JP6431671B2 - 発作および虚血療法としてのドデカフルオロペンタンエマルション - Google Patents

Description

政府の権利
本発明は、国立衛生研究所により認められた政府援助ＨＬ０８２４８１によりなされた。政府はこの発明に対して特定の権利を有する。

本発明は、虚血性事象を経験している、または虚血性事象の危険性のある対象において、組織損傷を低減する方法および組み合わせを提供する。

血液損失、虚血、または低酸素症を伴う状況は、罹患および死亡を引き起こす臓器および組織の損傷を日常的にもたらしている。これらの状況には、一般的な外科的および介入的な手法、ならびに外傷および自然疾患状態が含まれる。これらの症状は、体中および四肢に広範囲に分布される虚血性症候群として、ならびに脳に発作として現れる。加えて、手術および血管造影法を含む臨床手法は、微小塞栓を生じる可能性があり、無症候性または無症性脳虚血、ならびに臨床性発作をもたらす。神経保護化合物、高圧酸素、ヘモグロビンに基づいた代用血液、他の手法、および液体ペルフルオロカーボンに基づいた酸素運搬体は、有望であることを示したが、これらの状況を補うことにおおむね失敗している。迅速な血管再生および酸素化血流の回復が、現時点では依然として臨床発作療法の主な焦点のままである。

したがって、有意な量の酸素および他の電子豊富呼吸ガスを、そうでなければ虚血症状において酸素化されない微小循環および組織の最小領域にも物理的に溶解、輸送、および送達する能力を有する別の酸素輸送物質の必要性が存在する。

本発明の１つの態様は、虚血性事象によりもたらされる虚血を経験している対象の組織における梗塞体積を低減する方法を包含する。方法は、ペルフルオロカーボンエマルションを含む組成物の有効量を対象に投与することを含み、ここで梗塞体積は虚血性事象を解決することなく低減される。

本発明の別の態様は、虚血性組織損傷の危険性のある対象において、組織酸素化を改善する方法を包含する。方法は、対象に虚血性組織損傷の高い危険性をもたらす医学的手法の前に、ペルフルオロカーボンエマルションを含む組成物の有効量を対象に投与することを含む。

本発明のなお別の態様は、虚血性組織損傷の危険性のある対象において神経保護を改善する方法を包含する。方法は、対象に虚血性神経組織損傷の高い危険性をもたらす医学的手法の前に、ペルフルオロカーボンエマルションを含む組成物の有効量を対象に投与することを含む。

本発明の更に別の態様は、出血性発作を治療する方法を包含する。方法は、ペルフルオロカーボンエマルションを含む組成物の有効量を、出血性発作の治療の必要な対象に投与することを含む。

本発明の更なる態様は、頭蓋内脳出血によりもたらされる梗塞の大きさを減少する方法を包含する。方法は、ペルフルオロカーボンエマルションを含む組成物の有効量を、頭蓋内脳出血の治療の必要な対象に投与することを含む。

本発明の代替的な態様は、組み合わせを包含する。組み合わせは、ペルフルオロカーボンエマルションと血栓溶解剤とを含む組成物を含む。

本発明の他の態様および繰り返しが下記に詳述される。
注、下記の図面の簡単な説明において、図１２では、各時点での対照は以下であった。

酸素吸収の測定に使用される設定の画像を示す。左側のバイアルは、ＰＦＣエマルションの１つを含有し、右側のバイアルは、ブランク製剤を含有する。 ３７℃での注入による体積膨張の測定に使用される設定を示す。 ２３℃±２℃で６か月間のＤＤＦＰｅの粒径分布を図示する。エラーバーは、三重測定の１つの標準偏差を表す。中空菱形は、その時点での２％未満の粒子分布の測定値を表す。 ６０分間にわたる２１℃（青色）および３７℃（赤色）でのＤＤＦＰｅ（三角形）、ＰＦＤｅ（菱形）、ＰＦＯＢｅ（四角形）、およびブランク製剤（中空円形）の５ｍＬの注入により吸収された酸素の量を図示する。 ３つのＰＦＣエマルション、ブランク製剤、および水の５ｍＬの注入を３７℃に加熱することによる体積増加を図示する。 ウサギの血管造影法の画像を示す。内頸動脈の部分選択拡大血管造影図は、（Ａ）ウィリス動脈輪、ＭＣＡおよびＡＣＡ（それぞれ、矢印および矢じり）、ならびに（Ｂ）３つの塞栓性球体の注入後のＭＣＡおよびＡＣＡの閉塞を示す。 ＭＣＡおよびＡＣＡ塞栓形成後の脳梗塞を図示する。２，３，５−トリフェニルテトラゾリウムクロリド（ＴＴＣ）で染色されたウサギ脳の２つの連続切片は、淡色領域の梗塞（矢印）を明示する。尺度目盛りはミリメートルを表す。 ＤＤＦＰｅ治療時間に対する４時間での梗塞体積を図示する。前処置、超急性、および急性療法の様々な臨床シナリオのモデルを設計するための治療時間の分類は、対照と比較して改善された結果を示す。ＤＤＦＰｅを前処置（塞栓形成の３０分前）、超急性治療（０〜３０分）、または急性治療（１〜３時間）として使用するかに関わらず、発作量は有意に低減される。^＊Ｐ≦０．０２１、順位のＤｕｎｎｅｔｔ調整比較。 血管造影解剖学（Ａ）、中大脳動脈および前大脳動脈の塞栓形成（Ｂ）、ならびにウサギの脳の断面における出血を伴う梗塞（Ｃ）の画像を示す。 ＤＤＦＰｅ治療を受けている虚血性発作ウサギモデルにおける発作量を示す。ＤＤＦＰｅは、永久動脈閉塞の６０分後に与えられても、発作を低減する。（横線：中央値、中実四角：平均、縦線：最大値および最小値、長方形：２５および７５パーセンタイル値）。 塞栓形成の３時間後までＤＤＦＰｅ治療を受けた虚血性発作ウサギモデルにおける発作量を示す。 塞栓形成の６時間後までＤＤＦＰｅ治療を受けた虚血性発作ウサギモデルにおける発作量を示す。 塞栓形成の０〜３０分後（超急性）および塞栓形成の１〜３時間後（急性）にＤＤＦＰｅ治療を受けた虚血性発作ウサギモデルにおける発作量を示す。

本発明は、虚血性事象によりもたらされる組織損傷を対象において低減するのに使用できる方法および組み合わせを記載する。本方法は、酸素輸送物質を含む組成物または組み合わせを対象に投与することを含む。好ましい実施形態において、酸素輸送物質は、ペルフルオロカーボンエマルションを含む組成物である。加えて、本方法および組み合わせは、虚血を経験している対象、または医学的手法に起因する虚血の危険性がある対象において梗塞体積を低減すること、および神経保護を提供することに有効である。本発明の方法は、出血性発作または頭蓋内出血による組織損傷を低減することも包含する。有利には、本方法および組み合わせは、虚血性事象の危険性が高い対象を前処置するのに有効である。

Ｉ．本発明の方法
（ａ）梗塞体積を低減する方法
１つの実施形態において、本発明は、虚血性事象によりもたらされる虚血を経験している対象の組織において、梗塞体積を低減する方法を包含する。本方法は、酸素輸送物質を含む組成物の有効量を対象に投与することを含み、ここで梗塞体積は虚血性事象を解決することなく低減される。好ましい実施形態において、酸素輸送物質は、ペルフルオロカーボンエマルションを含む組成物である。

一般的に言えば、酸素輸送物質を、虚血性事象が解決される前に対象に投与することができる。別の方法で記述すると、酸素輸送物質を、正常な血流、血圧、または組織の酸素化レベルが回復していなくても、梗塞体積を低減するために投与することができる。

ｉ．虚血
本明細書で使用されるとき、用語「虚血」は、一般に血管の要因に起因する血液供給の制限、その結果としての不適切な酸素化に起因する組織の損傷または機能不全を意味することができる。虚血は、「虚血性事象」により引き起こされることがある。一般的に言えば、「虚血性事象」は、閉塞血管、低血圧症、または低酸素症により引き起こされることがある。虚血性事象の非限定例には、鎌状赤血球貧血およびモヤモヤ病のような疾患、または腸軸捻転もしくはヘルニアのような閉塞血管もしくは出血、腫瘍、心室性頻拍のような動脈の機械的圧迫、心臓発作および先天性心臓欠損によりもたらされる超低血圧、心肺停止、出血、一酸化中毒、外傷もしくはアテローム性動脈硬化症もしくは血管炎による動脈の損傷、もしくはコカイン血管収縮のような動脈の血管収縮、心臓手術もしくは他の外科的介入、冠動脈および頸動脈介入などの医原性虚血症状、羊水塞栓症、一過性凝塊、もしくは気泡（気体性塞栓）のような塞栓症（循環中の異物）、炎症および低灌流の症状、アクロバットおよび軍事飛行のような、血流を制限し、血流を体の四肢に押しやる誘起重力、凍傷もしくは不適切な冷圧療法のような局在性超低温、止血帯の使用、低酸素症、低血糖症（正常なグルコースレベルよりも低い）、動脈塞栓、血栓、もしくは動脈硬化性プラーク、および発作のような動脈および他の閉塞をもたらしうる循環系における異常が含まれる。これらの症例の大部分において、疾患または異常は、体の部位への血液供給の停止を引き起こしうる血餅の形成もしくは血餅の形成の危険性の増加、または出血により虚血を引き起こしうる。幾つかの実施形態において、虚血は発作に起因しうる。

虚血は、任意の臓器、組織、または体の部位において起こりうる。例えば、腸間膜虚血は、小腸への不十分な血液供給によりもたらされることがあり、虚血性大腸炎は、大腸への不十分な血液供給によりもたらされることがあり、脳虚血は、閉塞血管または出血性発作を引き起こす出血に起因する脳への不十分な血液供給によりもたらされることがあり、心筋虚血は、心臓への不十分な血液供給によりもたらされることがあり、冠動脈虚血は、冠動脈への不十分な血液供給によりもたらされることがあり、腎虚血は、腎臓虚血とも呼ばれ、一方または両方の腎臓またはネフロンのへ不十分な血液供給によりもたらされることがあり、肢虚血は、肢へ不十分な血液供給によりもたらされることがあり、前部虚血性視神経症（ＡＩＯＮ）は、視神経への不十分な血液供給によりもたらされることがある。

特定の実施形態において、虚血は医学的手法に起因しうる。例えば、幾つかの実施形態において、虚血は、血管閉塞の危険性を増加する医学的手法（例えば、塞栓または微小塞栓を生じる医学的手法）に起因しうる。血管閉塞の危険性を増加しうる医学的手法の非限定例には、虚血および整体調整をもたらす出血または血餅の形成を引き起こしうる大または小手術法が含まれうる。虚血を引き起こしうる医学的手法の他の例には、心臓切開法、冠動脈バイパス移植術、心肺バイパス術、頸動脈手術、心臓手術、血管形成術、ステント挿入、装置移植、切除、および心臓弁膜手術のような心臓手術が含まれる。虚血を引き起こしうる医学的手法のなお他の例には、「開腹手術」、ならびに整形外科手術、骨格手術、および股関節部骨折固定手術が含まれる。

ｉｉ．梗塞
幾つかの実施形態において、本発明は、組織中の梗塞体積を低減する方法を提供する。好ましい実施形態において、本発明の方法は、脳出血の発生率を増加することなく組織における梗塞体積の低減を提供する。本明細書で使用されるとき、用語「梗塞」は、上記のセクションＩ（ａ）ｉに記載されている虚血により引き起こされる組織の損傷または死滅によって引き起こされる病変を意味することができる。梗塞体積を測定する方法は、当該技術において知られている。例えば、梗塞体積は、生存または死亡細胞染色を使用して組織または臓器を染色し、続いて組織または臓器の近接した区分の梗塞領域を測定することにより、組織または臓器において死後測定することができる。あるいは、梗塞体積は、Ｘ線、コンピューター断層撮影法、磁気共鳴画像化、または他のインビボ画像化技術を使用して、生きている対象において測定することができる。梗塞体積は、体積単位で表すことができる、またはそれが存在する組織または臓器の率として表すことができる。

幾つかの実施形態において、梗塞体積は、酸素輸送物質が同等の虚血性事象の際に投与されないときの梗塞体積と比較して、約１００％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、または１０％減少されうる。例えば、梗塞体積は、酸素輸送物質が同等の虚血性事象の際に投与されないときの梗塞体積と比較して、約１００、９９、９８、９７、９６、９５、９４、９３、９２、９１、９０、８９、８８、８７、８６、８５、８４、８３、８２、８１、８０、７９、７８、７７、７６、７５、７４、７３、７２、７１、７０、６９、６８、６７、６６、６５、６４、６３、６２、６１、６、５９、５８、５７、５６、５５、５４、５３、５２、５１、５０、４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、または１０％減少されうる。例示的な実施形態において、梗塞体積は、酸素輸送物質が同等の虚血性事象の際に投与されないときの梗塞体積と比較して、約７０〜約９０％減少されうる。

