたっては、必要に応じて本発明の効果を損なわない範囲で、通常、化粧料に使用される成分、すなわち、精製水、アルコール類、水溶性高分子、油剤、界面活性剤、ゲル化剤、保湿剤、ビタミン類、抗菌剤、香料、塩類、ｐＨ調整剤等を加えることができる。

以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に何ら制約されるものではない。

実施例１
ＭＴＤの抽出と単離：
琉球大学（沖縄県中頭郡西原町千原１）のキャンパスからゲットウ（Alpinia zerumbet）を採取し、ゲットウの根茎を抽出試料とした。
乾燥重量４００ｇの根茎をカンナで削り、これにメタノール２Ｌを加え、２日間、室温で抽出した。

抽出溶媒を留去させた後、蒸留水３００ｍＬに乾燥抽出物５．７gを溶かし、ヘキサン３００ｍＬで脱脂した。脱脂後の水性抽出物２．９ｇをクロロホルム２００ｍＬとそれに続くエチルアセテート２００ｍＬで分画し、エチルアセテート画分１．６ｇをシリカゲルが入ったガラスクロマトグラフィーカラム（Ｓｉｌｉｃａｇｅｌ６０Ｎ, ｐａｒｔｉｃｌｅｓｉｚｅ６３−１２０μｍ，７０−２３０ｍｅｓｈＡＳＴＭ)に付し、石油エーテル：クロロホルム（０−１００％）の直線勾配で溶出し、３つの画分を得た。２番目の画分をＨＰＬＣを使用して更に精製した。

次にＳｙｎｅｒｇｉ４ｕＭＡＸ−ＲＰ８０Ａｃｏｌｕｍｎ（１５０ｘ４．６０ｍｍ,４ｍｉｃｒｏｎ；Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ, Ｔｏｒｒａｎｃｅ, ＣＡ)を用い、２８０ｎｍで単離化合物を収集した。移動相は、０．１％酢酸溶液（ｖ／ｖ）(溶液Ａ)と０．１％酢酸を含むアセトニトリル(溶液Ｂ)を用い、流速を１．００ｍＬ/ｍｉｎとした。グラジエント溶離の条件は、０〜７分間：溶液Ｂの４０〜７０％勾配、７〜２０分間：溶液Ｂの７０〜１００％直線勾配、２０〜３０分間：溶液Ｂの１００％定組成溶離とした。分画１ｍｇ/ｍＬのメタノール溶液５μＬを化合物単離に使用した。ＭＴＤを含む画分を図１に示す。

また、ＭＴＤの物理化学的性質を以下に示す。
HREIMS m/z 285.1 [M⁺] (calcd for C₁₈H₂₂O₃, 286.16). IR v (KBr) cm^-1: 669, 1646, 2341, 2359. ¹H-NMR (500 MHz, MeOD-d₄): 3.83 (q, 3H, OCH₃, J = 5.5 Hz, 9), 5.62 (d, 1H, OCH, 2), 6.24 (d, 1H, CH, 7), 6.86 (d, 1H, CH, 6), 7.58 (s, 1H, CH, 5), 7.59 (d, 1H, CH, 4), 7.14 (q, 1H, CH, J = 5.0 Hz, 1), 7.41 (t, 1H, CH, J = 7.0 Hz, 3), 7.36 (t, 1H, CH, J = 4.0 Hz, 8). ¹³C-NMR (500 MHz, MeOD-d₄): 57.01 (C-9), 89.42 (C-2), 102.78 (C-7), 120.05 (C-6), 128.63 (C-5), 129.14 (C-4), 129.99 (C-3), 130.55 (C-1), 136.66 (C-8)

実施例２
ＴＭＯＱの抽出と単離：
ゲットウの種子１００ｇを乳鉢で粉砕して、二日間、室温でメタノール５００ｍＬに浸漬し抽出した。濾過後、その濾液からメタノールを留去させ、濃いシロップ状の抽出物２１．６ｇ得た。この抽出物を蒸留水５００ｍＬに懸濁し、ヘキサン５００ｍＬとエチルアセテート５００ｍＬで分画した。エチルアセテート抽出画分１１．０７ｇを、シリカゲルを含むガラスクロマトグラフィーカラム（Ｓｉｌｉｃａｇｅｌ６０Ｎ, ｐａｒｔｉｃｌｅｓｉｚｅ６３−１２０μｍ, ７０−２３０ｍｅｓｈＡＳＴＭ）に付し、１％から５０％へ段階勾配的にクロロホルムにメタノールを混合し溶出させた。４画分が溶出したが、このうち画分４を、実施例１のＨＰＬＣと同じカラム及び同じ条件で更に精製した。得られたＴＭＯＱ画分を図２に示す。

