WO2021111642A1 - 管状細胞構造体の培養方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、細胞だけで作製される管状細胞構造体の品質と強度を控除させることを目的とする。 本発明に係る管状細胞構造体の培養方法の代表的な構成は、細胞を管状の細胞構造体に形成し、前記細胞構造体をバルーンにより前記細胞構造体の内腔内から径方向外側に拡張しながら培養することを特徴とする。

Description

管状細胞構造体の培養方法

　本発明は、管状細胞構造体の培養方法に関するものである。

　高齢化などに伴い、心臓バイパス手術や透析患者向けのシャントなど、血管及び管状の細胞組織の移植に対するニーズは高まるばかりである。
　従来の管状細胞構造体の培養に関するものとして、特許文献１（特許第６４３９２２３号公報）、特許文献２（米国特許第６９９１６２８号明細書）がある。
　特許文献１には、針状部材により血管形状を有する管状細胞構造体の輪郭、形状を規定して、管状細胞構造体を製造することが開示されている。この手法で径方向に厚みのある管状細胞構造体が作成されることが実証されているが、例えば血管用途に使用するためには、耐破裂強度など物理的強度を高める手法が望まれる。
　特許文献２には、血管を軸方向（Ａｘｉａｌｌｙ）に延伸することが開示されているが、その効果は不明である。

特許第６４３９２２３号公報 米国特許第６９９１６２８号明細書

　本発明は、上記特許文献１、２の技術を改良したものであり、製造される管状細胞構造体の品質及び強度を向上させることができる伸展培養手法及び伸展培養装置、品質を向上させた管状細胞構造体を提供することを目的とする。

　上記課題を解決するために本発明に係る管状細胞構造体の培養方法の代表的な構成は、細胞を管状の細胞構造体に形成し、前記細胞構造体を前記細胞構造体の内腔内から径方向外側に拡張しながら培養することを特徴とする。
　上記課題を解決するために本発明に係る伸展培養装置の代表的な構成は、内部に細胞凝集体８００を保持する管状に並べられた支持部材と、前記管状に並べられた支持部材に保持された細胞凝集体８００が融合して一つの組織となった管状細胞構造体８１０を前記細胞構造体の内腔内から径方向外側に押圧して伸展培養する拡張部材と、を有することを特徴とする。
　上記課題を解決するために本発明に係る管状細胞構造体の代表的な構成は、上記伸展培養手法で培養されたことを特徴とする。

　本発明によれば、製造される細胞構造体の品質及び強度を向上させることができる。

バルーン伸展培養の構成図である。（ａ）バルーン収縮時を示す。（ｂ）バルーン伸展時を示す。 チューブモールド全体の斜面図である。 チューブモールドの構成図である。 チューブモールドの針保持フレーム上の上面図である。内周針を保持する内周針穴、外周針を保持する外周針穴、細胞を投入する細胞投入孔を示す。 チューブモールドの針保持フレームに内周針及び外周針を差し込んだ状態を示す図である。 チューブモールドの断面簡略図である 伸展培養の手順を示す略図である。 伸展培養の手順を示すもう一つの略図である 本発明を使ったバルーン伸展培養の実際の写真である。 本発明を使ったバルーン伸展培養前後の実際の管状細胞構造体の写真である。 本発明を使ったバルーン伸展培養前後の実際の管状細胞構造体をヘマトキシリン・エオジン染色した写真である。 バルーン培養後の内腔を映した写真である。

