JP6439223B1 - 細胞構造体の製造装置、製造システムおよび製造方法 - Google Patents

Abstract

複数の線状の部材を用いて３次元構造の細胞構造体を製造する製造装置、製造システムおよび製造方法を提供する。製造装置１００は、トップ板１１０と、ピン１２０Ａないし１２０Ｄ、第１スライド板１３０、第２スライド板１４０、ストッパー１５０、ベース板１６０、外周針状部材１７０、内周針状部材１８０とを含む。外周針状部材１７０と内周針状部材１８０によって規定される管状の３次元空間Ｓ１に細胞凝集体４００を投入し、蓄積した細胞凝集体４００の上部にトップ板１１０を押し下げる。細胞凝集体４００は、培養液２１０の中に浸されると互いに接着し、３次元空間Ｓ１を型とした管状の細胞構造体５００が製造される。

Description

本発明は、細胞凝集体を用いた３次元細胞構造体もしくは３次元細胞構築物の製造に関し、特に、垂直方向に形成されたストリップ状、線状の部材を用いた３次元細胞構造体の装置方法に関する。

世界的な人口増加と長寿命化に従い医療行為への要求・要望・需要は高まるばかりであるが、近年は新たな手法として細胞を利用した再生医療が注目されている。個々の細胞をそのまま体内に注入する医療手法はすでに他分野にて実用化されている。この手法の施術は簡易であるが、注入した細胞が所望の部位に定着しにくいという課題がある。

これに対して、大量の細胞を融合させて立体的構造体に作製する手法が開発されてきている。細胞をシャーレ、ゲル状の支持体、針状の支持体などで任意の形状に空間的に保持し、立体構造体を作成する手法である。この手法の用途には大きく二つがあげられる。

一つ目は人体移植目的とした人工組織や人工臓器の作製である。人工組織はその一部分を機能が発現する形で作製されたもので、人体移植が最終目的である。ただし、人体への移植までには相応の評価認定が必要となり、長期的な取り組みが必要である。現状では複雑な形状をした臓器を直接作製することは難しく、単純な形状の臓器（血管など）を作成するにとどまっている。

二つ目は、これらの３次元細胞構造体を用いた毒性検査、薬剤効果判定、病理判定、発生学などを試験片としての活用法である。ヒト細胞のみを用いて３次元細胞構造体を作成し体内の環境を再現もしくは近い環境下にて上記の試験をすることで、体内を模した実験が体外で可能となる。これにより効率的な創薬研究、パーソナライズした投薬診断、各器官発生の観察研究などが可能になる。特にがんの投薬においてはその時期と効果予測判定が難しいが、例えば本技術を利用患者のがん組織にて作成された試験片を体外でまず投薬試験評価判定をすることで、薬効果の見極めの指標となることが期待される。

細胞には、浮遊系細胞と足場依存の接着性細胞の２種類がある。前者には、血液系や免疫系の細胞が属し、後者には臓器や皮膚、骨などの細胞が属する。接着性細胞は、在溶液中で浮いている状態では長期間の生存はできず、ガラスシャーレやハイドロゲルなどの足場に付着することで生存及び増殖させる必要がある。接着性の細胞を非接着の環境下に置くと、細胞は足場を求めて相互に接着し、細胞凝集体が形成され、さらに細胞凝集体同士を何らかの手法で相互に接触した環境下に置くと、それらが接着、融合しさらに大きな３次元細胞構造体を構成する。この現象は広く知られており、非特許文献１〜６はこれらの具体的実施例を示すものである。非特許文献１にあるように細胞凝集体（本文献内ではClusterとも表記される）が融合する現象は古く１９６０年代から知られている。特に非特許文献６にて示されるのは、３次元細胞構造体を「積木ブロック（Building Block）」として扱うアイデアを示しており、多様な細胞が利用可能であることを示唆している。

細胞塊（Spheroid）は、細胞のみで構成されたおおむね円形の凝集体、細胞凝集体凝集体（Cell Aggregate）は、細胞塊及び細胞とそれ以外の物質で構成された凝集体を示すものとする。

特許文献１は、担体を用いることなく細胞だけで任意の形状の組織を作成することができる組織プラグ製造方法を開示する。具体的には、底面のみに培養液が通過できる微細孔を有するチャンバー内に細胞凝集体を入れ、細胞凝集体の一部が気相に接する程度の量の培養液がチャンバー内に含まれるようにして、チャンバー内の培養液よりも過剰量の培養液中で細胞凝集体を培養させるものである。

また、３次元細胞構造体を製造する方法として、特許文献２に示すバイオプリンターのノズルから細胞凝集体を平面上に分注していくディスペンス方式や、特許文献３に示す針状の支持体に細胞塊を貫通させる剣山方式が知られている。さらに特許文献４は、透過性シート上で平面培養した培養細胞を他の平面培養した培養細胞上にシートごと積層し、立体的な細胞を製造する方法を開示している。

