JP6518588B2 - 歯の障害を治療するための組成物の製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、歯の障害を治療するための組成物を製造する方法に関し、該組成物は、ある特定のｐＨで自己組織化することができるペプチドを含有している。本発明の組成物は、医療分野での使用、特に、表面下のカリエス障害等の歯の障害にミネラルを補充するのに非常に適している。

現在にいたるまで、歯のミネラル補充は、主に、カルシウムおよびホスフェートイオンを歯の障害またはキャビティ中に届けることにより達成される。カルシウムおよびホスフェートイオンは、通常、例えば、研磨剤、フッ化物、界面活性剤および他のミネラル補充剤をも含有する練り歯磨きに含まれている。カルシウムおよびホスフェートイオンは、リカルデント系材料中等に、例えば、ヒドロキシアパタイト系材料として、または非晶質カルシウムホスフェートとして種々の結晶形態で使用されている場合もある。

より最近になって、簡潔合理的に記載された自己組織化(self-assembling)ペペプチドに基づいた、歯のミネラル補充の別のアプローチが記載されている。WO2004/007352は、三次元足場を形成できるペプチドを開示しており、それにより新規のカルシウムホスフェートの核形成を促進する。これらの人工のペプチドは、一次元にアセンブルし(assemble)、βシート、テープ様アセンブリー(assembly)を形成する。ペプチドアセンブリーは、化学的または物理的トリガーに応答して、流体からネマチック状態、より硬いゲル状体に転換することができる。ペプチドは、テープ、リボン、フィブリルおよびファイバーの段階的順序で、ある特定のｐＨ，イオン強度および/または温度条件に反応してアセンブリーを形成するようにデザインされた。Aggeliら（2003, J. Am. Chem. Soc. 125, 9619-9628）は、ペプチドβシート自己組織化(self-assembly)のトリガーとしてｐＨを分析している。

先行技術には、他にもいくつかの自己組織化ペプチドが記載されている。例えば、WO2010/0041636A1には、親水性アミノ酸または疎水性アミノ酸が結合した８−２００のアミノ酸残渣を有し、生理学的ｐＨでβ構造に自己組織化する人工のペプチドを含有する生物吸着性ペプチド組織咬合剤を記載している。また、細胞外マトリックスと相互作用する、親水性および疎水性残渣またはストレッチ（stretches)を交互に有する自己組織化ペプチドが、WO2008/113030A2に開示されている。WO2010/103887A1は、特定の第１シーケンスを有する、塩基性、疎水性および酸性アミノ酸からなる自己組織化ペプチドおよびそれらの高強度ペプチドゲルを開示している。

もう一つの出願、WO2007/000979A1は、極性および非極性アミノ酸を有する自己組織化ペプチドを記載している。該ペプチドはβシート構造を形成することができ、非極性アミノ酸は、アセンブルされた形態にて該構造の一側面上に配列されている。安定な巨視的メンブランとして使用するための両親媒性自己組織化ペプチド、それは、例えば、遅拡散性ドラッグデリバリー等の生体材料用途に使用されるが、US6548630に記載されている。

EP2327428A2は、お互いに対して相補的である自己組織化ペプチドナノファイバー、および、例えば心筋梗塞後の組織などの損傷をうけた組織を修復する少なくとも１つの細胞からなる医薬組成物に言及している。

生物活性剤をデリバリーするための自己組織化ペプチドを使用することが、例えば、US2008/199431A1および「WO2009/026729等の先行技術にも記載されている。WO2006/073889A2は、インビボでPDGFをゆっくりとリリースするゲルにアセンブルするペプチドにヒトPDGFが直接結合している組成物に関する。WO2006/047315A2は、ビオチン/ストレプトアビジン結合を使用して、治療薬を自己組織化ペプチドにアタッチすることが提案されている。カークハム(Kirkham)らは、エナメル質のミネラル補充を促進する自己組織化ペプチド骨格に関する（2007, Dent. Res. 86(5), 426-430）。

上記に見られるように、カルシウムホスフェートのインシッツ(in situ)核形成のための歯のミネラル補充におけるテンプレートや骨格として使用できる自己組織化ペプチドがいくつか記載されている。しかしながら、歯のミネラル補充において直面する特別の問題は、表面下の障害には、ペプチドがアセンブルした形態では近づき難いということである。一旦、これらのペプチドが、テープ、リボン、フィブリルまたはファイバーを形成してしまうと、アセンブリーのサイズは、歯表面上の無機質過剰化プレートにおける小孔を通って表面下の障害中へ拡散することが、意味ある効果を達成するのに必要な量で行われることは、もはや不可能であるといったものとなっている。

それ故、表面下障害を効率よく治療するために、自己組織化ペプチドは、歯の障害の外側でモノマー形態にあり、表面下障害中への拡散を可能とし、一旦、歯の障害内に入ると原線維形態に転換することが必要である。ペプチドが障害の外側でアセンブルすると、形成される三次元構造が大きすぎて、細孔を通って拡散できなくなるので、障害内でミネラル補充を円滑化することができない。

先行技術に、ドラッグトランスファーデバイスを記載したものがいくつかある。例えば、ドラッグを直接適用するための封止装置を有する液体トランスファーデバイスが開示されている（例えば、WO2011/058545A1, WO2011/104711A1)。しかしながら、これらのドラッグトランスファーデバイスはどれも、歯の障害の外側でのアセンブリーの問題を解消していない。

国際公開第2004/007352号 国際公開第2010/041636号 国際公開第2008/113030号 国際公開第2010/103887号 国際公開第2007/000979号 国際公開第2009/026729号 国際公開第2006/073889号 国際公開第2006/047315号 国際公開第2011/058545号 国際公開第2011/104711号

本発明は、自己組織化ペプチドを歯の障害へ標的デリバリーする方法を提供するものであり、該方法は、該障害の外側でモノマー形態のままであることを可能とし、それにより、表面下障害中に拡散することを円滑化するものである。表面下障害中で、ペプチドは、自己組織化原線維状態に転換する。歯の障害への自己組織化ペプチドの標的デリバリー用組成物をも提供するものである。

特に、第１の面において、本発明は、
ａ）ｐＨ７．５未満で自己組織化し始めるペプチドを含有する溶液であって、前記ペプチドが自己組織化を始めるｐＨを０．１ないし０．５ｐＨ単位超えるｐＨを有する前記溶液を準備すること；
ｂ）前記溶液のｐＨを８．０以上に増加させ、そして、凍結乾燥の間に除去されるのに十分な揮発性を有している化合物を添加すること；
ｃ）前記溶液を凍結乾燥すること；および
ｄ）所望により、凍結乾燥物を水溶液に溶解させ、前記ペプチドが自己組織化を始めるｐＨを０．１ないし０．５ｐＨ単位超えるｐＨを有し、前記ペプチドをそのモノマー状態で含有する溶液を得ること；
を含む、カリエス障害等の歯の障害を治療するのに適した組成物の製造方法を提供するものである。

本発明は、とりわけ、凍結乾燥の間、揮発性があり、気化するアンモニアのような塩基性化合物を使用することが、自己組織化ペプチドのアセンブリーを制御するのに有用であるという知見に基づいている。特に、凍結乾燥の間の塩基性化合物の蒸発を通じて、ｐＨが塩基性からより酸性条件にシフトすることにより、水中で再懸濁すると、ペプチドが自己組織化し始めるｐＨに近いｐＨを有する主にモノマーペプチドを含んだ均一溶液となる、凍結乾燥物を得ることができる。この溶液を歯の表面に適用すると、モノマーペプチドは、ミネラル補充が達成されるべき歯の障害中に拡散する。歯の障害中においては、ｐＨは、口腔のマイクロフロラを形成する乳酸バクテリアにより乳酸が継続的に製造されている結果として、普通５．０と６．５の間か、それより低い。本発明の溶解緩衝液は、歯の障害中で希釈されながら、該障害中で、モノマーペプチドのｐＨ誘発アセンブリーがスタートし、後に起こるカルシウムホスフェートの沈着のための骨格として働きができる多量体アセンブリーを形成する。

