JP6458014B2 - 刃先付マイクロピペット保持装置 - Google Patents

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Description

本発明は、顕微授精などにおいて用いられるマイクロピペットを保持し、生体細胞へのマイクロピペットの刃先の刺入操作に用いられる刃先付マイクロピペット保持装置および卵子細胞質内精子注入方法に関する。
バイオテクノロジー分野において、顕微鏡観察下で、卵子への精子および精細胞、細胞への核、細胞質およびDNAの注入(インジェクション)操作が行われている。このような操作に用いられるマイクロマニピュレーションシステムとして、例えば、特開2005−258413(特許文献1)が提案されている。顕微鏡画像観察下にて、マイクロマニピュレータを用いて微小針(刃先付マイクロピペット)を操作することにより、被検体に対して遺伝子組み換え操作や顕微受精操作等の操作が行われる。
顕微授精におけるICSI(細胞質内精子注入法)は、生殖補助技術(ART)として、重度の精液所見不良例などを対象として施術される。顕微授精は、精子が雌性生殖路を遡上し、卵と受精、融合するまでの全ての過程を体外で行う方法である。この体外受精によれば、射精精液中に精子が極端に少ない症例や、精液中の精子が自力で卵子に侵入する能力(受精能)に欠けた症例であっても、受精が可能となる。
そして、ICSI(細胞質内精子注入法)では、卵子の内部である細胞質内に精子を直接注入することが必要であり、このためには、刃先付マイクロピペットを卵子の透明帯、卵膜を刺通し、細胞質内に到達させることが必要である。マイクロピペットの刃先による卵子の透明帯の刺通は、比較的容易に行われるが、卵膜は、マイクロピペットの刃先の当接により、変性し硬化するため、その刺通は容易なものではない。
特開2007−6775(特許文献2)には、振動型マイクロインジェクション装置が開示されている。特許文献2の振動型マイクロインジェクション装置は、マイクロピペット8に直列に接続されるとともに、圧電アクチュエータ29が装着されるハウジングを有する振動子28と、圧電アクチュエータ29に印加される電気信号を調節する信号調節装置21とを備え、圧電アクチュエータ29に電気信号を入力することにより、ハウジングを有する振動子28を介してマイクロピペット8の軸方向に振動を付与する。
特開2005−258413 特開2007−6775
特許文献2のものによれば、受精卵などの透明帯、細胞膜、核膜といった性質の異なる膜を貫通させる場合の刺し入れがある程度良好に行われるとのことであるが、より、簡便にかつより確実にマイクロピペットの刃先を卵子の細胞質内に刺入可能なものが望まれていた。
本発明の目的は、刃先付マイクロピペットを卵子の透明帯、卵膜を刺通し、細胞質内に容易かつ確実に到達させることができる刃先付マイクロピペット保持装置および卵子細胞質内精子注入方法を提供するものである。
上記目的を達成するものは、以下のものである。
生体細胞に刺入するための刃先付マイクロピペットを先端部に装着可能な筒状マイクロピペットホルダーと、前記マイクロピペットホルダーを保持するホルダー保持具とを備える刃先付マイクロピペット保持装置であって、
前記ホルダー保持具は、ベース部材と、前記ベース部材に回動可能に保持され、かつ、前記マイクロピペットホルダーが挿通可能な筒状回動部材とを備え、さらに、前記筒状回動部材は、前記筒状回動部材の側面かつ前記筒状回動部材の周方向に異なる位置に設けられた複数の側孔と、前記側孔より、前記筒状回動部材内に侵入可能かつ、挿通する前記マイクロピペットホルダーの外面に当接可能なホルダー位置調整部材とからなるホルダー位置調整機構を備えている刃先付マイクロピペット保持装置。
また、上記目的を達成するものは、以下のものである。
卵子細胞質内精子注入方法であって、卵子を吸引ピペットにて保持するステップと、前吸引ピペットに保持された前記卵子に、先端に刃先を有し、かつ内部に精子を保有するマイクロピペットの先端部を当接させるステップと、前記マイクロピペットを前進させて、前記刃先を前記卵子の透明帯を刺通させるステップと、前記刃先を前記卵子の卵膜に当接させ、前記刃先により前記卵膜を押圧するステップと、前記マイクロピペットを回転させることにより、前記刃先の刃面を回転させて、前記刃先を前記卵膜を刺通させ、前記刃先を細胞質内に進入させるマイクロピペット回転ステップと、前記マイクロピペット内の精子を前記細胞質内にて放出する精子放出ステップとを行う卵子細胞質内精子注入方法。
図1は、本発明の刃先付マイクロピペット保持装置の一実施例の正面図である。 図2は、図1に示した刃先付マイクロピペット保持装置のホルダー保持具部分の拡大正面図である。 図3は、図1に示した刃先付マイクロピペット保持装置のホルダー保持具部分の拡大平面図である。 図4は、図1に示した刃先付マイクロピペット保持装置のホルダー保持具部分の拡大右側面図である。 図5は、図2のA−A線断面図である。 図6は、図2のB−B線断面図である。 図7は、本発明の刃先付マイクロピペット保持装置に刃先付マイクロピペットを装着した状態の部分省略正面図である。 図8は、本発明の刃先付マイクロピペット保持装置に用いられるマイクロピペットホルダーの先端部の拡大断面図である。 図9は、図7の刃先付マイクロピペットおよびマイクロピペットホルダの先端部の拡大断面図である。 図10は、本発明の他の実施例の刃先付マイクロピペット保持装置のホルダー保持具部分の拡大断面図である。 図11は、本発明の他の実施例の刃先付マイクロピペット保持装置のホルダー保持具部分の拡大断面図である。 図12は、本発明の他の実施例の刃先付マイクロピペット保持装置のホルダー保持具部分の拡大断面図である。 図13は、本発明の他の実施例の刃先付マイクロピペット保持装置のホルダー保持具部分の拡大正面図である。 