CN104039316A - 作为中风和局部缺血治疗的十二氟戊烷乳液 - Google Patents

Abstract

本发明提供了用于在经历局部缺血或在处于形成局部缺血的危险的受试者的组织中减少梗塞体积的方法和组合，所述方法包括给予受试者有效量的全氟烃乳液与血栓溶解剂的组合，其中所述给药在不解决所述局部缺血性事件的情况下减少梗塞体积。

Description

作为中风和局部缺血治疗的十二氟戊烷乳液

政府权利

本申请在由美国国立卫生研究院授予的HL082481的政府支持下完成。政府享有本发明的某些权利。

发明领域

本发明提供了用于在经历局部缺血或处于发生局部缺血的危险的受试者中减少组织损伤的方法和组合。

发明背景

涉及常规地失血、局部缺血或缺氧的状况导致引起发病率和死亡率的器官和组织损伤。这些状况包括常见的手术操作和介入性操作以及创伤和自然疾病状态。这些事件作为局部缺血综合征存在，广泛遍布身体和肢端，且在脑中为中风。另外，包括手术和血管造影术的临床操作可产生微栓子，导致无症状心肌缺血或亚临床大脑局部缺血以及临床中风。神经保护化合物、高压氧、基于血红蛋白的血液替代物、其他方法和基于全氟化碳的氧载体已显示具有前景，但大部分不能补偿于这些状况。在此时立即的血管再生和氧化的血流的重建仍为临床中风治疗的首要焦点。

因此需要具有物理上溶解、运输和递送显著的量的氧和其他富电子的呼吸气到局部缺血性事件中否则将不会被氧化的微循环和组织的甚至最小的区域中的能力的另一氧运输物质。

发明概要

本发明的一方面包括用于在经历由于局部缺血性事件导致的局部缺血的受试者的组织中减少梗塞体积的方法。所述方法包括向受试者施用有效量的包含全氟化碳乳液的组合物，其中在未解决局部缺血性事件的情况下减小了梗塞体积。

本发明的另一方面包括用于在处于局部缺血组织损伤的危险的受试者中提高组织氧合的方法。所述方法包括在导致该受试者处于局部缺血性组织损伤的高危险的医疗操作之前向该受试者施用有效量的包含全氟化碳乳液的组合物。

本发明的另一方面包括用于在处于局部缺血性组织损伤的危险的受试者中提高神经保护的方法。所述方法包括在导致该受试者处于局部缺血性神经组织损伤的高危险的医疗操作之前向该受试者施用有效量的包含全氟化碳乳液的组合物。

本发明的另一方面包括用于治疗出血性中风的方法。所述方法包括向需要出血性中风的治疗的受试者施用有效量的包含全氟化碳乳液的组合物。

本发明的另一方面包括用于减小由于颅内脑出血导致的梗塞大小的方法。所述方法包括向需要颅内脑出血治疗的受试者施用有效量的包含全氟化碳乳液的组合物。

本发明的另一方面包括组合。所述组合包含组合物和溶栓剂，所述组合物包含全氟化碳乳液。

以下详细说明了本发明的其他方面和陈述。

附图简述

图1描绘了用于测量氧吸收的装置的图像。左侧的小瓶包含PFC乳液之一和右侧的小瓶包含空白制剂。

图2描绘了用于在37℃下测量注射后体积膨胀的装置。

图3用图表描绘了在23℃±2℃下持续6个月的DDFPe的粒度分布。误差条代表三个重复测量结果的一个标准偏差。空心菱形代表在该时间点小于2％的粒子分布的测量结果。

图4用图表描绘了在60分钟的过程中在21℃(蓝色)和37℃(红色)下被5mL的DDFPe(三角)、PFDe(菱形)、PFOBe(正方形)和制剂空白(空心圆圈)的注射物所吸收的氧的量。

图5用图表描绘了在将5mL的PFC乳液、空白制剂和水的3个注射物加热至37℃后的体积增加。

图6描绘了兔血管造影术的图像。颈内动脉的超选择性放大血管造影显示了(A)Willis环和MCA和ACA(分别为箭头和三角)和(B)注射三种栓塞性球之后MCA和ACA的闭塞。