自己組織化をし始めるｐＨより高いｐＨを有する新しいペプチド溶液は、最初は、ほんの少量パーセンテージの自己組織化マルティマーを含有しているだけだろうが、溶液の保管や、空気への暴露などで、炭酸水素塩の形成や、その後の溶液の酸性化が起こり、アセンブリーが引き起こされ得る。

本発明の方法によると、ペプチドの効果的モノマー化は、ペプチド含有溶液のｐＨを８．０以上に増加させることにより達成される。ペプチドのモノマー化は、溶液のｐＨを、ペプチドが自己組織化し始めるｐＨより少なくとも０．５単位高いｐＨに増加させることにより達成されることが好ましい。例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２として本明細書に言及されているペプチドを使用するとき、これらのペプチドの自己組織化は、ｐＨ７．５でスタートするので、モノマー化は、８．０以上のｐＨで達成される。このような高いｐＨでは、９５％を超える、好ましくは、９６％を超える、９７％を超える、９８％を超える、９９％を超える、そして最も好ましくは１００％の溶液中のペプチドが、非アセンブル状態、すなわちモノマーである。溶液を凍結乾燥し、続いて水または中性または中性に近いｐＨを有する他の水性媒体中に溶解した後、該ペプチドは依然としてモノマー形態の状態にある。このように、本発明は、モノマーペプチドの歯の障害中への標的デリバリーおよびその後の該歯の障害内での該ペプチドの自己組織化を可能とし、後者のステップは、ユーザー、例えば歯医者のなんらの関与なしに、歯の障害中におけるｐＨによって開始される。本発明の方法および組成物は、特に、有利である、というのは歯の障害の外側でのペプチドの自己組織化によるペプチドの甚大な量の損失が避けられるからである。同時に、本発明の方法および組成物は、障害体内部で自己組織化を可能とするに必要な濃縮を容易にする。

本発明の方法は、哺乳類における、より好ましくはヒトにおける、カリエス障害等の歯の障害を治療するに高度に適した組成物を提供する。さらに、本発明は、歯におけるキャビティにミネラル補充するのに高度に適した組成物を提供する。とりわけ、本発明の方法および組成物は、例えば、唾液中に存在するカルシウムおよびホスフェートイオンの沈着により、障害のミネラル補充を促進する相互に連結したペプチドのネットワークで、歯の障害および/またはキャビティを満たすのに使用することができる。本明細書において使用されている、カリエス”障害”(lesion)は、一般に、歯の薄皮に存在するバクテリアの酸形成に起因する歯または歯表面における表面下障害または表面下ミクロ障害である。本明細書において使用されている、歯の”キャビティ”（cavity)は、歯の表面におけるホールである。バクテリア、特に、ストレプトコッカス属、ラクトバシラス属およびクチノマイセス属のバクテリアは、食物から生じる炭水化物の発酵により酸を製造する。発酵の際に形成された酸により、硬質歯組織、すなわち、エナメル、象牙質およびセメント質が脱灰されることになる。歯の障害およびキャビティは、また物理的外傷の結果でもありうる。もし、治療しないままでいると、カリエス障害またはキャビティは、血管および神経を含んでいる髄質の感染につながりうるものであり、究極的に歯を失うことにもなりかねない。

一般に、障害またはキャビティは、いかなる歯上にも、例えば、切歯（門歯）、犬歯（Dentescanini)、小臼歯(Dentespraemolares)、および/または大臼歯(Dentesmolares)上に存在しうる。同様に、障害またはキャビティは、いかなる歯の表面、すなわち、唇側表面、近心表面、頬側表面、口蓋表面、隣接面および/または遠心表面上に影響しうる。

本発明方法の第１ステップにおいて、１種以上の自己組織化ペプチドを含有する溶液を準備する。本発明の方法に使用するための自己組織化ペプチドは、それが、その環境のｐＨがあるｐＨ値、例えばｐＨ７．５より低くなるとすぐ、自己組織化するようなものが選択される。本発明の自己組織化ペプチドが自己組織化し始めるｐＨは、７．５未満、好ましくは７．２未満、より好ましくは７．０未満である。例えば、自己組織化ペプチドＰ１１−４（SEQ ID NO:1)および末端変性Ｐ１１−４（SEQ ID NO:2)が自己組織化し始めるｐＨは、約７．５である。このことは、自己組織化ペプチドは、ｐＨが７．５未満になるとかなりの程度まで自己組織化し始めるということを意味している。

本明細書に使用されている、ペプチドの「自己組織化(self-assembly)」は、ペプチドが、それと同じ種類のペプチド（すなわち、類似した構造を有しているペプチド）と、自然発生的かつ可逆的に組織化し、非共有結合性相互作用により、多量体アセンブリーを形成することを意味している。多量体アセンブリー形成を担っている非共有結合性相互作用としては、ペプチドのアミノ酸主鎖および/またはアミノ酸側鎖間のファンデルワールス相互作用、パイスタッキング(pistacking）相互作用、水素結合相互作用、極性相互作用およびイオン相互作用を含む。

本明細書に使用されている、自己組織化するペプチドが、自己組織化し始めるｐＨは、溶液中のペプチドのかなりの程度の自己組織化が観測されるｐＨ未満を意味しており、溶液中に見いだされるペプチドの少なくとも約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％またはさらには約１００％が、ペプチドが自己組織化し始めるｐＨ未満でアセンブルすることを意味している。好ましい態様においては、溶液中に見いだされるペプチドの少なくとも約２５％が、ペプチドが自己組織化し始めるｐＨ未満でアセンブルしている。

好ましくは、自己組織化を開始するｐＨ、例えばＰ１１−４および変性Ｐ１１−４に対しては約ｐＨ７．５で、ペプチドの約２０％以下だけ、好ましくは約１５％以下だけ、より好ましくは１０％以下だけ、さらにより好ましくは約５％だけが多量体状態にある。それ故、ペプチドが、本発明の意味においてモノマー形態で「主に」存在する溶液は、ペプチドの約２０％以下だけ、好ましくは約１５％以下だけ、より好ましくは１０％以下、さらにより好ましくは５％、４％、３％、２％、１％以下が、モノマー状態である溶液である。

対照的に、自己組織化を開始するｐＨ、例えば、ペプチドＰ１１−４（SEQ ID NO:1)および変性Ｐ１１−４（SEQ ID NO:2)に対するｐＨ７．５未満では、溶液中のかなりの程度のペプチドの自己組織化が観察され、そのことは、溶液中に見いだされるペプチドの少なくとも約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％または約１００％がアセンブルしている、すなわち、多量体であることを意味している。

本発明の方法に使用するための自己組織化するペプチドは、好ましくは、ベータプリーツシート(beta-pleated sheet)にアセンブルする。ベータプリーツシートにおいては、異なるポリペプチド鎖における残渣間、または折り重ね型ポリペプチドの異なるセクションにおける残渣間の一連の水素結合によりシート様構造が創り出される。一般に、ベータプリーツシートにおける隣接ポリペプチド鎖は、それらの鎖が反対方向に延びていることを意味する、アンチパラレルである。しかしながら、隣接する鎖は、パラレルに延びていてもよい。いくつかのポリペプチド鎖が、シート形成に関与しているのであれば、そのシートは堅い壁様構造である。マルチプリーツシートは、必要なタフネスおよび剛性を備えている。本発明の方法に使用できるペプチドは、自己組織化すると安定な２次構造を形成するようにデザインされている。好ましくは、本発明の方法に使用するためのペプチドは、厚さがシングル分子のベータプリーツ構造を含む長い「ベータテープ（beta-tapes)」を形成する。ペプチドは、アセンブリーの間、ヘリカルテープ（シングル分子厚さ）、ツイステッドリッボン（ダブルテープ）、フィブリル（リボンのツイステッドスタック）やファイバー（絡み合ったフィブリル）等の複合構造を形成する。ｐＨを減少させるにつれ、ヘリカルテープ、ツイステッドリボン、フィブリル、そして最後にファイバーが形成される。