特許第４１２２２８０号 米国特許第８８５２９３２号公報 特許第４５１７１２５号公報（国際出願番号ＰＣＴ／ＪＰ２００８／０５６８２６号） 国際公開ＷＯ２００５／０４７４９６号公報 PLOS ONE, Journal. Pone. 0136681, "Scaffold-Free Tubular Tissues Created by a Bio-3D printer Undergo Remolding and Endothelialization when Implanted in Rat Aortae", Manabu Itoh et al, September 1, 2015 Gordon R, Goel NS, Steinberg MS, Wiseman LL. A rheological mechanism sufficient to explain the kinetics of cell sorting. J Theor Biol. 1972; 37:43-73. [PubMed: 4652421] Jakab K, Damon B, Marga F, Doaga O, Mironov V, Kosztin I, Markwald R, Forgacs G. Relating cell and tissue mechanics: implications and applications. Dev. Dyn. 2008; 237:2438-2449. [PubMed: 18729216] Jakab K, Neagu A, Mironov V, Markwald RR, Forgacs G. Engineering biological structures of prescribed shape using self-assembling multicellular systems. Proc Natl Acad Sci U S A. 2004; 101:2864-2869. [PubMed: 14981244] Perez-Pomares JM, Foty RA. Tissue fusion and cell sorting in embryonic development and disease:biomedical implications. Bioessays. 2006; 28:809-821. [PubMed: 16927301] Organ printing: Tissue spheroids as building blocks" Biomaterials. Vladimir Mironov, Richard P. Visconti, Vladimir Kasynocv, Gabor Forgacs, Christopher J. Drake, and Roger R. Markwald, 2009 April ; 30(12):2164-2174. doi:10.1016

特許文献２に示すディスペンス方式の多くは、バイオインクと呼ばれる細胞塊とハイドロゲルやコラーゲンなどの繋ぎ材を混ぜ合わせたものを平面上に吐出していく手法、もしくはハイドロゲルやコラーゲンなどの固まりやすい形状保持可能な材料にてあらかじめ作成した足場（Scaffold）の内部に細胞塊を注入して３次元細胞構造体手法であるが、細胞間の接触が妨げられる欠点がある。また、この手法で作製された３次元細胞構造体の形状は、繋ぎ材の形状保持力に依存するため、３次元細胞構造体の大きさや形状（特に高さ方向）に制限が課される。さらに３次元細胞構造体内に繋ぎ材が残存するので、繋ぎ材が細胞に与える悪影響を排除しきれないという課題が残り、人体移植時、もしくは効果判定時に追加の評価確認が必要となる。また、特許文献３に示す剣山方式は、針状の支持体による形状が制約される。

本発明は、このような従来の課題を解決し、複数の線状の部材を用いて３次元構造の細胞構造体を製造する製造装置、製造システムおよび製造方法を提供することを目的とする。

本発明に係る細胞構造体の製造装置は、細胞構造体の製造装置であって、少なくとも１つの上側部材と、少なくとも１つの下側部材と、前記上側部材と前記下側部材との間に配置され複数の線状の部材であって、各線状の部材の一方の端部が前記上側部材によって支持され、他方の端部が前記下側部材によって支持される、前記複数の線状の部材とを有し、前記複数の線状の部材は３次元空間を規定し、当該空間には複数の細胞凝集体が収容可能である。

ある実施態様では、前記複数の線状の部材は、概ね第１の面を規定する第１の線状の部材と、前記第１の面から離間された概ね第２の面を規定する第２の線状の部材とを含み、第１の面と第２の面との間によって形成された空間内に細胞凝集体を収容する。ある実施態様では、前記第１の面は、前記細胞構造体の外側の形状を規定し、前記第２の面は、前記細胞構造体の内側の形状を規定する。ある実施態様では、前記第１の面および前記第２の面は円形である。ある実施態様では、前記空間内に収容された細胞凝集体は、前記複数の線状の部材を介して培地等の液体に晒される。ある実施態様では、前記上側部材は、概ね平坦な部材を含み、当該平坦な部材には、前記空間内に前記細胞凝集体を投入するための投入孔が形成される。ある実施態様では、製造装置はさらに、前記上側部材と前記下側部材との間に前記複数の線状の部材を貫通する複数の貫通孔が形成されたスライド部材を含み、前記スライド部材は、前記上側部材と前記下側部材との間で移動可能である。ある実施態様では、製造装置はさらに、前記上側部材と前記下側部材を連絡する複数の支柱を含み、前記スライド部材は、前記複数の支柱にガイドされて前記上側部材に接近または離間する方向に移動可能である。ある実施態様では、前記複数の支柱の少なくとも１つには、前記スライド部材の移動を規制する規制部材が設けられる。ある実施態様では、請求項前記第１および第２の線状の部材は、血管の構造を規定する。ある実施態様では、前記第１および第２の線状の部材は、心臓の弁の構造を規定する。ある実施態様では、前記複数の線状の部材は、３次元プリンタにより製造された部材である。ある実施態様では、前記複数の線状の部材は、半導体製造に使われるようなワイヤーボンディング方式により製造された部材である。ある実施態様では、前記複数の線状の部材は、型枠による成型により製造された部材である。

本発明に係る製造システムは、上記構成の製造装置と、前記製造装置を収容可能であり、前記製造装置内の細胞凝集体に栄養を与える培地を収容する容器と、前記培地を循環させるポンプとを有する。ある実施態様では、前記製造システムは、前記容器を震盪させる震盪手段を含む。ある実施態様では、前記製造システムは、任意に特定の部位に培地供給する手段を含む。

本発明に係る細胞構造体の製造方法は、上記構成の製造装置を利用した細胞構造体の製造方法であって、前記空間に複数の細胞凝集体を供給するステップと、前記細胞凝集体を培養し、前記細胞凝集体を融合するステップと、前記融合さされた細胞凝集体から前記複数の線状の部材を離脱させるステップと、を有する。ある実施態様では、前記スライド部材を移動させることにより細胞凝集体から複数の線状の部材を離脱させる。ある実施態様では、前記複数の線状の部材を離脱させるステップは、線状の部材を個別に離脱させるステップを含む。

本発明によれば、少なくとも１つの上側部材と少なくとも１つの下側部材とによって支持された複数の線状の部材により３次元空間を形成し、その空間内に複数の細胞凝集体を収容するようにしたので、複数の線状の部材により任意の形状または構造の細胞凝集体を容易に製造することができる。