特定の実施形態において、梗塞体積は、酸素輸送物質が投与されないときの約３．２％以上の梗塞体積と比較して、開示されている酸素輸送物質が投与されたとき、組織の約０、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、または約３．１％に減少されうる。他の実施形態において、梗塞体積は、酸素輸送物質が投与されないときの約３．２％以上の梗塞体積と比較して、開示されている酸素輸送物質が投与されたとき、組織の約０、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、または約０．６％に減少されうる。なお他の実施形態において、梗塞体積は、酸素輸送物質が投与されないときの約３．２％以上の梗塞体積と比較して、開示されている酸素輸送物質が投与されたとき、組織の約０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、または約１．１％に減少されうる。追加的な実施形態において、梗塞体積は、酸素輸送物質が投与されないときの約３．２％以上の梗塞体積と比較して、開示されている酸素輸送物質が投与されたとき、組織の約１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、または約１．６％に減少されうる。他の実施形態において、梗塞体積は、酸素輸送物質が投与されないときの約３．２％以上の梗塞体積と比較して、開示されている酸素輸送物質が投与されたとき、組織の約１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、または約２．１％に減少されうる。更に他の実施形態において、梗塞体積は、酸素輸送物質が投与されないときの約３．２％以上の梗塞体積と比較して、開示されている酸素輸送物質が投与されたとき、組織の約２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、または約２．６％に減少されうる。追加的な実施形態において、梗塞体積は、酸素輸送物質が投与されないときの約３．２％以上の梗塞体積と比較して、開示されている酸素輸送物質が投与されたとき、組織の約２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、または約３．１％に減少されうる。なお他の実施形態において、梗塞体積は、酸素輸送物質が投与されないときの約３．２％以上の梗塞体積と比較して、開示されている酸素輸送物質が投与されたとき、組織の約０、０．５、１、１．５、２、２．５、３．０、または約３．１％に減少されうる。

（ｂ）医学的手法の前に酸素化を改善する、または神経保護を提供する方法
本発明の別の実施形態は、虚血性組織損傷の危険性のある対象において、組織酸素化を改善する方法を包含する。本方法は、対象に虚血性組織損傷の高い危険性をもたらす医学的手法の前に、酸素輸送物質を含む組成物の有効量を対象に投与することを含む。好ましい実施態様において、酸素輸送物質は、ペルフルオロカーボンエマルションを含む組成物である。虚血性組織損傷の危険性をもたらしうる医学的手法の非限定例は、上記のセクションＩ（ａ）ｉに詳述されている。

本発明のなお別の実施形態は、虚血性組織損傷の危険性のある対象において神経保護を改善する方法を包含する。本方法は、対象に虚血性神経組織損傷の高い危険性をもたらす医学的手法の前に、酸素輸送物質を含む組成物の有効量を対象に投与することを含む。好ましい実施態様において、酸素輸送物質は、ペルフルオロカーボンエマルションを含む組成物である。本明細書で使用されるとき、用語「神経保護」は、対象の神経系の組織損傷を低減することを意味する。神経系は、中枢神経系および末梢神経系の両方を包含する。

（ｃ）出血性の状態を治療する方法
本発明の更に別の実施形態は、出血性発作を治療する方法を包含する。本方法は、酸素輸送物質を含む組成物の有効量を、出血性発作の治療の必要な対象に投与することを含む。好ましい実施形態において、酸素輸送物質は、ペルフルオロカーボンエマルションを含む組成物である。

本発明の更なる態様は、頭蓋内脳出血によりもたらされる梗塞の大きさを減少する方法を包含する。本方法は、酸素輸送物質を含む組成物の有効量を、頭蓋内脳出血の治療の必要な対象に投与することを含む。好ましい実施態様において、酸素輸送物質は、ペルフルオロカーボンエマルションを含む組成物である。

（ｄ）対象
本開示の方法は、酸素輸送物質を対象に投与することを含む。酸素輸送物質を必要とする対象の非限定例は、齧歯類、ヒト、家畜動物、愛玩動物、実験動物、または動物園の動物でありうる。１つの実施形態において、酸素輸送物質を必要とする対象は実験動物でありうる。実験動物の非限定例には、ウサギ、マウス、モルモット、ハムスター、またはラットが含まれる。別の実施形態において、酸素輸送物質を必要とする対象は、齧歯類、例えば、マウス、ラット、モルモットなどでありうる。なお別の実施形態において、酸素輸送物質を必要とする対象は家畜動物でありうる。適切な家畜動物の非限定例には、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ラマ、およびアルパカが含まれうる。別の実施形態において、酸素輸送物質を必要とする対象は愛玩動物でありうる。愛玩動物の非限定例には、イヌ、ネコ、ウサギ、およびトリなどのペットが含まれうる。更になお別の実施形態において、酸素輸送物質を必要とする対象は動物園の動物でありうる。本明細書で使用されるとき、「動物園の動物」は、動物園において見出されうる動物を意味する。そのような動物には、非ヒト霊長類、大型のネコ科、オオカミ、およびクマが含まれうる。例示的な実施形態において、酸素輸送物質を必要とする対象はヒトでありうる。

幾つかの実施形態において、対象は虚血を経験していることがある。特定の実施形態において、対象は、閉塞血管、低酸素症、または低血圧症により引き起こされる虚血を経験していることがある。例示的な実施形態において、対象は、発作に起因する虚血を経験していることがある。

他の実施形態において、対象は、虚血性事象を発生する高い危険性がありうる。対象には制御可能または制御不能な危険因子の結果として虚血性事象の高い危険性がありうることを、当業者は理解する。制御可能な危険因子の非限定例には、高血圧症、心房細動、高コレステロール、糖尿病、アテローム性動脈硬化症、循環の問題、タバコの使用および喫煙、アルコールの使用、肉体的不活発、および肥満が含まれうる。制御可能な危険因子の非限定例には、年齢、性別、人種、家族歴、以前の発作またはＴＩＡ、線維筋性異形成症、および卵円孔開存（ＰＦＯまたは心臓に開いた孔）が含まれうる。

なお他の実施形態において、対象は、虚血性事象の危険性を増加する医学的手法を経験していることがある。血管閉塞の危険性を増加しうる医学的手法の非限定例には、虚血および整体調整をもたらす出血または血餅の形成を引き起こしうる大もしくは小手術、またはカテーテルに基づいた手法もしくは介入が含まれうる。

他の実施形態において、対象は、出血性発作の治療が必要でありうる。

（ｅ）好ましい実施形態
幾つかの実施形態において、本発明は、閉塞血管により引き起こされる虚血を経験している対象の組織における梗塞体積を低減する方法であって、本方法は、有効量のドデカフルオロペンタンエマルションを対象に投与することを含み、ドデカフルオロペンタンエマルションは、梗塞体積が閉塞を解決することなく低減されるように、組織の酸素化を改善する。

他の実施形態において、本発明は、血管閉塞の危険性を増加する医学的手法の際に血管閉塞を低減する方法であって、医学的手法が実施される前に、有効量のドデカフルオロペンタンエマルションを対象に投与することを含む。

なお他の実施形態において、本発明は、閉塞血管を発生する高い危険性がある対象の組織における梗塞体積を低減する方法であって、閉塞血管の症状が発症する前に、有効量のドデカフルオロペンタンエマルションを対象に投与することを含む。

上記の実施形態のそれぞれにおいて、本方法は、閉塞を解決することを更に含むことができる。

他の実施形態において、本発明は、出血性発作を治療する方法であって、有効量のドデカフルオロペンタンエマルションを、出血性発作の治療の必要な対象に投与することを含む。

好ましい実施形態において、対象は、齧歯類、研究動物、愛玩動物、農業用動物、およびヒトから選択される。

他の好ましい実施形態において、ドデカフルオロペンタンエマルションは、閉塞血管の症状の発症の直後から閉塞血管の症状の発症の２４時間後までの範囲の時間で投与される。

なお他の好ましい実施形態において、ドデカフルオロペンタンエマルションは、対象に静脈内投与される。

他の好ましい実施形態では、ドデカフルオロペンタンエマルションの約１％〜約５％ｗ／ｖの溶液が、対象の１キログラムあたり約０．２ｍＬ〜約１ｍＬの量で対象に投与される。

なお他の好ましい実施形態では、ドデカフルオロペンタンエマルションの約２％ｗ／ｖの溶液が、対象の１キログラムあたり約０．０１ｍＬ〜１キログラムあたり約１ｍｌの量で対象に投与される。

他の好ましい実施形態において、ドデカフルオロペンタンエマルションは、梗塞体積が脳出血の発生率を増加することなく減少されるように、組織の酸素化を改善する。

なお他の好ましい実施形態において、ドデカフルオロペンタンエマルションは、抗凝血薬と組み合わせて投与される。

他の実施形態において、ドデカフルオロペンタンエマルションは、組織プラスミノーゲンアクチベーター、アンチストレプターゼ、ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される血栓溶解薬と組み合わせて投与される。

なお他の実施形態において、ドデカフルオロペンタンエマルションは、心臓手術、開腹手術、整形外科手術、および骨格手術、血管形成術、ステント挿入、装置移植、および切除、ならびにこれらの組み合わせからなる群より選択される外科的技術と組み合わせて投与される。

追加的な好ましい実施形態において、対象は、発作に起因する虚血を経験している。

ＩＩ．組成物
本開示の方法は、酸素輸送物質を対象に投与することを含む。幾つかの実施形態において、酸素輸送物質は、血液、血液製剤、または合成的に生成された酸素輸送物質でありうる。好ましい実施形態において、酸素輸送物質は、合成的に生成された酸素輸送物質でありうる。合成的に生成された酸素輸送物質は、当該技術において知られており、ヘモグロビンに基づいた酸素運搬体およびペルフルオロ化合物が含まれうる。幾つかの実施形態において、合成的に生成された酸素輸送物質は、ヘモグロビンに基づいた酸素運搬体でありうる。ヘモグロビンに基づいた酸素運搬体の非限定例は、ヘモグロビン、重合ヘモグロビン、複合ヘモグロビン、架橋ヘモグロビン、リン脂質被包ヘモグロビン、組み換えヘモグロビン、スーパーオキシドジムスターゼおよびカタラーゼとの複合型のヘモグロビンに基づいた酸素運搬体、ならびにヘモグロビン誘導体でありうる。好ましい実施形態において、合成的に生成された酸素輸送物質は、ペルフルオロ化合物（ＰＦＣ）でありうる。ＰＦＣは、酸素に溶解する液体ペルフルオロ化合物でありうる。酸素に溶解し、酸素輸送物質として使用することができる液体ＰＦＣの非限定例には、ペルフルオロオクチルブロミド、ペルフルオロオクチルジブロミド、ブロモフルオロカーボン、ペルフルオロエーテル、Ｆｌｕｏｓｏｌ ＤＡ（商標）、Ｆ−４４Ｅ、１，２−ビスペルフルオロブチル−エチレン、Ｆ−４−メチルオクタヒドロキノリジジン、９〜１２個の炭素のペルフルオロアミン、ペルフルオロデカリン、ペルフルオロインダン、ペルフルオロトリメチルビシクロ［３，３，１］オナン、ペルフルオロメチルアダマント、およびペルフルオロジメチルアダマンタンが含まれる。

ＰＦＣは、また、酸素を対象の体内に送達するのに使用されるガスでありうる。特に有用なものは、微小気泡に処方されるＰＦＣガスである。ＰＦＣを含む微小気泡は当該技術において知られており、例えば、米国特許第５，３９３，５２４号、同第５，４０９，６８８号、同第５，５５８，８５４号、同第５，５５８，８５５号、同第５，５９５，７２３号、および同第５，５５８，８５３号に開示されており、これらは全て参照として本明細書に組み込まれる。微小気泡に処方されうるＰＦＣガスの非限定例には、ドデカフルオロペンタン（ＤＤＦＰｅ）、六フッ化硫黄、ペンタン、ヘキサフルオロプロピレン、オクタフルオロプロパン、ヘキサフルオロエタン、オクタフルオロ−２−ブチン、ヘキサフルオロブタ−１，３−ジエン、イソプレン、オクタフルオロシクロブタン、デカフルオロブタン、シス−２−ペンテン、ジメチルスルフィド、エチルアルシン、ブロモクロロフルオロメタン、トランス−２−ペンテン、２−クロロプロパン、ヘキサフルオロジスルフィド、エチルメルカプタン、ジエチルエーテル、エチルビニルエーテル、バリレン、トリスフルオロアルシン、フルフリルブロミド、シス−プロペニルクロリド、ビチルフルオリド（ｂｙｔｙｌ ｆｌｕｏｒｉｄｅ）、１，１−ジクロロエタン、イソプロピルメチルエーテル、イソプロピルアミン、ギ酸メチル、２−アセチル−フラン、フッ化エチレン、１−ペンテン、イソプロピルアセチレン、ペルフルオロペンタン、イソペンタン、ビニルエーテル、２−ブチン、１，４−ペンタジエン、テトラメチルシラン、ジメチルホスフィン、ジブロモジフルオロメタン、２−クロロ−プロペン、ジフルオロヨードメタン、アセトアルデヒド、ホウ酸トリメチル、３−メチル−２−ブテン、１，１−ジメチルシクロプロパン、アミノエタン、臭化ビニル、ジシラノメタン、トリクロロフルオロメタン、ブロモフルオロメタン、トリフルオロジクロロエタン、ペルフルオロペンテン、および他のフッ素含有炭化水素が含まれる。好ましい実施形態において、酸素輸送物質は、ＰＦＣドデカフルオロペンタン（ＤＤＦＰｅ）を含む微小気泡でありうる。