本発明の方法に使用しうる自己組織化ペプチドのサイズは、特に限定されない。本発明のペプチドは、ｐＨ依存方法で自己組織化できれば、いかなる長さであってもよい。好ましくは、ペプチドは、約４−２００アミノ酸、より好ましくは６−１００アミノ酸、８−５０アミノ酸、１０−３０アミノ酸または１１−２０アミノ酸のサイズを有する。よりさらに好ましくは、自己組織化ペプチドは、約２７アミノ酸、２４アミノ酸、２１アミノ酸、１５アミノ酸、または１１アミノ酸の長さを有する。特に好ましい態様においては、自己組織化ペプチドは、１１アミノ酸の長さを有する。

自己組織化ペプチドは、ペプチド合成の分野で一般的に知られている方法であり、適しておればいかなる方法で調製されてもよい。例えば、５０アミノ酸を超える長さを有するペプチドは、組換え方法で調製されてよい。一態様においては、自己組織化ペプチドは、融合ペプチドとして製造される。本明細書で使用されているような、融合ペプチドは、第２アミノ酸シーケンスにＮ−末端またはＣ−末端でリンクされる関心のある自己組織化ペプチドを含有する第１アミノ酸シーケンスの融合を意味している。第２アミノ酸シーケンスは、アフィニティー標識、すなわち、自己組織化ペプチドの５’または３’末端に融合し、他の化合物にアフィニティー増大を示すアミノ酸シーケンスであってもよく、それにより、融合ペプチドの精製を可能とする。好ましくは、標識シーケンスは、例えば、自己組織化ペプチドとアフィニティー標識の間にタンパク分解開裂サイトを与えることにより、精製後、関心の自己組織化ペプチドから除去される。一態様において、自己組織化ペプチドは、Kyle ら., 2010, Biomaterials 31, 9395-9405に開示されているように調製される。

より小さな自己組織化ペプチドは、通例、化学合成により調製される。例えば、ペプチドは固相法または液相法により化学的に合成される。ペプチドの液相化学合成手順が記載されている（例えば、Andersson ら, Biopolymers 55:227-250, 2000参照）。固相合成としては、Merrifield (J. Am. Chem. Soc., 1964, 85, 2149-2154)に記載されている技術を使用できる。本アプローチにおいては、成長ペプチドは、不溶性樹脂上に固定され、未反応溶解性試薬は、操作的ロスなく、濾過または洗浄により取り除かれる。固相ペプチド合成は、オートメーション化された装置を使用することにより難なく行うことができる。

本発明の方法に使用するペプチドは、どのような天然たんぱく質性（proteinogenic）アミノ酸を含有していてもよい。さらに、ペプチドは、珍しい非天然たんぱく質性（non-proteinogenic）アミノ酸、例えば、カルニチン、γ-アミノ酪酸（GABA）、ヒドロキシプロリン、セレノメチオニン、ハイプシン、ランチオニン、2-アミノイソ酪酸、デヒドロアラニン、オルニチン（Orn、O）、シトルリン、β-アラニン（3-アミノプロパン酸）等を含有していていもよい。非天然たんぱく質性アミノ酸は、ペプチドの化学合成の間に翻訳後修飾によりまたは直接組み込みによりペプチド中に組み込むことができる。

本発明の方法に使用する自己組織化ペプチドは、好ましくは、−ＣＯＯＨ基を含むアミノ酸鎖を含有している。−ＣＯＯＨを有するアミノ酸鎖は、その公称ｐＫ値を超えるｐＨ値で脱プロトン化される。例えば、スパラギン酸（Asp、D）やグルタミン酸（グルタミン酸、E）等の側鎖に-COOH基を含むアミノ酸は、低いｐＫａ（ASP：3.71;Glu：4.15）なので、中性、すなわちｐＨ７を超えるｐＨで本質的に脱プロトン化される。本発明の自己組織化ペプチドにおいて、−ＣＯＯＨ基を含有するアミノ酸側鎖は、隣接ペプチド間の静電気相互作用をコントロールするように、すなわち、−ＣＯＯＨ基が−ＣＯＯ⁻に脱プロトン化学されたとき、隣接の同一の自己組織化ペプチドが、静電気的相互作用を通して反発するように、そして、ペプチド間の結合における会合自由エネルギーを支配するように、とりわけペプチド鎖中に置かれている。ある特定のしきい値、すなわち、ペプチドが自己組織化し始めるｐＨ、例えば、Ｐ１１−４（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１）および変性Ｐ１１−４（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：２）ではｐＨ７．５であるが、それ未満のｐＨに減少すると、本発明の自己組織化ペプチドにおける−ＣＯＯＨ基がプロトン化し、ペプチド間の静電的相互作用の反発が減少し、ペプチドの自己組織化が可能となる。

本発明の方法に使用する自己組織化ペプチドは、好ましくは、式Ｘ１−Ｘ２−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ１（式中、Ｘ１は、酸性側鎖を有するアミノ酸であり、Ｘ２は、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）からなる群から選択される疎水性側鎖を有するアミノ酸である。）のシーケンスを含有している。より好ましい態様においては、本発明の方法に使用する自己組織化ペプチドは、シーケンスＧｌｕ−Ｘ２−Ｇｌｕ−Ｘ２−Ｇｌｕ（式中、Ｘ２は、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンからなるグループから選択される疎水性側鎖を有するアミノ酸である）（SEQ ID NO：4）、またはＡｓｐ−Ｘ２−Ａｓｐ−Ｘ２−Ａｓｐ（式中、Ｘ２は、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンからなるグループから選択される疎水性側鎖を有するアミノ酸である）（SEQ ID NO：5）。もう一つの好ましい態様においては、本発明の方法に使用する自己組織化ペプチドは、シーケンスＧｌｎ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ， （Ｐ１１−４， ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１)、またはそれと少なくとも８０％シーケンス同一性を有するか、からなる。本発明の方法に使用するペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されているような変性Ｐ１１−４またはそれと少なくとも８０％シーケンス同一性を有するシーケンスであるということがさらに好ましい。

Ｐ１１−４として本明細書で言及されているペプチドに関しては、モノマーから組織化多量体形態へのスイッチは、ｐＨにより制御される。ｐＨがｐＨ７．５未満であると、ペプチドはアセンブルする。ｐＨがそれより高いと、ペプチドの状態はモノマー（monomeric)である。

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１または２に対して少なくとも８０％以上のシーケンス同一性を有するペプチドシーケンスは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１または２のアミノ酸５，７および９に対応する部位にグルタミン酸またはアスパラギン酸を好ましくは含有する。特に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に対して少なくとも８０％以上のシーケンス同一性を有するペプチドシーケンスは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸５，７および９に対応する部位にグルタミン酸を好ましくは含有する。好ましくは、残りのアミノ酸部位は、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンからなるグループから選択される疎水性側鎖を有するアミノ酸である。好ましくは、残りのアミノ酸部位は、塩基性側鎖を有するアミノ酸、すなわち中性付近のｐＨで正に荷電さるであろうアミノ酸でないことである。

一態様において、本発明のペプチドは、１，２または３アミノ酸の置換により、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１および２に示されているシーケンスと異なるシーケンスを含有するか、からなるものである。一般的に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１および２のペプチドシーケンス中の各アミノ酸残基は、得られるペプチドが、７．５未満のｐＨ値でなお自己組織化することができる限り、別の残基で置き換えてもよい。置換は、保存的置換、すなわち、１以上のアミノ酸残基を、機能的に等価物として作用する、同等の極性を有するアミノ酸で置換することが好ましい。好ましくは、置換として使用されるアミノ酸残基は、置換されるべきアミノ酸残基と同じグループのアミノ酸から選択される。例えば、疎水性残基は、別の疎水性残基で置換でき、また、極性残基は、同じ電荷を有する別の極性残基で置換することができる。保存的置換に使用できる機能的に相同のアミノ酸としては、例えば、グリシン、バリン、アラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、およびトリプトファン等の非極性アミノ酸を含む。非荷電極性アミノ酸の例としては、セリン、トレオニン、グルタミン、アスパラギン、チロシンおよびシステインを含む。荷電極性（塩基性）アミノ酸の例としては、ヒスチジン、アルギニンおよびリシンを含む。荷電極性（酸性）アミノ酸の例としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸を含む。