本発明の実施例に係る細胞構造体の製造装置を示す斜視図である。 本発明の実施例に係る細胞構造体の製造装置の分解斜視図を示す図である。 本発明の実施例に係るトップ板を説明する図である。 本発明の実施例に係るピンを説明する図である。 本発明の実施例に係る第１スライド板を説明する図である。 本発明の実施例に係る第２スライド板を説明する図である。 本発明の実施例に係るストッパーを説明する図である。 本発明の実施例に係るベース板を説明する図である。 本発明の実施例に係る針状部材を説明する図である。 本発明の実施例に係る管状の３次元空間を説明する図である。 本発明の実施例に係る細胞構造体の製造方法を示すフロー図である。 本発明の実施例に係る細胞凝集体の投入を説明する図である。 本発明の実施例に係るトップ板の下降を説明する図である。 細胞凝集体の培養例を示す図である。 複数のノズルを用いた培養例を示す図である。 複数のノズルを持ち同時に別系統の培地を供給する培養例を示す図である。 製造された細胞構造体を取り出す様子を説明する図である。 製造された細胞構造体を取り出す様子を説明する図である。 他の実施例に係る細胞構造体の製造装置を示す斜視図である。 他の実施例に係る細胞構造体の製造装置の分解斜視図を示す図である。 他の実施例に係る細胞構造体の形状を例示する図である。 他の実施例に係る細胞構造体の成型を説明する図である。 他の実施例に係る細胞構造体の成型を説明する模式的な断面図である 他の実施例に係る細胞凝集体の培養例を示す図である。 他の実施例に係る複数のノズルを用いた培養例を示す図である。 他の実施例に係る複数のノズルを持ち同時に別系統の培地を供給する培養例を示す図である。 他の実施例に係る細胞構造体の製造方法を示すフロー図である。

本発明の実施の形態に係る３次元細胞構築物の製造装置は、垂直方向に配置された複数の線状または針状の部材により細胞凝集体の３次元構造を規定し、３次元構造に応じた立体形状の細胞構造体を製造する。線状または針状の部材は、任意の形状に加工されることができ、かつ細胞構造体からの引き抜きが容易になるように、ステンレス等の鋼材、プラスチック、生体分解材料、その他の軟質の材料から構成される。ある実施態様では、製造装置に供給された複数の細胞凝集体は、栄養成分を含んだ溶液により培養され、１つの細胞構造体に融合される。また、線状または針状の部材は、３次元プリンタを用いて任意の形状に作成することができる。３次元プリンタは、３次元データに基づき任意の３次元構造を規定する部材を生成する。また、線状または針状の部材は求められる形状を有した型枠を用いて成型することもできる。また、半導体製造時の配線につかわれるワイヤボンダーの手法を用いて作成することもできる。なお、図面のスケールは、本発明を理解するために誇張されており、必ずしも実際の製品等の大きさとは同一ではない点に留意すべきである。

次に、本発明の実施例について図面を参照して説明する。本実施例では、３次元細胞構築物の製造装置を用いて、管状（チューブ状）の細胞構造体を製造する例について説明する。管状の細胞構造体は、例えば、血管である。

図１は、本発明の実施例に係る細胞構造体の製造装置を示す斜視図であり、図２は、本発明の実施例に係る細胞構造体の製造装置の分解斜視図を示す図である。本実施例の細胞構造体の製造装置１００は、トップ板１１０と、４つのピン１２０Ａないし１２０Ｄ（以下、総称してピン１２０と呼ぶことがある）と、略矩形状の第１スライド板１３０、略矩形状の第２スライド板１４０、ストッパー１５０、ベース板１６０、外周針状部材１７０、内周針状部材１８０とを含んで構成される。

図３は、トップ板の斜視図であり、図３（Ａ）は、トップ板１１０を上方から見た図、図３（Ｂ）は、トップ板１１０を下方から見た図である。トップ板１１０は、長さＸ１、Ｙ１、厚さＤ１を有する概ね矩形状の平坦な板状部材から構成される。トップ板１１０には、４つのコーナー部近傍に、概ね円形状の貫通孔１１２Ａ、１１２Ｂ、１１２Ｃ、１１２Ｄ（以下、総称して貫通孔１１２と呼ぶことがある）が形成されている。対角線上の一対の貫通孔１１２Ａ、１１２Ｃの径Ｗ１は、他方の対角線上の一対の貫通孔１１２Ｂおよび１１２Ｄの径Ｗ２よりも小さい。

トップ板１１０の中央付近には、略楕円形上の一対の投入孔１１４Ａ、１１４Ｂ（以下、総称して投入孔１１４と呼ぶことがある）が形成される。投入孔１１４は、トップ板１１０を貫通し、好ましくは、投入孔１１４は、表面側の径が裏面側の径よりも大きいすり鉢状を有する。一対の投入孔１１４Ａ、１１４Ｂの間には、培地循環穴１１６が形成される。培地循環穴１１６は、略円状の貫通孔であり、投入孔１１４に挟まれるような位置する。トップ板１１０にはさらに、図９に示すような外周針状部材１７０を挿入しかつ支持するための複数の針穴１１８Ａと、内周針状部材１８０を挿入しかつ支持するための複数の針穴１１８Ｂとが形成されている。針孔１１８Ａ、１１８Ｂは、培地循環穴１１６のほぼ同心円上に配置された貫通孔である。