酸素療法として有用な好ましいフルオロカーボンは、およそ室温から、およそまたはほぼ生理的温度までの沸点を有する。１つの実施形態において、フルオロカーボンは、約１００℃未満の沸点を有する。好ましいフルオロカーボンは、ペルフルオロペンタンであり、ペルフルオロイソペンタンが特に好ましい。他の材料には、ｎ−ペルフルオロペンタン、ペルフルオロプロパン（沸点−３６．７℃）、ペルフルオロブタン（沸点＝−１．７℃）、ペルフルオロシクロヘキサン（沸点５９〜６０℃）、ペルフルオロメチルシクロペンタン（沸点４８℃）、ｎ−ペルフルオロヘキサン（沸点５８〜６０℃）、ペルフルオロシクロペンタン（沸点４５℃）、およびペルフルオロトリエチルアミン（沸点６８〜６９℃）が含まれる。

例えば、下記の表Ａは、幾つかのＰＦＣの沸点を列挙する。
表Ａ

血液中に酸素を輸送することができる、ＰＦＣを含む微小気泡は、赤血球よりも小さく、部分的に妨げられている血管の中を通って大量の酸素を酸素欠乏組織または臓器に送達することができる。ＰＦＣを含む微小気泡を処方する方法は当該技術において知られており、例えば、米国特許第５，３９３，５２４号および同第５，５５８，８５３号に開示されており、これらは全て参照として本明細書に組み込まれる。実質的に、ＰＦＣガスを含む微小気泡は、液体ＰＦＣ液滴のエマルションが冷却環境下で調製され、次に個体の体内に注入または注射されたとき、液滴が、ＰＦＣガスを含む気化ガス微小気泡になる、位相シフト技術により調製される。

（ａ）エマルション
本明細書で使用されるとき、用語「エマルション」は、１つの不混和性液体が別の液体に液滴の形態で分散されているコロイド分散体を意味し、この直径は、一般におよそ１００ｎｍを超え、典型的には、分散および連続相の屈折率が適合されていない限り、光学的に不透明である。一般に、本発明のエマルションは、分散ＰＦＣ液滴および両親媒性材料を連続相に含む。

本発明のコロイド分散体の連続相は、水性媒質でありうる。本明細書で使用されるとき、用語「水性媒質」は、酸化剤、アルカリ化剤、抗菌性防腐剤、酸化防止剤、緩衝剤、キレート剤、錯化剤、可溶化剤、保湿剤、溶媒、懸濁および／または粘度増加剤、等張化剤、湿潤剤、または他の生体適合性材料のような薬学的に許容される添加剤を含有しうる水含有液体を意味することができる。両親媒性材料は、生体適合性タンパク質、フッ素含有界面活性剤、ポリオキシプロピレンポリオキシエチレングリコール非イオン性ブロックコポリマー、および合成界面活性剤でありうる。

幾つかの実施形態において、本発明の組成物は界面活性剤を含むことができる。本発明の組成物に使用することができる界面活性剤の非限定例には、Ｔｗｅｅｎ、Ｓｐａｎ、Ｔｒｉｔｏｎなどを含む様々な市販のアニオン性、カチオン性、および非イオン性界面活性剤、リン脂質、コレステロール、ＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｆ−６８（登録商標）、ＨＡＭＰＯＳＹＬ Ｌ３０（登録商標）（Ｗ．Ｒ．Ｇｒａｃｅ Ｃｏ．，Ｎａｓｈｕａ Ｎ．Ｈ．）、ナトリウムドデシルスルフェート、Ａｅｒｏｓｏｌ ４１３（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｙａｎａｍｉｄ Ｃｏ．，Ｗａｙｎｅ，Ｎ．Ｊ．）、Ａｅｒｏｓｏｌ ２００（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｙａｎａｍｉｄ Ｃｏ．）、ＬＩＰＯＰＲＯＴＥＯＬ ＬＣＯ（登録商標）（Ｒｈｏｄｉａ Ｉｎｃ．，Ｍａｎｍｍｏｔｈ，Ｎ．Ｊ．）、ＳＴＡＮＤＡＰＯＬ ＳＨ １３５（登録商標）（Ｈｅｎｋｅｌ Ｃｏｒｐ．，Ｔｅａｎｅｃｋ，Ｎ．Ｊ．）、ＦＩＺＵＬ １０−１２７（登録商標）（Ｆｉｎｅｔｅｘ Ｉｎｃ．，Ｅｌｍｗｏｏｄ Ｐａｒｋ，Ｎ．Ｊ．）、およびＣＹＣＬＯＰＯＬ ＳＢＦＡ ３０（登録商標）（Ｃｙｃｌｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｃｏｒｐ．，Ｍｉａｍｉ，Ｆｌａ．）、商標名：ＤＥＲＩＰＨＡＴ １７０（登録商標）（Ｈｅｎｋｅｌ Ｃｏｒｐ．）、ＬＯＮＺＡＩＮＥ ＪＳ（登録商標）（Ｌｏｎｚａ，Ｉｎｃ．）、ＮＩＲＮＯＬ Ｃ２Ｎ−ＳＦ（登録商標）（Ｍｉｒａｎｏｌ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｉｎｃ．，Ｄａｙｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）、ＡＭＰＨＯＴＥＲＧＥ Ｗ２（登録商標）（Ｌｏｎｚａ，Ｉｎｃ．）、およびＡＭＰＨＯＴＥＲＧＥ ２ＷＡＳ（登録商標）（Ｌｏｎｚａ，Ｉｎｃ．）で販売されているような両性のもの、商標名ＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｆ−６８（登録商標）（ＢＡＳＦ Ｗｙａｎｄｏｔｔｅ，Ｗｙａｎｄｏｔｔｅ，Ｍｉｃｈ．）、ＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｆ−１２７（登録商標）（ＢＡＳＦ Ｗｙａｎｄｏｔｔｅ）、ＢＲＩＪ ３５（登録商標）（ＩＣＩ Ａｍｅｒｉｃａｓ；Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，Ｄｅｌ．）、ＴＲＩＴＯＮ Ｘ−１００（登録商標）（Ｒｏｈｍ ａｎｄ Ｈａａｓ Ｃｏ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．）、ＢＲＩＪ ５２（登録商標）（ＩＣＩ Ａｍｅｒｉｃａｓ）、ＳＰＡＮ ２０（登録商標）（ＩＣＩ Ａｍｅｒｉｃａｓ）、ＧＥＮＥＲＯＬ １２２ ＥＳ（登録商標）（Ｈｅｎｋｅｌ Ｃｏｒｐ．）、ＴＲＩＴＯＮ Ｎ４２（登録商標）（Ｒｏｈｍ ａｎｄ Ｈａａｓ Ｃｏ．）、ＴＲＩＴＯＮ Ｎ−１０１（登録商標）（Ｒｏｈｍ ａｎｄ Ｈａａｓ Ｃｏ．）、ＴＲＩＴＯＮ Ｘ−４０５（登録商標）（Ｒｏｈｍ ａｎｄ Ｈａａｓ Ｃｏ．）、ＴＷＥＥＮ ８０（登録商標）（ＩＣＩ Ａｍｅｒｉｃａｓ）、ＴＷＥＥＮ ８５（登録商標）（ＩＣＩ Ａｍｅｒｉｃａｓ）、ＢＲＩＪ ５６（登録商標）（ＩＣＩ Ａｍｅｒｉｃａｓ）などで販売されているような非イオン性界面活性剤、１，２−ジパルミトイル−ｓｎグリセロール−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチルアミド、アミン−ＰＥＧ２０００−ホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ Ｔｅｌｏｍｅｒ Ｂ、ホスファチジルエタノールアミン、アカシア、コレステロール、ジエタノールアミン、グリセリルモノステアレート、ラノリンアルコール、卵黄レシチンを含むレシチン、モノ−およびジ−グリセリド、モノ−エタノールアミン、オレイン酸、オレイルアルコール、ポロキサマー、ピーナッツ油、パルミチン酸、ポリオキシエチレン５０ステアレート、ポリオキシル３５ヒマシ油、ポリオキシル１０オレイルエーテル、ポリオキシル２０セトステアリルエーテル、ポリオキシル４０ステアレート、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、ポリソルベート８０、プロピレングリコールジアセテート、プロピレングリコールモノステアレート、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ソルビタンモノ−ラウレート、ソルビタンモノ−オレエート、ソルビタンモノ−パルミテート、ソルビタンモノステアレート、ステアリン酸、トロラミン、および乳化ロウが含まれうる。上記の界面活性剤を単独で、または本発明の組成物と組み合わせて使用することができる。

フルオロカーボンのエマルションは、幾つかの実施形態において、フッ素化リン脂質のようなフルオロ界面活性剤を使用して調製することができる。例えば、１つの実施形態において、界面活性剤は、ＰＥＧ−Ｔｅｌｏｍｅｒ−Ｂである。例示的な実施形態において、組成物は、ＰＥＧ−Ｔｅｌｏｍｅｒ−Ｂを伴うＤＤＦＰｅを含む。リン脂質もエマルションの調製に有用であり、１つ以上の異なるリン脂質および脂肪酸も含むことができる。リン脂質の鎖長さは、約１２〜約２０個の炭素原子の長さに変わりうる。アルキル基は、飽和または不飽和でありうる。好ましくは、リン脂質が用いられる場合、２つ以上の脂質が用いられる。例えば、ジパルミトイルホスファチジルクロリンを、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン−ＰＥＧ（ＤＰＰＥ−ＰＥＧ）と混合することができる。この場合、ペグ化脂質は、通常、１〜１０モルパーセントで非ＰＥＧ化脂質と混合される。ＰＥＧ鎖は、約１，０００〜１０，０００ＭＷに変わることができるが、より好ましくは２，０００〜５，０００ＭＷである。コレステロールおよびコレステロール−アセテートのようなコレステロールの誘導体を、エマルションに含めることができる。エマルションは、カチオン性（ジパルミトイルホスファチジルエチルクロリン）もしくはアニオン性の脂質（例えば、ジパルミトイルホスファチジン酸）、またはグリコシル化脂質を含有することができる。脂質または界面活性剤は、フルオロカーボンと混合および均質化されて、エマルションを調製する。１つ以上の粘度調整剤をエマルションに含めることもできる。

エマルションは、分散相を安定化すること、または製剤を生体適合性にすることを助けるために、様々な添加剤を含むこともできる。許容される添加剤には、酸化剤、アルカリ化剤、抗菌性防腐剤、酸化防止剤、緩衝剤、キレート剤、イオヘキソールもしくはイオパミドールのようなトリオドベンゼン（ｔｒｉｏｄｏｂｅｎｚｅｎｅ）誘導体、等張化剤、アカシア、寒天、アルギン酸、アルミニウムモノ−ステアレート、ベントナイト、マグマ、カルボマー９３４Ｐ、カルボキシメチルセルロース、カルシウムおよびナトリウム、ナトリウム１２、カラギーナン、セルロース、デキストリン、ゼラチン、グアーガム、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ケイ酸マグネシウムアルミニウム、メチルセルロース、ペクチン、ポリエチレンオキシド、ポリビニルアルコール、ポビドン、アルギン酸プロピレングリコール、二酸化ケイ素、アルギン酸ナトリウム、トラガカント、およびキサンタンガムを含む懸濁および／または粘度増加剤が含まれる。

幾つかの実施形態において、酸素輸送物質は、約０．１％〜約８％ｗ／ｖのドデカフルオロペンタンのエマルションでありうる。他の実施形態において、酸素輸送物質は、約０．１％〜約１．５％ｗ／ｖのドデカフルオロペンタンのエマルションでありうる。なお他の実施形態において、酸素輸送物質は、約０．５％〜約２．５％ｗ／ｖのドデカフルオロペンタンのエマルションでありうる。追加的な実施形態において、酸素輸送物質は、約１％〜約３％ｗ／ｖのドデカフルオロペンタンのエマルションでありうる。好ましい実施形態において、酸素輸送物質は、約１％〜約５％ｗ／ｖのドデカフルオロペンタンのエマルションでありうる。