图7用图表描绘了MCA和ACA栓塞后的脑梗塞。来自2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色的兔脑的两个连续的切片清楚地展示出梗塞的苍白区域(箭头)。比例条代表毫米。

图8用图表描绘了4小时的梗塞体积对比DDFPe处理时间。对处理时间分类以模仿多种不同的临床情况，预处理、超急性治疗和急性治疗，显示了与对照相比较改良的转归。无论是否使用DDFPe作为预处理(栓塞前30分钟)、超急性处理(0至30分钟)或急性处理(1至3小时)，中风体积显著减少了。*P≤0.021，Dunnett校正后的排序等级的比较。

图9描绘了血管造影解剖学的图像，兔脑的(A)大脑中动脉和大脑前动脉的栓塞(B)，和兔脑的横切面中的伴有出血的梗塞(C)。

图10描绘了在接受DDFPe处理的局部缺血中风兔模型中的中风体积。甚至当在永久性动脉闭塞后60分钟施用时DDFPe降低了中风。(水平线：中位值，实心正方形：平均值，垂直线：最大值和最小值，矩形：25％和75％)。

图11描绘了在栓塞后长达3小时接受DDFPe治疗的局部缺血中风兔模型中的中风体积。

图12描绘了在栓塞后长达6小时接受DDFPe治疗的局部缺血中风兔模型中的中风体积。注意，对于图12，对于每个时间点的对照如下：

时间点	对照值
		30分钟	4小时时的对照(最左侧的柱)
1小时	4小时时的对照(最左侧的柱)
		2小时	4小时时的对照(最左侧的柱)
3小时	4小时时的对照(最左侧的柱)
		6小时	7小时时的对照

图13描绘了栓塞后0至30分钟(超急性)和栓塞后1至3小时(急性)接受DDFPe处理的局部缺血中风兔模型中的中风体积。

发明详述

本发明描述了可用于在受试者中减少由于局部缺血性事件导致的组织损伤的方法和组合。所述方法包括向受试者施用包含氧运输物质的组合物或组合。在一个优选的实施方案中，氧运输物质是包含全氟化碳乳液的组合物。并且，所述方法和组合有效地减少经历局部缺血的受试者或处于由于医疗操作导致的局部缺血的危险的受试者的梗塞体积并向该受试者提供神经保护。本发明的方法还包括减少来自出血性中风或颅内出血的组织损伤。有利地，该方法和组合对于预处理处于局部缺血性事件的高危险的受试者是有效的。

I.本发明的方法

(a)减少梗塞体积的方法

在一个实施方案中，本发明包括用于在经历由于局部缺血性事件导致的局部缺血的受试者的组织中减少梗塞体积的方法。所述方法包括向受试者施用有效量的包含氧运输物质的组合物，其中在不解决局部缺血性事件的情况下减少了梗塞体积。在一个优选的实施方案中，氧运输物质是包含全氟化碳乳液的组合物。

一般而言，在解决局部缺血性事件之前可向受试者施用氧运输物质。换言之，即使组织中的正常血流、血压或氧合水平未重建，可施用氧运输物质以减少梗塞体积。

i.局部缺血

如本文所用的，术语“局部缺血”可指通常由于血管中的因子导致的血液供给的限制，和随之由于充氧不足导致的组织的损伤或功能异常。局部缺血可由“局部缺血性事件”所导致。一般而言，“局部缺血性事件”可由闭塞的脉管、低血压或缺氧所导致。局部缺血性事件的非限制性例子可包括疾病诸如镰状细胞性贫血和烟雾阴影病，或循环系统中可导致闭塞的脉管或出血的异常，比如肠扭转或疝，诸如由肿瘤导致的动脉的机械压迫、室性心动过速、心脏病发作和先天性心脏缺陷导致的极低的血压、心血管呼吸停止、出血、一氧化碳中毒、创伤对动脉的损伤，或如动脉粥样硬化或血管炎，或对动脉的血管收缩诸如可卡因收缩、医源性局部缺血性事件诸如心脏手术或其他手术介入、冠脉介入和颈动脉介入、栓塞(循环中的异物)诸如羊水栓塞、暂时性凝血或气泡(气体栓)、炎症和输注不足事件，限制血流并迫使血流至身体的肢部比如在特技飞行和军事飞行中，局部的极寒比如由于霜冻或不适当的冷压治疗、止血带应用、缺氧、低血糖(低于葡萄糖的正常水平)所导致，动脉和其他闭塞诸如动脉栓、血栓或动脉粥样硬化斑和中风。在这些例子中的多数中，疾病或异常可通过形成或增加血块或出血的形成的危险导致局部缺血，其可导致血液停止供给至身体的部分。在一些实施方案中，局部缺血可由于中风导致。