図４に、１つのピンを例示する。ピン１２０は、長さＬ１、径Ｗ３の細長い円柱状の部材であり、例えば、鋼材から構成される。径Ｗ３は、貫通孔１１２Ａ、１１２Ｃの径Ｗ１とほぼ同径若しくはそれらよりも若干小さく、ピン１２０は、貫通孔１１２を貫通することができる。ピン１２０の両端には、雄ネジ部１２２、１２４が形成され、雄ネジ部１２２には、これと噛み合うリング部材１２６が取り付けられる。リング部材１２６は、ピン１２０の径Ｗ３とほぼ同等の内径Ｗ４を有し、回転することによりその位置を可変することができる。リング部材１２６は、雄ネジ部１２２の軸方向の長さＬ１−１の範囲で移動することができる。なお、リング部材１２６はピン１２０と固定されていてもよい。

リング部材１２６の外径Ｗ５は、貫通孔１１２Ｂ、１１２Ｄの径Ｗ２とほぼ同径若しくはそれらよりも若干小さく、リング部材１２６は、貫通孔１１２Ｂ、１１２Ｄを貫通することができる。リング部材１２６は、図２で示すように、ピン１２０Ｂ、１２０Ｄに装着され、ピン１２０Ａ、ピン１２０Ｃには装着されない。雄ネジ部１２４は、後述するベース板１６０に取付けられる。

図５に、第１スライド板を示す。第１スライド板１３０は、長さＸ２、Ｙ２、厚さＤ２の略矩形状の平坦な板状部材である。第１スライド板１３０には、トップ板１１０の貫通孔１１２Ａ、１１２Ｂ、１１２Ｃ、１１２Ｄと整合する位置に、４つの同じサイズの貫通孔１３２Ａ、１３２Ｂ、１３２Ｃ、１３２Ｄ（以下、総称して貫通孔１３２と呼ぶことがある）が形成され、これらの貫通孔内に、ピン１２０Ａ、１２０Ｂ、１２０Ｃ、１２０Ｄが挿入される。第１スライド板１３０は、貫通孔１３２内に挿入されたピン１２０をガイドにして、ピン１２０の軸方向に移動することができる。また、第１スライド板１３０の中心付近には、針穴１１８Ａおよび針穴１１８Ｂに整合する位置に、外周針状部材１７０および内周針状部材１８０を挿入可能な複数の針穴１３４Ａおよび１３４Ｂ（以下、総称して針穴１３４と呼ぶことがある）が形成される。さらに、針穴１３４Ｂの内側には、略円状の貫通孔である培地循環穴１３５が形成される。

図６に、第２スライド板を示す。第２スライド板１４０は、長さＸ３、Ｙ３、厚さＤ３の略矩形状の板状部材である。ある実施態様では、第１スライド板１３０との関係において、Ｘ３＜Ｘ２、Ｙ３＞Ｙ２である。第２スライド板１４０には、第１スライド板１３０の４つの貫通孔１３２Ａ、１３２Ｂ、１３２Ｃ、１３２Ｄと整合する位置に、ほぼ同じサイズの貫通孔１４２Ａ、１４２Ｂ、１４２Ｃ、１４２Ｄ（以下、総称して貫通孔１４２と呼ぶことがある）が形成され、これらの貫通孔１４２内に、それぞれピン１２０Ａ、１２０Ｂ、１２０Ｃ、１２０Ｄが挿入される。また、第２スライド板１４０の中心付近には、第１スライド板１３０と同様に、針穴１１８Ａおよび針穴１１８Ｂに整合する位置に、外周針状部材１７０および内周針状部材１８０を挿入しかつ支持するための複数の針穴１４４Ａおよび１４４Ｂ（以下、総称して針穴１４４と呼ぶことがある）が形成される。さらに、針穴１４４Ｂの内側には、略円状の貫通孔である培地循環穴１４５が形成される。

図７に、ストッパーを示す。ストッパー１５０は、図７（Ａ）に示すように、把持部１５２、培地循環穴１５４、ピン１２０を通過可能なスライドガイド１５６Ａおよび１５６Ｂ（以下、総称してスライドガイド１５６と呼ぶことがある）を含む。把持部１５２は、図１に示す製造装置１００で把握されるように、第２スライド板１４０とベース板１６０の間から若干突出しており、把持部１５２を引っ張ることによって、ストッパー１５０を製造装置１００から引き抜くことができる。培地循環穴１５４は、培養液を細胞構造体に供給するための貫通孔である。スライドガイド１５６は、細長状のガイドであり、細長状のガイドの一端が開口している。従って、当該開口を介して、スライドガイド１５６Ａにピン１２０Ａおよび１２０Ｂを、スライドガイド１５６Ｂにピン１２０Ｃおよび１２０Ｄを通すことができる。ストッパー１５０は、このような構造を有することにより、例えば、図１に示すような製造装置１００が組み上がっている状態であっても、第２スライド板１４０とベース板１６０の間に抜き差しすることができる。

図７（Ｂ）は、ストッパー１５０と他の部材との関係を示す図である。ストッパー１５０の上には、外周針状部材１７０および内周針状部材１８０が配置される。好ましくは、培地循環穴１５４が内周針状部材１８０の内側に入るように配置される。外周針状部材１７０および内周針状部材１８０は、針穴１３４および針穴１４４を介して、第１スライド板１３０および第２スライド板１４０を貫通する。従って、ストッパー１５０と第２スライド板１４０によって外周針状部材１７０および内周針状部材１８０が固定され、第１スライド板１３０を移動させても、針状部材は固定される。