　本実施形態の機構及び手順を、図を用いて説明する。
　バルーン伸展培養は、円径方向に伸展拡大するバルーン部、空気もしくは液体を送り込むシリンダー＆ピストン、ピストンを駆動するステッピングモーター部、ステッピングモーターを制御するコントローラー部、細胞を保持する枠体であるチューブモールド、及び培養容器などで構成される。
　図１はバルーン伸展培養に使われる器具の構成図である。
　（ａ）バルーン収縮時の状態を示している。円周方向に伸展展開可能なバルーン１００はシリンダー２００に接続され、ピストン３００の移動により液圧もしくは空気厚により伸展展開させられる。ピストン３００はコントローラー５００により制御されたステッピングモーター４００により往復移動する。
（ｂ）バルーン伸展時の状態を示す。コントローラー５００の制御によりステッピングモーター４００が駆動し、ピストンが移動し内部の液圧もしくは空気圧によりバルーン１００が円周方向に伸展展開し円周が拡大する。
　図２はチューブモールド６００の全体を示す斜面図である。
　図３に構成図が示されるように、チューブモールド６００は組み立てられる。フレーム保持柱６８０はベース６９０にねじ込まれて固定する。
　針保持柔軟支持材６５０例えば布、フエルト、不織布などのような柔軟性を持つ素材でできた部材であり、内周針、外周針を容易に貫通させることができる。
　図４に示されるように針保持フレーム上６３０及び針保持フレーム下６４０には内周針６６０及び外周針６７０を差し込むための内周針孔６６５及び外周針穴６７５があけられている。
　図５に示されるように針保持柔軟支持材６５０の２枚は　針保持フレーム上６３０及び針保持フレーム下６４０に挟まれる形で配置され、内周針６６０は内周針穴６６５に、外周針６７０は外周針穴６７５に挿入される。この作業により内周針６６０及び外周針６７０は所望の内径及び外径を持った円形状に配置される。
　図６はチューブモールド６００の断面簡略図である。図５で示された配置で組み立てられたチューブモールド６００は、針保持柔軟支持材６５０の間隔を所望の距離に広げることで、細胞投入空間６８０を形成する。
　図７は伸展培養の手順を示す略図である。まず（ａ）に示されるように細胞投入孔６２０から注射針などを用いて、細胞投入空間７００に細胞凝集体を投入する。（ｂ）に示されるように１~４週間程度の培養により細胞８００が融合し、管状構造体８１０が細胞投入空間７００内に形成される。実際のヒト皮膚由来線維芽細胞で作製したものが管状構造体８１１である。
　その後（ｃ）に示されるようにバルーン１００をバルーン用穴６１０からバルーンが内腔内に挿入される。バルーン収縮時１０１及びバルーン展開時１１１は実際のバルーンの写真である。
　（ｄ）に示されるように、バルーンが展開すると内腔内側から内周針６６０、管状構造体及び外周針を円周外側に向けて伸展される。
　図８はバルーン１００及びバルーン展開時１１０と内周針６６０及び外周針６７０の位置関係を示す略図である。内周針６６０及び外周針６７０は針保持柔軟支持材６５０により保持されているので、円形の位置関係を保ったまま、円周外側に伸展される。さらに、バルーンが収縮すると針保持柔軟支持材６５０の柔軟性により元の直径に復元される。
　バルーンはより効果的に伸展培養を行うために、軸方向に移動しながら伸展を行ってもよいし、回転させながら展開させることもよい。
　図９は実際に本手法を用いて行われた伸展培養時の写真である。針保持柔軟支持材６５０に挟まれた部位は外周針の外側にまで管状構造体８１０が融合しているところが見える。
　図１０が実際に本手法を用いて作成された管状構造体８１０の写真である。（ａ）はバルーン伸展培養をする直前の写真である。均一であるが厚みのある形状を示している。（ｂ）はバルーン伸展培養を行った後の写真である。厚みが薄くより本来の血管のような形状を示し、引張強度も増加している。
　図１１は実際に本手法を用いて作成された管状構造体８１０をヘマトキシリン・エオジン染色を行った写真である。点一つが細胞の核を表す。（ａ）のバルーン伸展培養前では細胞の分布が少ない部位があるが、（ｂ）では全体にわたって細胞が密に存在し融合している。
　図１２はバルーン培養終了直後にバルーンを抜去し、内腔を撮影したものである。バルーンは伸展時に表面が平滑であるが、その平滑さが内腔内に転写されている。平滑でなく何らかの模様を表面に作製したい場合には、バルーン表面にその凹凸を設けることで内腔内への転写が可能となる。
本実施形態による管状細胞構造体培養は単純に細胞を融合させただけでは得られない、薄くより実際の血管などに近い形状を持ち、より強度のある管状細胞構造体を作製することを可能とする。

１００　バルーン収縮時
１０１　バルーン収縮時の写真
１１０　バルーン展開時
１１１　バルーン展開時の写真
２００　シリンダー（バルーンに接続され、空気圧もしくは液圧で伸展させる）
２１０　シリンダー（（バルーン展開時）
３００　ピストン　（ステッピングモーターで駆動され、空気圧もしくは液圧を発生させる）
３１０　ピストン（バルーン展開時）
４００　ステッピングモーター（コントローラーにより駆動されピストンを移動する）
５００　コントローラー　（プログラムに従いステッピングモーターを駆動する）
６００　チューブモールド　斜面図
６１０　バルーン用穴（針保持フレーム上に設けられたバルーンを挿入する穴）
６２０　細胞投入孔（針保持フレーム上に設けられた細胞を投入する穴）
６３０　針保持フレーム上（内周針穴及び外周針穴を持ち、内外周針の位置を規定する）
６４０　針保持フレーム下（内周針穴及び外周針穴を持ち、内外周針の位置を規定する）
６５０　針保持柔軟支持材（針保持フレーム上下に挟まれて位置し、バルーン伸展培養時に内外周針の位置関係を維持する。バルーン収縮時には元の位置に戻る）
６６０　内周針（管状細胞構造体の内腔を規定する）
６６５　内周針　展開時　（バルーン伸展時の内周針）
６７０　外周針（管状細胞構造体の外径を規定する）
６７５　外周針　展開時　（バルーン伸展時の外周針）
６８０　フレーム保持柱　（培養時に針保持フレーム上下を保持する）
６９０　ベース（培養時にフレーム保持柱を固定する
７００　細胞投入空間（内外周針及び針保持柔軟支持材に囲まれた細胞を投入する空間）
８００　細胞（凝集性を持つ細胞。ヒト線維芽細胞、マウス線維芽細胞、ヒト間葉系幹細胞、ヒトｉＰＳ心筋細胞、などで融合が確認されている）
８１０　管状細胞構造体（細胞投入空間に投入された細胞が融合して作製される）
８１１　管状細胞構造体の実例（ヒト線維芽細胞）