局部缺血可发生于任何器官、组织或身体的部分。例如，肠系膜局部缺血，可由于血液供给到小肠的不足而导致；局部缺血结肠炎，可由于血液供给到大肠的不足而导致；脑局部缺血，可由于因闭塞的血管或出血引起的血液供给到脑的不足而导致，导致出血性中风；心肌局部缺血可由于血液供给到心脏的不足而导致；冠脉局部缺血可由于血液供给到冠状动脉的不足而导致；肾脏局部缺血，也称作肾局部缺血，可由于血液供给到单肾或双肾或肾单位的不足而导致；肢体局部缺血可由于血液供给到肢体的不足而导致；前部缺血性视神经病变(AION)可由于血液供给到视神经的不足而导致。

在某些实施方案中，局部缺血可由于医疗操作引起。例如，在一些实施方案中，局部缺血可由于增加脉管闭塞的危险的医疗操作引起(例如，产生栓或微栓的医疗操作)。可增加脉管闭塞的危险的医疗操作的非限制性的例子可包括可导致导致局部缺血的大型手术操作或小型手术操作，和脊柱按摩矫正。可导致局部缺血的医疗操作的其他例子包括心脏手术比如开心脏操作、冠状动脉旁路移植手术、心肺旁路移植手术、颈动脉手术、心脏手术、血管成形术、支架术、装置植入术、切除术和心瓣膜手术。可导致局部缺血的医疗操作的又一些另外的例子包括“开放手术”以及矫形手术、骨骼手术和髋骨折固定手术。

ii.梗塞

在一些实施方案中，本发明提供了用于在组织中减少梗塞体积的方法。在优选的实施方案中，本发明的方法提供了在不增加脑出血的发生率的情况下在组织中减少梗塞体积。如本文所用的，术语“梗塞”可指由因如以上章节I(a)i中所描述的局部缺血导致的组织损伤或死亡导致的损害。测量梗塞体积的方法是本领域中已知的。例如，梗塞体积可通过利用活细胞或死细胞染色染色组织或器官，然后测量与组织或器官的部分紧密相问的梗塞的面积而在组织或器官中进行死后测量。可选地，梗塞体积可利用放射照相术、计算机断层照相术、磁共振成像或其他体内成像技术在活的受试者中进行测量。梗塞体积可以体积单位来表示，或可表示为其所存在的组织或器官的百分比。

在一些实施方案中，与当在可比较的局部缺血性事件过程中不施用氧运输物质的梗塞体积相比较，梗塞体积可减少约100％、90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％或10％。例如，与当在可比较的局部缺血性事件过程中不施用氧运输物质的梗塞体积相比较，梗塞体积可减少约100、99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、89、88、87、86、85、84、83、82、81、80、79、78、77、76、75、74、73、72、71、70、69、68、67、66、65、64、63、62、61、6、59、58、57、56、55、54、53、52、51、50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11或10％。在一个示例性的实施方案中，与当在可比较的局部缺血性事件过程中不施用氧运输物质的梗塞体积相比较，梗塞体积可减少约70％至约90％。