また、ＴＭＯＱの物理化学的性質を以下に示す。
HREIMS m/z 317.55 [M⁺] (calcd for C₂₂H₃₉N, 317.2). IR v (KBr) cm^-1: 1024, 1121, 1456, 1507, 1541, 1558, 1646, 1698, 1748, 2360, 2927, 3448. ¹H-NMR (500 MHz, MeOD-d₄): 0.75 (q, 3H, CH₃, J = 10.5 Hz, 20), 0.85 (t, 3H, CH₃, J = 1.5 Hz, 18), 0.89 (q, 3H, CH₃, J = 4.0 Hz, 21), 0.94 (t, 3H, CH₃, J = 2.5 Hz, 1), 1.09 (t, 2H, CH₂, J = 2.5, 8), 1.17 (q, 2H, CH_2,11), 1.22 (q, 2H, CH₂, J = 1.5 Hz, 14), 1.28 (s, 2H, CH₂, 14), 1.39 (q, 1H, NCH, J = 2.5 Hz, 12), 1.43 (q, 2H, CH₂, J = 2.2 Hz, 4), 1.58 (t, 3H, CH₃, J = 2.0 Hz, 19), 1.64 (q, 2H, CH₂, J = 4.5 Hz, 7), 1.75 (q, 2H, CH₂, J = 2.0 Hz, 5), 2.00 (d, 2H, NCH₂, 13), 2.26 (d, 2H, CH₂, 6), 2.47 (t, 2H, NCH₂, J = 5.5 Hz, 17), 3.27 (t, 2H, CH₂, J = 8.0 Hz, 22), 6.02 (q, 1H, CH, 3) and 6.36 (d, 1H, CH, 2). ¹³C-NMR (500 MHz, MeOD-d₄): 14.00 (C- 21), 15.48 (C-20), 20.16 (C-4), 20.39 (C-19), 22.37 (C-18), 24.53 (C-5), 31.77 (C-7), 34.02 (C-15), 34.50 (C- 1), 37.79 (C-6), 39.90 (C-16), 40.36 (C-8), 42.03 (C-11), 43.39 (C-14), 55.96 (C-9), 63.34 (C-12), 65.83 (C-17), 68.81 (C-13), 108.85 (C-22), 122.20 (C-2), 135.00 (C- 3), 150.77 (C-10)

実施例３
α−グルコシダーゼ活性阻害試験：
α−グルコシダーゼ活性阻害試験は、Ａｈｍａｄｅｔａｌ. （２０１１）が報告した方法を多少改変した手法により行った。まず、９６穴プレートに異なる濃度サンプル１５μＬと酵素溶液１４０μＬ（α−グルコシダーゼ０．００７３Ｕ/ｍＬ；１００ｍＭＮａＣｌ含有０．０５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液）を加え、１５分間、３７℃でインキュベートした。その後、０．０５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８）に０．７ｍＭＰＮＰ−Ｇを含む溶液２５μＬをそれぞれのウェルに加えた。α-グルコシダーゼ活性は、酵素加水分解によりＰＮＧ−Ｐ（マルトース）から形成されるグルコース量を分光光度計（ＵＶｍｉｎｉ１２４０, Ｓｈｉｍａｄｚｕ, Ｋｙｏｔｏ, Ｊａｐａｎ）を用いて、４０５ｎｍで測定することにより決定した。陽性コントロールとして、ケルセチン及びカテキンを使用した。

結果：
ＴＭＯＱとＭＴＤのＩＣ_５０は、それぞれ１．６２および１．６４μｇ／ｍＬであった。これら化合物は、陽性コントロールのケルセチン（１．６２μｇ／ｍＬ）と同程度の阻害効果を有することが分かった。結果を図３に示す。