図14は、図13に示した刃先付マイクロピペット保持装置のホルダー保持具部分の拡大平面図である。 図15は、本発明の他の実施例の刃先付マイクロピペット保持装置のホルダー保持具部分の拡大正面図である。 図16は、本発明の他の実施例の刃先付マイクロピペット保持装置のホルダー保持具部分の拡大正面図である。 図17は、図16に示した刃先付マイクロピペット保持装置のホルダー保持具部分の拡大平面図である。 図18は、図17の刃先付マイクロピペット保持装置のホルダー保持具よりホルダー保持具を取り除いた状態の拡大平面図である。 図19は、本発明の他の実施例の刃先付マイクロピペット保持装置のホルダー保持具部分の拡大正面図である。 図20は、本発明の刃先付マイクロピペット保持装置の他の実施例を説明するための説明図である。 図21は、本発明の卵子細胞質内精子注入方法を説明するための説明図である。 図22は、本発明の卵子細胞質内精子注入方法を説明するための説明図である。 図23は、本発明の卵子細胞質内精子注入方法を説明するための説明図である。
本発明の刃先付マイクロピペット保持装置を図面に示した実施例を用いて説明する。
本発明の刃先付マイクロピペット保持装置1は、生体細胞(例えば、卵子、核移植細胞)に刺入するための刃先付マイクロピペット15を先端部に装着可能な筒状マイクロピペットホルダー5と、マイクロピペットホルダー5を保持するホルダー保持具2とを備える。ホルダー保持具2は、ベース部材20と、ベース部材20に回動可能に保持され、かつ、筒状マイクロピペットホルダー5が挿通可能な筒状回動部材3とを備え、さらに、筒状回動部材3は、筒状回動部材3の側面かつ筒状回動部材3の周方向に異なる位置に設けられた複数の側孔35と、側孔35より、筒状回動部材3内に侵入可能かつ、挿通するマイクロピペットホルダー5の外面に当接可能なホルダー位置調整部材62,72とからなるホルダー位置調整機構6,7を備えている。
本発明のマイクロピペット保持装置1を顕微授精用のマイクロピペットを保持するためのマイクロピペット保持装置に応用した実施例を用いて説明する。
本発明の刃先付マイクロピペット保持装置1は、図1ないし図6に示すように、筒状マイクロピペットホルダー5と、マイクロピペットホルダー5を保持するホルダー保持具2とを備える。
筒状マイクロピペットホルダー5は、図1、図7ないし図9に示すように、筒状本体51と、筒状本体51の先端部に設けられた先端側リング状部材52と、筒状本体51の基端側に設けられた基端側リング状部材53と、先端側リング状部材52内に収納され、かつ、先端側リング状部材52と筒状本体51の先端により押圧される筒状弾性体54とを備える。
筒状本体51は、マイクロピペット15の外径より大きな内径を有する筒状体であり、先端から基端まで貫通する内腔56を備えている。また、筒状本体51の先端部には、先端側リング状部材52の内面に形成された雌ねじ部と螺合可能な雄ねじ部が形成されている。筒状本体51の先端部は、マイクロピペット15の基端部保持部を構成している。そして、先端側リング状部材52内に収納されている筒状弾性体54は、マイクロピペット15の基端部を挿通可能かつ、筒状本体51の先端と先端側リング状部材52の内径小径部の基端間により押圧可能なものとなっており、かつ、押圧されることにより、内径が縮径し、マイクロピペット15の基端部に密着し、保持可能なものとなっている。
また、筒状本体51の後端部には、最も基端に位置し、外径が小径となった小径基端部と、この小径基端部より先端方向に延びる雄ねじ部を備えている。そして、基端側リング状部材53は、小径基端部の被包部と、内面に形成され、上記の雄ねじ部と螺合可能な雌ねじ部を備えている。小径基端部は、図21に示すように、マイクロピペット15内への吸引および吐出のための気体もしくは液体を流動させるためのチューブ24の接続部を構成している。
筒状マイクロピペットホルダー5に装着される刃先付マイクロピペット15は、筒状本体51内と連通可能かつ先端から基端まで貫通する内部通路19を有し、かつ、先端に刃先18を有する中空針である。特に、図9に図示するマイクロピペット15は、刃先18より所定長基端側に延びる細径部17と、細径部17の基端から後端まで延びる本体部16とを備えている。刃先は、中心軸に対して斜めにカットされた刃面を備えている。刃先付マイクロピペット15としては、通常、ガラス製の透明針が用いられる。
この実施例のマイクロピペット保持装置1では、ホルダー保持具2は、ベース部材20と、ベース部材20に回動可能に保持され、かつ、筒状マイクロピペットホルダー5が挿通可能な筒状回動部材3とを備える。
ベース部材20は、図2ないし図6に示すように、基盤部21と、基盤部21より起立する2つの側板部22,23と、それぞれの側板部22,23に固定されたボールベアリング8a,8bとを備える。基盤部21は、矩形状に形成された板状部であり、側板部22,23は、向かい合うように、かつ基盤部のそれぞれの側端部より起立している。また、側板部22,23は、ほぼ平行かつ同じ高さとなるように形成されている。さらに、2つの側板部22,23は、上部に設けられた凹部22a,23aを備える。
筒状回動部材3は、図1ないし図6に示すように、筒状体31の一端に固定されたボールベアリング8aと、他端に固定されたボールベアリング8bを備えている。ボールベアリング8a、8bは、図5に示すように、外側リング状部材81と、内側リング状部材82と、2つのリング状部材に配置された複数のボール体83を備えている。そして、ボールベアリング8aの内側リング状部材82は、筒状体31の一端に固定され、ボールベアリング8bの内側リング状部材82は、筒状体31の他端に固定されている。そして、両端にボールベアリング8a,8bを備える筒状体31は、ボールベアリング部分にて、ベース部材20の側板部22,23の凹部22a,23aに装着されている。