在特定的实施方案中，与当不施用氧运输物质时的约3.2％或更高的梗塞体积相比较，当施用本公开内容的氧运输物质时梗塞体积可减小至组织的约0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0或约3.1％。在另外的实施方案中，与当不施用氧运输物质时的约3.2％或更高的梗塞体积相比较，当施用本公开内容的氧运输物质时梗塞体积可减小至组织的约0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5或约0.6％。在又一些另外的实施方案中，与当不施用氧运输物质时的约3.2％或更高的梗塞体积相比较，当施用本公开内容的氧运输物质时梗塞体积可减小至组织的约0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1或约1.1％。在另外的实施方案中，与当不施用氧运输物质时的约3.2％或更高的梗塞体积相比较，当施用本公开内容的氧运输物质时梗塞体积可减小至组织的约1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5或约1.6％。在另外的实施方案中，与当不施用氧运输物质时的约3.2％或更高的梗塞体积相比较，当施用本公开内容的氧运输物质时梗塞体积可减小至组织的约1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2或约2.1％。在又一些另外的实施方案中，与当不施用氧运输物质时的约3.2％或更高的梗塞体积相比较，当施用本公开内容的氧运输物质时梗塞体积可减小至组织的约2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5或约2.6％。在另外的实施方案中，与当不施用氧运输物质时的约3.2％或更高的梗塞体积相比较，当施用本公开内容的氧运输物质时梗塞体积可减小至组织的约2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0或约3.1％。在又一些另外的实施方案中，与当不施用氧运输物质时的约3.2％或更高的梗塞体积相比较，当施用本公开内容的氧运输物质时梗塞体积可减小至组织的约0、0.5、1、1.5、2、2.5、3.0或约3.1％。

(b)用于提高氧合或在医疗操作之前提供神经保护的方法

本发明的另一个实施方案中包括用于在处于局部缺血性组织损伤的危险的受试者中提高组织氧合的方法。所述方法包括在导致受试者处于局部缺血组织损伤的高危险的医疗操作之前将有效量的包含氧运输物质的组合物施用于受试者。在一个优选的实施方案中，氧运输物质是包含全氟化碳乳液的组合物。可导致局部缺血性组织损伤危险的医疗操作的非限制性例子详细描述于以上的章节I(a)i中。

本发明的另一个实施方案包括用于在处于局部缺血性组织损伤的危险的受试者中提高神经保护的方法。方法包括在导致受试者处于神经局部缺血性组织损伤的高危险的医疗操作之前向受试者施用有效量的包含氧运输物质的组合物。在一个优选的实施方案中，氧运输物质是包含全氟化碳乳液的组合物。如本文所用的，术语“神经保护”指受试者的神经系统中降低的组织损伤。神经系统包括中枢神经系统和周围神经系统。

(c)用于治疗出血性病症的方法

本发明的又一个另外的实施方案包括用于治疗出血性中风的方法。所述方法包括向需要治疗出血性中风的受试者施用有效量的包含氧运输物质的组合物。在一个优选的实施方案中，氧运输物质是包含全氟化碳乳液的组合物。

本发明的另一方面包括用于减小由于颅内脑出血导致的梗塞的大小的方法。所述方法包括向需要治疗颅内脑出血的受试者施用有效量的包含氧运输物质的组合物。在一个优选的实施方案中，氧运输物质是包含全氟化碳乳液的组合物。

(d)受试者

本公开内容的方法包括向受试者施用氧运输物质。需要氧运输物质的受试者的非限制性例子可以是啮齿类、人类、家畜动物、伴侣动物、实验室动物或动物园动物。在一个实施方案中，需要氧运输物质的受试者可以是实验室动物。实验室动物的非限制性例子包括兔、小鼠、豚鼠、仓鼠或大鼠。在另一个实施方案中，需要氧运输物质的受试者可以是啮齿类，例如，小鼠、大鼠、豚鼠等。在又一个另外的实施方案中，需要氧运输物质的受试者可以是家畜动物。适宜的家畜动物的非限制性例子可包括猪、牛、马、山羊、绵羊、美洲驼和羊驼。在另一个实施方案中，需要氧运输物质的受试者可以是伴侣动物。伴侣动物的非限制性例子可包括宠物诸如狗、猫、兔和鸟。在又一个另外的实施方案中，需要氧运输物质的受试者可以是动物园动物。如本文所用的，“动物园动物”指可在动物园中发现的动物。这样的动物可包括非人灵长类、大型猫科动物、狼和熊。在一个示例性的实施方案中，需要氧运输物质的受试者可以是人类。