図８に、ベース板を示す。ベース板１６０は、長さＸ４、Ｙ４、厚さＤ４の略矩形状の部材である。ベース板１６０には、ほぼ同径の雌ネジ部１６２Ａ、１６２Ｂ、１６２Ｃ、１６２Ｄ（以下、総称して雌ネジ部１６２と呼ぶことがある）が設けられており、それぞれ、ピン１２０Ａ、１２０Ｂ、１２０Ｃ、１２０Ｄの雄ネジ部１２４に対応する。ピン１２０は、雌ネジ部１６２によってベース板１６０にネジ固定され、垂直方向に保持される。また、ベース板１６０の中心には、径Ｗ６の貫通孔１６４が設けられており、ストッパー１５０を引き抜いた状態であれば、貫通孔１６４から外周針状部材１７０および内周針状部材１８０を引き抜くことができる。

図９に、針状部材を示す。外周針状部材１７０は、複数の針状部材１７２を円形状に配置し、針状部材１７２の一端は、ほぼ直角に折り曲げられ、他端は、針穴１４４Ａ、１３４Ａ、１１８Ａを貫通することができる。内周針状部材１８０は、複数の針状部材１８２を円形状に配置し、針状部材１８２の一端は、ほぼ直角に折り曲げられ、他端は、針穴１４４Ｂ、１３４Ｂ、１１８Ｂを貫通することができる。これらの針状部材により、トップ板１１０と第１スライド板１３０の間に管状の３次元空間が形成される。針状部材は、例えば、ステンレス材、プラスチック材、生体分解材などから構成される。針状部材の断面形状は任意であるが、細胞凝集体からの離脱を容易にするために例えば円形状もしくは楕円形状であり、かつその太さは一様であることが望ましい。但し、断面形状が三角形状や角柱状であってもよい。また、針状部材の表面は、細胞凝集体からの離脱を容易にするための非接着性のある材質がコーティングされてもよい。

図１０は、本発明の実施例に係る管状の３次元空間を説明する図である。図１０（Ａ）は、製造装置１００の外周針状部材１７０および内周針状部材１８０を取り出した図である。内周針状部材１８０は、外周針状部材１７０の内部空間に挿入され、内周針状部材１８０および外周針状部材１７０によって、管状の３次元空間Ｓ１が形成される。図１０（Ｂ）は、図１０（Ａ）の俯瞰図である（針状部材の折り曲げ部は省略されている）。後述する細胞構造体の製造方法により、３次元空間Ｓ１に細胞凝集体が供給されることにより、管状の細胞構造体が製造される。従って、管状の細胞構造体の外径は、外周針状部材１７０の径Ｗ７によって規定され、内径は、内周針状部材１８０の径Ｗ８によって規定されることになる。空間Ｓ２は、管状の細胞構造体のスペース空間となる。なお、図１０（Ｂ）では、外周針状部材１７０の一部を拡大しており、針状部材同士の間隔Ｌ２は、供給される細胞凝集体よりも小さい。すなわち、間隔Ｌ２は、細胞凝集体が漏れ出ない程度の間隔である。これは、内周針状部材１８０の針状部材同士の間隔についても同様である。間隔Ｌ２は、細胞凝集体が漏れ出ない程度の間隔であれば良く、必ずしもすべての針状部材同士の間隔を一定にする必要はない。なお、針状部材同士の間隔Ｌ２は、後述する培養液２１０を通すことは可能であるため、針状部材の間から栄養の入った培地を供給することができる。

次に、本実施例に係る製造装置１００を用いた細胞構造体の製造方法について説明する。図１１は、本発明の実施例に係る細胞構造体の製造方法を示すフロー図である。細胞構造体の製造方法は、まず、細胞凝集体（スフェロイド）を製造装置１００の投入孔１１４から供給する（Ｓ１００）。図１２は、本発明の実施例に係る細胞凝集体の投入を説明する図である。針状部材同士の間隔Ｌ２よりも大きい細胞凝集体４００を投入孔１１４から投入すると、管状の３次元空間Ｓ１に細胞凝集体４００が蓄積していく。次に、ある程度、細胞凝集体４００を蓄積したところで、図１３に示すように、トップ板１１０をＺ１方向に下降させ、細胞凝集体４００を互いに密着させ、かつ動き回らないようにする（Ｓ１０２）。

次に、管状に蓄積させた細胞凝集体を培養する（Ｓ１０４）。図１４Ａは、細胞凝集体の培養例を示す図である。蓄積された細胞凝集体４００は、製造装置１００ごと容器２００に入れられる。容器２００には、細胞凝集体４００を培養するための養分が溶け込んだ培養液２１０が入っており、細胞凝集体４００に養分を供給する。好ましくは、循環用ポンプ３００を用意し、チューブ３２０で培養液を吸い上げて、チューブ３１０から培養液を吐き出すことにより培養液２１０を循環させることができる。チューブ３１０の先端には、ノズル３３０が接続されており、培地循環穴１１６、１３５、１４５を介して培養液を循環させることで、細胞凝集体全体に培養液を行き渡らせることができる。さらに好ましくは、容器２００を震盪させる振動アクチュエータ２２０を用意し、容器２００を震盪させながら培養するようにしても良い。なお、細胞凝集体４００を培養する際は、図１４Ａに示す製造システムを、培養に適した温度、湿度、光量などで管理することが好ましい。