具体的には、ボールベアリング8a,8bの外側リング状部材81が、ベース部材20の側板部22,23の凹部22a,23aに装着されている。これにより、筒状体31は、ベース部材20の2つの側板部22,23間に回転可能に保持されたものとなっている。さらに、ボールベアリング8a,8bの外側リング状部材81は、側板部22,23に設けられた凹部の内径より大きい外径を有するフランジ部を備え、そのフランジ部が、側板部22,23の外側側面に当接するように設けられている。このため、ボールベアリング8a,8bが装着された筒状体31の移動を阻止している。
また、筒状回動部材3は、筒状体31の側面かつ筒状体31(筒状回動部材3)の周方向に異なる位置に設けられた複数の側孔35と、側孔35より、筒状回動部材3内に侵入可能かつ、挿通するマイクロピペットホルダー5の外面に当接可能なホルダー位置調整部材62,72とからなるホルダー位置調整機構6,7を備えている。
本発明の刃先付マイクロピペット保持装置1では、このホルダー位置調整機構を備えるため、刃先付マイクロピペット15をマイクロピペットホルダー5に装着した状態にて、ホルダー位置調整機構6,7を調整することにより、マイクロピペット15の先端部の中心軸を筒状回動部材3の回動時におけるほぼ中心に調整することが可能となっている。このため、マイクロピペットの刃先の刃面を良好に回転させることができる。
この実施例のマイクロピペット保持装置1では、筒状回動部材3は、第1のホルダー位置調整機構6と、第1のホルダー位置調整機構6と所定長離間した位置に設けられた第2のホルダー位置調整機構7を備えている。このように、2つのホルダー位置調整機構6、7を設けることが好ましいが、一つであってもよい。
そして、ホルダー位置調整機構6は、筒状体31の軸方向のほぼ同じ位置に設けられた複数(具体的には、4つ)の側孔35と、ホルダー位置調整部材を構成する複数の雄ねじ部材62と、側孔35付近に設けられ、雄ねじ部材62と螺合可能な雌ねじ部61とにより構成されている。この実施例では、4つの側孔35は、筒状体31の中心軸に対して、ほぼ等角度間隔(具体的には、90度間隔)となるように形成されている。
そして、ホルダー位置調整機構7もホルダー位置調整機構6と同様に、筒状体31の軸方向のほぼ同じ位置に設けられた複数(具体的には、4つ)の側孔35と、ホルダー位置調整部材を構成する複数の雄ねじ部材72と、側孔35付近に設けられ、雄ねじ部材72と螺合可能な雌ねじ部71とにより構成されている。この実施例では、4つの側孔35は、筒状体31の中心軸に対して、ほぼ等角度間隔(具体的には、90度間隔)となるように形成されている。
雌ねじ部61、71として、ナットが用いられており、ナットは、内部の雌ねじ部が側孔35上となるように筒状体31の外面に配置され、固定部(具体的には、溶接部)64,74により、筒状体31に固定されている。雄ねじ部62、72は、筒状体31に固定された雌ねじ部(ナット)61、71に螺合させることにより、その先端部は、雌ねじ部(ナット)61、71、側孔35を貫通し、筒状体31の内部に到達可能なものとなっている。さらに、筒状体31の内部に到達したホルダー位置調整部材である各雄ねじ部62、72は、図6に示すように、筒状体31内を挿通したマイクロピペットホルダー5の外面と当接可能なものとなっている。
そして、各雄ねじ部62、72の筒状体31内での突出長を調整することにより、筒状体31内を挿通したマイクロピペットホルダー5の筒状体31内で位置を微調整することが可能となっている。例えば、図6における上下方向に向かいあう2つの雄ねじ部62を調整することにより、筒状体31内におけるマイクロピペットホルダー5の上下位置を調整することができ、図6における左右方向に向かいあう2つの雄ねじ部62を調整することにより、筒状体31内におけるマイクロピペットホルダー5の左右位置を調整することができる。
そして、この実施例のマイクロピペット保持装置1では、筒状回動部材3は、筒状回動部材3を手動にて回動させるための操作用突出部4を備えている。具体的には、筒状回動部材3は、筒状体31の側面に設けられた回動操作用突出部4を備えている。回動操作用突出部4は、その先端部4aが、筒状体31の側部貫通口に挿入され、固定されている。回動操作用突出部4としては、丸棒、角柱などの棒状体が好適である。そして、この回動操作用突出部4を把持することにより、筒状回動部材3(筒状体31)を容易に回転させることができる。また、この回動操作用突出部4は、回動の進行により、ベース部材20の基盤部21に当接する。このため、この実施例のマイクロピペット保持装置1では、筒状回動部材3は、360度回転するとができないものとなっている。よって、回動操作用突出部4は、筒状回動部材3の回転角度規制部材として機能する。
さらに、この実施例のマイクロピペット保持装置1では、筒状回動部材3は、筒状体31の一端側および他端側の内部に収納された2つの弾性筒状部材33,34を備えている。弾性筒状部材33,34は、マイクロピペットホルダー5に密着可能かつ挿通可能である。この弾性部材33,34により、マイクロピペットホルダー5は、がたつくことなく、筒状回動部材3(筒状体31)に保持されている。また、マイクロピペットホルダー5は、筒状体31を貫通し、両端部が、筒状体31より突出している。これにより、ホルダー保持具2がマイクロピペットホルダー5を保持するともに、マイクロピペットホルダー5の中間部に装着された状態となっている。
さらに、この実施例のマイクロピペット保持装置1は、ベース部材20に設けられ、マニピュレーター装置に装着するための装着部9を備えている。
