JP6505490B2 - 分子インプリンティング膜、その製造方法、鋳型化合物、およびステロイドホルモン化合物の検出方法 - Google Patents
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Description
上記ステロイドホルモン化合物が下記式(I)で表されるものであり、
R1は、メチル基、ヒドロキシメチル基またはホルミル基を示し、
R2は、水素原子、水酸基またはオキソ基を示し、
R3は、メチル基、ヒドロキシメチル基またはホルミル基を示し、
R4は、1以上の置換基αで置換されているC1-10アルキル基、または水酸基を示し、
R5は、水素原子または水酸基を示し、
R4とR5は一緒になってオキソ基を形成してもよく、
置換基αは、水酸基およびオキソ基から選択される置換基を示す]
自己組織化単分子膜の上にポリマー層が積層されている積層構造を有し、
上記自己組織化単分子膜の表面にはβ−シクロデキストリンが結合しており、
上記ポリマー層には上記ステロイドホルモン化合物に対する特異的認識空間が形成されており、
上記特異的認識空間の一端には上記β−シクロデキストリンが存在し、且つ、上記特異的認識空間の他端にはアミノオキシ基が存在することを特徴とする分子インプリンティング膜。
XとYは、独立してリンカー基を示し、
R1は、メチル基、ヒドロキシメチル基またはホルミル基を示し、
R2は、水素原子、水酸基またはオキソ基を示し、
R3は、メチル基、ヒドロキシメチル基またはホルミル基を示し、
R5は、水素原子または水酸基を示し、
R6は、水素原子またはメチル基を示す]
金属基板上に自己組織化単分子膜を形成する工程、
上記自己組織化単分子膜の表面にβ−シクロデキストリンを結合させる工程、
上記β−シクロデキストリンに、上記[2]に記載の鋳型化合物のアダマンチル基を相互作用させる工程、
ビニルモノマーを添加し、上記鋳型化合物のビニル基と共重合させる工程、
上記鋳型化合物のオキシム基を加水分解し、上記鋳型化合物のステロイド部分を除去する工程を含むことを特徴とする方法。
上記ステロイドホルモン化合物は、上記[1]で規定されている式(I)で表されるものであり、
溶媒中、上記[1]に記載の分子インプリンティング膜と上記試料を接触させる工程、および、
上記分子インプリンティング膜と上記試料との接触による反応系の変化を測定する工程を含むことを特徴とする方法。
上記測定工程において、反応系の溶液における標識基の濃度変化を測定する上記[4]に記載の方法。
本発明に係る分子インプリンティング膜は、上記ステロイドホルモン化合物(I)に対して選択性を示すので、その特異的認識空間を形成するための鋳型化合物(II)は、ステロイドホルモン化合物(I)を原料化合物とすることができる。
(2−1) 自己組織化単分子膜の形成工程
本工程では、金属基板上に自己組織化単分子膜(SAM:Self−Assembled Monolayer)を形成する。SAMは、金属基板へ化学結合していると共に、金属基板上に分子が分子間力により密に且つ規則的に整列していることから、安定で均一である。
本工程では、上記工程(2−1)により金属基板上に形成されたSAM、または当該SAMの表面に導入されたリンカー基に、β−シクロデキストリン(以下、「β−CD」と略記する)を結合させる。
本工程では、上記β−CDに鋳型化合物(II)のアダマンチル基を相互作用させる。この際、当該アダマンチル基はβ−CDに包接させるので、鋳型化合物(II)の向きは均一であり、上記SAMの表面に配向されることになる。
本工程では、ビニルモノマーを添加し、SAM表面に配向させた鋳型化合物(II)中のビニル基と共重合させることにより、鋳型化合物(II)を含むポリマー層を形成する。
本工程では、ビニル基の共重合によりポリマー中に取り込まれている鋳型化合物(II)のオキシム基を加水分解し、鋳型化合物(II)のステロイド部分を除去する。その結果、ポリマー中には、除去されたステロイド部分に特異的な認識空間が形成される。なお、上記ステロイド部分とは、鋳型化合物(II)のうち、リンカー基を介してアダマンチル基が結合したステロイド骨格部分をいう。
(1) templete化合物の調製