さらに、本発明のペプチドは、例えば、１以上の変性を導入することにより、１以上のアミノ酸部位において構造的に変性してもよい。本発明によれば、これらの変性アミノ酸は、例えば、ビオチン化、リン酸化、グリコシル化、アセチル化、分岐および/または環化により荷電されたアミノ酸であってよい。さらに、本発明のペプチドは、追加的にまたは選択的に、末端ブロック基、ホルミル−、γ−カルボキシグルタミン酸ヒドロキシル−、メチル−、ホスホリル−、ピロリドンカルボン酸−、および/またはスルフェート−基等の他の変性を含んでいてもよい。好ましい態様においては、本発明のペプチドは、そのＮ−末端でアセチル化、および/または、そのＣ−末端で、例えばＮＨ_２−基でアミド化されている。特に、好ましい態様は、次のシーケンス：：ＣＨ_３ＣＯ−ＱＱＲＦＥＷＥＦＥＱＱ−ＮＨ_２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）および図１に示されているような、Ｎ−末端アセチル化およびＮＨ_２−基Ｃ−末端アミド化ペプチドＰ１１−４である。

ペプチド濃度が、ペプチドのアセンブリーに影響しうるということ、すなわち特に高ペプチド濃度の場合、早めにアセンブルがトリガーされ得るということは当業者に知られている。さらに、非常に低ペプチド濃度の場合、歯の障害および口腔キャビティに存在するような低いｐＨ条件下であっても、本発明のペプチドのアセンブリーが妨げられ得る。それ故、ステップa)の溶液中のペプチド濃度は、０．１ないし１００ｍｇ／ｍｌ、０．５ないし５０ｍｇ／ｍｌ、１ないし４０ｍｇ／ｍｌ、１ないし３０ｍｇ／ｍｌ、または１ないし２０ｍｇ／ｍｌ、または１ないし１０ｍｇ／ｍｌの間となる。特に好ましい態様においては、ステップa)の溶液中のペプチド濃度は１ないし１０ｍｇ／ｍｌの間となる。さらに、好ましい態様において、ステップa)の溶液中のペプチド濃度は、約２ｍｇ／ｍｌとなるものである。

１種以上の自己組織化ペプチドを含有する上記方法のステップａ）に述べられている溶液は、該ペプチドが自己組織化を始めるｐＨを０．１〜１．５、好ましくは０．１〜１．０、０．１〜０．５、０．２〜０．４、より好ましくは約０．３単位超えるｐＨを有し、そのことは、ペプチド含有溶液のｐＨが、該ペプチドのモノマー溶液のアセンブリーを開始するｐＨより、わずかに高いことを意味している。好ましい態様においては、ステップａ）で述べられている溶液は、ペプチドが自己組織化をし始めるｐＨを０．３ｐＨ単位超えるｐＨを有している。特に好ましい態様においては、該溶液は、ペプチドＰ１１−４（（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されているような変性Ｐ１１−４を含有し、該溶液は、上記方法のステップａ）において約ｐＨ７．８以上を有する。溶液は、好ましくは水溶液である。しかしながら、溶液は、有機溶媒または無機溶媒等の他の溶媒、すなわちアルコール、エーテル、ケトン等を含有していてもよい。

上記したように、ペプチドが自己組織化し始めるｐＨを超えるｐＨにステップａ）における溶液をキープすることが、一旦、ｐＨの初期上昇で、ペプチドをお互いから分離させた後、自己組織化ペプチドがそのモノマー形態を維持するのに最適である。このｐＨは、ペプチドの自己組織化がスタートするｐＨをわずか超えるものである。ステップａ）の溶液は、好ましくは、ステップａ）の溶液のｐＨを消耗の範囲に維持するために１種以上のバッファを含有する。好ましい態様においては、ステップａ）の溶液は、ペプチドが自己組織化し始めるｐＨより０．１〜０．５ｐＨ単位高いｐＨになるように緩衝液で処理されている。ペプチドが自己組織化し始めるｐＨを０．１ないし０．５ｐＨ単位超えるｐＨを付与するバッファは、本質的に不揮発性のバッファであり、該バッファは凍結乾燥の間、そしてその後も組成物中に残っている。好ましくは、溶液は、ｐＨ７．５を０．１ないし０．５ｐＨ単位超えるｐＨを付与するバッファを含有している。

好適なバッファとしては、ＴＡＰＳ（｛［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アミノ｝プロパンスルホン酸）、ビシン（Ｎ、Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン）、トリス(トリス（ヒドロキシメチル）-アミノメタン）、トリシン（Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチルグリシン）、ＴＡＰＳＯ（３−［Ｎ − トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）、ＨＥＰＥＳ（４−２-ヒドロキシエチル−１−ピペラジンエタンスルホン酸）、ＴＥＳ（２−｛［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アミノ｝エタンスルホン酸）、ＭＯＰＳ（３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸）、ＰＩＰＥＳ（ピペラジン−Ｎ、Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸））、カコジレート（ジメチルアルシン酸）、ＳＳＣ（クエン酸ナトリウム食塩水）、ＭＥＳ（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸）および、本質的に中性ｐＨ範囲を維持する他のバッファを含む。クエン酸、リン酸等の酸性バッファを、上記バッファおよび/またはアルカリ性バッファ、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、リン酸ナトリウムジ- およびトリ−塩基、リン酸カリウムジ-およびトリ-塩基、トリポリリン酸ナトリウム、トリス、トリエタノールアミン、ポリエチレンイミン等と組み合わせて使用し、ペプチドが自己組織化し始めるｐＨを０．１ないし０．５ｐＨ単位超える所望のｐＨを得、そして緩衝能を付与してもよい。好ましい態様においては、ペプチドが自己組織化し始めるｐＨを０．１ないし０．５ｐＨ単位超える特定のｐＨ、例えばｐＨ７．５等を付与するバッファは、トリスである。

ステップａ）の溶液を調製するのに使用されるバッファは、ペプチドが自己組織化し始めるｐＨを０．１ないし０．５ｐＨ単位超えるｐＨを付与するに十分である濃度を有する。同時に、バッファ濃度は、凍結乾燥後低いイオン強度が付与されるように可能な限り低くする。好ましい態様においては、ステップａ）の溶液におけるバッファの濃度は、２００ｍＭ未満、１５０ｍＭ未満、１００ｍＭ未満、５０ｍＭ未満、４０ｍＭ未満、３０ｍＭ未満、２０ｍＭ未満、または１０ｍＭ未満である。より好ましい態様においては、バッファは、２００ｍＭ未満、１５０ｍＭ未満、１００ｍＭ未満、５０ｍＭ未満、４０ｍＭ未満、３０ｍＭ未満、２０ｍＭ未満、または１０ｍＭ未満の濃度にあるトリスである。好ましい態様においては、ブッファは、約４ｍＭの濃度にあるトリスである。

ステップａ）の溶液は、追加成分、例えば、塩等、詳しくは、例えばＮａＣｌ等をさらに含有していてもよい。当業者に知られているように、ペプチドのアセンブリー状態は、溶液のイオン強度にも影響を受ける。溶液のイオン強度は、その溶液中に存在するすべてのイオンの濃度の関数である。それ故、ペプチドが自己組織化し始めるｐＨを超えるｐＨであっても、すなわち、ペプチドが溶液中で実質的にモノマーであっても、イオン強度がとりわけ高いと、ペプチドのアセンブリーを誘発しうる。しかしながら、イオン強度が生理範囲、すなわち１５０ｍＭＮａＣｌに相当するイオン強度以下に対応するが、にあるとき、本発明のペプチドのアセンブリーは、好都合なことに誘発されない。当業者は、溶液のイオン強度を決定し、測定する方法を知っていよう。イオン強度Ｉは一般的に、式Ｉ＝１/２Σｚ_i ^２ｂ_ｉ（式中、ｚは原子価ファクターであり、ｂ_ｉは、i番目のイオン濃度の重量モル濃度[mol/kg {H₂O}]である）に従い計算される。加算Σは、溶液中の全てのイオンについて行われる。例えば、１５０ｍＭ ＮａＣｌ溶液のイオン強度は、約０．１５である。この値は、ほぼ血液のイオン強度でもある。口腔キャビティ中に存在する唾液のイオン強度は、一般にもっと低く、例えば約０．０４程度である。それ故、ステップａ）の溶液のイオン強度は、０．１５未満、０．１未満、０．０５未満、０．０２５未満である。好ましい態様においては、ステップａ）の溶液のイオン強度は、０．１５未満である。より好ましい態様においては、溶液は、０．１未満である。