在一些实施方案中，受试者可正在经历局部缺血。在某些实施方案中，受试者可正在经历由闭塞的脉管、缺氧或低血压导致的局部缺血。在一个示例性的实施方案中，受试者可正在经历由于中风导致的局部缺血。

在另外的实施方案中，受试者可处于发生局部缺血性事件的高危险中。将被本领域中的那些技术人员理解的是受试者可处于由于可控的或非可控的危险因素导致的局部缺血性事件的高危险。可控的危险因素的非限制性例子可包括高血压、心房颤动、高胆固醇、糖尿病、动脉粥样硬化、循环问题、烟草使用和吸烟、酒精使用、身体不活跃和肥胖。可控的危险因素的非限制性例子可包括年龄、性别、种族、家族史、既往中风或TIA、纤维肌性发育不良和卵圆孔未闭(心脏中的PFO或洞)。

在又一些另外的实施方案中，受试者可经历增加局部缺血性事件的危险的医疗操作。可增加脉管闭塞的危险的医疗操作的非限制性例子可包括可导致引起局部缺血的出血或血凝块的形成的大型或小型手术或基于导管的操作或介入，和脊柱按摩矫正。

在另外的实施方案中，受试者可需要出血性中风的治疗。

(e)优选的实施方案

在一些实施方案中，本发明包括用于在经历由闭塞的脉管导致的局部缺血的受试者的组织中减少梗塞体积的方法，该方法包括向受试者施用有效量的十二氟戊烷乳液，其中所述十二氟戊烷乳液提高了组织的氧合从而在未解决闭塞的情况下减少了梗塞体积。

在另外的实施方案中，本发明包括用于在增高脉管闭塞的危险的医疗操作过程中减少脉管闭塞的方法，该方法包括在进行所述医疗操作之前向受试者施用有效量的十二氟戊烷乳液。

在又一个另外的实施方案中，本发明包括用于在处于发生闭塞血管的高危险的受试者的组织中减少梗塞体积的方法，该方法包括在闭塞的血管的症状发作之前向受试者施用有效量的十二氟戊烷乳液。