エマルションは、機械的、手作業、または音響エネルギー適用により、連続相中の分散相の懸濁液を微粉砕して形成することができる。微粉砕は、手作業、機械、または超音波作用による混合で生じた機械的なエネルギーを使用して、液体分散および連続相を一緒に混合し、次に分散相の粒子の大きさを大型粒子から必要な大きさに減少させる、コロイド分散体の形成プロセスを含む。適切な混合は、参照として本明細書に組み込まれる米国特許第４，５３３，２５４号に記載されている、ＭｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃのＭｏｄｅｌ １１０ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ装置により達成することができる。

特定の化合物に応じて、微小気泡は、数分間から数時間までの範囲の時間にわたって血流に存続するように安定化される。形成される微小気泡の大きさを、全身または肺の毛細管を妨げないように、かつ大型の赤血球の流れを閉塞させている血管の中もしくは周りを通過するように十分に小さくする製造プロセスによって、制御することができることを当業者は理解する。例示的な実施形態において、酸素輸送物質は、２５０ナノメートル液滴のエマルションとして処方される、ＤＤＦＰｅを含む微小気泡でありうる。

（ｂ）投与
開示されている酸素輸送物質を、静脈注射、動脈内、筋肉内、腹腔内、心室内、硬膜外、頭蓋内注射および注入技術を介するような非経口投与により対象に投与することができる。１つの実施形態において、酸素輸送物質を、動脈内注射により対象に投与することができる。別の実施形態において、酸素輸送物質を、筋肉内注射により対象に投与することができる。更に別の実施形態において、酸素輸送物質を、腹腔内注射を介して対象に投与することができる。別の実施形態において、酸素輸送物質を、心室内注射により対象に投与することができる。なお別の実施形態において、酸素輸送物質を、頭蓋内注射により対象に投与することができる。別の実施形態において、酸素輸送物質を、硬膜外注射により対象に投与することができる。好ましい実施形態において、酸素輸送物質を、静脈内で対象に投与することができる。

幾つかの実施形態において、酸素輸送物質をボーラスで投与することができる。他の実施形態において、酸素輸送物質を連続的に投与することができる。なお他の実施形態において、酸素輸送物質を、ボーラスおよび連続の組み合わせで投与することができる。連続投与の非限定例には、注入が含まれうる。

酸素輸送物質を、対象に１回または複数回投与することができる。幾つかの好ましい実施形態において、酸素輸送物質を１回投与することができる。他の実施形態において、酸素輸送物質を複数回投与することができる。例えば、酸素輸送物質を、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０回、またはそれ以上の回数で投与することができる。幾つかの実施形態において、酸素輸送物質を、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０回投与することができる。他の実施形態において、酸素輸送物質を、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０回、またはそれ以上の回数で投与することができる。好ましい実施形態において、酸素輸送物質を、２、３、４、５、または６回投与することができる。

投与のなお別の好ましい方法は、持続性ＩＶ注入によるものである。ＩＶ注入により投与される場合、初期ボーラスまたはスローＩＶプッシュ初回負荷量を、一般に体重１ｋｇあたり約０．０１〜約０．６ｃｃの範囲で、２％ｗ／ｖｏｌのＤＤＦＰｅと共に投与することができる。より好ましくは、この負荷量は、１ｋｇあたり約０．０５〜約０．３ｃｃである。その後、材料は、約１時間から２４時間まで、更には対象の状態に応じてより長時間ＩＶ注入される。持続性注入では、材料は、一般に毎時１ｋｇあたり約０．０１〜約０．３ｃｃ、より好ましくは１ｋｇあたり約０．０２５〜約０．１ｃｃの速度で注入される。

複数回投与される場合、酸素輸送物質を、定期的な間隔または対象の治療の間の変わりうる間隔で投与することができる。幾つかの実施形態において、酸素輸送物質を、対象の治療の間の変わりうる間隔で複数回投与することができる。好ましい実施形態において、酸素輸送物質を定期的な間隔で複数回投与することができる。好ましい実施形態の幾つかの代替案において、酸素輸送物質を、約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０分、またはそれ以上の間隔で投与することができる。好ましい実施形態の他の代替案において、酸素輸送物質を、約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００分、またはそれ以上の間隔で投与することができる。好ましい実施形態のなお他の代替案において、酸素輸送物質を、約８０、９０、１００分、またはそれ以上の間隔で投与することができる。好ましい実施形態の他の代替案において、酸素輸送物質を、約８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００分、またはそれ以上の間隔で投与することができる。例示的な実施形態において、酸素輸送物質を約９０分の間隔で投与することができる。

酸素輸送物質を、虚血を経験している対象に投与することができる、虚血の発生の前に対象に投与することができる、または虚血の発生の前に投与し、虚血症状の全体にわたって続けることができる。例えば、対象への酸素輸送物質の投与を、対象が血管閉塞に起因する虚血の危険性を増加する医学的手法を経験しているとき、または対象に上記のセクションＩ（ｂ）に記載されている閉塞血管の発生の高い危険性があるとき、虚血の発生前に投与することができる。幾つかの実施形態において、酸素輸送物質を、虚血を経験している対象に投与することができる。他の実施形態において、酸素輸送物質を、虚血の発生前に対象に投与することができる。なお他の実施形態において、酸素輸送物質を、虚血の発生前に対象に投与し、虚血症状の全体にわたって続けることができる。好ましい実施形態において、酸素輸送物質を、血管閉塞の危険性を増加する医学的手法が実施される前に、対象に投与することができる。他の好ましい実施形態において、酸素輸送物質を、閉塞血管の症状の発症前に、閉塞血管を発生する高い危険性のある対象に投与することができる。

幾つかの実施形態において、酸素輸送物質を、虚血の発生の約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０分、またはそれ以上の前に投与することができる。１つの実施形態において、酸素輸送物質を、虚血の発生の約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０分前に投与することができる。別の実施形態において、酸素輸送物質を、虚血の発生の約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０分前に投与することができる。なお別の実施形態において、酸素輸送物質を、虚血の発生の約２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０分前に投与することができる。別の実施形態において、酸素輸送物質を、虚血の発生の約３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０分前に投与することができる。追加的な実施形態において、酸素輸送物質を、虚血の発生の約４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０分前に投与することができる。なお別の実施形態において、酸素輸送物質を、虚血の発生の約５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０分前に投与することができる。別の実施形態において、酸素輸送物質を、虚血の発生の約６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０分前に投与することができる。なお別の実施形態において、酸素輸送物質を、虚血の発生の約７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０分前に投与することができる。追加的な実施形態において、酸素輸送物質を、虚血の発生の約８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００分前に投与することができる。更に別の実施形態において、酸素輸送物質を、虚血の発生の約９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０分、またはそれ以上の前に投与することができる。好ましい実施形態において、酸素輸送物質を、虚血の発生の約２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５分前に投与することができる。

幾つかの実施形態において、酸素輸送物質を、虚血の発症の約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５分、または１、２、３、４、５、もしくは６時間、またはそれ以上の後に投与することができる。１つの実施形態において、酸素輸送物質を、虚血の発症の約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０分後に投与することができる。別の実施形態において、酸素輸送物質を、虚血の発症の約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０分後に投与することができる。なお別の実施形態において、酸素輸送物質を、虚血の発症の約２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０分後に投与することができる。別の実施形態において、酸素輸送物質を、虚血の発症の約３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０分後に投与することができる。なお別の実施形態において、酸素輸送物質を、虚血の発症の約１、２、３、４、５、もしくは６時間、またはそれ以上の後に投与することができる。好ましい実施形態において、酸素輸送物質を、虚血の発症の約４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、または６５分後に投与することができる。別の実施形態において、酸素輸送物質を、虚血の発症の約１、２、３、４、５、もしくは６時間、またはそれ以上の後に投与することができる。例示的な実施形態において、酸素輸送物質を、虚血の発症の約１時間未満後に投与することができる。別の実施形態において、酸素輸送物質を、虚血の発症の約１、２、または３時間後に投与することができる。

幾つかの実施形態において、酸素輸送物質を、対象の１キログラムあたり約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、または約１．１ｍＬの量で対象に投与することができる。他の実施形態において、酸素輸送物質を、対象の１キログラムあたり約０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．１１、０．１２、０．１３、０．１４、０．１５、０．１６、０．１７、０．１８、０．１９、または約０．２ｍＬの量で対象に投与することができる。なお他の実施形態において、酸素輸送物質を、対象の１キログラムあたり約０．１１、０．１２、０．１３、０．１４、０．１５、０．１６、０．１７、０．１８、０．１９、０．２、０．２１、０．２２、０．２３、０．２４、０．２５、０．２６、０．２７、０．２８、０．２９、または約０．３ｍＬの量で対象に投与することができる。更に他の実施形態において、酸素輸送物質を、対象の１キログラムあたり約０．２１、０．２２、０．２３、０．２４、０．２５、０．２６、０．２７、０．２８、０．２９、０．３、０．３１、０．３２、０．３３、０．３４、０．３５、０．３６、０．３７、０．３８、０．３９、または約０．４ｍＬの量で対象に投与することができる。他の実施形態において、酸素輸送物質を、対象の１キログラムあたり約０．３１、０．３２、０．３３、０．３４、０．３５、０．３６、０．３７、０．３８、０．３９、０．４、０．４１、０．４２、０．４３、０．４４、０．４５、０．４６、０．４７、０．４８、０．４９、または約０．５ｍＬの量で対象に投与することができる。なお他の実施形態において、酸素輸送物質を、対象の１キログラムあたり約０．４１、０．４２、０．４３、０．４４、０．４５、０．４６、０．４７、０．４８、０．４９、０．５、０．５１、０．４２、０．５３、０．５４、０．５５、０．５６、０．５７、０．５８、０．５９、または約０．６ｍＬの量で対象に投与することができる。更に他の実施形態において、酸素輸送物質を、対象の１キログラムあたり約０．００１、０．００５、０．０１、０．０１５、０．０２、０．０２５、０．０３、０．０３５、０．０４、０．０４５、０．０５、０．０５５、０．０６、０．０６５、０．０７、０．０７５、０．０８、０．０８５、０．０９、または約０．１ｍＬの量で対象に投与することができる。幾つかの好ましい実施形態において、酸素輸送物質を、対象の１キログラムあたり約０．６ｍＬの量で対象に投与することができる。他の好ましい実施形態において、酸素輸送物質を、対象の１キログラムあたり約０．３ｍＬの量で対象に投与することができる。なお他の好ましい実施形態において、酸素輸送物質を、対象の１キログラムあたり約０．１ｍＬの量で対象に投与することができる。

（ｃ）組み合わせ法
本発明の酸素輸送物質を、虚血の他の治療または組織の酸素化を増加しうる治療と組み合わせて投与することができる。虚血の治療または組織の酸素化を増加しうる治療の非限定例には、酸素吸入、血液、血栓溶解薬、または抗凝血薬の投与、および組織の温度の低減が含まれうる。

一般的に言えば、本発明の酸素輸送物質の投与を使用して、梗塞体積を低減することができ、一方、二次治療が閉塞を解決するために使用される。重要なことに、本発明の組成物を、閉塞が解決されていなくても、虚血の際に梗塞体積を低減するために使用することができる。故に、本発明の組成物を最初に投与して組織を保護し、次に閉塞を解決するための治療を投与できることが考慮される。

幾つかの実施形態において、本発明の酸素輸送物質を血液と組み合わせて投与することができる。他の実施形態において、本発明の酸素輸送物質を酸素吸入と組み合わせて投与することができる。なお他の実施形態において、本発明の酸素輸送物質を１つ以上の抗凝血薬と組み合わせて投与することができる。抗凝血薬の非限定例には、アセノクマロール、クマテトラリル、ジクマロール、ビスクマ酢酸エチル、フェンプロクーモン、ワルファリン、クロリンジオン、ジフェナジオン、フェニンジオンのようなビタミンＫアンタゴニスト、アブシキシマブ、エプチフィバチド、チロフィバン、クロピドグレル、プラスグレル、チクロピジン、カングレロール、エリノグレル、チカグレロール、ベラプロスト、プロスタサイクリン、イロプロスト、トレプロスチニル、アセチルサリチル酸（アスピリン）、アロキシプリン、カルバサラートカルシウム、インドブフェン、トリフルサル、ジピリダモール、ピコタミド、テルトロバン（ｔｅｒｕｔｒｏｂａｎ）、シロスタゾール、ジピリダモール、トリフルサル、クロリクロメン、ジタゾールのような抗血小板化合物、ベミパリン、セルトパリン（ｃｅｒｔｏｐａｒｉｎ）、ダルテパリン、エノキサパリン、ナドロパリン、パルナパリン、レビパリン、チンザパリン、フォンダパリナックス、イドラパリナックス、ダナパロイド、スロデキシド、デルマタン硫酸、アピキサバン、ベトリキサバン（ｂｅｔｒｉｘａｂａｎ）、エドキサバン、オタミキサバン（ｏｔａｍｉｘａｂａｎ）、リバロキサバン、ペビパリン（ｐｅｖｉｐａｒｉｎ）、ＹＭ４６６のような第Ｘａ因子インヒビター、ビバリルジン、レピルジン、デシルジン、アルガトロバン、ダビガトラン、メラガトラン、キシメラガトラン、ＲＥＧ１、デフィブロチド、ラマトロバン、アンチトロンビンＩＩＩ、およびタンパク質Ｃ（ドロトレコギンアルファ）のようなダイレクトトロンビンＩＩインヒビター、ならびにプラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ；アルテプラーゼ、レテプラーゼ、テネクテプラーゼ）、アンチストレプターゼ、ウロキナーゼ、サルプラーゼ、ストレプトキナーゼ、アニストレプラーゼ、モンテプラーゼ、アンクロッド、フィブリノリジン、およびブリナーゼのような血栓溶解薬が含まれうる。