装着部9は、棒状に形成された装着本体部91と、ベース部材20への装着部93と、両者間を接続するボールジョイント部92とを備えている。ボールジョイント部92は、装着本体部側のボール軸受け92aと、装着部93の端部に設けられたボールジョイント93aと、固定調整部材92bにより構成されている。固定調整部材92bを緩めることにより、ボールジョイント93a(ベース部材20の基盤部21)に対する装着本体部91の角度を変更することができ、所望の角度に装着本体部91を変更した後、固定調整部材92bを締めることにより、その状態を維持することが可能である。
なお、上述した実施例のマイクロピペット保持装置において、筒状体31への雌ねじ部(ナット)61の固定形態は、図10に示す実施例のマイクロピペット保持装置1aのように、筒状体31の外面に設けられた接着部材64a,74aにより行うものであってもよい。この実施例のマイクロピペット保持装置1aでは、筒状体31には、側孔を取り囲むようにかつある程度の厚さを有するように、接着部材64a、74aが設けられており、接着部材64a、74aにある程度、雌ねじ部(ナット)61、71が埋設した状態となっている。なお、この実施例では、雌ねじ部(ナット)61、71は、筒状体31の外面に実質的に接触しないものとなっている。よって、この実施例マイクロピペット保持装置1aでは、ホルダー位置調整機構6、7は、側孔35、雌ねじ部(ナット)61、71、雄ねじ部62、72および接着部材64a,74aにより構成されている。
また、上述した実施例のマイクロピペット保持装置において、筒状体31への雌ねじ部の形成形態は、図11に示す実施例のマイクロピペット保持装置1bのように、ナットを備えず、筒状体31aの側孔の内面に、雄ねじ部62,72と螺合する雌ねじ部36を形成したものであってもよい。この実施例では、筒状体31aは、少なくとも中央部分が、所定の厚さを有する肉厚部となっており、この肉厚部に、側孔が形成されている。このため、側孔は、所定の長さを備えている。さらに、その側孔の内面には、雌ねじ部36が形成されたものとなっている。よって、この実施例マイクロピペット保持装置1bでは、ホルダー位置調整機構6、7は、内面に雌ねじを有する側孔35、雄ねじ部62、72により構成されており、ナットおよび固着部を備えないものとなっている。
また、上述したすべての実施例のマイクロピペット保持装置において、側孔、雌ねじ部(ナット)および雄ねじ部は、図12に示す実施例のマイクロピペット保持装置1cのように、筒状体31の軸方向のほぼ同じ位置に設けられた複数(具体的には、3つ)の側孔35と、ホルダー位置調整部材を構成する複数の雄ねじ部材62と、側孔35付近に設けられ、雄ねじ部材62と螺合可能な雌ねじ部61とにより構成されているものであってもよい。この実施例では、3つの側孔35は、筒状体31の中心軸に対して、ほぼ等角度間隔(具体的には、120度間隔)となるように形成されている。
また、上述したすべての実施例のマイクロピペット保持装置において、側孔、雌ねじ部(ナット)および雄ねじ部は、図13および図14に示す実施例のマイクロピペット保持装置1dが備えるようなものであってもよい。マイクロピペット保持装置1dでは、筒状体31の軸方向のほぼ同じ位置に設けられた向かい合う2つの側孔、2つのホルダー位置調整部材を構成する複数の雄ねじ部材62、側孔付近に設けられ、雄ねじ部材62と螺合可能な2つの雌ねじ部61とにより構成された第1のホルダー位置調整機構6aと、筒状体31の中心軸に対して、第1のホルダー位置調整機構6aの2つの側孔とほぼ90度異なり、かつ、所長離間する位置に設けられた向かい合う2つの側孔、2つのホルダー位置調整部材を構成する複数の雄ねじ部材72、側孔付近に設けられ、雄ねじ部材72と螺合可能な2つの雌ねじ部71とにより構成された第2のホルダー位置調整機構7aとを有している。
この実施例のマイクロピペット保持装置1dでは、第1のホルダー位置調整機構6aにより、図13における筒状体31内を挿通したマイクロピペットホルダー5の筒状体31内で上下方向位置が調整可能であり、第2のホルダー位置調整機構7aにより、図13における筒状体31内を挿通したマイクロピペットホルダー5の筒状体31内で前後方向位置が調整可能となっている。
また、上述したすべての実施例のマイクロピペット保持装置において、側孔、雌ねじ部(ナット)および雄ねじ部は、図15に示す実施例のマイクロピペット保持装置1eのように、筒状体31の軸方向の異なる位置に設けられた4つの側孔、4つのホルダー位置調整部材を構成する複数の雄ねじ部材62、側孔付近に設けられ、雄ねじ部材62と螺合可能な4つの雌ねじ部61とにより構成されたホルダー位置調整機構6cを有するものであってもよい。
この実施例のマイクロピペット保持装置1eでは、筒状体31には、4つの側孔が、軸方向の基端側に向かって、筒状体31の中心軸に対して、90度ずつずれるように設けられている。言い換えれば、4つの側孔が、螺旋的に配置された状態となっている。このため、4つの側孔は、筒状体31の軸方向の同じ位置に位置することなく、また、軸方向に複数の側孔が直線上に並ばないものとなっている。そして、この実施例のホルダー位置調整機構6cでは、図15における左側から奇数番目に位置するホルダー位置調整機構(雄ねじ部材62)により、図15における筒状体31内を挿通したマイクロピペットホルダー5の筒状体31内で前後方向位置が調整可能であり、図15における左側から偶数番目に位置するホルダー位置調整機構(雄ねじ部材62)により、図15における筒状体31内を挿通したマイクロピペットホルダー5の筒状体31内で上下方向位置が調整可能となっている。
上述したすべての実施例のマイクロピペット保持装置は、筒状回動部材3を操作用突出部4にて把持し、手動で回転させるものとなっているが、このようなものに限定されるものではない。
マイクロピペット保持装置としては、図16ないし図18に示す刃先付マイクロピペット保持装置1fのように、筒状回動部材3を非手動にて回動させるための回動手段40を備えるものであってもよい。