当業者は、溶液のイオン強度を求める種々の方法を知っている。例えば、イオン強度は、次のようなラッセルファクター(Russell's factor)：Ｉ＝１．６ ｘ １０^−５ ｘ 伝導率[μＳ/ｃｍ]による、溶液の電導度（Ｓ＝１/Ω＝Ａ/Ｖ）の測定値から見積もってもよい。１５０ｍＭＮａＣｌ溶液は、約８０〜１００ ｍＳ/ｃｍの電導度を有している。それ故、上記および電導度の上記見積もりに従うと、ステップａ）の溶液は、１００ｍＳ/ｃｍ未満、好ましくは８０ｍＳ/ｃｍ未満の電導度を有する。

さらに、当業者は、本発明のペプチドが所定のイオン強度で自己組織化をスタートするｐＨを決定する多くの方法を知っている。適当な方法が、例えば、Aggeliらによる刊行物(2003, J Am Chem Soc, 125, 9619-9628)に示めされている。

上記方法のステップｂ）において、溶液のｐＨを８．０以上に増加させる塩基性化合物が、該溶液に添加される。好ましくは、ステップｂ）におけるｐＨは、８．０以上、好ましくは８．０〜９．５、より好ましくは、ｐＨ８．５に増加される。該塩基性化合物は、部分的または完全に揮発性であり、水と一緒に気化させることによる凍結乾燥の間に除去される。好ましい態様においては、７０％以上、８０％以上、９０％％以上、９５％％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、さらにより好ましくは９９％以上の揮発性化合物が、ステップｃ）において除去される。もし、ごくわずかの該化合物が凍結乾燥物中に残るとしても、その化合物が全くない同じ溶液と比較して、その量では、凍結乾燥物の復元後、０．３ｐＨ単位を超えてｐＨを増加させるほど十分ではない。本発明の方法のｂ）ステップにおいてｐＨを増加するのに適した塩基性化合物として、これらに限定されるものではないが、例えば、アンモニア（NH₃）、2-アミノエタノール（モノエタノールアミン）、4-メチルモルホリンおよびピリジン等がある。本発明の方法のｂ）ステップにおいてアンモニアを使用することが特に好ましい。

当業者であれば、塩基性化合物のどの濃度が、溶液のｐＨを８．０以上に増加するのに必要とされるか決定することができる。該ｐＨは、ルーチン法により該塩基性化合物を添加して決定することができる。例えば、簡単なアプローチにおいては、溶液のｐＨは、ブロムチモールブルー等のｐＨ指示薬、ｐＨメーターまたはｐＨストリップを使用することにより決定されてよい。ｐＨを増加させる化合物は、ｐＨが８以上に増加するまで、溶液に添加される。好ましくは、ｐＨを増加させる化合物は、ｐＨが少なくとも８．０、少なくとも８．２、少なくとも８．４、少なくとも８．６、少なくとも８．８、少なくとも９．０に達するまで、添加される。

本発明の方法のステップｂ）においては、本質的にすべての自己組織化ペプチドが、モノマー形態となるまで、ｐＨを増加させる。当業者であれば、ルーチン実験により、本質的にすべての自己組織化ペプチドが、モノマー形態にあるかどうか決定できる。例えば、溶液中のペプチドのアセンブリー状態は、^１Ｈ−ＮＫＲ等の核磁気共鳴（NMR）により、円偏光二色性分析により、動的光散乱（DLS）分析、拡散波分光法、ネイティブ電気泳動法、フーリエ変換赤外分光法（FTIR）、粘度測定（レオロジー）等により決定できる。

さらに、アセンブリーがかなりの程度になるとペプチド溶液の粘度を変化させるので、アセンブリー状態は、得られる溶液の粘度を基にして見積もってもよい。例えば、水溶液においては、ペプチドＰ１１−４(SEQ ID NO:1)は、ｐＨの増加に伴うペプチドの自己組織化に応じて、ｐＨ７．５を超えるとアイソトロピック(isotropic)流体として、約ｐＨ７．５と約ｐＨ５の間ではネマチック流体として、約ｐＨ５と約ｐＨ３の間では凝集塊として、ｐＨ３未満ではネマチックゲルとして存在する(Aggeliら, 2003, J Am Chem Soc, 125:9619-9628; 図 3)。溶液の粘度は、溶液の次のような特性を目視観察することにより見積もってもよい。例えば、アイソトロピック流体が、ニードルを通じて効率よく射出されているのであれば、これば、より粘性の高い相に対するケースとはならない。本発明のペプチドが、溶液中で本質的にモノマーであるとき、すなわち、該溶液がアイソトロピック流体として存在するとき、該溶液は、ニードルを通して溶液の射出を容易にする比較的低粘性を有している。例えば、本発明のペプチドが、溶液中で本質的にモノマーであるとき、該溶液は、例えば１．６ ｍｍまたは１．１ｍｍの直径を有するニードルを通じてすみやかに射出され得る。

溶液中のペプチドの劣化および/または沈殿を防止するために、ｐＨは通常１０．５を超える値まで増加させない。ペプチドの化学的特性はアミノ酸シーケンスに依存するということは一般に知られている。例えば、システイン残基およびメチオニン残基の可逆性の酸化は、より高いｐＨで加速され、チオールはより容易に脱プロトン化し、鎖内または鎖間ジスルフィド結合を速やかに形成する。当業者であれば、塩基性ｐＨに有害的に影響を受けるアミノ酸側鎖のことは知っており、ルーチンの実験することにより、自己組織化ペプチドの完全性を損なわず維持する最大ｐＨを決定できる。例えば、この最大ｐＨは、ペプチド中に存在する各アミノ酸の公知の特性に基づき予測され得る。または、電気泳動的方法等の生化学的方法を採用し、ペプチドの完全性を決定してもよい。好ましくは、ステップｂ）におけるｐＨは、塩基性化合物の添加後、８．０と１０．５の間、より好ましくは、８．０と１０．０の間、最も好ましくは、８．０と９．５の間となる。さらに、ステップｂ）におけるｐＨは、８．５と１０．５の間、および、８．５と１０．０の間であってもよい。

さらに、ステップａ）の溶液に対して上記したように、ステップｂ）における溶液のイオン強度は、上記定義の塩基性化合物の添加により、０．１５を超えてまで増加し、本発明のペプチドのアセンブリーを妨げることにならない。それ故、ステップｂ）の溶液のイオン強度は、０．１５未満、１．０未満、０．０５未満、または０．２５未満となる。好ましい態様においては、ステップｂ）の溶液のイオン強度は、０．１５未満である。さらに好ましい態様においては、溶液は、０．１未満である。ステップａ）の溶液のイオン強度に関して上記したすべてのコメントは、ステップｂ）の溶液にあてはまる。

本発明の一態様においては、濾過ステップｂ１）を、上記方法のステップｂ）とステップｃ）の間に追加する。当該分野で知られているいかなる濾過テクニックも本発明の方法に使用することができる。ペプチド溶液の濾過は、ルーチンの処置であるので、当業者であれば、発明活動なしに、必要なフィルターのタイプ、孔径および効率的な濾過ルーチンを決定できる。