在以上的实施方案的每一个中，所述方法可进一步包括解决闭塞。

在另外的实施方案中，本发明包括用于治疗出血性中风的方法，该方法包括向需要出血性中风的治疗的受试者施用有效量的十二氟戊烷乳液。

在优选的实施方案中，受试者选自啮齿类、研究动物、伴侣动物、农业动物和人类。

在另外的优选的实施方案中，十二氟戊烷乳液在范围从闭塞的血管的症状刚刚发作后至闭塞的血管的症状发作后24小时的时间中来施用。

在又一些另外的优选的实施方案中，将十二氟戊烷乳液静脉内施用于受试者。

在另外的优选的实施方案中，以每千克受试者约0.2mL至约1mL的量将约1％至约5％w/v的十二氟戊烷乳液的溶液施用于受试者。

在又一些优选的实施方案中，以每千克受试者约0.01mL至每千克受试者约1ml的量将约2％w/v的十二氟戊烷乳液的溶液施用于受试者。

在另外的优选的实施方案中，十二氟戊烷乳液提高了对组织的氧合从而在不增加脑出血的发生率的情况下减少了梗塞体积。

在又一些另外的实施方案中，将十二氟戊烷乳液与抗凝血剂组合施用。

在另外的实施方案中，将十二氟戊烷乳液与选自由组织纤溶酶原激活剂、抗链激酶、链激酶、尿激酶和其组合组成的组的溶栓药结合施用。

在又一些另外的实施方案中，十二氟戊烷乳液与选自由心脏手术、开放手术、矫形手术和骨骼手术、血管成形术、支架术、装置植入和切除术和其组合组成的组的手术技术结合施用。

在另外的优选的实施方案中，受试者正经历由于中风导致的局部缺血。

II.组合物

本公开内容的方法包括向受试者施用氧运输物质。在一些实施方案中，氧运输物质可以是血液、血液制品或合成产生的氧运输物质。在优选的实施方案中，氧运输物质可以是合成产生的氧运输物质。合成产生的氧运输物质是本领域中已知的并可包括基于血红蛋白的氧载体和全氟化碳。在一些实施方案中，合成产生的氧运输物质可以是基于血红蛋白的氧载体。基于血红蛋白的氧载体的非限制性例子可以是血红蛋白、聚合的血红蛋白、缀合的血红蛋白、交联的血红蛋白、磷脂包裹的血红蛋白、重组的血红蛋白、与超氧化物歧化酶和过氧化氢酶复合的基于血红蛋白的氧载体，和血红蛋白衍生物。在优选的实施方案中，合成产生的氧运输物质可以是全氟化碳(PFC)。PFC可以是溶解氧的液体全氟化碳。溶解氧且可用作氧运输物质的液体PFC的非限制性例子包括全氟溴辛烷、全氟二溴辛烷、溴氟碳化合物、全氟醚、Fluosol DA^TM、F-44E、1，2-双全氟丁基-乙烯、F-4-甲基八氢喹嗪、9至12碳全氟胺、全氟萘烷、全氟茚满、全氟三甲基二环[3，3，1]壬烷、全氟甲基金刚烷酯和全氟二甲基金刚烷。

PFC还可以是用于将氧递送到受试者的身体的气体。特别有用的是已经被配制在微泡中的PFC气体。包含PFC的微泡是本领域中已知的并公开于，例如，美国专利第5,393,524号、第5,409,688号、第5,558,854号、第5,558,855号、第5,595,723号、和第5,558,853号中，其均通过引用并入本文。可被配制在微泡中的PFC气体的非限制性例子包括十二氟戊烷(DDFPe)、六氟化硫、戊烷、六氟丙烯、八氟丙烷、六氟乙烷、八氟-2-丁炔、六氟-1，3-丁二烯、异戊二烯、八氟环丁烷、十氟丁烷、顺-2-戊烯、二甲硫醚、乙胂、溴氯氟甲烷、反-2-戊烯、2-氯丙烷、六氟二硫醚、乙硫醇、乙醚、乙基乙烯基醚、异戊烯炔、三氟胂、溴化呋喃、顺氯丙烯、氟化丁基、1，1二氯乙烷、异丙基甲基醚、异丙胺、甲酸甲酯、2-乙酰基-呋喃、氟化乙烯、1-戊烯、异丙基乙炔、全氟戊烷、异戊烷、乙烯基醚、2-丁炔、1，4-戊二烯、四甲基硅烷、二甲基膦、二溴二氟甲烷、2-氯-丙烯、二氟碘甲烷、乙醛、三甲基硼酸、3-甲基-2-丁烯、1，1二甲基环丙烷、氨基乙烷、乙烯基溴、二硅甲烷、三氯氟甲烷，溴氟甲烷、三氟二氯乙烷、全氟戊烯及其他含氟烃。在优选的实施方案中，氧运输物质可以是包含PFC十二氟戊烷(DDFPe)的微泡。

用作氧治疗的优选的碳氟化合物具有在约室温和大约或接近生理温度之间的沸点。在一个实施方案中，碳氟化合物具有约100℃以下的沸点。优选的碳氟化合物是全氟戊烷，且全氟异戊烷为特别优选的。其他物质包括正-全氟戊烷、全氟丙烷(沸点-36.7℃)、全氟丁烷(沸点＝-1.7℃)、全氟环己烷(沸点59-60℃)、全氟甲基环戊烷(沸点48℃)、正-全氟己烷(沸点58-60℃)、全氟环戊烷(沸点45℃)和全氟三乙胺(沸点68-69℃)。

为进行参考，以下表A列出了一些PFC的沸点。

表A

PFC	沸点
		六氟乙烷(全氟乙烷)	-78.2℃

八氟丙烷(全氟丙烷)	-36.7℃
		十氟丁烷(全氟丁烷)	-1.7℃
十二氟戊烷(全氟戊烷)	29.05-29.45℃
		全氟己烷(十四氟己烷)	56℃
全氟庚烷(十六氟庚烷)	82-84℃
		全氟辛烷(十八氟辛烷)	103-104℃