実施例４
トリプシン活性阻害試験：
トリプシン活性阻害試験は、基質としてＢＡＰＮＡを用い、ＷＡＴＩら（２００９）の方法で測定した。まず、サンプル１００μＬ、２０μｇ／ｍＬのトリプシン２００μＬおよび蒸留水１００μＬを含んだ溶液を３７℃で、１０分間インキュベートした。これに、あらかじめ３７℃でプレウォームした０．４ｍｇ／ｍＬのＢＡＰＮＡ５００μＬを加え、反応を開始させた。１０分間、３７℃でインキュベーションした後、１００μＬの３０％酢酸（ｖ／ｖ）を加えて反応を終了させ、遠心分離（１０分、４℃、２０００ｇ）にかけた。トリプシン活性は、吸光度４１０ｎｍでｐ−ニトロアニリン量を測定することにより決定した。陽性コントロールとして、ケルセチン及びカテキンを使用した。

結果：
ＴＭＯＱとＭＴＤのＩＣ_５０は、それぞれ３１．７５および４１．４８μｇ／ｍＬであった。ＴＭＯＱは、陽性コントロールであるケルセチン（３４．６８μｇ／ｍＬ）よりも阻害効果が高いことが分かった。結果を図４に示す。

実施例５
一酸化窒素生成阻害実験：
一酸化窒素阻害実験はＧｒｉｅｓｓＩｌｌｏｓｖｏｙｒｅａｃｔｉｏｎ（Ｇｏｖｉｎｄａｒａｊａｎら、２００３）を用いて行った。まず、１０ｍＭＳＮＰ２００μＬ、リン酸緩衝生理食塩水５０μＬ及びサンプル５０μＬを含んだ反応混合溶液３００μＬを１５０分間、２５℃でインキュベートした。次いで、反応混合溶液５０μＬを０．３３％スルファニル酸（２０％氷酢酸中）１００μＬと混合し、５分間室温に置いて完全にジアゾ化させ、ＮＥＤＨ１００μＬを添加し、混合して２５℃で、３０分放置した。放置後の吸光度を５４０ｎｍで測定した。陽性コントロールとして、カテキンとケルセチンを使用した。

結果：
ＴＭＯＱのＩＣ_５０は１５．７０μｇ／ｍＬであった。また、ＭＴＤのＩＣ_５０は、３０μｇ／ｍＬであった。ＴＭＯＱは、陽性コントロールのケルセチン（１８．９０μｇ／ｍＬ）より高い効果を有することが分かった。結果を図５に示す。

実施例６
キサンチンオキシダーゼ活性阻害試験：
０．１ｍＭＥＤＴＡ含有５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．４）に、キサンチン１００μＭ、馬心臓シトクロムｃ２５μＭ及び異なる濃度のサンプルを添加し、反応混合液を作成した。この反応混合液に、キサンチンオキシダーゼ(０．０７Ｕ／ｍＬ)を添加し、反応を開始させた。２分後、分光光度計を用いて５５０ｎｍで還元されたシトクロムｃを測定した。生成したスーパーオキシドの量は、ε＝２１，１００Ｍ^−１ｃｍ^−１を使用して計算した。陽性コントロールとしてＬ−ＮＡＭＥ（ＮＧ-ニトロアルギニンメチルエステル）を使用した。

結果：
ＴＭＯＱのＩＣ_５０は１４．５１μＭであった。また、ＭＴＤのＩＣ_５０は、１４０μＭであった。ＴＭＯＱは、陽性コントコロールのＬ−ＮＡＭＥ(ＩＣ_５０＝１２．８８μＭ)とほぼ同等の効果を有することが分かった。結果を図６に示す。