さらなる態様においては、ステップｂ）またはｂ１）のペプチド溶液は、充填ステップｂ２）において、容器中へ充填する。充填ステップｂ２）は、好ましくは、ステップｂ）とステップｃ）の間、またはステップｂ１）とステップｃ）の間で実施される。ペプチド溶液の確定容積を容器中へ充填することが好ましい。確定容積としては、例えば、約５μｌと１ｍｌの間、約５μｌと５００μｌの間、約１０μｌと２５０μｌの間である。例えば、確定容積は好ましくは、１ｍｌ未満、５００μｌ未満、２５０μｌ未満または５０μｌ未満である。しかしながら、確定容積は、もちろん、１ｍｌより多くてもよい。充填は、ピペット、チューブ、またはシリンジなどで実施してよい。ペプチド溶液は、手作業で、例えば、溶液をピペットで計ることにより、または自動で、例えば、ハイスループット装置において、容器中へ充填されてもよい。

容器は、液体ペプチド溶液を収容するに適している性質のものであればよい。例えば、容器はバイアルであってよい。好ましくは、バイアルまたは容器は、ガラスまたはハードプラスチック製のものである。バイアルまたは容器材料は、好ましくは、化学的に不活性であり、ペプチド溶液と著しく反応しない。ペプチド溶液が容器の壁にくっつかないか、本質的にくっつかないということがさらに好ましい。それ故、材料は、ペプチドが材料に付着するのを妨げるであろう静電的特性を有し得る。

好ましい態様においては、ステップｂ１）およびｂ２）は組み合わせられたステップとして実施される。すなわち、確定容積のペプチド溶液を容器中に濾過するのである。

容器またはバイアルは、ステップｄ）において、凍結乾燥後、好ましくは閉じる。例えば、容器またはバイアルは、キャップまたはシールすることができる。適切なキャップおよびシールは、当該分野において公知である。

上記方法のステップｃ）において、溶液は凍結乾燥される。当該分野で公知のいかなる凍結乾燥プロセスをも本発明の方法に使用できる。凍結乾燥は、一般に３つの主ステージを含んでいる：フリージング、第１乾燥および第２乾燥。フリージングは、水を氷へ、または何らかの非晶質組成物成分を結晶性形態へ変える。第１乾燥は、低圧温度での直接昇華により、氷を凍結生成物から除去するときのプロセスステップである。第２乾燥は、残余の水の蒸発表面への拡散を利用して、結合水をプロダクトマトリックスから取り除くときのプロセスステップである。どのような種類の凍結乾燥機をも、例えばマニホールド凍結乾燥機、ロータリー凍結乾燥機、マルチシェルフ凍結乾燥機またはトレースタイル凍結乾燥機を凍結乾燥に使用してよい。

自己組織化ペプチドを含有し、凍結乾燥を受ける溶液は、凍結乾燥および/または貯蔵の間ペプチドを劣化するのを妨げるのに有用となる、または乾燥ペプチドの再水和を維持する、安定剤、増量剤、および/または界面活性剤等の添加剤を含有していてもよい。それ故、凍結乾燥の間のプロテインを脱水ストレスから防止する、凍結乾燥の間のプロテイン安定性を高める、ケーキ（すなわち、凍結乾燥物）安定性を向上する、および/または貯蔵中の凍結乾燥ペプチドの安定性を改良するために、適切な添加剤を、ステップｃ）に先立って添加してもよい。好ましくは、添加剤はステップａ）とステップｂ）の間に添加される。特に、添加剤は、凍結乾燥および/または貯蔵の間、ペプチドがその物理的および化学的安定性およびそのモノマー状態を本質的に保持するという効果を有している。

一般的に、好適な添加剤は、非荷電および/または非還元性糖、例えば、スクロース、ラフィノース、トレハロース、マンニトール、ソルビトール等、またはそれらの誘導体、例えば、トレハロース二水和物等、またはアミノ酸、例えば、グリシン、アルギニン、およびメチオニン等である。さらに好適な安定剤としては、クエン酸、重炭酸ナトリウム、EDTA、ベンジルアルコール、塩化ナトリウム、ラクトース等がある。好ましい態様においては、添加される安定剤または増量剤は、マンニトール、ソルビトール、スクロース、トレハロースおよびグリシンまたはそれらの誘導体、例えば、トレハロース二水和物等を含むグループから選択される非還元性糖である。特に好ましい態様においては、トレハロース二水和物が、ステップｃ）に先立って本発明の方法において添加される。

凍結乾燥される溶液における安定剤および／または増量剤の量は、凍結乾燥される組成物に使用される特定のペプチドおよび成分に依存する。使用される典型的な量は、例えば、非還元性糖の場合、ステップａ）、ｂ）またはｄ）のどの溶液でもその０．１〜５％、好ましくは１〜４％、より好ましくは２〜３％である。使用される好適な量は、例えば、トレハロース二水和物等の非還元性糖の場合、約１ないし３０ｍｇ／ｍｌで、約５ないし２０ｍｇ／ｍｌ、例えば約１０ｍｇ／ｍｌである。

ステップｃ）から得られる組成物は、ペプチドが、劣化または望まれていない自己組織化から保護されているという点で、高度に安定であるので、積み出しおよび貯蔵に好適な凍結乾燥物である。それ故、本発明の方法の一態様において、凍結乾燥物は、水溶液に溶解して、モノマー状態のペプチドを含みペプチドが自己組織化し始めるｐＨより０．１ないし０．５ｐＨ単位高いｐＨを有する溶液として得られる。例えば、カリエス障害を、例えば歯医者が、処置するために、該凍結乾燥物を使用するとき、水等の水溶液を、当該凍結乾燥物に添加し、モノマー状態のペプチドを含みペプチドが自己組織化し始めるｐＨより０．１ないし０．５ｐＨ単位高いｐＨを有する最終溶液を得る。凍結乾燥物は、好ましくは淡水に、より好ましくは脱イオン水に溶解される。しかしながら、得られる溶液が、モノマー状態のペプチドを含みペプチドが自己組織化し始めるｐＨより０．１ないし０．５ｐＨ単位高いｐＨを有する限り、凍結乾燥物は、どのような種類の水溶液に溶解してもよい。好ましい態様においては、水等の水溶液は、２５℃で５ｍＳ／ｃｍ未満の電導度に相当するイオン強度を有する。非揮発性バッファが、ステップａ）の溶液に存在した場合、それは、なお凍結乾燥物中に存在する。

凍結乾燥物は、０．１ないし１００ｍｇ／ｍｌの間、０．５ないし５０ｍｇ／ｍｌの間、１ないし４０ｍｇ／ｍｌの間、１ないし３０ｍｇ／ｍｌの間、１ないし２０ｍｇ／ｍｌの間、または１ないし１０ｍｇ／ｍｌの間のペプチド濃度が得られるに十分な容積に溶解されることが好ましい。特に好ましい態様においては、凍結乾燥物は、１ないし１０ｍｇ／ｍｌの間のペプチド濃度が得られるに十分な容積に溶解されることが好ましい。さらに好ましい態様においては、凍結乾燥物は、約２ｍｇ／ｍｌの間のペプチド濃度が得られるに十分な容積に溶解されることが好ましい。

さらに、ステップａ）の溶液に対して上記したように、ステップｄ）の溶液のイオン強度は、０．１５未満、１．０未満、０．０５未満、または０．２５未満となる。好ましい態様においては、ステップｄ）の溶液のイオン強度は、０．１５未満である。さらに好ましい態様においては、溶液は、０．１未満である。ステップａ）の溶液のイオン強度に関して上記したすべてのコメントは、ステップｄ）の溶液にあてはまる。

ペプチドが溶液中にある時間を最小にするために、凍結乾燥物は、歯へ適用する直前に溶解するということが好ましい。特に、凍結乾燥物は、使用前１時間以内、好ましくは使用前約４５分以内、使用前約４５分以内、使用前約４５分以内、使用前約３０分以内、使用前約２５分以内、使用前約２０分以内、使用前約１５分以内、使用前約１０分以内、さらにより好ましくは、使用前約５分以下以内に溶解するということが好ましい。