血液中包含能够转运氧的PFC的微泡比红细胞小，且能够部分地流过阻塞的脉管以将大量的氧递送到氧缺少的组织或器官。配制包含PFC的微泡的方法是本领域中已知的，且公开于例如美国专利第5,393,524号和第5,558,855号，其均通过引用并入本文。实质上，通过相移技术来制备包含PFC气体的微泡，其中在冷的环境中制备液体PFC液滴的乳液，且然后当灌注或注射到单独的个体时，液滴变为包含PFC气体的汽化的气体微泡。

(a)乳液

如本文所用的，术语“乳液”可指一种不混溶的液体以液滴的形式分散于另一种液体的胶态的分散体，除非分散相和连续相是折射率匹配的，通常所述不混溶液体的直径大于约100nm且其通常是不透光的。通常，本发明的乳液包含分散的PFC液滴和连续相中的两亲性物质。

本发明的胶态的分散体的连续相可以是水成介质。如本文所用的，术语“水成介质”可指含水液体，其可包含药学上可接受的添加剂诸如酸化剂、碱化剂、杀菌防腐剂、抗氧化剂、缓冲剂、螯合剂、络合剂、增溶剂、湿润剂、溶剂、悬浮剂和/或增粘剂，张度剂、润湿剂或其他生物相容性物质。两亲性物质可以是生物相容性蛋白、含氟表面活性剂、聚氧丙烯聚氧乙二醇非离子嵌段共聚物和合成的表面活性剂。

在一些实施方案中，本发明的组合物可包含表面活性剂。可用于本发明的组合物的表面活性剂的非限制性例子可包括多种商业上的阴离子、阳离子和非离子表面活性剂，包括Tweens、Spans、Tritons和类似的表面活性剂，磷脂、胆固醇、PLURONICHAMPOSYL(W.R.Grace Co.，Nashua、N.H.)、十二烷基硫酸钠、Aerosol413(American Cyanamid C0.，Wayne、N.J.)、Aerosol200(American Cyanamid Co.)、LIPOPROTEOL (Rhodia Inc.，Manmmoth，N.J.)、STANDAPOL (Henkel Corp.，Teaneck，N.J.)、(Finetex Inc.，Elmwood Park，N.J.)、和CYCLOPOL (Cyclo Chemicals Corp.，Miami、Fla.)、两性表面活性剂，比如以以下商品名出售的那些：(Henkel Corp.)、LONZAINE(Lonza、Inc.)、NIRNOL(Miranol Chemical Co.，Inc.，Dayton，N.J.)、AMPHOTERGE(Lonza，Inc.)、和(Lonza，Inc.)、非离子表面活性剂，比如以以下商品名出售的那些：(BASFWyandotte，Wyandotte，Mich.)、PLURONIC(BASFWyandotte)、(ICI Americas；Wilmington，Del.)、TRITON(Rohm and Haas Co.，Philadelphia，Pa.)、(ICIAmericas)、(ICI Americas)、(HenkelCorp.)、TRITON(Rohm and Haas Co.)、TRITON (Rohm and Haas Co.)、TRITON(Rohm and Haas Co.)、(ICI Americas)、(ICI Americas)、 (ICI Americas)和类似的表面活性剂，1，2-二棕榈酰-sn甘油-3-磷酸乙醇胺-N-4-(对-马来酰亚胺苯基)丁酰胺、胺-PEG2000-磷脂酰乙醇胺、PEG Telomer B、磷脂酰乙醇胺、阿拉伯胶、胆固醇、二乙醇胺、单硬脂酸甘油酯、羊毛脂醇、卵磷脂，包括蛋黄卵磷脂、甘油单酯和甘油二酯、单乙醇胺、油酸、油醇、泊洛沙姆、花生油、棕榈酸、聚氧乙烯50硬脂酸酯、聚聚乙二醇35蓖麻油、聚乙二醇10油醚、聚乙二醇20十六烷基-十八烷基醚、聚乙二醇40硬脂酸酯、聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯80、丙二醇二乙酸酯、丙二醇单硬脂酸酯、月桂基硫酸钠、硬脂酸钠、山梨糖醇酐单月桂酸酯、山梨糖醇酐单油酸酯、山梨糖醇酐单棕榈酸酯、山梨糖醇酐单硬脂酸酯、硬脂酸、三乙醇胺和乳化蜡。以上的表面活性剂可单独使用或与本发明的组合物组合使用。