他の実施形態において、本発明の酸素輸送物質を１つ以上の血栓溶解薬と組み合わせて投与することができる。血栓溶解薬の非限定例には、プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ；アルテプラーゼ、レテプラーゼ、テネクテプラーゼ）、アンチストレプターゼ、ウロキナーゼ、サルプラーゼ、ストレプトキナーゼ、アニストレプラーゼ、モンテプラーゼ、アンクロッド、フィブリノリジン、およびブリナーゼが含まれうる。

幾つかの好ましい実施形態において、本発明の酸素輸送物質を、組織プラスミノーゲンアクチベーター、アンチストレプターゼ、ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される抗凝血薬または血栓溶解薬と組み合わせて投与することができる。好ましい実施形態の１つの代替案において、本発明の酸素輸送物質をｔＰＡと組み合わせて投与することができる。例示的な実施形態において、実施例に記載されているように、ｔＰＡを本発明の酸素輸送物質の投与後に投与することができ、続いて第２用量の酸素輸送物質を投与することができる。

他の実施形態において、本発明の組成物を、虚血性事象に罹患している組織の温度を下げることを伴って投与することができる。しかし、全ての場合において、組織温度は２９℃を下回って低下されない。例えば、組織温度は、約３０、３１、３２、３３、３４、３５、または３６℃に低下されうる。

ＩＩＩ．組み合わせ組成物
幾つかの態様において、本開示は、ドデカフルオロペンタンエマルションおよび血栓溶解薬を含む組み合わせを提供する。ドデカフルオロペンタンエマルションおよび血栓溶解薬は、上記のセクション（Ｉ）に記載されたとおりである。幾つかの実施形態において、組み合わせは、組織プラスミノーゲンアクチベーター、アンチストレプターゼ、ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される血栓溶解薬を含む。好ましい実施形態において、組み合わせは、ドデカフルオロペンタンエマルションおよびｔＰＡを含む。一般的に言えば、有効量のｔＰＡは、当該技術において慣用的に知られている方法を使用して決定することができる。

以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すために含まれている。以下の実施例に開示されている技術は、本発明の実施において良好に機能することが本発明者たちにより発見された技術を表すことを、当業者は理解するべきである。しかし当業者は、本開示を考慮すると、開示されている特定の実施形態において多くの変更を行うことができ、依然として、本発明の精神および範囲から逸脱することなく同様または類似の結果を得ることができ、したがって、添付の図面に記載または示されている全ての事項は、例示的であり、制限的な意味ではないと解釈されるべきことを理解するべきである。

以下の実施例は本発明の様々な繰り返しを説明する。

酸素交換の促進におけるドデカフルオロペンタン（ＤＤＦＰ）、ペルフルオロデカリン（ＰＦＤ）、およびペルフルオロオクチルブロミド（ＰＦＯＢ）のインビトロでの比較
特定の臨床および野外の状況（例えば、出血性ショック）における呼吸ガスの交換を増加させうる、静脈内注射を開発する必要がある［１，２］。体が、細胞に健康的な代謝プロセスを維持するために一定の酸素供給、ならびに効率的な二酸化炭素の除去機構を必要とすることは、良く知られている。加えて、効率的な酸素および二酸化炭素交換の利益の程度は、低酸素事象（虚血性再灌流）の後にこの交換プロセスが回復する時間によって左右されうる［３，４］。腫瘍放射線感作［５］、減圧病における組織内窒素の排除［６］、一酸化炭素中毒の治療［７］、および細胞損傷を引き起こす様々な低酸素状態の治療を含む、これらの必要性を都合良く補足することができる生成物の潜在的な適用が広がっている。発作は、神経損傷をもたらしうる重大で広汎性の状態である。そのような損傷は、局所脳細胞が酸素と二酸化炭素を交換する機会を部分的に低減させることが知られている。アスピリンのような現在承認されている発作の治療は、血栓形成のプロセスを制限するように設計されているが、組織の生存力を回復するように設計されていない。組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）のような作用物質は、現在、後で投与された場合に頭蓋内出血の発生率を増加することに起因して、発作の発症後の４．５時間の範囲でのみ利用可能である［８，９］。作用物質を使用して、組織生存力の時間範囲を伸ばすことができ、それによって、血栓溶解または再疎通のいずれかの救命治療パラダイムを現在の制限を超えて使用できるのであれば、興味深く、非常に有益である。ドデカフルオロペンタン（ＤＤＦＰ）（ペルフルオロペンタンとしても知られている）の２％ｗ／ｖのサブマイクロエマルションが開発され、ヒトに対して安全であることが示されている［１０］。このエマルションは、呼吸ガス輸送を実施すること、および組織生存力のみならず重篤な貧血ラットに正常な生理的プロセスを維持することも、Ｌｕｎｄｇｒｅｎら［１１］によって証明された。更に、Ｋｏｃｈら［５］は、嫌気性腫瘍細胞の酸素化を促進することによって、製剤がこれらの細胞を好気性にし、それによりこれらを放射線に対して脆弱にすることを示している。本明細書に詳述されるインビトロ実験は、この２％ｗ／ｖのＤＤＦＰエマルション（ＤＤＦＰｅ）がどのように機能して組織内酸素灌流の維持を助けうるかを示す、物理的特徴およびガス輸送機構を示唆する。データは、製剤が発作または心臓発作の際にどのようにして細胞保護剤として有用でありうるかについての洞察も、提供することができる。比較的少ない用量で投与されるとき、これらのサブミクロンの大きさの粒子（赤血球よりも５〜１０×小さい）は、血球が灌流できないときに血管閉塞を超えて灌流し、重要な酸素を提供することができることがある。

ヘモグロビンは、体内における唯一の天然の酸素運輸送体である。体積を比較すると、フルオロカーボンは、他の流体または濃縮赤血球よりも効果的にガスを溶解することが知られている［１２］。このように、ガス輸送について調査されている他のフルオロカーボンエマルションが存在する。これらの開発中の他の生成物は、両方とも１４２℃〜１４４℃の沸点を有する、ペルフルオロデカリン（ＰＦＤ）およびペルフルオロオクチルブロミド（ＰＦＯＢ）［１３］のような比較的大型の非揮発性ペルフルオロカーボン（ＰＦＣ）を含有する。これらは、適切な酸素を提供するために、高濃度（２０％〜６０％ｗ／ｖ）で処方される［１４−１６］。酸素の可溶性は、ＰＦＤおよびＰＦＯＢにおいてそれぞれ４２％および５０％ｖ／ｖであると報告されている［１７，１８］。これらの２つのＰＦＣも、極度の疎水性に起因して多量の分布を経験することが知られている。これらは脂質に誘引されないが、水の水素結合によって強力に反発され、このことにより強力な疎水性になるが、わずかに相対的に疎油性になる。したがって、これらは主に組織に分布し、特にＲＥＳマイクロファージにより取り込まれ、高度な蓄積に起因して、比較的長い第二相半減期を示す［１９，２０］。このことは、酸素療法としての有用性をいくらか制限する。あるいは、ＤＤＦＰ分子が小さく、高濃度の酸素（８０％ｖ／ｖ）を溶解し、２９℃の沸点を有し、したがって生物学的温度である程度揮発しうる（酸素装填量を更に増強する）ので、はるかに少ない体積が、十分な酸素をインビボで供給するために必要となる［６，２１，２２］。加えて、研究は、ＤＤＦＰが血中で２分の半減期を有すること、および介入投与の２時間後に肺から９９％が清掃されることを示す［２３］。この短い半減期は不利でありうると思われるが、動物研究は、ＩＶ注入で１回投与される１ｋｇあたりほぼ０．７ｃｃの低用量のＤＤＦＰｅが、重篤な貧血動物の蘇生に十分でありうることを示唆している［６，１１］。別の考慮は、酸素療法が血液を交換する必要がなく、追加的な確定された療法（例えば、輸血）が施用されうるまで、重大な貧血または虚血の患者を安定化する有用な役割を依然として有しうることである。前に記述されたように、ＤＤＦＰは、短い直鎖長さ［１，１７］および低い沸点［６，２１］に起因して、多くの他のＰＦＣよりもガスの可溶化において有利であることが示唆されている。このより効率的な酸素吸収は、ＤＤＦＰが、長鎖のペルフルオロカーボン（ＰＦＤおよびＰＦＯＢ）と比較して、二級ＣＦ_２基よりも高い割合で一級ＣＦ_３基を有するという事実に起因しうる。ＣＦ_３基は、強い電気陰性であり、ガスの誘引の主な原因である［２４］。したがって、体積に基づいて、液体ＤＤＦＰは、他の直鎖液体ＰＦＣよりも多くの呼吸ガスを溶解することができる。恐らく酸素運搬能力にとってより重要なことは、ＤＤＦＰが生物学的温度で液体から気体の状態に膨張し［７，２５，２６］、その結果として局所圧力勾配に基づいてガスを移動するという事実である。気体状態のＤＤＦＰは、それ自体の液体状態と比較するのみならず他の大型ＰＦＣの液体状態とも比較して、はるかに多くの酸素を吸収、送達、および交換できると考えられる［２１，２７］。この実施例の目的は、２％ｗ／ｖのＤＤＦＰｅの能力を、酸素を捕捉する能力について、したがって酸素が低酸素環境に運搬および送達されるのに利用可能になるシナリオを刺激する能力について、ＰＦＤおよびＰＦＯＢの同等のエマルションと比較することである。更に、ＤＤＦＰｅの物理的安定性について取り組まれる。

方法
生成物の調製
２％ｗ／ｖのＰＦＣ（ＤＤＦＰ、ＰＦＤ、およびＰＦＯＢ）エマルションの３つの別々のバッチを、Ｌｕｎｄｇｒｅｎらにより以前に記載されたとおりに調製した［６］。加えて、ブランク製剤を、３つのエマルションと同じ方法であるが、ＰＦＣなしで調製した。具体的には、各１リットルのバッチでは、３グラムのＰＥＧ−Ｔｅｌｏｍｅｒ Ｂおよび２０グラムのＰＦＣ（ブランクを除いて）を、Ａｖｅｓｔｉｎ Ｅｍｕｌｓｉｆｌｅｘ−Ｃ５ホモジナイザーに取り付けた特別仕様半密閉ステンレススチール収容系を使用して、３３％のスクロース溶液と共に均質化した。それぞれのホモジネートを、１４，０００ｐｓｉでチャンバーに６回通して加工し、次に５ｍＬのバイアルに充填する直前に、最終滅菌濾過した。バイアルに栓を付け、圧着し、次に室温で保存した。

生成物分析
粒子分粒。３つのバイアルをそれぞれの処方バッチから無作為に選択した。バイアルを５秒間渦動し、液体製剤の１０μＬのアリコートをシリンジで取り出し、２ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水希釈物（既知の粘度）を含有する３ｍＬのコルベットに注入し、氷浴で冷やした。コルベットに覆いを付け、穏やかに３回逆さまにした。次に、試料の温度を測定し、各試料を、決定された温度および粘度設定でＭａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ ＨＳ１００を使用して分析した。Ｍａｌｖｅｒｎによりエラーメッセージが提示されない限り、９個の選択されたバイアルからそれぞれ１回試料採取し、提示される場合では、試料採取を通過試験が達成されるまで繰り返した。ＤＤＦＰｅの粒径のみが６か月間にわたってモニターされた。

ｐＨ分析。Ｓｙｍｐｈｏｎｙ ＳＢ２１ ｐＨメーターおよびＳｙｍｐｈｏｎｙ ８５０ｐＨプローブを使用して、最終製剤のｐＨを決定した。水素イオン濃度の分析を三重に実施した。メーターを４．０および７．０でｐＨ標準により較正し、次にバッチ内不均一を確認するため、１つのバイアルを各バッチの始め、中頃、および終了時に測定のために選択した。