さらなる側面において、本発明は、組成物、例えば、カリエス障害を治療する組成物および/または歯表面および/またはカリエス障害にミネラルを補充する組成物を提供する。組成物は、好ましくは、７．５未満のｐＨ値で自己組織化する上記ペプチドの１種を含有する再構成用凍結乾燥形態組成物であり、凍結乾燥物の溶解により、ペプチドが自己組織化し始めるｐＨを０．１ないし０．５ｐＨ単位超えるｐＨを有し、該ペプチドがモノマーの形態で主に存在する溶液が得られる。上記したように、ペプチドは、好ましくは、シーケンスＸ１−Ｘ２−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ１（式中、Ｘ１は、酸性側鎖を有するアミノ酸であり、Ｘ２は、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファンからなる群から選択される疎水性側鎖を有するアミノ酸である。）を含有している。ペプチドは、シーケンスＧｌｕ−Ｘ２−Ｇｌｕ−Ｘ２−ＧｌｕまたはＡｓｐ−Ｘ２−Ａｓｐ−Ｘ２−Ａｓｐ（式中、Ｘ２は、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンからなるグループから選択される疎水性側鎖を有するアミノ酸である）を含有しているということがさらに好ましい。例えば、該組成物は、SEQ ID NO：1またはSEQ ID NO：2で示されるシーケンスまたはそれに対して少なくとも８０％同一シーケンスを有するシーケンスを有するペプチドを含有していてもよい。

好ましい態様においては、ペプチドの、少なくとも７０％、好ましくは、少なくとも８０％、より好ましくは、少なくとも９０％が、モノマー形態で存在する。

本発明の組成物は、上記した方法により好ましくは得られる。１つの態様において、本発明は、本発明の方法のステップｃ）で得られる凍結乾燥物、または、本発明のステップｄ）で得られる溶解液(reconstituted solution)を含有する組成物を提供する。

該組成物は、治療部位、すなわち、歯の障害またはキャビティにモノマーペプチドを投与する際に補助するさらなる成分と混合することができる。例えば、ステップｄ）で得られる溶解液は、ヒドロゲル等のビヒクルと混合することができる。本発明の文脈の中で、ヒドロゲルは、水に不溶であるが、水を吸収して膨潤し、かなりの容積増加をもたらす共有結合的にまたは非共有結合的に相互結合したポリマーのネットワークを表している。好ましくは、膨潤による容積増加は、１０％以上、１５％以上、２０％以上、２５％以上、３０％以上、３５％以上、４０％以上、４５％以上、５０％以上である。好ましいヒドロゲルは、ヒアルロン酸またはポリウレタンを含有するかまたはそれらからなる。医薬用途に使用するヒドロゲルは、一般的に知られており、いろいろな製造業者から購入することができる。

本発明は、カリエス障害、好ましくは表面下カリエス障害を治療する方法をも提供し、該方法においては、本発明の組成物がそれを必要としている患者に投与される。なおさらなる側面において、本発明は、歯表面、および/またはカリエス障害、好ましくは表面下カリエス障害にミネラルを補充する方法を提供し、該方法においては、本発明の組成物がそれを必要としている患者に投与される。

それ故、上記組成物は、カリエス障害、好ましくは表面下カリエス障害を治療する方法に使用してもよい。好ましい態様においては、上記組成物は、歯表面および/またはカリエス障害、好ましくは表面下カリエス障害にミネラルを補充する方法に使用される。

本発明の組成物は、医師により、または口腔障害内酸性環境から医薬組成物を多少でも隔離できる手段により、治療を必要とする歯に直接適用してもよい。例えば、組成物は、液体ドラッグ移入デバイス、例えば、WO 2011/104712 A1, WO 2011/104711 A1, WO 2011/058545, WO 2005/105014 A2に記載されているようなデバイスの助けを借りて適用されてもよい。該液体ドラッグ移入デバイスは、例えば、口腔障害における酸性環境から組成物を分離するシーリング機構を有していてもよい。

自己組織化ペプチドＰ１１−４のシーケンス（SEQ ID NO：1）およびＮ−およびＣ−末端変性されたＰ１１−４のシーケンス（SEQ ID NO：2）。 凍結乾燥前のバルク溶液での実施例組成物（Ａ），凍結乾燥前充填後の実施例組成物（Ｂ）、凍結乾燥後の実施例組成物（ＣおよびＤ）。（Ｂ）における組成物は、視覚化のために着色されている。 ｐＨ（DCl/NaOD)の関数としてＰ１１−４（ｃ＝６．３ｍＭ）の相挙動：Ｉ＝ネマチックゲル、ＩＩ＝凝集塊（flocculate)、ＩＩＩ＝ネマチック流体、ＩＶ＝アイソトロピック流体。○＝ゼロ煎断粘度、および●＝ＦＴＩＲを使用して決定された％ β-シート：実線は、フィブリル中のペプチドの割合を示す。領域Ｉ，ＩＩ，およびＩＩＩを分離する垂直の破線は、異なる巨視的原線維状態間の適切な境界を示し、分離領域ＩＩＩおよびＩＶは、一次ネマチック−to−アイソトロピック遷移を示す（図は、Aggeliら(2003, J am ChemSoc, 125, 9619-9628)から許可を得て複写した）。

本発明の方法を、以下の実施例においてより詳細に例示する。

実施例
実施例１：ペプチド溶液の調製
SEQ ID NO：2に示されているシーケンスを有する変性Ｐ１１−４ペプチドを５＋/−３℃の温度で、使用２４時間前に解凍した。４ｍＭトリスを、ＷＦＩ（注入用水(water for injection))グレードの水に、室温で少なくとも１０分間撹拌下、添加する。１０mg/gの最終濃度になるまで、トレハロース二水和物を、撹拌を続けながら添加する。続いて、ペプチドＰ１１−４を、2 mg/gの最終濃度になるまで添加し、透明になるまで撹拌し溶解する。このペプチド溶液は、最初、約８．２のｐＨを有している。

該ペプチド溶液のｐＨを、１％ＮＨ_４ＯＨ溶液で、８．５＋/−０．４に調整する。続いて、該ペプチド溶液を、サートポア(Sartopore)フィルタを通して滅菌濾過する。滅菌溶液をバイアルに充填し、次に、マルチシェルフ凍結乾燥機中で凍結乾燥にかけられる。−４５℃で１ないし３時間凍結後、該バイアルを１０ないし１３時間３０℃で主乾燥ステップに、７〜１０時間３０℃で後乾燥ステップにかける。エアリングは、２００ないし８００ｍｂａｒで窒素が供給される。バイアルは、３０℃、２００ｍｂａｒで閉じられ、輸送のためにキャップされる。

続いて、バイアルは、ケーキ（すなわち、凍結乾燥物）の完全さを目視検査される。

結果：
ペプチド溶液は、溶解後、ネマチック粘弾性流体であった。ｐＨを８．５に調整後、ペプチド溶液は、アイソトロピック流体（図２Ａ）のようなクリアーで非粘性となった。該溶液をバイアルに充填した後も、該溶液はクリアーで非粘性であった（図２Ｂ：溶液の視覚化のためだけにブルーに着色された実施例アリコート）。凍結乾燥により無傷の「ケーキ」、すなわち凍結乾燥物（図２Ｃ）が得られ、それは、良好な貯蔵安定性を示した。

実施例２
いろいろな濃度を有するペプチド溶液の調製
上記したように、いろいろなバッファ（トリス）濃度、ペプチド（Ｐ１１−４）濃度および増量剤（トレハロース二水和物）濃度を有するペプチド溶液を調製した。ｐＨは上記したように調製した。

結果
該溶液をバイアルに充填後、全３種類の溶液は、クリアーで非粘性であった。凍結乾燥により無傷の「ケーキ」、すなわち凍結乾燥物が得られ、それらは、良好な貯蔵安定性を示した。

実施例３
Ｐ１１−４ペプチド溶液の粘度
ペプチド溶液におけるアセンブリーを評価するために、いろいろな充填ニードルを通じてＰ１１−４を通過させてテストした。

Ｐ１１−４バルク溶液の組成物
Ｐ１１−４バルク溶液を以下のように調合した：

表１−２は、溶液の組成を示している。

Ｐ１１−４、トレハロース二水和物（Hayashibara Co. Ltd., Lot Nr. 9D081）およびトリス(Carl Roth, A411.1)を精製水に溶解した。約０．５mL １％ ＮＨ３−溶液を使用して、ｐＨを８．５に調整した。バルク溶液の最終重量を、精製水で２５０ｇに調整した。