実施例７
ＬＤＬ酸化活性阻害試験：
ＬＤＬ酸化活性阻害試験は、ＲａｔｔａｎとＡｒａｄ（１９９８）の方法により行った。まず、１０ｍＭＰＢＳ（ｐＨ７．４）によりＬＤＬを２２０μｇ／ｍＬに調整し、一定量の異なる濃度のサンプルを添加した。ＬＤＬの酸化反応は、５５μＭＣｕＳＯ_４の添加で開始し、３７℃で２４時間インキュベートした。その後、1ＭＥＤＴＡ５０μＬを添加して反応を停止させ、Ｓｔｅｉｎｂｒｅｃｈｅｒら（１９８４）の方法によりＴＢＡＲＳ活性のため２０℃でサンプルを静置した。酸化後、ＬＤＬに０．６７％ＴＢＡ１．５ｍＬと２０％ＴＣＡ１．５ｍＬを混合し、１００℃、３０分でサンプルを静置した。反応物は３０分、２５℃で保管され、１５分、４℃、２００ｇで遠心分離した。上澄を５３２ｎｍで吸光度を測定した。

結果：
ＭＴＤのＩＣ_５０は、２０μＭであった。ＴＭＯＱのＩＣ_５０は、２．１０μＭであり、陽性コントロールのケルセチンよりも高い効果を示した。結果を図７に示す。

実施例８
ラジカル生成阻害試験：
（１）ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の準備：
ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を以下の方法で準備した。
ＤＳファーマバイオメディカル株式会社（大阪府、日本）から、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）(Lot:121210/ 255902-1R, No.12002053)とＣＳＣ完全組み換え培地を購入した。細胞は付属因子を含んだＣＳＣ培地で維持され、３７℃、５％ＣＯ_２の加湿雰囲気で増殖させた。

ゼラチンでコーティングしたフラスコに、２０％ＦＢＳ、５Ｕ／ｍＬヘパリン、１ｍＬＬ−グルタミン＋ストレプトマイシン＋ペニシリン、１μｇ／ｍＬヒドロコルチソン、５０μｇ／ｍＬ内皮細胞成長サプリメント及び１０μｇ／ｍＬヒト表皮成長因子を添加した培地１９９を注ぎ、同培地に２〜４継代したＨＵＶＥＣ細胞（１０^６細胞）及び各サンプル５０μＭを加え、２４時間インキュベートした。インキュベート後、培地を除去し、細胞を５ｍＬＰＢＳで洗浄した。５ｍＬ０．２５％トリプシン-ＥＤＴＡで細胞を収集し、遠心分離し（５分、１０００ｇ、４℃）、細胞を回収した。

（２）Ｏ_２ ^・−生産の阻害試験：
上記回収した細胞（ＨＵＶＥＣ）を、５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．４）によって洗浄し、４０μＭフェリシトクロムｃ含有ＨＥＰＥＳ緩衝等張塩培地（１３３ｍＭＮａＣｌ、６．５ｍＭＫＣｌ、１ｍＭＣａＣｌ_２、１ｍＭＭｇＣｌ_２、５．５ｍＭグルコース、５０μＭＬ−アルギニン、２０ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４）を用いて、６時間、３７℃で１μＭアンジオテンシンＩＩを作用させた。フェリシトクロムｃの減少は、上澄みの５５０ｎｍにおける吸光度によって測定された。Ｏ_２ ^・−放出はＳＯＤ（スーパーオキシドジスムターゼ；２００Ｕ／ｍＬ）添加とＳＯＤ無添加を用意しその差から計算された（Ｓｔｅｆｆｅｎら、２００８）。

結果：
ＭＴＤ及びＴＭＯＱのＯ_２ ^・−生産は、サンプル未処理のコントロールに対して、９５．９４±０．３９及び８４．２３±０．５２％であった。結果を図８に示す。

実施例９
活性酸素種（ＲＯＳ）及び一酸化窒素（ＮＯ）生成阻害試験：
（１）細胞として、３Ｔ３−Ｌ１細胞（アメリカン・タイプ・カルチュア・コレクション（ＡＴＣＣ）から入手）を用い、これを、２％のグルタミンと、１０（ｖ／ｖ）％のウシ胎児血清（ＣＳ）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中、コンフルエントになるまで培養した。コンフルエンシーに達した２日後に、細胞は、さらに２日間、１０％ＦＢＳ、０.５ｍＭ３−イソブチル−１−メトキシキサンチン（ＩＢＭＸ）、１μＭデキサメサゾンおよび１０μＭインシュリンを含むＤＭＥＭ培地中で培養し脂肪細胞に分化するように刺激された。細胞は、それから更に、２日間、１０％ＦＢＳと１０μｇ／ｍＬインシュリンを含むＤＭＥＭ中で維持され、更に４日間、１０％ＦＢＳのみを含むＤＭＥＭで培養された。
この結果、細胞の９０％以上は、脂質滴が蓄積された３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞に分化していた。分化した３Ｔ３−Ｌ１細胞は、異なった濃度の試験化合物で処理され、試験中を通して５％のＣＯ_２を含む加湿されたインキュベーター中で、３７℃に維持した。