統計分析。粒径、ｐＨ、酸素取り込み、および体積膨張の計算の平均および標準偏差のような全ての記述統計は、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ ２００３ Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｋｉｔを使用して実施した。

インビトロ性能試験
酸素輸送。図１に示されている、製剤による酸素取り込みを測定するインビトロ設定は、Ｌｕｎｄｇｒｅｎら［１１］から採用した。撹拌バーを備えた３００ｍＬのビーカーに、２５０ｍＬの脱イオン水を充填し、温度制御水浴にいれた。水浴を撹拌ホットプレートの上に置いた。携帯型酸素メーターのプローブをビーカーの中に沈め、溶解酸素の読み取り値を安定させた。安定化が達成されると、水面を最初にＳｔｙｒｏ−ｆｏａｍ（登録商標）ディスクで覆い、次にＰａｒａｆｉｌｍ（登録商標）で密閉してヘッドスペースを除去し、大気との更なるガス交換を防止した。針およびシリンジを使用して、５ｍＬの製剤を、パラフィルムを通して２５０ｍＬ容量の水の中に注入した（１：５０、ｖ：ｖ）。注入孔を毎回接着テープで再密閉した。溶解酸素読み取り値を、各注入の１時間後に、特別設計コミュニケーションポートデータロガーソフトウエア［２８］を使用してコンピューターにより３０秒の間隔で記録した。この手法をＤＤＦＰｅ、ＰＦＤｅ、ＰＦＯＢｅ、およびブランク製剤において、２０℃および３７℃の両方の温度で三重に実施した。

体積膨張。ＤＤＦＰが３７℃で揮発すると予測されるので、注入による各製剤の体積膨張は、図２に示されているナノメートル装置を使用して試験した。並列実験において、５ｍＬの容量のＤＤＦＰｅ、ＰＦＤｅ、ＰＦＯＢｅ、ブランク製剤、および脱イオン水を、２５０ｍＬの撹拌脱イオン水に注入し、同時に、２５０ｍＬの脱イオン水を含有した２５０ｍＬの栓付きＥｒｌｅｎｍｅｙｅｒフラスコの温度を３７℃に維持した。２５ｍＬのビュレットを、栓を通して挿入し、容量の増加がビュレットの中に押し込まれ、測定できるように、先端部を水の中に沈めた。

結果
粒子分粒。初期平均粒子直径は、ＤＤＦＰｅ、ＰＦＤｅ、およびＰＦＯＢｅでは、それぞれ２１５±５６ｎｍ、１０３±８ｎｍ、および１５５±６ｎｍであると決定された。図３は、ＤＤＦＰｅ粒子の大きさが、４００ｎｍ未満の直径に室温（２３℃±２℃）で６か月間安定したままであることを示す。中空菱形が試料の２％未満の粒子を表し、これらの双峰分布は、最初の２か月間だけ観察されたことに留意すること。

ｐＨ分析。ＤＤＦＰｅ、ＰＦＤｅ、およびＰＦＯＢｅのｐＨ値は、それぞれ５．５、６．１、および５．７であることが見出された。

酸素輸送。図４は、試験された全ての試料および対照の酸素取り込みデータを示す。ＰＦＤｅおよびＰＦＯＢｅの製剤は、２１℃および３７℃の両方の試験温度でブランク製剤よりも多くの酸素を吸収しないことが確定された。対照的に、ＤＤＦＰｅは、両方の温度でＰＦＤｅ、ＰＦＯＢｅ、およびブランク製剤よりも有意に多くの酸素を吸収した。具体的には、６０分間では、ＤＤＦＰｅは２１℃でおよそ３倍多くの酸素（ｐ＝０．０３）を吸収し、３７℃では７倍多くの酸素（ｐ＝０．００１）を吸収した。このことは２つの重要なことに起因しうる。一方は、ＤＤＦＰｅがＰＦＣ ｗｔ量のおよそ２倍のモル量のペルフルオロカーボンを含有するという事実であり、他方は、他の製剤と比較して単位体積あたり高い割合のトリフルオロメチル基が存在することである。

体積膨張。図５は、３７℃の半密閉フラスコに導入されたときの、全ての試料および対照の体積膨張の差を示す。ＰＦＤｅおよびＰＦＯＢｅに膨張が観察されるが、両方とも、水の等しい注入による膨張より有意に大きくない（ＰＦＤｅおよびＰＦＯＢｅではそれぞれｐ＝０．３５およびｐ＝０．０６）。ＰＦＯＢｅおよびブランク製剤の体積増加に中程度の差があると思われるが（ｐ＝０．０１）、水およびブランク製剤の間ではないと思われる（ｐ＝０．１２）。ブランクとＰＦＯＢｅの見掛け上の差の理由は不明であるが、ＰＦＯＢは高温においてＰＦＤよりも膨張することが可能である。最も注目される結果は、ＤＤＦＰｅの膨張において見られる。他の試験注入よりも少なくとも５倍有意に大きい（ｐ＜０．００００１）。

結論
２％ｗ／ｖのＤＤＦＰエマルションを調製し、酸素吸収能力について、等しいエマルション濃度のＰＦＤおよびＰＦＯＢと試験した。最終ＤＤＦＰｅは５．５のｐＨを有し、乳白色の外観があり、初期の粒径は２１５±５６ｎｍである。２％ＤＤＦＰｅは、ＰＦＤまたはＰＦＯＢの２％ｗ／ｖのエマルションより７倍多くの酸素を運搬することが見出された。これらの差は、ｐ＝０．００１の信頼度で有意であると決定された。このように、生理学的温度で膨張するＤＤＦＰの能力は、高い装填量の酸素を送達するのにＰＦＤおよびＰＦＯＢよりも顕著な利点をもたらすと思われる。恐らくこのことが、酸素送達が意図されるＰＦＤおよびＰＦＯＢによる製剤が慣用的に４０％〜６０％の濃度で調製される理由である。ＤＤＦＰは、はるかに少ない用量のＰＦＣを投与して所望の結果を達成できる点において、ＰＦＤおよびＰＦＯＢよりも強い利点をもたらすことが明らかである。ＰＦＣが肺を通って体から出ることが明確に実証されているので、このことは患者ばかりでなく環境にとっても侵襲性が少ない。本明細書のデータは、ＤＤＦＰが生理学的温度で液体からガスへの膨張によって、他のＰＦＣよりも増強された酸素送達を提供できるはずであるという点において、ＢｕｒｋａｒｄおよびＶａｎ Ｌｉｅｗ［２１］、ならびにＬｕｎｄｇｒｅｎら［６，１１］の論点を支持する。ラットでのＬｕｎｄｇｒｅｎら［１１］により得られたインビボの結果を加えたこれらのインビトロ研究は、少ない用量のＤＤＦＰエマルションが、急性低酸素事象の際に組織の保存を管理するにも有用でありうることを示すと思われる。更に、結果は、心血管発作または発作の低酸素症状の際の、神経保護を支持するための追加的な使用を示すことができる。

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ドデカフルオロペンタンエマルションはウサギ虚血性発作モデルにおいて梗塞体積を減少する
血液損失、虚血、または低酸素症を伴う多くの多様な状況は、罹患および死亡を引き起こす臓器および組織の損傷をもたらしている。これらの状況には、一般的な外科的および介入的な手法、ならびに外傷および自然疾患状態が含まれる。これらの症状は、一般的に、心筋梗塞として、体中および四肢に広範囲に分布される低酸素性または虚血性症候群として、ならびに虚血性発作としても現れる。加えて、手術および血管造影法を含む臨床手法は、微小塞栓を生じる可能性があり、無症候性もしくは無症性脳虚血、または急性発作をもたらす（１）。神経保護化合物、高圧酸素、ヘモグロビンに基づいた代用血液、他の手法、および液体ペルフルオロカーボン（ＰＦＣ）に基づいた酸素運搬体は、有望であることを示したが、これらの状況を補うことにおおむね失敗している（２−７）。迅速な血管再生および酸素化血流の回復が、現時点では依然として臨床発作療法の主な焦点のままである。

別の酸素輸送物質は、治療可能性を有することがあり、それは、ＰＦＣ、ＰＦＣエマルションに固有の高度に求電子性のフッ素含有量および分子間誘引力の欠如が、有意な量の酸素および他の電子豊富呼吸ガスを物理的に溶解、輸送、および送達する能力を有するからである（８，９）。高度な技術は、顕著に小さい粒子の安定したＰＦＣエマルションの生成を可能にする。そのような小型の液滴は、８μｍの赤血球を阻止する多くの血管閉塞を超える通過を可能にし、そうでなければ閉塞動脈供給により酸素化されない微小循環および組織の最小の領域への灌流も可能にする。

ドデカフルオロペンタン（ＤＤＦＰ）エマルション（ＤＤＦＰｅ）は、３７℃でのインビトロ投与で気体状態への膨張を経験する（１０および実施例１）、２５０ｎｍ液滴の安定したエマルションである。この膨張は、ＰＦＣのうちでＤＤＦＰに特有のものである。ＤＤＦＰはおよそ２９℃の沸点を有し、したがって３７℃では、大きな細胞間「ポケット」がＤＤＦＰｅ液滴の中に開き、それよって高濃度の呼吸ガスがその中に急速に引き込まれうる。インビトロでは、ＤＤＦＰ液滴は最終的に膨張して微小気泡を形成する。しかし、インビボでは、ＤＤＦＰｅが静脈内に注射される場合、膨張して真の気泡形態にならない（実施例１）。血管内圧力は完全な気泡膨張を遅らせるが、液滴が微小気泡の大きさに達することなく血流を移動すると、呼吸ガスの吸収および放出のために必要であれば偶発的な液滴の交互の膨張および収縮を可能にする。液体ＰＦＣはこの能力を有さず、このことは、ガス可溶性の能力において相対的に限定される。３つのＰＦＣエマルションのインビトロ比較は、気体状態のＤＤＦＰｅが著しく優れた酸素送達を実証した（図４）。インビボでは、ＤＤＦＰｅはおよそ２時間機能し、ＤＤＦＰｅは、体内に長時間保持されることなく通常の呼吸により呼気される（１２）。

この実施例では、急性の虚血性発作のウサギモデルにおける静脈内エマルション治療は、内頸動脈（ＩＣＡ）の分岐部の血管造影法永久閉塞によりなされた。目的は、神経保護が血流を回復することなく提供されうるかを決定することである。

材料および方法
動物に対する全ての手順は、研究機関の動物管理および使用委員会により承認された。ニュージーランド白ウサギ（合計ｎ＝９５）をこの研究に使用した。外科的および血管造影的手法は、以前に記載されている（１３，１４）。簡潔には、ウサギを３０ｍｇ／ｋｇのケタミン（Ｋｅｔａｓｅｔ；Ｆｏｒｔ Ｄｏｄｇｅ，Ｆｏｒｔ Ｄｏｄｇｅ，Ｉｏｗａ）および３ｍｇ／ｋｇのキシラジン（ＡｎａＳｅｄ；Ｌｌｏｙｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｓｈｅｎａｎｄｏａｈ，Ｉｏｗａ）の筋肉内注射により鎮静させ、イソフルラン（Ｎｏｖａｐｌｕｓ；Ｈｏｓｐｉｒａ，Ｌａｋｅ Ｆｏｒｅｓｔ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）で麻酔をかけた。大腿動脈を外科的に露出させ、改変した６５ｃｍの傾斜先端３−Ｆカテーテル（Ｓｌｉｐ−Ｃａｔｈ；Ｃｏｏｋ，Ｂｌｏｏｍｉｎｇｔｏｎ，Ｉｎｄｉａｎａ）を、標準的な血管造影技術を介して進めて、ＩＣＡを選択した。

部分選択拡大血管造影法を、塞栓形成の前および塞栓形成の１分後に実施して、脳血管系の正確な閉塞を実証した（図６）。画像化は、単一面Ｃアームデジタルモバイル画像化系（ＯＥＣ ９８００；ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；Ｓａｌｔ Ｌａｋｅ Ｃｉｔｙ，Ｕｔａｈ）を使用して実施した。ＩＣＡに流入させた直径が７００〜９００μｍの２または３つの個別の微小球（Ｅｍｂｏｓｐｈｅｒｅ；ＢｉｏＳｐｈｅｒｅ，Ｒｏｃｋｌａｎｄ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）による塞栓形成は、通常は中大脳動脈（ＭＣＡ）および／または前大脳動脈（ＡＣＡ）である幾つかの分岐を閉塞させた。１分後の反復血管造影法は、虚血性領域における血管閉塞および流れの障害を確認した。均一の欠陥をもたらすため、他の閉塞または血管造影合併症（ｎ＝３１）を有するウサギを研究から排除した。