この実施例のマイクロピペット保持装置1fでは、図18に示すように、広い表面を有する基盤部21aを備えたベース部材2aが用いられており、その上面にモータ41が取り付けられている。
この実施例の刃先付マイクロピペット保持装置1fでは、回動手段40は、モータ41との回転軸42の回転を筒状回動部材3に伝達し、筒状回動部材3を回転させる回転力伝達部を備えている。そして、この実施例では、回転力伝達部は、モーター41の回転軸42に設けられたウォームギア43と、筒状体31に設けられ、ウォームギア43と噛合う平歯車37により構成されている。ウォームギア43と平歯車37との組み合わせにより、モータ41の回転軸の回転が、90度変更され、筒状回動部材3は、その中心軸を中心に良好に回転する。また、ウォームギア43と平歯車37と組み合わせにより、モータ41の回転軸42の回転速度は、大きく減速されるため、筒状回動部材3は、ゆっくりと回転するものとなっている。
また、回転力伝達部としては、図19に示す刃先付マイクロピペット保持装置1gの回動手段40aが備えるような回転力伝達部であってもよい。このマイクロピペット保持装置1gの回動手段40aでは、回転力伝達部が、プーリーとベルトを用いるものとなっている。具体的には、回動手段40aは、回転力伝達部として、モーター41の回転軸42に設けられた第1のプーリー45と、筒状体31に設けられた第2のプーリー39と、第1のプーリー45と第2のプーリー39の各環状凹部間に掛け回された環状ベルト(無端ベルト)46により構成されている。この実施例の装置1gでは、モータ41は、筒状回動部材3と平行に配置されており、モータ41の回転軸も筒状回動部材3と平行なものとなっている。
そして、モーター41の回転軸42に設けられた第1のプーリー45と、筒状体31に設けられた第2のプーリー39も平行にかつ隣り合うように配置されている。さらに。第1のプーリー45の環状凹部と第2のプーリー39の環状凹部の隣り合い、かつ直線状に位置するものとなっている。そして、それらの凹部に環状ベルト(無端ベルト)46が緩みなく掛け回されて、2つのプーリー39,45は、ベルト46により連結されている。そして、モータ41の回転軸42が、回転することにより、プーリー45が回転し、その回転力は、ベルト46を介して、プーリー39に伝達され、回動部材3は、その中心軸を中心に良好に回転する。なお、モータ41には、回転軸の回転速度を減速させる減速ギアを取り付けてもよい。
また、この実施例のマイクロピペット保持装置1gでは、回動手段40aは、ベース部材2bの基盤部21に固定されたモーター固定部材47を備えている。この固定部材47により、モータ41は、回転可能に、ベース部材2bに取り付けられている。
次に、図20に示す本発明の刃先付マイクロピペット保持装置の他の実施例を説明する。この実施例の刃先付マイクロピペット保持装置1hでは、筒状回動部材3を手動にて回動させるための回動機構40bを備えている。
この実施例の刃先付マイクロピペット保持装置1hは、図20に示すように、精子注入用マニピュレータ10に組み込まれる。さらに、精子注入用マニピュレータ10は、精子注入用マニピュレータ10をXYZ方向に移動させるための移動装置80に装着される。このため、移動装置80を駆動させることにより、精子注入用マニピュレータ10は、前後、左右および上下に移動可能である。また、使用時には、図20に示すように、顕微鏡装置50の下方に、シャーレ30が配置される。
この実施例の筒状回動部材回動機構40bは、図20に示すように、ワイヤーシース57と、このワイヤーシース57内を摺動可能に貫通する操作用ワイヤーとを備えている。そして、操作用ワイヤー55は、先端に、操作用突出部4への装着部55aを備える。ワイヤー55は、基端部に把持部(操作部)55bを備えている。この実施例では、装着部55aは、操作用突出部4が挿通可能なリング状部材により形成されている。また、ワイヤーシース57の基端には、筒状保持部58が固定されており、筒状保持部58内にて、ワイヤー55の基端部は、シース57より突出している。ワイヤーの基端部に固定された把持部55bは、筒状保持部58の上面に設けられた軸方向に延びるスリットより、突出している。このため、ワイヤー55の後端部に固定された操作部55bは、筒状保持部58のスリット内を軸方向に移動可能である。そして、操作部55bを軸方向に移動させることにより、ワイヤー55の先端および装着部55aは、前後に動く。ワイヤの先端および装着部55aの前後の動きは、装着部55aが装着されている操作用突出部4に伝達され、これにより、筒状回動部材3は、回動する。
具体的には、図20に示す状態において、操作部55bを左方向に移動させると、シース57の先端より突出するワイヤー55の突出長が長くなり、操作用突出部4は、ワイヤー55により下方に押され、筒状回動部材3は、下方向に回転する。逆に、操作部55bを右方向に移動させると、シース57の先端より突出するワイヤー55の突出長が短くなり、操作用突出部4は、ワイヤー55により上方に引かれ、筒状回動部材3は、上方向に回転する。
また、この実施例の筒状回動部材回動機構40bは、図20に示すように、ベース部59を備え、筒状保持部58は、装着部59aにより、ベース部59に固定されている。さらに、この実施例では、シース57は、固定部材88により、移動装置80に固定されている。そして、この実施例では、固定部材88により、ワイヤーおよびシースが湾曲保持されている。これにより、ワイヤーおよびシースの先端部が向かう方向が、筒状回動部材3の回動軸とほぼ直交するものとなっている。このため、操作部55bのスライド操作により、筒状回動部材3は、良好に回動する。
次に、本発明の卵子細胞質内精子注入方法について、図21ないし図23を用いて説明する。