（２）３Ｔ３−Ｌ１細胞生存性
細胞生存率を、ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）アッセイにより測定した。３Ｔ３−Ｌ１前脂肪細胞を９６ウェルプレートに１×１０^４細胞／ウェルの密度で播種し、培養培地中で培養した。次いで、細胞を１００又は２５０μｇ／ｍＬの濃度の試験化合物により処理した。７２時間後、暗所にて細胞を３７℃で４時間ＭＴＴ溶液でインキュベートした。上清を吸引し、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を各ウェルに添加し、プレートを撹拌してホルマザン結晶生成物を溶解させた。マイクロプレート分光光度計（Bio-Rad Laboratories, Inc.）を用いて５７０ｎｍにおける吸光度を測定した。未処理の場合を１００％として、細胞生存率を求めた。結果を図９に示す。

（３）細胞内活性酸素種（ＲＯＳ）測定
細胞を９６ウェルプレートに２×１０^６細胞／ｍＬの密度で播種し、上記と同様にしてコンフルエントまで培養し、分化させた。ＲＯＳ生成は、ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）アッセイによって検出した（Oliveira, H.R.; Verlengia, R.; Carvalho, C.R.; Britto L.R.; Curi, R.; Carpinelli, A.R. Pancreatic β-cells express phagocyte-like NAD(P)H oxidase. J. Diabetes. 2003, 52, 1457-1463.）。ＮＢＴは、ＲＯＳにより還元され、ホルマザンと呼ばれる暗青色で不溶性形態になる。分化後、細胞を１０又は２０μｇ／ｍＬの濃度の試験化合物とともに２４時間インキュベートした。次いで、細胞を０．２％ＮＢＴ含有ＰＢＳ１００μＬ中で９０分間インキュベートした。暗青色のホルマザンを５０％酢酸に溶解し、５７０ｎｍにおける吸光度を測定した。結果を図１０に示す。

（４）細胞内一酸化窒素（ＮＯ）生成測定
上記と同様にして、細胞を９６ウェルプレートに播種し、分化させた。亜硝酸塩生成（ＮＯ_２）アッセイを用いて測定した( Fang, X.K.; Gao, J.; Zhu, D.N. Kaempferol and quercetin isolated from Euonymus alatus improve glucose uptake of 3T3-L1 cells without adipogenesis activity. J. Life Sci. 2008, 82, 615-622.)。細胞を１０又は２０μｇ／ｍＬの濃度の試験化合物とともに２４時間インキュベートした。上清（１００μＬ）及びグリース試薬（１００μＬ、１％スルファニルアミドと０．１％ナフチルエチレンジアミン二塩酸塩含有５％リン酸の１：１混合物（ｖ／ｖ））を、９６ウェルプレート中で混合し、室温で１０分間インキュベートした。マイクロプレート分光光度計を用いて５４０ｎｍにおける吸光度を測定し、亜硝酸ナトリウムで作成した標準曲線により亜硝酸塩濃度を推定した。結果を図１１に示す。

結果：
ＭＴＤ及びＴＭＯＱは、脂肪細胞におけるＲＯＳ生成を強く阻害した。濃度２０μｇ／ｍＬにおける阻害率は、ＭＴＤが５９．５±１．９０％，ＴＭＯＱは５２．５±１．１０％であった。またＮＯ生成も有意に抑制し、ＮＯ生成量は、ＭＴＤにより７１．１±０．８１％、ＴＭＯＱにより５７．７±０．５８％に減少した。一方、ＭＴＤ及びＴＭＯＱは、１００μｇ／ｍＬの濃度で３Ｔ３−Ｌ１細胞生存性に対してほとんど影響を示さず、２５０μｇ／ｍＬでもわずかな生存率の低下しか認められなかった（ＭＴＤ：６．９±２．４９％、ＴＭＯＱ：６．９±１．２８％）。