治療は、耳静脈カテーテルアクセス（Ｉｎｓｔｙｌｅ−Ｗ；Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎｄｙ，Ｕｔａｈ）を使用して、群のスケジュールに従って開始した。塞栓形成の４または７時間後、ウサギを１．５ｍＬの静脈内ペントバルビタールで安楽死させた（Ｅｕｔｈａｓｏｌ；Ｖｉｒｂａｃ，Ｆｏｒｔ Ｗｏｒｔｈ，Ｔｅｘａｓ）。

治療では、ウサギを４時間の研究において７つの群に無作為に割り当てた：（ｉ）対照、治療なしで塞栓形成（ｎ＝７）；（ｉｉ）塞栓形成の３０分前にＤＤＦＰｅで前処置（ｎ＝７）；（ｉｉｉ）直後にＤＤＦＰｅ（ｎ＝８）；（ｉｖ）発作の３０分後にＤＤＦＰｅ（ｎ＝５）；（ｖ）発作の１時間後にＤＤＦＰｅ（ｎ＝７）；（ｖｉ）発作の２時間後にＤＤＦＰｅ（ｎ＝５）；および（ｖｉｉ）発作の３時間後にＤＤＦＰｅ（ｎ＝６）。治療の投与は、指定された群の時間により、安楽死させる前まで９０分毎に繰り返したスロープッシュ静脈内用量のＤＤＦＰｅ（２重量／容量％のＤＤＦＰ、０．６ｍＬ／ｋｇ；ＮｕｖＯｘ Ｐｈａｒｍａ，Ｔｕｃｓｏｎ，Ａｒｉｚｏｎａ）であった。

治療効能の限界を観察するため、並列研究を、別の対照群と比較してはるかに遅い治療を使用して実施した。群は、対照ウサギ（ｎ＝６）、発作の１時間後にＤＤＦＰｅで治療し、９０分毎に追加の用量で治療したウサギ（ｎ＝８）、および発作の６時間後に始めたＤＤＦＰｅで治療したウサギ（ｎ＝５）である。これらの動物を、塞栓形成の７時間後に安楽死させた。

安楽死させた後、脳を採取し、直後に生理食塩水で冷やし、次に冷やした脳成形型（ＲＢＭ−７０００Ｃ；ＡＳＩ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｗａｒｒｅｎ，Ｍｉｃｈｉｇａｎ）を使用して４．０ｍｍ間隔で冠状に薄片に切った。脳切片（ｎ＝８）を、１％の２，３，５−トリフェニルテトラゾリウムクロリド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）の中に３７℃で４５分間入れ、次に１０％ホルマリンで固定し、デジタル撮影した（図７）。脳の大きさ、および梗塞の領域を、治療群と無関係の技術者によりデジタル分析（ＩｍａｇｅＪソフトウエア、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）を使用して測定した。梗塞体積を、全脳の率として計算した。

固定脳切片をパラフィンに埋め、４μｍで切断した。標準ヘマトキシリンおよびエオジン染色の後、切片を分析し、次に、赤血球の溢出および細胞外空間への流体として定義される頭蓋内出血（ＩＣＨ）について評価した（１５）。ＩＣＨの存在および位置を、治療群と無関係の獣医病理学者により記録した。

ＤＤＦＰｅの治療は、分析のために３つの重要な群を組み合わせた：塞栓形成の３０分前の前処置、症状発症の１時間未満後の超急性治療、および発症の１〜３時間後の急性療法。

梗塞体積が正常に分布されなかったので、梗塞体積率の順位を、ＳＡＳソフトウエア（ＳＡＳ，Ｃａｒｙ，Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ）のＰＲＯＣ ＧＬＭ（すなわち、Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ同等物）機能により分析した。ダネット調整Ｐ値を、対照と各ＤＤＦＰｅ群との比較に使用した。４および７時間の対照群の比較、ならびに急性および超急性治療下位群内の治療群の比較は、ソフトウエアパッケージＳｔａｔＸａｃｔ（Ｃｙｔｅｌ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）の「正確な」手順を使用して行った。発作領域内または外の出血の発生率は、Ｘ^２試験およびフィッシャー直接検定を使用して比較した。

結果
血管造影手法を経験した９５匹のウサギのうち、１１匹には、ＩＣＡの重篤な血管痙攣がもたらされ、８４匹のウサギは、ＭＣＡおよび／またはＡＣＡの永久閉塞を有する塞栓形成を成功裏に有した。これらのうちの２０匹は、後大脳または上小脳動脈の閉塞も有し、研究から排除され、分析には６４匹が残った。全てのウサギは、手法および治療の全体にわたって酸素化および心臓機能の正常な生理学的状態を成功裏に維持した。

４時間の研究では（表１）、梗塞体積の中央値は、ＤＤＦＰｅで治療した全てのウサギ（ｎ＝３８）が、対照と比較して（０．３０％対３．２０％）減少した（Ｐ＝０．００１、正確なＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定）。超急性群の中央値（ｎ＝１３：図８）は、対照と比較して有意に低減された（０．３０％）（Ｐ＝０．０２１、順位のダネット調整比較；未調整 Ｐ＝０．００８）。急性群の中央値（ｎ＝１８）も、低減された（０．３０％；Ｐ＝０．００５、順位のダネット調整比較；未調整 Ｐ＝０．００２）。超急性および急性の分類内の個別の群は、互いに差がなかった（それぞれＰ＝０．５４およびＰ＝０．９２、正確なＫｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定）。

７時間の研究において（表２）、対照の梗塞体積は４時間の対照と類似しており、平均が３．８８％であり、中央値が２．２％である（Ｐ＝０．７０、正確なＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定）。１時間療法の動物は、最低対照値以下の８つの値のうちの７つを有し、６時間療法の動物は、最低対照値以下の５つの値のうち３つを有した。

顕微鏡による出血率は、４時間の研究にわたって発作領域内（Ｐ＝０．８５）および発作領域外（Ｐ＝０．３２）の両方で全ての群（ｎ＝４４）において類似していた。発作内の出血は、対照動物では１４％（ｎ＝７のうちの１）、ＤＤＦＰｅ前処置群では１４％（ｎ＝７のうちの１）、直後のＤＤＦＰｅ群では１４％（ｎ＝７のうちの１）、３０分ＤＤＦＰｅ群では２０％（ｎ＝５のうちの１）、１時間ＤＤＦＰｅ群（ｎ＝７）ではゼロ、２時間ＤＤＦＰｅ群では２０％（ｎ＝５のうちの１）、および３時間ＤＤＦＰｅ群（ｎ＝６）ではゼロに見られた。これらの群における発作外の出血の発生率は、それぞれ１４％、５７％、２８％、０％、１４％、２０％、および１７％であった。

７時間の対照ウサギは、４時間の対照動物と比較して数値的に大きな全体的な出血率を有したが、有意なレベルではなかった（８３％対２９％；Ｐ＝０．１０）。発作内の出血の発生率は、対照と比較して、１時間および７時間で安楽死させるまで９０分毎のＤＤＦＰｅによる治療で下降する傾向があった（Ｐ＝０．０６）。発作内の出血は、対照動物では６７％（ｎ＝６のうちの４）、１時間ＤＤＦＰｅ群（ｎ＝６）ではゼロ、および６時間ＤＤＦＰｅ群では６０％（ｎ＝５のうちの３）に見られた。発作外の出血は、これらの群のそれぞれ５０％、２０％、および３３％において生じ、群間で差はなかった（Ｐ＝０．８２）。

１つのＤＤＦＰｅ用量（ｎ＝１１）、２つの用量（ｎ＝２５）、３つの用量（ｎ＝７）、４つの用量（ｎ＝８）、ゼロの用量（すなわち、対照；ｎ＝１３）を受けた動物は、全て、明らかな有害事象を有することなく予定された安楽死まで生存した。

考察
急性発作に使用される神経保護剤の探求は、長年にわたって最優先のことであった。代用血液の並行探求には、代用ヘモグロビンおよび液体形態のＰＦＣが含まれている。低酸素症および虚血症にこれらの代用物を使用する多数の研究は、副作用および重篤な合併症に遭遇し、研究された全ての作用物質を、成功したヒト療法につなげることに失敗している。幾つかの酸素フリーラジカルスカベンジャーおよび他の新規技術は、小型動物の発作モデル、通常はマウスまたはラットにおいて極めて有望であることを示していた。依然として、ヒトの発作の療法につながるものはない（４）。ここで、塞栓溶解の可能性がない塞栓性発作モデルにおける新規酸素輸送手法が試験された。この発作のウサギモデルは、組織プラスミノーゲンアクチベーター（ＴＰＡ）発作療法の開発の成功に使用されたモデル（１６）と類似している。このモデルは、ラットおよびマウスよりも高価であるが、規模における有利さが重要であり、他の成功もヒトの結果につながっていることに留意しなければならない。これには、Ｓｔｒｏｋｅ Ａｃｕｔｅ Ｉｓｃｈｅｍｉｃ ＮＸＹ−０５９ Ｔｒｉａｌにおける酸化防止剤ＮＸＹ−０５９の失敗の予測も含まれた（１７，１８）。

血液は、主に赤血球が毛細管を移動する必要があるので、酸素を送達するには制限された許容量を有する。血流の減少または閉塞によって、この制限は重大になり、幾つかの領域ではほぼ直後の細胞死をもたらす梗塞を引き起こし、他では、直後の細胞死のない虚血性損傷を引き起こす。この危機に直面する領域は、境界域である。多くの発作において、潜在的に生存可能な脳組織の虚血性境界域は、酸素を送達することができれば救うことができる。

液体ＰＦＣに基づいた酸素運搬体を含む以前の療法は、酸素不足を補うことのほぼ失敗している。しかし、体温でガスのＤＤＦＰｅは、液体ＰＦＣよりも１体積量あたり何倍も多くの酸素を輸送する（図４）。ＤＤＦＰｅの静脈内用量は、他のＰＦＣに基づいた作用物質の１％未満である。ナノサイズの液滴および気泡は、ＴＰＡのように、赤血球よりも小さい空間を通過し、全血流が阻止された虚血性領域に酸素を輸送する。他のＰＦＣ剤は、大用量を必要とし、体内に長期間保持される。ヒトの薬物動態研究では、単回少用量の静脈内ＤＤＦＰｅは耐性が十分であり、有意な残留または副作用がなく呼気により急速に除去される（１２）。ラットおよびブタでは、大用量は２時間まで作用する（１９）。

静脈内に与えられると、ＤＤＦＰｅは、治療範囲で数時間「時計を一時停止させる」ことができ、更なる急性発作療法の橋渡しとして作用し、これは、現行の治療時間範囲を超えて遅れることがある。本発明のウサギ研究は、ＤＤＦＰｅが閉塞または超急性時間（すなわち、０〜３０分）の前に与えられるときだけでなく、１〜３時間の遅延のときも、未治療対照と比較して発作体積の減少において明確な利点を示す。発作前投与は、高危険性手法において予防療法のモデルを作ることができ、０〜３０分療法は、医原性虚血症状のモデルを作ることができるが、後者の群は、通常の発作療法のモデルを作り、これは更に遅れる（２０）。本発明の研究において、３時間での継続的に改善された結果は、臨床的には非常に有望であり、それは、大部分の慣用のヒト療法の静脈内ＴＰＡ投与は、この時間枠で効能を失い始め、発症の６時間の長さの後で実施されうる血管内再疎通は、主要医療施設に限定されているからである。この３時間改善は、ＤＤＦＰｅが更なる損傷を停止することに加え、非致死的な損傷を実際に逆転する可能性を生じる。７時間モデルは、損傷が、６時間投与の小型試料の大きさによる統計的に有意な治療利益にとって極端に進行していることを示す。重要なことに、このモデルは、１時間での投与が、多回用量による７時間まで成功を持続できることを示しており、この時点は、現在使用されている大部分の現行の血栓溶解プロトコールを超えている。成功の延長も可能でありうる。しかし、多回大用量の安全性は、ヒトにおいて実証されておらず、イヌにおいて問題があり、ＤＤＦＰｅの急速用量は、肺高血圧症および重篤な症状を引き起こした（２１）。

発作の４時間後の頭蓋内出血（ＩＣＨ）率の測定値は、全ての群において類似していた。７時間の対照ウサギにおける出血率の増加傾向は、この発症後数時間の時間範囲が微視的な出血の発生にとって重要であることを示唆している。特に励みになることは、１時間のＤＤＦＰｅで治療された７時間群におけるＩＣＨの不在である（１５，２２）。このことは、本療法の保護態様の可能性を生じるが、多数の動物研究により確認する必要がある（２３および図９）。

虚血性および出血性の急性発作に加えて、臨床適用には、高い危険性の心臓および頸動脈手術、または神経血管もしくは心臓介入の前処置も含まれ、医原性虚血症状の際に数時間の改善された組織酸素化をもたらす。一過性の凝塊、気泡、または低酸素症により引き起こされる多くの発作、認知欠損、または心筋梗塞を完全に回避することができる。手術および血管または心臓介入に関連する気体塞栓および低灌流の症状は、一過性の現象であり、ＤＤＦＰｅ治療の後に追加の療法を必要としない場合がある。ヒトの単回用量の経験は、安全であると思われ、この試験を素早く進めることができる。