図１４Ｂは、複数のノズルを用いた培養例を示す図である。この場合、培地循環穴１１６に挿入されるノズル３３０Ａに加え、細胞凝集体４００の周囲から培地を供給するノズル３３０Ｂおよびノズル３３０Ｃが設けられる。同図に示す製造システムでは、チューブ３２０から吸い上げられた培養液は、再びチューブ３１０を介して３つのノズル３３０Ａ、３３０Ｂ、３３０Ｃから排出される。循環用ポンプ３００は、吸い上げた培地を濾過する機能を備えるものであってもよい。また、ノズル３３０Ｂおよびノズル３３０Ｃは、任意の位置に配置可能な固定機構を持ち、細胞凝集体４００の任意の部位に効率的に培養液を供給するようにしてもよい。また、ノズル３３０Ｂ及びノズル３３０Ｃは、アクチュエーターなどの駆動装置または駆動機構により任意の軌道あるいは位置に移動できるようにしてもよい。

図１４Ｃは、複数のノズルを持ち同時に別系統で培地を供給する例を示す図である。同図に示す製造システムでは、別系統の循環用ポンプ３００Ａおよび３００Ｂを有し、それぞれのポンプには、吐出用のチューブ３１０Ａ、３１０Ｂと、吸い上げ用のチューブ３２０Ａ、３２０Ｂとが接続されている。チューブ３２０Ａから吸い上げられた培地は、チューブ３１０Ａを介してノズル３３０Ａから吐出される。また、チューブ３２０Ｂから吸い上げられた培地は、チューブ３１０Ｂを介してノズル３３０Ｂおよび３３０Ｃから吐出される。この場合、細胞凝集体４００の任意の特定の部位に培地を供給することができることに加え、ノズル３３０Ｂおよびノズル３３０Ｃは別系統のタンクに接続されているため、いずれか一方の循環用ポンプのみを起動させることも可能である。また、ノズル３３０Ｂ及びノズル３３０Ｃは、アクチュエーターなどの駆動装置または駆動機構により任意の軌道あるいは位置に移動できるようにしてもよい。

細胞凝集体４００は、Ｓ１０４の培養により互いに接着し、３次元空間Ｓ１に沿った細胞構造体に成長していく。図１５Ａおよび図１５Ｂは、製造された細胞構造体を取り出す様子を説明する図である。図１５Ａに示すように、細胞凝集体４００が細胞構造体５００に成長すると、まずは、トップ板１１０が取り外される（Ｓ１０６）。次に、第１スライド板１３０をＺ２方向にスライドさせながら、外周針状部材１７０および内周針状部材１８０から細胞構造体５００を引き抜いていく（Ｓ１０８）。このとき、針状部材から細胞構造体５００が抜きにくい場合には、ストッパー１５０をＺ３方向に引き抜き、貫通孔１６４から針状部材を１つまたは複数本ずつ取り出すことができる。細胞構造体５００が容易に針状部材から引き抜かれる場合には、図１５Ｂ（Ａ）に示すように、ストッパー１５０を抜かず、第１スライド板１３０をスライドさせることで細胞構造体５００を抜き取ることができる。図１５Ｂ（Ａ）のように引き抜けば、外周針状部材１７０および内周針状部材１８０が製造装置１００に組み込まれた状態で残るため、再度、針状部材を針穴に通す手間を省くことができる。このようにして、第１スライド板１３０上に管状の細胞構造体５００が製造される。図１５Ｂ（Ｂ）は、製造された細胞構造体を例示する図である。

細胞構造体５００が製造装置１００から取り出される際、細胞構造体５００が針状部材と接着してしまうことを防ぐため、外周針状部材１７０および内周針状部材１８０は、例えば、ステンレス、ナイロン、ポリエステルなどの材料から構成され、大きさは、直径１０μｍ程度であることが好ましい。さらに好ましくは、Ｐ−ＨＥＭＡ等の非接着剤を針状部材にコーティングし、エタノール等によって消毒する。さらに好ましくは、トップ板１１０と細胞構造体５００の接触面、第１スライド板１３０と細胞構造体５００の接触面などに、予め非接着剤を塗布しておき、細胞構造体５００を取り出しやすいようにしても良い。

上記実施例では、２組の外周針状部材１７０と内周針状部材１８０とを用い、それぞれが血管の外周面と内周面の輪郭を規定するようにしたが、これは一例であり、３組またはそれ以上の針状部材によりさらに複雑な形状を有する細胞構造体の輪郭、形状を規定することができる。さらに針状部材により規定する輪郭または輪郭面は、球面または曲面に限らず、直線的なものであってもよく、例えば、角柱状の細胞構造体、多角形状の細胞構造体などの輪郭または形状を規定することも可能である。

さらに上記実施例では、外周針状部材１７０および内周針状部材１８０の端部をトップ板および第２スライド板の貫通孔内に直接挿入することで、これらの針状部材の支持を行ったが、これは一例であり、例えば、専用の支持部材等を介して間接的にトップ板および第２スライド板に取付けるようにしてもよい。

次に、本発明の他の実施例について図面を参照して説明する。他の実施例では、３次元細胞構築物の製造装置を用いて、弁部を有する細胞構造体を製造する例について説明する。弁部を有する細胞構造体は、例えば、心臓弁を模した細胞構造体である。

図１６は、本発明の他の実施例に係る細胞構造体の製造装置を示す斜視図であり、図１７は、当該他の実施例に係る細胞構造体の製造装置の分解斜視図を示す図である。本実施例に係る細胞構造体の製造装置１００Ａは、上部枠体６１０、下部枠体６２０、上部枠体６１０および下部枠体６２０に設けられた培地循環穴６３０Ａ、６３０Ｂ、６３０Ｃ、６３０Ｄ、６３０Ｅ（以下、総称して培地循環穴６３０と呼ぶことがある）、下部枠体６２０に設けられた投入孔６４０Ａ、６４０Ｂ、６４０Ｃ（以下、総称して投入孔６４０と呼ぶことがある）、第１外側針状部材６５０、弁成型針状部材上部６６０、弁成型針状部材中部６７０、弁成型針状部材下部６８０、第２外側針状部材６９０とを含む。上部枠体６１０と下部枠体６２０は、図１６や図１７に示すように、３つのピースから構成される。これは、上部枠体６１０や下部枠体６２０を三次元プリンタ等での製造を容易にするため、それぞれのピースを接合して上部枠体６１０や下部枠体６２０が構成される。但し、必ずしも各ピースに分割される必要はなく、上部枠体６１０および下部枠体６２０がそれぞれ１つの部材から構成されてもよい。