Claims (23)

1. 　細胞構造体の培養方法であって、
   　細胞構造体の内部空間に拡張部材を挿入し、前記拡張部材により前記内部空間を拡張させて前記細胞構造体を培養する、培養方法。
2. 　前記細胞構造体は管状であり、前記拡張部材を径方向に拡張させる、請求項１の培養方法。
3. 　前記細胞構造体は、少なくとも前記内部空間に接続された端部を含み、前記拡張部材は、前記端部から内部空間内に挿入される、請求項１乃至２のいずれか一項に記載の培養方法。
4. 　前記拡張部材は、内部に充填される流体によって拡張可能である、請求項１乃至３のいずれか一項に記載の培養方法。
5. 　前記拡張部材に充填する流体の流量を調整することで前記拡張部材の拡張する範囲を規定する、請求項１乃至４のいずれか一項に記載の培養方法。
6. 　前記拡張部材は、バルーン部材である、請求項１乃至５のいずれか一項に記載の培養方法。
7. 　前記拡張部材の表面が平滑である請求項１乃至６のいずれか一項に記載の伸展培養手法。
8. 　前記拡張部材の表面が所定の凹凸を持つ請求項１乃至７のいずれか一項に記載の伸展培養手法。
9. 　前記拡張は、所定の間隔で断続的に行う請求項１乃至８のいずれか一項に記載の伸展培養手法。
10. 　内部空間が形成された細胞凝集体を保持する保持部材と、
    　前記保持部材に保持された細胞凝集体の内部空間内に配置される拡張部材と、
    　前記内部空間が拡張されるように前記拡張部材を駆動する駆動手段と、
    　を有する培養装置。
11. 　前記駆動手段は、前記拡張部材に流体を充填させることで前記拡張部材を拡張させる、請求項１０に記載の培養装置。
12. 　前記駆動手段は、前記拡張部材に充填される流体の流量を制御する、請求項１０乃至１１のいずれか一項に記載の培養装置。
13. 　前記拡張部材は、所定の時間的間隔で断続的に拡張可能である請求項１０乃至１２のいずれか一項に記載の伸展培養装置。
14. 　前記保持部材は、前記細胞構造体の径方向外側に設けられた複数の線状部材を有する請求項１０乃至１３のいずれか一項に記載の伸展培養装置。
15. 　前記保持部材は、前記細胞構造体の径方向内側に設けられた複数の線状部材を有する請求項１０乃至１４のいずれか一項に記載の伸展培養装置。
16. 　前記保持部材は、前記線状部材を保持する伸縮性に富んだ材質の保持部材を有する請求項１０乃至１５のいずれか一項に記載の伸展培養装置。
17. 　前記拡張部材は、膨張、収縮を繰り返し可能なバルーン部材である請求項１０乃至１６のいずれか一項に記載の伸展培養装置。
18. 　膨張した状態の前記拡張部材の表面が平滑である請求項１０乃至１７のいずれか一項に記載の伸展培養装置。
19. 　膨張した状態の前記拡張部材の表面が所定の凹凸を持つ請求項１０乃至１８のいずれか一項に記載の伸展培養装置。
20. 　前記拡張部材を長手方向前後に移動させる請求項１０乃至１９のいずれか一項に記載の伸展培養装置。
21. 　前記拡張部材を回転に移動させる請求項１０乃至２０のいずれか一項に記載の伸展培養装置。
22. 　請求項１乃至９のいずれか１項に記載の伸展培養手法で培養された管状の細胞構造体。
23. 　請求項１乃至９のいずれか１項に記載の伸展培養手法で培養された細胞由来血管

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