1−アダマンタンカルボン酸(270mg,1.5mmol)、EDC(285mg,1.5mmol)、およびDMAP(183mg,1.5mmol)をジクロロメタンに溶解させ、氷冷下で撹拌した。そこにコルチゾール(362mg,1.0mmol)を加え、一晩撹拌した。反応の初期には反応混合液は白濁していたが、一晩撹拌した後は淡黄色の溶液になっていた。薄層クロマトグラフィー(展開液−ヘキサン:酢酸エチル=1:1)のスポットについて、DMAPのRf値は0、コルチゾールのRf値は0.125、目的化合物のRf値は0.375であり、一晩攪拌後でも原料化合物であるコルチゾールのスポットが消えていなかったので、新たに1−アダマンタンカルボン酸(135mg,0.75mmol)、EDC(143mg,0.75mmol)、およびDMAP(92mg,0.75mmol)を追加した。3時間後に薄層クロマトグラフィーで反応の進行を確認したが、原料スポットは依然として消えなかったので、反応を終了し、反応液を飽和クエン酸、飽和炭酸水素ナトリウムおよび飽和食塩水で洗浄し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー(溶離液−ヘキサン:酢酸エチル=1:1)で精製した。その後、無水硫酸ナトリウムで脱水し、溶媒を減圧留去し、真空乾燥することにより、目的化合物を白色固体として得た(収量:212mg,収率:40.3%)。
1H-NMR(300.40MHz,CDCl3):δ=5.68(s,1H,4位のH),2.03(s,3H,アダマンタン),1.91(s,6H,アダマンタン),1.72(t,6H,アダマンタン),2.8-1.4(m,コルチゾール)
MALDI-TOF-MS m/z=525.6[M+H+],547.7[M+Na+]
上記(1−1)で得た アダマンタンカルボン酸エステル(131mg,0.25mmol)を、メタノール:ジクロロメタン=1:1の混合溶媒に溶解させ、そこへピロリジン(124μL,1.5mmol)を加えた。20分後、溶液が黄色に変色したことを確認し、カルボキシメトキシアミン・0.5塩酸塩(54.5mg,0.5mmol)を加え、室温で5時間撹拌した。反応終了時における薄層クロマトグラフィー(展開液−酢酸エチル)のスポットについて、ピロリジンのRf値は0、目的化合物のRf値は0.1であり、原料化合物のRf値=0.725のスポットの消失を確認した。溶媒を減圧留去し、残渣に純水を加え、1M HClにてpH=2.0に調整し、酢酸エチルで抽出した。有機層を食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで脱水した後、溶媒を減圧留去し、真空乾燥することにより、目的化合物を淡黄色固体として得た(収量:149mg,収率:99.7%)。
1H-NMR(300.40MHz,DMSO-d6):δ=1.99(s,3H,アダマンタン),1.82(s,6H,アダマンタン),1.68(t,6H,アダマンタン),2.5-1.5(m,コルチゾール)
MALDI-TOF-MS m/z=598.8[M+H+],620.8[M+Na+]
上記(1−2)で得たオキシム化合物(149mg,0.25mmol)をメタノールに溶解させ、氷冷下、4−アミノスチレン(44.5mg,0.375mmol)とDMT−MM(138mg,0.5mmol)を加えた。氷浴を外し、常温で一晩反応させた。反応終了時における薄層クロマトグラフィー(展開液−ヘキサン:酢酸エチル=1:1)のスポットについて、目的化合物のRf値は0.35であり、原料化合物のRf値=0.725のスポットの消失を確認した。溶媒を減圧留去し、残渣を酢酸エチルに溶解させ、飽和クエン酸水溶液と食塩水にて洗浄し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー(溶離液−ヘキサン:酢酸エチル=1:2)で精製した。その後、無水硫酸ナトリウムで脱水した後、溶媒を減圧留去し、真空乾燥することにより、目的化合物を白色固体として得た(収量:61.0mg,収率:34.9%)。
1H-NMR(300.40MHz,CDCl3):δ=8.02(d,1H,NH),7.50(d,2H,ベンゼン環),7.38(d,2H,ベンゼン環),2.02(s,3H,アダマンタン),1.97(s,6H,アダマンタン),1.73(t,6H,アダマンタン),2.8-1.5(m,コルチゾール)