ＤＤＦＰｅの効果を経時的に完全に調査する必要性に加えて、本研究の別の制限は、治療投与量試験を欠いていることである。超音波画像化のために確立された用量レベル、ならびにウサギおよびヒトの治療用量レベルの最適化を使用するこれらの研究が、必要である。顕著な利点が選択された投与量および時点において実証されているが、他の人工酸素運搬体と比較し、治療効果を完全に特徴付ける更なる研究が必要である。しかし、ＤＤＦＰｅの使用は、微小気泡および超音波（ＵＳ）による静脈内ＴＰＡ塞栓溶解、動脈内介入、または超音波塞栓溶解との組み合わせ治療として、血栓塞栓性発作モデルにおいて検査しなければならない。ここで、安全性および相乗的または追加的な効果が評価される。継続的な臨床前研究がこれらの制限を克服するのであれば、急性発作のヒト実現可能性試験は、急速に進展することができる。

ヒトへの投与量、時間、効能、および安全性を更に最適化することができる。このことは、２，０００人を超える患者での米国の造影剤としてのＤＤＦＰｅの以前の研究によって、および欧州医薬品審査庁（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ａｇｅｎｃｙ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）（現在は、欧州医薬品庁（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ Ａｇｅｎｃｙ）として知られている）による米国の造影剤としての認可によって促進される（２４，２５）。現行の単回用量は、ヒト造影剤として使用されているものと類似しており、治療使用の用量最適化および多回用量の安全性試験は、未だ実施されていない。造影剤としてのＤＤＦＰｅの報告は非常に肯定的であったが、開発は、経済的理由で停止され、ＤＤＦＰｅは、現時点で市販されていない。

静脈内ＤＤＦＰｅは、おそらく低酸素症の程度を減少することによって虚血症から脳組織を保護する。発作において梗塞体積を減少し、効果を反復用量によって数時間持続させることができる。ヒトにおける安全性は実証されている。更なる動物研究、ならびに発作、血液損失、虚血症、低酸素症の際に、および高危険性手法のような幾つかの保護状況において、治療酸素送達剤としての急速な開発が認められている。

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ドデカフルオロペンタンエマルションはウサギ虚血性発作モデルにおいて梗塞体積を減少する
ニュージーランド白ウサギ（ｎ＝４０）を使用した。動物に対する手順は、上記の実施例２に記載されたとおりであった。簡潔には、ウサギを３０ｍｇ／ｋｇのケタミンおよび３ｍｇ／ｋｇのキシラジンの筋肉内注射により鎮静させ、イソフルランで麻酔をかけた。大腿動脈を露出させ、改変した６５ｃｍの傾斜先端３Ｆカテーテルを使用して、ＩＣＡを選択した。ＩＣＡに流入させた直径が７００〜９００μｍの３つの塞栓性球体（Ｅｍｂｏｓｐｈｅｒｅ Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ；Ｂｉｏｓｐｈｅｒｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｃ．）による塞栓形成は、通常は中大脳動脈（ＭＣＡ）および前大脳動脈（ＡＣＡ）である幾つかの分岐を閉塞させた。均一の欠陥をもたらすため、他の閉塞を有するウサギを排除した。

治療は、耳静脈カテーテルを使用して、群のスケジュールに従って開始した。塞栓形成の４時間後、ウサギを１．５ｍＬの静脈内ペントバルビタールで安楽死させた。

ウサギを無作為に４群に割り当てた：１）対照、治療なし（ｎ＝７）；２）直後のＤＤＦＰｅ（ｎ＝８）；３）３０分のＤＤＦＰｅ（ｎ＝６）；４）６０分のＤＤＦＰｅ（ｎ＝７）。治療は、指定された群時間での１用量の２％ｗ／ｖのＤＤＦＰｅの静脈内０．６ｍＬ／ｋｇおよび９０分後の第２の同一用量であった。

安楽死させた後、脳を採取し、直後に生理食塩水で冷やし、次に冷やした脳成形型を使用して０．４ｃｍ間隔で冠状に薄片に切った。脳切片（ｎ＝８）を、１％の２，３，５−トリフェニルテトラゾリウムクロリドの中に３７℃で４５分間入れ、次に１０％ホルマリンで固定し、デジタル撮影した。脳の大きさ、および梗塞の領域を、盲検様式でデジタル分析（ＮＩＨ ＩｍａｇｅＪ）を使用して測定した。梗塞体積の率を計算した。

梗塞体積が正常に分布されなかったので、梗塞体積の順位を、ＳＡＳのＰＲＯＣ ＧＬＭ（Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ同等物）により分析した。ダネット調整ｐ値を、各ＤＤＦＰｅ群と対照との比較に使用した。

結果および考察
４０匹のウサギのうち、通常、痙攣により６匹で血管造影法に失敗し、３４匹は、血管造影法、およびＭＣＡまたはＡＣＡを梗塞させる塞栓形成に成功し、梗塞を示した（図９）。６匹は、後大脳または上小脳動脈の閉塞も有し、研究から排除され、分析には２８匹が残った。梗塞体積の中央率は、ＤＤＦＰｅで治療した全てのウサギ（０．３０％）が、対照（３．２０％）と比較して減少した（Ｐ＝０．００５４）。全ての個別の群の中央値は、対照より低かった（２＝０．２０％、ｐ＝０．０３３；３＝０．３５％、ｐ＝０．０７１；４＝０．３０％、ｐ＝０．０３９）（図１０）。

体温でドデカフルオロペンタン（ＤＤＦＰｅ）は、酸素不足を補うことにほぼ失敗している液体ペルフルオロカーボン（ＰＦＣ）のような液体フルオロカーボンに基づいた酸素運搬体を使用する以前の療法より、１体積量あたり何倍も多くの酸素を輸送する。簡単なＤＤＦＰｅの静脈内用量は、他のＰＦＣに基づいた作用物質の１／１００未満である。ナノサイズの液滴および気泡は、ｔＰＡのように、赤血球よりも小さい空間を通過し、全血流が阻止された虚血性領域に酸素を輸送する。他のＰＦＣ剤は、大用量を必要とし、体内に長期間保持される。ヒトの薬物動態研究では、静脈内ＤＤＦＰｅは耐性が十分であり、約２時間作用し、数時間以内に呼気により除去される。

このウサギ研究は、直後に与えられるときだけでなく、３０または６０分の遅延のときも、未治療対照と比較して発作体積の減少において明確な利点を示す。直後の投与は高危険性手法において予防療法のモデルを作ることができ、一方、遅延群は通常の発作のモデルを作る。

虚血性および出血性の両方の急性発作に加えて、臨床適用には、高い危険性の心臓および頸動脈手術、または神経血管もしくは心臓介入の前処置も含まれ、医原性虚血症状の際に数時間の改善された組織酸素化をもたらす。一過性の凝塊、気泡、または低酸素症により引き起こされる多くの発作または心筋梗塞を、完全に回避することができる。気体塞栓および低灌流の症状は、一過性の現象であり、ＤＤＦＰｅ治療の後に追加の療法を必要としない場合がある。

塞栓形成の３時間後のＤＤＦＰｅ治療
外科的手法、ＤＤＦＰｅによる血管造影治療、梗塞および梗塞体積の測定は、上記の実施例２に記載されたとおりであった。ウサギを無作為に６群に割り当てた：１）対照、治療なし；２）直後のＤＤＦＰｅ；３）３０分のＤＤＦＰｅ；４）１時間のＤＤＦＰｅ；５）２時間のＤＤＦＰｅ；および６）３時間のＤＤＦＰｅ。

梗塞体積の中央率は、ＤＤＦＰｅで治療した全てのウサギが、対照と比較して、塞栓形成の３時間後でも有意に減少した（図１１）。

ＤＤＦＰｅによる前処置および塞栓形成の７時間後の治療
外科的手法、ＤＤＦＰｅによる血管造影治療、梗塞および梗塞体積の測定は、上記の実施例２に記載されたとおりであった。ウサギを無作為に８群に割り当てた：１）対照、治療なし；２）対照、塞栓形成の７時間前にＤＤＦＰｅで前処置；３）直後のＤＤＦＰｅ；４）３０分のＤＤＦＰｅ；５）１時間のＤＤＦＰｅ；６）２時間のＤＤＦＰｅ；７）３時間のＤＤＦＰｅ；および８）６時間のＤＤＦＰｅ。

梗塞体積の中央率は、ＤＤＦＰｅで治療した全てのウサギが、対照と比較して、塞栓形成の３時間後まででも有意に減少した（図１２）。

塞栓形成後の超急性および急性ＤＤＦＰｅ治療
外科的手法、ＤＤＦＰｅによる血管造影治療、梗塞および梗塞体積の測定は、上記の実施例２に記載されたとおりであった。ウサギを無作為に３群に割り当てた：１）対照、治療なし（７匹のウサギ）；２）塞栓形成の０〜３０分後のＤＤＦＰｅでの超急性治療；および３）塞栓形成の１〜３時間後のＤＤＦＰｅでの急性治療。

梗塞体積の中央率は、ＤＤＦＰｅによる超急性および急性治療においてＤＤＦＰｅで治療した全てのウサギが、対照と比較して有意に減少した（図１３）。

７時間でのＤＤＦＰｅの効能は低用量で維持される
別の実験において、７時間での効能の用量範囲の永久球体閉塞モデルを実施した。閉塞モデルおよびＤＤＦＰｅの投与は、上記の実施例に記載されたとおりである。結果は、ＤＤＦＰｅが上記の実施例に記載されたものより低い用量で効果的であったことを示し、０．３ｍｌ／ｋｇおよび０．１ｍｌ／ｋｇの両方で肯定的であった（それぞれ、Ｐ＝＜０．０１）。

実施例８．ＤＤＦＰｅおよびｔＰＡ療法の組み合わせ
この実施例において、組み合わせ研究は、老化凝塊を使用して、塞栓形成の１時間後に０．６ｍｌ／ｋｇの静脈内ＤＤＦＰｅの投与により、続いて１時間の標準的静脈内ｔＰＡ療法により実施した。第２用量の静脈内ＤＤＦＰｅを９０分で与えた。これらの動物は２４時間生存した。対照（ｎ＝１３）は、平均梗塞体積の３．０４％を示し、一方、ＤＤＦＰｅ動物（ｎ＝６）は、０．４３％であった。これらの結果は、ＤＤＦＰｅ（約５時間の適用範囲で２つの用量に制限）およびｔＰＡ療法の組み合わせは、閉塞凝塊が溶解し、過剰な出血が灌流を伴って生じないとき、改善を生じることを示す。

ＤＤＦＰｅ投与は血管再生なしで神経保護を２４時間維持することができる
２４時間にわたる合計で１５用量の９０分毎での０．１ｍｌ／ｋｇの静脈内ＤＤＦＰｅ用量を、永久球体閉塞モデルに使用した。ＤＤＦＰｅ用量は塞栓形成の１時間後に開始した。実験は６匹の動物を使用して繰り返した。平均梗塞体積（閉塞した脳の部分）は、対照の２．８７％と比較して０．５５％であった（ｐ＝０．０１）。全ての動物は２４時間生存した。したがって、神経保護は血管再生なしで２４時間維持されうる。加えて、これらの実験は、この用量のＤＤＦＰｅがウサギにおいて耐性されうることを示す。

Claims (6)

1. 虚血性事象によりもたらされる虚血を経験している組織において梗塞体積を低減するための医薬組成物であって、該医薬組成物が、ドデカフルオロペンタンを１％〜５％ｗ／ｖ含むエマルションを含有し、該エマルションが虚血性事象の発生の直後から症状発症の１時間後〜２４時間後までの範囲の時点における０．０１ｍｌ／ｋｇ〜１ｍｌ／ｋｇの用量でのボーラス静脈内投与用に製剤される、脳出血の発生率を増加させることなく該梗塞体積が低減される医薬組成物。
2. 梗塞体積が、酸素輸送物質が同等の虚血性事象の際に投与されないときの梗塞体積と比較して、10%、20%、30%、40%、50%、60%、または70%〜90%減少される、請求項１に記載の医薬組成物。
3. 医薬組成物が、抗凝血薬および血栓溶解剤から選ばれる第２の作用剤との併用で投与される、請求項２に記載の医薬組成物。
4. 医薬組成物が、梗塞体積が酸素輸送物質が同等の虚血性事象の際に投与されないときの梗塞体積と比較して、７０〜９０％まで低減されるように組織の酸素化を改善する、請求項３に記載の医薬組成物。
5. 虚血性事象が、発作である、請求項４に記載の医薬組成物。
6. 医薬組成物が、ｔＰＡとの併用で投与される、請求項２に記載の医薬組成物。

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