第１外側針状部材６５０、弁成型針状部材上部６６０、弁成型針状部材中部６７０は、図１７（Ｂ）に示すように、上部枠体６１０の面（下部枠体６２０と対向する面）に固定される。固定は、第1の実施例のときと同様に、上部枠体６１０に複数の貫通孔を形成し、そこに針状部材が挿入される。弁成型針状部材下部６８０、第２外側針状部材６９０は、図１７（Ｃ）に示すように、下部枠体６２０の面（上部枠体６１０と対向する面）に同様の方法で固定される。本実施例に係る細胞構造体の製造装置１００Ａは、このような針状部材により３次元構造の輪郭を規定し、複雑な形状を有する心臓弁の細胞構造体を製造することができる。

図１８は、本実施例に係る心臓弁の細胞構造体の例示する図である。管状の細胞構造体７００は、その管状の部分から内側に延在する複数の弁部７１０を備えている（図１８（Ａ））。図１８（Ｂ）に拡大されるように、弁部７１０は、３つの弁７１０Ａ、７１０Ｂ、７１０Ｃから構成される。

図１９Ａは、本実施例に係る細胞構造体の成型を説明する図である。弁部７１０は、凸型の弁成型針状部材下部６８０と、扇状に末広がる弁成型針状部材中部６７０との間の空間によって、その輪郭が規定される。図１９Ｂは、本実施例に係る細胞構造体の成型を説明するための模式的な断面図である。図１９Ｂ（Ａ）は、製造装置１００Ａの上部枠体６１０と下部枠体６２０とが分離した状態を示している。上部枠体６１０と下部枠体６２０を組み合わせることで、図１６に示すような製造装置１００Ａとなる。ここには図示しないが、上部枠体６１０と下部枠体６２０は、図１に示すようなピン１２０によって位置を調整され、かつ間隔を調整される。

図１９Ｂ（Ｂ）は、細胞凝集体４００を投入孔６４０から投入した状態を示している。細胞凝集体４００は、第１外側針状部材６５０、第２外側針状部材６９０によって規定される細胞構造体７００の管の厚さ部分に蓄積していき、ある程度の量が蓄積されると、弁成型針状部材下部６８０と弁成型針状部材中部６７０によって規定される弁部７１０を成型する空間に蓄積される。空間Ｓ１は、その一端に培地循環穴６３０Ｅ、当該一端に対向する他端に培地循環穴６３０Ｄを有する空間であり、培養液２１０を循環させることができる。また、空間Ｓ２およびＳ３は、培地循環穴６３０（ＡまたはＢまたはＣ）と通じており、これらの空間にも培養液２１０を供給することができる。なお、細胞凝集体４００を投入する投入孔６４０は、下部枠体６２０に設けられているため、図１９Ｂでは、下部枠体６２０が図面上部に記載されている点に留意する。

図２０Ａは、本実施例に係る細胞凝集体の培養例を示す図である。製造装置１００Ａは、図１４Ａで示した製造システムのように培養液２１０中に浸漬される。ノズル３００からは、循環用ポンプ３００から供給される培養液が吐出しており、培地循環穴６３０Ｅから６３０Ｄにかけて培養液を循環させることができる。図２０Ｂは、本実施例に係る複数のノズルを用いた培養例を示す図である。この場合、培地循環穴６３０Ｅに挿入されるノズル３３０Ａに加え、細胞凝集体４００の周囲から培地を供給するノズル３３０Ｂおよびノズル３３０Ｃが用いられる。また、図１４Ｂで示した製造システムと同様に、それぞれのノズルを任意の位置に固定することができる。図２０Ｃは、本実施例に係る複数のノズルを持ち同時に別系統の培地を供給する培養例を示す図である。図２０に示す製造システムでは、図１４Ｃで示した製造システムと同様に、別系統の循環用ポンプ３００Ａおよび３００Ｂを用いた培養が可能である。図２０Ｂおよび図２０Ｃで示したノズル３３０Ｂおよび３３０Ｃは、好ましくは、培地循環穴６３０の近傍に固定され、空間Ｓ２およびＳ３に培養液２１０を供給する。

図２１は、本実施例に係る複数のノズルを持ち同時に別系統の培地を供給する培養例を示すフローである。まず、製造装置１００Ａの投入孔６４０から細胞凝集体４００を投入する（Ｓ２００）。その後、図２０Ａないし図２０Ｃに示すように培地内で培養し（Ｓ２０２）、上部枠体６１０および下部枠体６２０を細胞構造体７００から離すように除去する。

以上、本発明の好ましい実施の形態について詳述したが、本発明は、特定の実施形態に限定されるものではなく、特許請求の範囲に記載された本発明の要旨の範囲内において、種々の変形・変更が可能である。