MALDI-TOF-MS m/z=699.1[M+H+],721.3[M+Na+]
氷冷下で0.4Mの水酸化ナトリウム水溶液(40mL)にβ−シクロデキストリン(2.0g,1.75mmol)を溶解し、p−トルエンスルホニルクロリド(2.0g,6eq)を加え4間撹拌した。薄層クロマトグラフィー(展開液 − 1−ブタノール:メタノール:水=5:4:3にて目的物のスポット(Rf値=0.6)および二置換体(Rf値=0.65)が確認されたことから、未反応のp−トルエンスルホニルクロリドをろ過で取り除き、ろ液を塩酸水溶液で中和した。その後一晩放置し、成長した結晶を減圧ろ過により回収し、真空乾燥させることにより目的化合物である6−トシル−β−シクロデキストリンを得た(収量:830mg,収率:36.8%)。
1H-NMR(300.40MHz,DMSO-d6):δ=7.76(d,2H,phenyl),7.43(d,2H,phenyl),5.89-5.57(m,14H,OH),4.91-4.73(m,7H,CD),4.52-4.31(m,7H,CD),3.77(m,42H,CD),2.43(s,3H,Methyl)
MALDI-TOF-MS m/z=1311[M+Na+]
上記(2−1)で得た6−トシル−β−シクロデキストリン(830mg,0.644mmol)を80℃の水に懸濁し、アジ化ナトリウム(455mg,7mmol)を加え、80℃のオイルバス中で一晩反応させた。反応終了後、室温までゆっくり冷却した後、この溶液をアセトン(60mL)に注ぎ込み、生じた白色沈殿を減圧ろ過により回収し、真空乾燥させることにより、目的化合物である6−アジド−β−シクロデキストリンを得た(収量:548mg,収率:73.4%)。
1H-NMR(300.40MHz,DMSO-d6):δ=5.74-5.63(m,14H,OH),4.82(m,7H,CD),4.52-4.46(m,6H,CD),3.62-3.57(m,42H,CD)
MALDI-TOF-MS m/z=1182[M+Na+]
上記(2−2)で得た6−アジド−β−シクロデキストリン(548mg,0.472mmol)とトリフェニルホスフィン(262mg,1.0mmol)をDMFに溶解させ、室温で1時間撹拌後、反応液に超純水(Milli−Q水,1mL)を添加し、90℃のオイルバス中で一晩反応させた。薄層クロマトグラフィー(展開液 − 1−ブタノール:メタノール:水=5:4:3にて目的物のスポット(Rf値=0.075)が確認され、原料化合物のスポット(Rf値=0.55)の消失が確認されたことから、反応を終了した。室温までゆっくり冷却した後、この溶液をアセトン(60mL)に注ぎ込み、生じた白色沈殿を減圧ろ過により回収し、真空乾燥させることにより、目的化合物である6−アミノ−β−シクロデキストリンを得た(収量:430mg,収率:80.4%)。
1H-NMR(300.40MHz,DMSO-d6):δ=5.76-5.65(m,14H,OH),4.82(m,7H,CD),4.46(b,6H,CD),3.63-3.55(m,28H,CD)
MALDI-TOF-MS m/z=1156[M+Na+]
(3−1) 複合自己組織化単分子膜(複合SAM膜)の形成
金/ガラス基板(日本分光社製)を水とエタノールで十分に洗浄した後、窒素ガスを吹き付けて乾燥した。乾燥した金表面をArエッチング処理した後、0.5mMビス[2−(2−ブロモイソブチリルオキシ)ウンデシル]ジスルフィド+0.5mM 11−アミノ−1−ウンデカンチオール塩酸塩を含むエタノール溶液(5mL)に、25℃で24時間浸漬した。なお、2−ブロモイソブチリル基は、重合開始作用を示す。
上記金/ガラス基板を、さらに5mM NHS−dPEG4−NHSエステルを含むDMF溶液(10mL)に、25℃で1時間浸漬することにより、上記複合SAM膜の末端アミノ基に、PEG鎖を介してNHS活性化カルボキシ基を導入した。
上記(2)で調製したモノアミノ−β−シクロデキストリン(20.4mg,18μmol)をDMF(6mL)に溶解し、3mM溶液を調製した。次いで、NHS活性化カルボキシ基が導入された上記金/ガラス基板を当該溶液に25℃で3時間浸漬することにより、β−シクロデキストリンを固定化した。