次に、蠕動ポンプ(520Di, Watson-Marlow Pumps Group, ファルマス, 英国)に連結したＡｃｒｏｄｉｓｃ^{(登録商品)} 25ｍｍシリンジフィルター（0.22μｍ Fluorodyne^{（登録商品）} II メンブラン）を使用し、１０rpmのポンプスピードでバルク溶液を出力し、該溶液を濾過した。

ペプチド溶液の密度
Ｐ１１−４バルク溶液を調合し、DMA300ポータブル密度計(Anton Paar Germany GmbH, オストフィルデン, ドイツ)を使用して、溶液の密度を求めた。シリンジを使用して、バルク溶液を密度計に充填した。２５℃への温度補償は、密度計により自動的に行われた。

ペプチド溶液の密度測定を行った。該溶液は、1.001 mg/mL（２５ °Ｃ）, n = 2となった。

ペプチド溶液の粘度
ＥＤＭ ３２９５計量装置(Bausch + Stroebel Maschinenfabrik GmbH+Co．ケージー（KG）, イルショーフェン（Ilshofen）、ドイツ)を、２５０ｍｇの充填重量に調整した。テストインレーバイアルを空で秤量し、バルク溶液で充填し、充填後、再度、秤量した。

表２は、充填ニードル443009L(φ 1.6 mm, 長さ 96 mm; 材料コード: AISI316L)を使用した、テスト充填の結果である。

表２：充填ニードル443009L(φ1.6 mm)を使用した統計的評価テスト充填

表３は、充填ニードル443008L(φ 1.1 mm, 長さ 96 mm; 材料コード: AISI316L)を使用した、テスト充填の結果である。

表３：充填ニードル443008L(φ1.1 mm)を使用した統計的評価テスト充填

両充填ニードルは、250ｍｇの充填重量で、1.0ｍｇ、すなわち物質の最小ロスに相当する充填精度を示した。その結果、ペプチド溶液は、両ニードルを効率的に通過できた。本質的に、ニードルの目詰まりは、全く生じなかった。溶液の濃度は、ニードル通過を可能とするに十分低かった。このことは、ペプチド溶液はアイソトロピック流体として存在していることを意味している（Aggeliら, 2003, J Am Chem Soc, 125: 9619-9628、「the phase behaviour of peptide P11-4 as a function of the pH」を比較)。

Claims (14)

1. ａ）ｐＨ７．５未満で自己組織化し始めるペプチドを含有する溶液であって、凍結乾燥の間不揮発性であり、かつ前記ペプチドが自己組織化を始めるｐＨを０．１ないし０．５ｐＨ単位超えるｐＨを付与するバッファを含む溶液を準備すること；
   ｂ）前記溶液のｐＨを８．０以上に増加させ、そして、凍結乾燥の間に除去されるのに十分な揮発性を有している化合物を添加すること；
   ｃ）前記溶液を凍結乾燥すること、ここで、得られた凍結乾燥物は、水に溶解して、前記ペプチドが自己組織化を始めるｐＨを０．１ないし０．５ｐＨ単位超えるｐＨを有し、前記ペプチドをそのモノマー状態で主に含有する溶液を得るのに適している；および
   ｄ）所望により、凍結乾燥物を水に溶解させ、前記ペプチドが自己組織化を始めるｐＨを０．１ないし０．５ｐＨ単位超えるｐＨを有し、前記ペプチドをそのモノマー状態で主に含有する溶液を得ること；
   を含む、歯の障害を治療するための組成物の製造方法。
2. ステップｂ）におけるｐＨを、ｐＨ８−９、好ましくはｐＨ８．５に増加させる、請求項１に記載の方法。
3. ステップｃ）の前に、安定化剤および/または増量剤を前記溶液に添加する、請求項１〜２いずれかに記載の方法。
4. 安定化剤または増量剤が、マンニトール、ソルビトール、スクロース、トレハロースおよびグリシンを含むグループから選択される非還元性の糖である、請求項３に記載の方法。
5. ステップｂ）における前記化合物が、アンモニア、２−アミノエタノール、４−メチルモルホリン、およびピリジンからなるグループから選択される、請求項１〜４いずれかに記載の方法。
6. ９０％を超えるステップｂ）の前記化合物が、凍結乾燥時に前記溶液から除去される、請求項１〜５いずれかに記載の方法。
7. ステップｃ）またはｄ）において得られた組成物が、歯の表面に適用するのに適したビヒクル、好ましくはハイドロゲルとさらに混合される、請求項１〜６いずれかに記載の方法。
8. ステップａ）における前記溶液が、４０ｍＭ以下の濃度でトリス、好ましくは２０ｍＭ以下のトリス、より好ましくは１０ｍＭ以下のトリスを含有する、請求項１〜７いずれかに記載の方法。
9. ７．５未満のｐＨ値で自己組織化するペプチド
   非還元性糖、および
   凍結乾燥の間不揮発性のバッファ
   を含有する組成物であって、前記組成物を水中に溶解した時、前記ペプチドが自己組織化し始めるｐＨより０．１ないし０．５ｐＨ単位超えるｐＨを有し、かつ０.１５未満のイオン強度を有する溶液が得られ、前記ペプチドがモノマー形態で主に存在し、
   ここで、前記ペプチドがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるシーケンスを含み、かつ
   凍結乾燥の間不揮発性のバッファが、ＴＡＰＳ、ビシン、トリス、トリシン、ＴＡＰＳＯ、ＨＥＰＥＳ、ＴＥＳ、ＭＯＰＳ、ＰＩＰＥＳ、カコジレート、ＳＳＣ、ＭＥＳ、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される、または、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、リン酸カリウムジ-およびトリ-塩基、トリス、トリエタノールアミン、ポリエチレンイミンならびにそれらの任意の組合せ、と組み合わせたクエン酸またはリン酸からなる群から選択される、
   組成物。
10. ７．５未満のｐＨ値で自己組織化するペプチド
    非還元性糖、および
    凍結乾燥の間不揮発性のバッファ
    を含有する、凍結乾燥形態の組成物であって、前記組成物を水中に溶解した時、前記ペプチドが自己組織化し始めるｐＨより０．１ないし０．５ｐＨ単位超えるｐＨを有し、かつ０.１５未満のイオン強度を有する溶液が得られ、前記ペプチドがモノマー形態で主に存在し、
    ここで、前記ペプチドがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるシーケンスを含み、かつ
    凍結乾燥の間不揮発性のバッファが、ＴＡＰＳ、ビシン、トリス、トリシン、ＴＡＰＳＯ、ＨＥＰＥＳ、ＴＥＳ、ＭＯＰＳ、ＰＩＰＥＳ、カコジレート、ＳＳＣ、ＭＥＳ、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される、または、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、リン酸カリウムジ-およびトリ-塩基、トリス、トリエタノールアミン、ポリエチレンイミンならびにそれらの任意の組合せ、と組み合わせたクエン酸またはリン酸からなる群から選択される、
    組成物。
11. 非還元性糖が、マンニトール、ソルビトール、スクロース、トレハロース、グリシンおよびそれらの誘導体からなる群から選択される、請求項９または１０に記載の組成物。
12. 前記ペプチドが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるシーケンスを含み、非還元性糖が、トレハロースまたはトレハロース二水和物であり、かつ凍結乾燥の間不揮発性のバッファがトリスである、請求項９−１１のいずれかに記載の組成物。
13. 前記ペプチドの、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％が、モノマー形態で存在する、請求項９−１２いずれかに記載の組成物。
14. 歯の障害、好ましくは表面下カリエス障害を治療する方法に使用するための、または歯の表面および/またはカリエス障害、好ましくは表面下カリエス障害にミネラルを補充する方法に使用するための、請求項９−１３いずれかに記載の組成物。

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