本発明の卵子細胞質内精子注入方法では、卵子100を吸引ピペット12にて保持するステップと、吸引ピペット12に保持された卵子に、先端に刃先18を有し、かつ内部に精子を保有するマイクロピペット15の先端部を当接させるステップと、マイクロピペット15を前進させて、刃先18を卵子の透明帯101を刺通させるステップと、刃先18を卵子100の卵膜102に当接させ、刃先18により卵膜102を押圧するステップと、マイクロピペット15をマイクロピペットの軸をほぼ中心として回転させることにより、刃先18の刃面を回転させて、刃先18を卵膜102を刺通させ、刃先18を細胞質103内に進入させるマイクロピペット回転ステップと、マイクロピペット15内の精子を細胞質103内にて放出する精子放出ステップとが行われる。
本発明の卵子細胞質内精子注入方法における各ステップを説明する。
図21に示すように、シャーレ30内に培養液とともに卵子100を収納したものを準備する。そして、顕微鏡装置50の下方に、上記のシャーレ30を配置し、シャーレ30の一方には、精子を収納した刃先付マイクロピペット15を保持した本発明のマイクロピペット保持装置1が組み込まれた精子注入用マニピュレータ10を配置し、シャーレ30の他方には、吸引ピペット12を保持したマイクロピペット保持装置が組み込まれた卵子保持用マニピュレータ25を配置する。
なお、図21に示すシステムでは、精子注入用マニピュレータ10は、精子注入用マニピュレータ10をXYZ方向に移動させるための移動装置80に装着されている。このため、移動装置80を駆動させることにより、精子注入用マニピュレータ10は、前後、左右および上下に移動可能である。
同様に、卵子保持用マニピュレータ25は、卵子保持用マニピュレータ25をXYZ方向に移動させるための移動装置90に装着されている。このため、移動装置90を駆動させることにより、卵子保持用マニピュレータ25は、前後、左右および上下に移動可能である。また、卵子保持用マニピュレータ25は、吸引ピペットホルダ26、ホルダー保持部材29を備え、ホルダー保持部材29が、移動装置90に装着されている。吸引ピペットホルダ26は、上述したマイクロピペットホルダ5と同じ構成を備えている。具体的には、先端に、吸引ピペット12を保持するための先端部材27を備え、基端に、チューブ60を保持するための基端部材28を備えている。
本発明の卵子細胞質内精子注入方法では、最初に、図21および図22(A)に示すように、卵子100を吸引ピペット12にて吸引し、保持するステップを行う。このステップでは、移動装置90を作動させて、 卵子保持用マニピュレータ25に保持されている吸引ピペット12を卵子100が培養液とともに収納されているシャーレ30内に挿入する。続いて、卵子保持用マニピュレータ25に接続されている吸引手段(図示せず)を作動させることにより、卵子100を吸引ピペット12の先端に吸引保持する。
次に、吸引ピペット12に保持された卵子に、先端に刃先18を有し、かつ内部に精子を保有するマイクロピペット15の先端部を当接させるステップを行う。このステップでは、移動装置80を作動させて、 精子注入用マニピュレータ10に保持されている精子を収納した刃先付マイクロピペット15をシャーレ30内に挿入し、図22(A)に示すように、刃先18が、卵子100に近接した状態とする。続いて、移動装置80を作動させて、刃先付マイクロピペット15をわずかに卵子方向に前進させ、図22(B)に示すようにマイクロピペット15の刃先18を卵子に当接させる。この刃先18の当接により、卵子は、若干窪むように変形する。
続いて、マイクロピペット15を前進させて、刃先18を卵子の透明帯101を刺通させるステップを行う。このステップでは、図22(C)に示すように、刃先付マイクロピペット15の刃先18が、卵子100内に刺入し、透明帯101を刺通するように、移動装置80を作動させることにより行われる。
そして、刃先18を卵子100の卵膜102に当接させ、刃先18により卵膜102を押圧するステップを行う。このステップは、移動装置80を作動させて、刃先付マイクロピペット15をわずかに卵子方向に前進させることにより行われる。なお、上記の刃先18による卵子の透明帯101の刺通ステップの完了により、自然に刃先18により卵膜102が押圧された状態となる場合がある。また、自然に刃先18により卵膜102が押圧された状態となった場合においても、さらに、移動装置80を作動させて、刃先付マイクロピペット15をわずかに卵子方向に前進させ、より強く、押圧する状態としてもよい。このステップにより、図22(C)に示すように、マイクロピペット15の刃先18は、透明帯101を刺通し、かつ、卵膜102は、刃先18により押圧変形した状態となる。
続いて、図23(D)に示すように、マイクロピペット15をマイクロピペットの軸をほぼ中心として回転させることにより、刃先18の刃面を回転させて、刃先18を卵膜102を刺通させ、刃先18を細胞質103内に進入させるマイクロピペット回転ステップを行う。
この回転ステップでは、マイクロピペット15の位置は、変更せず、本発明のマイクロピペット保持装置1の筒状回動部材3の操作用突出部4を上もしくは下方向に動かすことにより行われる。このステップにより、刃先18の刃面が回転するため、刃先18は卵膜102を刺通する。これにより、図23(E)に示すように、刃先18は、細胞質103内に進入する。なお、このマイクロピペット回転ステップは、刃先付マイクロピペット15をわずかに卵子方向に前進させながら行ってもよい。
また、このステップにおけるマイクロピペットの回転は、マイクロピペットの先端部の中心軸をほぼ中心として回転させることが好ましい。言い換えれば、本発明のマイクロピペット保持装置1には、精子を収納した刃先付マイクロピペット15が、その先端部の中心軸をほぼ中心として回転するように保持された状態としたものと用いることが好ましい。