１００、１００Ａ：製造装置 １１０：トップ板
１１２：貫通孔 １１４：投入孔
１１６：培地循環穴 １１８：針穴
１２０：ピン １２２：雄ネジ部
１２４：雄ネジ部 １２６：リング部材
１３０：第１スライド板 １３２：貫通孔
１３４：針穴 １３５：培地循環穴
１４５：培地循環穴 １４０：第２スライド板
１４２：貫通孔 １４４：針穴
１５０：ストッパー １５２：把持部
１５４：培地循環穴 １５６：スライドガイド
１６０：ベース板 １６２：雌ネジ部
１６４：貫通孔 １７０：外周針状部材
１７２：針状部材 １８０：内周針状部材
１８２：針状部材 ２００：容器
２１０：培養液 ２２０：振動アクチュエータ
３００：循環用ポンプ ３１０：チューブ
３２０：チューブ ３３０：ノズル
４００：細胞凝集体 ５００：細胞構造体
６１０：上部枠体 ６２０：下部枠体
６３０：培地循環穴 ６４０：投入孔
６５０：第１外側針状部材 ６６０：弁成型針状部材上部
６７０：弁成型針状部材中部 ６８０：弁成型針状部材下部６８０
６９０：第２外側針状部材 ７００：細胞構造体
７１０：弁部

Claims (20)

1. 細胞構造体の製造装置であって、
   少なくとも１つの上側に配された第１の部材と、
   少なくとも１つの下側に配された第２の部材と、
   前記第１の部材と前記第２の部材との間に配置され複数の線状の部材であって、各線状の部材の一方の端部が前記第１の部材によって支持され、他方の端部が前記第２の部材によって支持される、前記複数の線状の部材とを有し、
   前記複数の線状の部材は、３次元空間の外側の形状を規定し、複数の線状の部材の間隔は、供給される細胞凝集体が漏れ出ない程度の間隔である、製造装置。
2. 細胞構造体の製造装置であって、
   少なくとも１つの上側に配された第１の部材と、
   少なくとも１つの下側に配された第２の部材と、
   前記第１の部材と前記第２の部材との間に配置され複数の線状の部材であって、各線状の部材の一方の端部が前記第１の部材によって支持され、他方の端部が前記第２の部材によって支持される、前記複数の線状の部材とを有し、
   前記複数の線状の部材は、３次元細胞構造体の外側の形状を規定し、複数の線状の部材の間隔は、供給される細胞凝集体の大きさよりも小さい、製造装置。
3. 前記複数の線状の部材は、概ね第１の面を規定する第１の線状の部材と、前記第１の面から離間された概ね第２の面を規定する第２の線状の部材とを含み、第１の面と第２の面との間によって形成された空間内に細胞凝集体を収容する、請求項１または２に記載の製造装置。
4. 前記第１の面は、前記細胞構造体の外側の形状を規定し、前記第２の面は、前記細胞構造体の内側の形状を規定する、請求項３に記載の製造装置。
5. 前記第１の面および前記第２の面は球面または曲面である、請求項３または４に記載の製造装置。
6. 前記空間内に収容された細胞凝集体は、前記複数の線状の部材を介して培地等の液体に晒される、請求項１ないし５いずれか１つに記載の製造装置。
7. 前記第１の部材は、概ね平坦な部材を含み、当該平坦な部材には、前記空間内に前記細胞凝集体を投入するための投入孔が形成される、請求項１ないし６いずれか１つに記載の製造装置。
8. 製造装置はさらに、前記第１の部材と前記第２の部材との間に前記複数の線状の部材を貫通する複数の貫通孔が形成されたスライド部材を含み、前記スライド部材は、前記第１の部材と前記第２の部材との間で移動可能である、請求項１ないし７いずれか１つに記載の製造装置。
9. 製造装置はさらに、前記第１の部材と前記第２の部材を連絡する複数の支柱を含み、前記スライド部材は、前記複数の支柱にガイドされて前記第１の部材に接近または離間する方向に移動可能である、請求項１ないし８いずれか１つに記載の製造装置。
10. 前記複数の支柱の少なくとも１つには、前記スライド部材の移動を規制する規制部材が設けられる、請求項９に記載の製造装置。
11. 前記第１および第２の線状の部材は、血管の構造を規定する、請求項３または４に記載の製造装置。
12. 前記第１および第２の線状の部材は、心臓の弁の構造を規定する、請求項３または４に記載の製造装置。
13. 前記複数の線状の部材は、３次元プリンタにより製造された部材である、請求項１ないし１２いずれか１つに記載の製造装置。
14. 前記複数の線状の部材は、半導体製造に使われるようなワイヤーボンディング方式により製造された部材である、請求項１ないし１３いずれか１つに記載の製造装置。
15. 前記複数の線状の部材は、型枠による成型により製造された部材である、請求項１ないし１４いずれか１つに記載の製造装置。
16. 請求項１ないし１５いずれか１つに記載の製造装置と、前記製造装置を収容可能であり、前記製造装置内の細胞凝集体に栄養を与える培地を収容する容器と、前記培地を循環させるポンプとを有する、細胞構造体を製造するための製造システム。
17. 前記製造システムは、前記容器を震盪させる震盪手段を含む、請求項１６に記載の製造システム。
18. 前記製造システムは、任意に特定の部位に培地を供給する手段を含む、請求項１６または１７に記載の製造システム。
19. 請求項１ないし１５いずれか１つに記載の製造装置を利用した細胞構造体の製造方法であって、
    前記空間に複数の細胞凝集体を供給するステップと、
    前記細胞凝集体を培養し、前記細胞凝集体を融合するステップと、
    前記融合さされた細胞凝集体から前記複数の線状の部材を離脱させるステップと、
    を有する製造方法。
20. 前記スライド部材を移動させることにより細胞凝集体から複数の線状の部材を離脱させる、請求項１９に記載の製造方法。
    

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