上記(1)で調製したtemplete化合物(3.5mg,5μmol)を少量のDMSOに溶解した後、水(5mL)を加えて1mM溶液を調製した。β−シクロデキストリンを固定化した上記金/ガラス基板を当該溶液に25℃で24時間浸漬することにより、templete化合物を固定化した。
反応容器中に、水(5mL)、templete化合物が固定化された上記金/ガラス基板、2−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン(MPC,88.6mg,300μmol)、臭化銅(II)(1.34mg,6μmol)、N,N,N’,N”,N”−ペンタメチルジエチレントリアミン(PMDETA,1.25μL,6μmol)を加え、反応容器中の気相を窒素ガスで置換した。次いで、アスコルビン酸(0.52mg,3μmol)を水(1mL)に溶解した0.5mM溶液を反応容器中に注入し、25℃で30分間重合反応を行った。
重合反応後、上記金/ガラス基板を分離し、水で洗浄した。次いで、残留している銅イオン(II)を除去するため、1M EDTA−4Na水溶液に、25℃で12時間浸漬した。
上記実施例1(3−4)〜(3−6)の「templete化合物の固定化」と「templete化合物の除去」を行わない以外は上記実施例1を同様にして、β−シクロデキストリンのみが固定化された高分子薄膜が形成された金/ガラス基板を作製した。
(1) 自己組織化単分子膜(SAM膜)の形成
金/ガラス基板(日本分光社製)を水とエタノールで十分に洗浄した後、窒素ガスを吹き付けて乾燥した。乾燥した金表面をArエッチング処理した。別途、ビス[2−(2−ブロモイソブチリルオキシ)ウンデシル]ジスルフィド(1.8μL,3μmol)をエタノール(6mL)に溶解し、0.5mM溶液を調製した。上記金/ガラス基板を当該溶液に25℃で24時間浸漬した。
反応容器中に、水(3.00mL)、DMSO(1mL)、上記(1)で得た金/ガラス基板、2−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン(MPC,66.5mg,225μmol)、上記実施例1(1)で得たtemplete化合物(3.15mg,4.5μmol)、臭化銅(II)(1.00mg,4.5μmol)、N,N,N’,N”,N”−ペンタメチルジエチレントリアミン(PMDETA,0.94μL,4.5μmol)を加え、反応容器中の気相を窒素ガスで置換した。次いで、アスコルビン酸(0.39mg,2.25μmol)を水(0.5mL)に溶解した0.5mM溶液を反応容器中に注入し、25℃で30分間重合反応を行った。
重合反応後、上記金/ガラス基板を分離し、水で洗浄した。次いで、残留している銅イオン(II)を除去するため、1M EDTA−4Na水溶液に、25℃で12時間浸漬した。
フルオレセインイソチオシアネート−ビスフェノールA(FITC−BPA)を10mMリン酸緩衝液(pH7.4)に溶解し、100nM FITC−BPA溶液を調製した。当該溶液に、コルチゾールに対するMIP膜が形成された金/ガラス基板(実施例1)を25℃で1時間浸漬した後、コルチゾールを10mMリン酸緩衝液(pH7.4)に溶解した溶液を加えていき、上澄み液の蛍光を測定した。この際、コルチゾールとビスフェノールAは立体コンフォメーションが似ているので、ビスフェノールAはコルチゾールに対するMIP膜に捕捉される一方で、MIP膜に対する親和性がより高いコルチゾールの添加により置換されて溶液中に漏出する。なお、蛍光測定における励起波長は495nmとし、測定蛍光波長は515nmとした。相対蛍光強度変化量[(I−I0)/I0]と、MIP金/ガラス基板が浸漬されている溶液に添加したコルチゾール濃度との関係を図2に示す。また、測定結果をグラフ作成ソフト(日本ポラデジタル「DeltaGraph」)で処理し、MIP金/ガラス基板とコルチゾールとの結合定数Kを算出した。結果を表1に示す。
上記実施例2において、コルチゾールに加え、構造が類似する17−β−エストラジオール、コレステロール、テストステロンおよびプロゲステロンを用いた以外は同様にして、本発明に係るMIP膜の親和性を測定した。各化合物の構造を以下に示し、測定結果を図3に示す。なお、図3中、コルチゾールの測定結果を「◆」で示し、その他の化合物の測定結果を「■」で示す。