そして、図23(E)に示すように、マイクロピペット15内の精子を細胞質103内にて放出する精子放出ステップを行う。このステップは、精子注入用マニピュレータ10に接続されている吐出手段(図示せず)を作動させることにより、精子をマイクロピペット15より吐出することにより行われる。
そして、精子注入ステップが終了した後、移動装置80を作動させて、刃先付マイクロピペット15を後退させて、卵子100より抜去する。これにより、卵子細胞質内精子注入方法は終了し、シャーレ30内には、精子が注入された卵子が、吸引ピペット12に吸引保持される。
本発明の刃先付マイクロピペット保持装置は、以下のものである。
(1) 生体細胞に刺入するための刃先付マイクロピペットを先端部に装着可能な筒状マイクロピペットホルダーと、前記マイクロピペットホルダーを保持するホルダー保持具とを備える刃先付マイクロピペット保持装置であって、
前記ホルダー保持具は、ベース部材と、前記ベース部材に回動可能に保持され、かつ、前記マイクロピペットホルダーが挿通可能な筒状回動部材とを備え、さらに、前記筒状回動部材は、前記筒状回動部材の側面かつ前記筒状回動部材の周方向に異なる位置に設けられた複数の側孔と、前記側孔より、前記筒状回動部材内に侵入可能かつ、挿通する前記マイクロピペットホルダーの外面に当接可能なホルダー位置調整部材とからなるホルダー位置調整機構を備えている刃先付マイクロピペット保持装置。
この刃先付マイクロピペット保持装置では、生体細胞に刺入するための刃先付マイクロピペットを装着可能な筒状のマイクロピペットホルダーを回動可能に保持するため、刃先付マイクロピペットの細胞内への刺入操作時、回動操作を容易に行うことがきでき、マイクロピペットの刃先の細胞内への刺入を容易に行うことができる。さらに、この刃先付マイクロピペット保持装置では、マイクロピペットホルダーが挿通される筒状回動部材が、ホルダー位置調整部材を備えているので、筒状部材の回動時における中心を調整可能、言い換えれば、装着された刃先付マイクロピペットの刃先における回転中心を調整可能であるため、良好な状態にて刃先付きマイクロピペットを回転させることができる。
また、上記の実施態様は、以下のものであってもよい。
(2) 前記刃先付マイクロピペット保持装置は、前記マイクロピペットを前記マイクロピペットホルダーに装着した状態にて、前記ホルダー位置調整機構を調整することにより、前記マイクロピペットの先端部の中心軸を前記筒状回動部材の回動時におけるほぼ中心に調整可能である上記(1)に記載の刃先付マイクロピペット保持装置。
(3) 前記ホルダー位置調整機構は、前記側孔と、前記ホルダー位置調整部材を構成する雄ねじ部材と、前記側孔付近もしくは前記側孔内に形成され、前記雄ねじ部材と螺合可能な雌ねじ部とからなるものである上記(1)または(2)に記載の刃先付マイクロピペット保持装置。
(4) 前記筒状回動部材は、前記筒状回動部材を手動にて回動させるための操作用突出部を備えている上記(1)ないし(3)のいずれかに記載の刃先付マイクロピペット保持装置。
(5) 前記マイクロピペット保持装置は、前記筒状回動部材を非手動にて回動させるための回動手段を備えている上記(1)ないし(3)のいずれかに記載の刃先付マイクロピペット保持装置。
(6) 前記回動手段は、モータと、前記モータの回動軸と前記筒状回動部材とを連結し、かつ、前記回動軸の回転により前記筒状回動部材を回転させる回転力伝達機構を備えている上記(5)に記載の刃先付マイクロピペット保持装置。
(7) 前記ベース部材は、基盤部と、前記基盤部より起立する2つの側板部を備え、
前記筒状回動部材は、両端部に設けられたボールベアリングを備え、前記筒状回動部材は、前記ボールベアリングを介して、前記2つの側板部に固定されることにより、前記ベース部材に回動可能に保持されたものとなっている上記(1)ないし(6)のいずれかに記載の刃先付マイクロピペット保持装置。
(8) 前記筒状回動部材は、一端側および他端側の内部に収納された2つの弾性筒状部材を備え、前記弾性筒状部材は、前記マイクロピペットホルダーに密着可能かつ挿通可能である上記(1)ないし(7)のいずれかに記載の刃先付マイクロピペット保持装置。
(9) 前記筒状回動部材は、第1の前記ホルダー位置調整機構と、前記第1のホルダー位置調整機構と所定長離間した位置に設けられた第2のホルダー位置調整機構を備えている上記(1)ないし(8)のいずれかに記載の刃先付マイクロピペット保持装置。
(10) 前記ホルダー位置調整機構は、向かい合うもしくは前記筒状回動部材の中心軸に対して等角度となるように設けられた複数の前記側孔と、各前記側孔より、前記筒状回動部材内に侵入可能かつ、挿通する前記マイクロピペットホルダーの外面に当接可能なホルダー位置調整部材とを備えるものである上記(1)ないし(9)のいずれかに記載の刃先付マイクロピペット保持装置。
(11) 前記マイクロピペット保持装置は、前記ベース部材に設けられ、マニピュレーター装置に装着するための装着部を備えている上記(1)ないし(10)のいずれかに記載の刃先付マイクロピペット保持装置。
(12) 前記マイクロピペットホルダーは、筒状本体と、前記筒状本体の先端部に設けられた先端側リング状部材と、前記筒状本体の基端側に設けられた基端側リング状部材と、前記先端側リング状部材内に収納され、かつ、前記先端側リング状部材と前記筒状本体の先端により押圧される筒状弾性体とを備え、前記筒状弾性体は、前記マイクロピペットの基端部を挿通可能かつ押圧時に前記マイクロピペットの基端部を保持可能である上記(1)ないし(11)のいずれかに記載の刃先付マイクロピペット保持装置。
(13) 前記マイクロピペット保持装置は、顕微授精用のマイクロピペットを保持するためのものである上記(1)ないし(12)のいずれかに記載の刃先付マイクロピペット保持装置。