実施例１０
メラニン生成抑制作用：
（１）マウスＢ１６Ｆ１０メラノーマ細胞（ＡＴＣＣより入手）を、３７℃にて、１０％熱不活化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および１％ペニシリン／ストレプトマイシン（１０．０００Ｕ／１００μｇ／ｍＬ）を加えたＤＭＥＭ中で５％ＣＯ_２の加湿雰囲気下で培養した。

（２）Ｂ１６Ｆ１０細胞生存性
細胞生存率はＭＴＴアッセイを用いて測定した（Campos, P.M.; da Silva Horinouchi, C.D.; da Silveira Prudente, A.; Cechinel-Filho, V.; de Almeida Cabrini, D.; Otuki, M.F. Effect of a Garcinia gardneriana (Planchon and Triana) Zappi hydroalcoholic extract on melanogenesis in B16F10 melanoma cells. J. Ethnopharmacol. 2013, 148, 199-204.）。Ｂ１６Ｆ１０細胞を９６ウェルプレートに７×１０^３細胞／ウェルの密度で播種した。４８時間培養後、細胞を１００又は２００μｇ／ｍＬの濃度の試験化合物、又は５００μＭコウジ酸溶液で処理し、３７℃でさらに４８時間インキュベートした。インキュベーション後、培地を除去し、細胞をリン酸緩衝液で２回洗浄し、３７℃、３時間ＭＴＴ溶液（０．５ｍｇ／ｍＬ）でインキュベートした。培地を捨てて、エタノール２００μＬを添加した。マイクロプレート分光光度計（Bio-Rad Laboratories, Inc.）を用いて５７０ｎｍにおける吸光度を測定した。結果を図１２に示す。

（３）メラニン含有量測定
メラニン含有量はYoonらの方法に従って測定した（Yoon, N.Y.; Eom, T-K.; Kim, M-M.; Kim, S-K. Inhibitory effect of Phlorotannins isolated from Ecklonia cava on mushroom tyrosianse activity and melanin formation in mouse B16F10 melanoma cells. J. Agri. Food. Chem. 2009, 57, 4124-4129.）。すなわち、Ｂ１６Ｆ１０細胞を７×１０^３細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレートに播種した。４８時間培養後、細胞を２０又は５０μｇ／ｍＬの試験化合物、又は５００μＭコウジ酸で処理した。１時間後、１００μＭイソブチル−１−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）を加え、さらに３７℃で４８時間インキュベートした。細胞をリン酸緩衝液で２回洗浄し、次いで１０％ＤＭＳＯを含むＮａＯＨ（１Ｎ）１００μＬに溶解させた。サンプルを８０℃で１時間インキュベートし、メラニンを可溶化するために混合した。混合ホモジネートの４９０ｎｍにおける光学濃度を測定した。対照群において実験期間中に生成するメラニンの総量を１００％とし、処置群における阻害率を計算した。結果を図１３に示す。

（４）細胞内チロシナーゼ活性
Liらの方法を若干修正してチロシナーゼ活性を測定した（Li, X.; Guo, L.; Sun, Y.; Zhou, J.; Gu, Y.; Li Y. Baicalein inhibits melanogenesis through activation of the ERK signaling pathway. Inter. J. Mol. Med. 2010, 25, 923-927.）。Ｂ１６Ｆ１０細胞を９６ウェルプレートに７×１０^３細胞／ウェルの密度で播種した。４８時間培養後、細胞を２０又は５０μｇ／ｍＬの試験化合物、又は５００μＭコウジ酸で処理した。１時間後、１００μＭイソブチル−１−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）を加え、さらに３７℃で４８時間インキュベートした。次いで、細胞を氷冷リン酸緩衝液で洗浄し、１％トリトン−Ｘ（９０μＬ／ウェル）含有リン酸緩衝液（ｐＨ６．８）で溶解した。プレートを−８０℃で３０分間凍結した。解凍、混合した後、１％Ｌ−ＤＯＰＡ１０μＬを各ウェルに加えた。３７℃、２時間インキュベーションした後、４９０ｎｍにおける吸光度を測定した。結果を図１４に示す。