上記実施例1(3−5)において、水(6mL)、2−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン(MPC,70.9mg,240μmol)、架橋剤であるN,N’−メチレンビスアクリルアミド(MBAAm,9.25mg,60μmol)、臭化銅(I)(1.34mg,6μmol)、N,N,N’,N”,N”−ペンタメチルジエチレントリアミン(PMDETA,1.25μL,6μmol)およびアスコルビン酸(0.52mg,3μmol)を用いた以外は上記実施例1と同様にして、金/ガラス基板上に架橋MIP膜を形成した。
Claims (6)
- ステロイドホルモン化合物の分子インプリンティング膜であって、
上記ステロイドホルモン化合物が下記式(I)で表されるものであり、
R1は、メチル基、ヒドロキシメチル基またはホルミル基を示し、
R2は、水素原子、水酸基またはオキソ基を示し、
R3は、メチル基、ヒドロキシメチル基またはホルミル基を示し、
R4は、1以上の置換基αで置換されているC1-10アルキル基、または水酸基を示し、
R5は、水素原子または水酸基を示し、
R4とR5は一緒になってオキソ基を形成してもよく、
置換基αは、水酸基およびオキソ基から選択される置換基を示す]
自己組織化単分子膜の上にポリマー層が積層されている積層構造を有し、
上記自己組織化単分子膜の表面の一部にβ−シクロデキストリンが結合しており、
上記ポリマー層には上記ステロイドホルモン化合物に対する特異的認識空間が形成されており、
上記特異的認識空間の一端には上記β−シクロデキストリンが存在し、且つ、上記特異的認識空間の他端にはアミノオキシ基が存在することを特徴とする分子インプリンティング膜。 - 分子インプリンティングポリマーの特異的認識空間を形成するための鋳型化合物であって、下記式(II)で表されることを特徴とする鋳型化合物。
XとYは、独立して、C 1-6 アルキレン基、C 6-12 アリーレン基、アミノ基、エーテル基、チオエーテル基、カルボニル基、チオニル基、エステル基、アミド基、スルホキシド基、スルホニル基、およびこれら2以上、5以下が結合したリンカー基を示し、
R1は、メチル基、ヒドロキシメチル基またはホルミル基を示し、
R2は、水素原子、水酸基またはオキソ基を示し、
R3は、メチル基、ヒドロキシメチル基またはホルミル基を示し、
R5は、水素原子または水酸基を示し、
R6は、水素原子またはメチル基を示す] - ステロイドホルモン化合物の分子インプリンティング膜を製造するための方法であって、
金属基板上に自己組織化単分子膜を形成する工程、
上記自己組織化単分子膜の表面にβ−シクロデキストリンを結合させる工程、
上記β−シクロデキストリンに、請求項2に記載の鋳型化合物のアダマンチル基を相互作用させる工程、
2−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンを含むビニルモノマーを添加し、上記鋳型化合物のビニル基と共重合させる工程、
上記鋳型化合物のオキシム基を加水分解し、上記鋳型化合物のステロイド部分を除去する工程を含むことを特徴とする方法。 - 試料中におけるステロイドホルモン化合物を検出する方法であって、
上記ステロイドホルモン化合物は、請求項1で規定されている式(I)で表されるものであり、
溶媒中、請求項1に記載の分子インプリンティング膜と上記試料を接触させる工程、および、
上記分子インプリンティング膜と上記試料との接触により上記特異的認識空間内に取り込まれた上記ステロイドホルモン化合物を測定する工程を含むことを特徴とする方法。 - さらに、上記接触工程の前に、上記分子インプリンティング膜の特異的認識空間に、標識基を有し、上記ステロイドホルモン化合物に類似する化学構造を有し、上記特異的認識空間に取り込まれ得るものであり、且つ上記ステロイドホルモン化合物に比べて上記特異的認識空間に対する親和性が低い疑似ステロイドホルモン化合物を挿入する工程を含み、
上記測定工程において、反応系の溶液における標識基の濃度変化を測定する請求項4に記載の方法。 - 上記測定工程において、反応系の変化を、表面プラズモン共鳴測定法、水晶振動子マイクロバランス法または電気化学インピーダンス法で測定する請求項4に記載の方法。
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