また、本発明の卵子細胞質内精子注入方法は、以下のものである。
(14) 卵子細胞質内精子注入方法であって、卵子を吸引ピペットにて保持するステップと、前吸引ピペットに保持された前記卵子に、先端に刃先を有し、かつ内部に精子を保有するマイクロピペットの先端部を当接させるステップと、前記マイクロピペットを前進させて、前記刃先を前記卵子の透明帯を刺通させるステップと、前記刃先を前記卵子の卵膜に当接させ、前記刃先により前記卵膜を押圧するステップと、前記マイクロピペットを回転させることにより、前記刃先の刃面を回転させて、前記刃先を前記卵膜を刺通させ、前記刃先を細胞質内に進入させるマイクロピペット回転ステップと、前記マイクロピペット内の精子を前記細胞質内にて放出する精子放出ステップとを行う卵子細胞質内精子注入方法。
本発明では、マイクロピペットの刃先の刃面を回転させることにより、刃先を卵膜に確実かつ容易に細胞質内に進入させることができ、マイクロピペットの刃先を確実に細胞質内に到達させることができる。
また、上記の実施態様は、以下のものであってもよい。
(15) 前記マイクロピペットの回転は、前記マイクロピペットの先端部の中心軸をほぼ中心として回転させるものである上記(14)に記載の卵子細胞質内精子注入方法。

Claims (13)

  1. 生体細胞に刺入するための刃先付マイクロピペットを先端部に装着可能な筒状マイクロピペットホルダーと、前記マイクロピペットホルダーを保持するホルダー保持具とを備える刃先付マイクロピペット保持装置であって、
    前記ホルダー保持具は、ベース部材と、前記ベース部材に回動可能に保持され、かつ、前記マイクロピペットホルダーが挿通可能な筒状回動部材とを備え、さらに、前記筒状回動部材は、前記筒状回動部材の側面かつ前記筒状回動部材の周方向に異なる位置に設けられた複数の側孔と、前記側孔より、前記筒状回動部材内に侵入可能かつ、挿通する前記マイクロピペットホルダーの外面に当接可能なホルダー位置調整部材とからなるホルダー位置調整機構を備えていることを特徴とする刃先付マイクロピペット保持装置。
  2. 前記刃先付マイクロピペット保持装置は、前記マイクロピペットを前記マイクロピペットホルダーに装着した状態にて、前記ホルダー位置調整機構を調整することにより、前記マイクロピペットの先端部の中心軸を前記筒状回動部材の回動時におけるほぼ中心に調整可能である請求項1に記載の刃先付マイクロピペット保持装置。
  3. 前記ホルダー位置調整機構は、前記側孔と、前記ホルダー位置調整部材を構成する雄ねじ部材と、前記側孔付近もしくは前記側孔内に形成され、前記雄ねじ部材と螺合可能な雌ねじ部とからなるものである請求項1または2に記載の刃先付マイクロピペット保持装置。
  4. 前記筒状回動部材は、前記筒状回動部材を手動にて回動させるための操作用突出部を備えている請求項1ないし3のいずれかに記載の刃先付マイクロピペット保持装置。
  5. 前記マイクロピペット保持装置は、前記筒状回動部材を非手動にて回動させるための回動手段を備えている請求項1ないし3のいずれかに記載の刃先付マイクロピペット保持装置。
  6. 前記回動手段は、モータと、前記モータの回動軸と前記筒状回動部材とを連結し、かつ、前記回動軸の回転により前記筒状回動部材を回転させる回転力伝達機構を備えている請求項5に記載の刃先付マイクロピペット保持装置。
  7. 前記ベース部材は、基盤部と、前記基盤部より起立する2つの側板部を備え、前記筒状回動部材は、両端部に設けられたボールベアリングを備え、前記筒状回動部材は、前記ボールベアリングを介して、前記2つの側板部に固定されることにより、前記ベース部材に回動可能に保持されたものとなっている請求項1ないし6のいずれかに記載の刃先付マイクロピペット保持装置。
  8. 前記筒状回動部材は、一端側および他端側の内部に収納された2つの弾性筒状部材を備え、前記弾性筒状部材は、前記マイクロピペットホルダーに密着可能かつ挿通可能である請求項1ないし7のいずれかに記載の刃先付マイクロピペット保持装置。
  9. 前記筒状回動部材は、第1の前記ホルダー位置調整機構と、前記第1のホルダー位置調整機構と所定長離間した位置に設けられた第2のホルダー位置調整機構を備えている請求項1ないし8のいずれかに記載の刃先付マイクロピペット保持装置。
  10. 前記ホルダー位置調整機構は、向かい合うもしくは前記筒状回動部材の中心軸に対して等角度となるように設けられた複数の前記側孔と、各前記側孔より、前記筒状回動部材内に侵入可能かつ、挿通する前記マイクロピペットホルダーの外面に当接可能なホルダー位置調整部材とを備えるものである請求項1ないし9のいずれかに記載の刃先付マイクロピペット保持装置。
  11. 前記マイクロピペット保持装置は、前記ベース部材に設けられ、マニピュレーター装置に装着するための装着部を備えている請求項1ないし10のいずれかに記載の刃先付マイクロピペット保持装置。
  12. 前記マイクロピペットホルダーは、筒状本体と、前記筒状本体の先端部に設けられた先端側リング状部材と、前記筒状本体の基端側に設けられた基端側リング状部材と、前記先端側リング状部材内に収納され、かつ、前記先端側リング状部材と前記筒状本体の先端により押圧される筒状弾性体とを備え、前記筒状弾性体は、前記マイクロピペットの基端部を挿通可能かつ押圧時に前記マイクロピペットの基端部を保持可能である請求項1ないし11のいずれかに記載の刃先付マイクロピペット保持装置。
  13. 前記マイクロピペット保持装置は、顕微授精用のマイクロピペットを保持するためのものである請求項1ないし12のいずれかに記載の刃先付マイクロピペット保持装置。
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