結果：
３−イソブチル−１−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）は、チロシナーゼを活性化する強力なメラニン生成刺激因子である。チロシナーゼはメラニン生成における重要かつ律速段階に関与する酵素であり、チロシンの水酸化により３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン（Ｌ−ＤＯＰＡ）を生成し、次にＬ−ＤＯＰＡの酸化によりドーパキノンとなる。メラニン産生刺激因子であるＩＢＭＸの存在下、ＭＴＤ及びＴＭＯＱのメラニン生成抑制作用を評価した。
Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ細胞を、４８時間ＩＢＭＸの存在下ＭＴＤ及びＴＭＯＱ（２０又は５０μｇ／ｍＬ）で処理したところ、図１３に示されるように、いずれも有意にメラニン含有量を減少させた。５０μｇ／ｍＬでは、ＭＴＤ、ＴＭＯＱのメラニン生成抑制率はそれぞれ７８．９±０．８２％、５８．７±８．８９％であり、陽性対照であるコウジ酸（５００μＭ、５０．５±４．９４％）よりも優れたメラニン生成抑制作用を示した。

ＭＴＤ及びＴＭＯＱが細胞内チロシナーゼ活性を阻害するか否かを評価するために、Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ細胞をＭＴＤ及びＴＭＯＱ(２０又は５０μｇ／ｍＬ)で４８時間処理し、Ｌ−ＤＯＰＡを加えてインキュベーションした。２０μｇ／ｍＬにおけるＭＴＤ、ＴＭＯＱのチロシナーゼ阻害率は、それぞれ７５．６±６．５６％、４６．２±２．５９％であった。５０μｇ／ｍＬにおける阻害率は、ＭＴＤが８２．５±５．８１％、ＴＭＯＱが６１．２±０．３４％であり、陽性対照であるコウジ酸（５３．４±１．３８％）よりも強い阻害活性を示した。一方、ＭＴＤ及びＴＭＯＱは、Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ細胞の生存性にほとんど影響を与えなかった。

本発明の新規化合物であるＭＴＤやＴＭＯＱは、α‐グルコシダーゼ及びトリプシンの活性阻害剤や一酸化窒素生成阻害剤として利用可能である。また、ラジカル阻害剤及びＬＤＬ酸化阻害剤としても利用可能である。特に、同新規化合物を糖尿病、動脈硬化、肥満及びメタボリックシンドロームの治療又は予防を目的とした飲食品、医薬品及び医薬部外品等や美白化粧料等の有効成分として利用することも可能である。

従って、新たな医薬品等の開発に極めて有効なものである。
以上

Claims

次の式（Ｉ）又は（ＩＩ）で表される化合物。
請求項１記載の化合物を有効成分として含有するα‐グルコシダーゼ、トリプシン、キサンチンオキシダーゼ及びチロシナーゼからなる群より選ばれる酵素活性阻害剤。
請求項１記載の化合物を有効成分として含有する一酸化窒素生成阻害剤。
請求項１記載の化合物を有効成分として含有するラジカル生成阻害剤。
請求項１記載の化合物を有効成分として含有するＬＤＬ酸化阻害剤。
請求項１記載の化合物を有効成分として含有する抗肥満剤。
請求項１記載の化合物を有効成分として含有するメラニン生成抑制剤。
請求項１記載の化合物を有効成分として含有する美白剤。
請求項１記載の化合物を有効成分として含有する糖尿病治療を目的として使用されることを特徴とする食品。
請求項１記載の化合物を有効成分として含有する糖尿病治療を目的として使用されることを特徴とする医薬品又は医薬部外品。
請求項１記載の化合物を有効成分として含有する動脈硬化治療を目的として使用されることを特徴とする食品。
請求項１記載の化合物を有効成分として含有する動脈硬化治療を目的として使用されることを特徴とする医薬品又は医薬部外品。
請求項1記載の化合物を有効成分として含有する肥満治療を目的として使用されることを特徴とする食品。
請求項1記載の化合物を有効成分として含有する肥満治療を目的として使用されることを特徴とする医薬品又は医薬部外品。
請求項１記載の化合物を含有する化粧料。