在一些实施方案中，利用诸如氟化磷脂的氟表面活性剂可制备碳氟化合物的乳液。例如，在一个实施方案中，表面活性剂是PEG-Telomer-B。在一个示例性的实施方案中，组合物包含DDFPe与PEG-Telomer-B。磷脂还用于制备乳液且可包括一种或多种不同的磷脂以及脂肪酸。磷脂中的链长度可从约12个碳原子长度至约20个碳原子长度而变化。烷基可以是饱和的或不饱和的。优选地，若使用磷脂，使用两种或多种脂质。例如，可将二棕榈酰磷脂酰胆碱与二棕榈酰磷酯酰乙醇胺-PEG(DPPE-PEG)相混合。在该情况中通常将1和10摩尔百分数之间的聚乙二醇化的脂质与非PEG化的脂质相混合。PEG链可从1,000至10,000MW变化，但更优选地为从2,000至5,000MW。胆固醇和胆固醇的衍生物诸如乙酸胆固醇可包括在乳液中。乳液可包含阳离子(二棕榈酰磷脂酰乙基胆碱)或阴离子脂质(例如，二棕榈酰磷脂酸)或糖基化的脂质。将脂质或表面活性剂与碳氟化合物相混合并均质化以制备乳液。一种或多种粘度改良剂也可包括在乳液中。

乳液还可包含多种添加剂以协助稳定分散相或协助使制剂为生物相容的。可接受的添加剂包括酸化剂、烷化剂、杀菌防腐剂、抗氧化剂、缓冲剂、螯合剂、悬浮剂和/或增粘剂，包括三碘苯衍生物，诸如碘海醇或碘异酞醇，张度剂、阿拉伯胶、琼脂、海藻酸、单硬脂酸铝、膨润土、乳浆剂、卡波姆934P、羧甲基纤维素、钙和钠和钠12、角叉藻聚糖、纤维素、糊精、明胶、瓜尔胶、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、硅酸镁铝、甲基纤维素、果胶、聚氧化乙烯、聚乙烯醇、聚烯吡酮、藻酸丙二醇酯、二氧化硅、藻酸钠、黄蓍胶和黄原胶。

在一些实施方案中，氧运输物质可以是约0.1％至约8％w/v十二氟戊烷的乳液。在另外的实施方案中，氧运输物质可以是约0.1％至约1.5％w/v十二氟戊烷的乳液。在又一些另外的实施方案中，氧运输物质可以是约0.5％至约2.5％w/v十二氟戊烷的乳液。在另外的实施方案中，氧运输物质可以是约1％至约3％w/v十二氟戊烷的乳液。在优选的实施方案中，氧运输物质可以是约1％至约5％w/v十二氟戊烷的乳液。

乳液可通过应用机械能、人工能或声能研细连续相中的分散相的悬浮液而形成。研细包括通过将液体分散相与连续相混合在一起形成胶态的分散体，且然后通过人工的、机械的或通过超声的作用混合生成的机械能导致分散相的颗粒的尺寸从大颗粒减小到所需的尺寸的过程。适当的混合可在Microfluidic的Model110微流化装置中实现，如美国专利第4,533,254号中所描述的，通过引用并入本文。

根据特定的化合物的不同，可使微泡稳定以在血流中持续范围从几分钟到几小时的时间。将被本领域中的技术人员所理解的是所形成的微泡的大小可受生产工序所控制以足够小从而不会阻塞全身毛细血管或肺毛细血管并穿过或绕过闭塞较大红细胞流动的血管。在一个示例性的实施方案中，氧运输物质可以是包括DDFPe的微泡，配制为250纳米液滴的乳液。

(b)施用

本公开内容的氧运输物质可通过诸如静脉内注射、动脉内注射、肌内注射、腹膜内注射、心室内注射、硬膜外注射、颅内注射和输注技术的胃肠外施用来施用于受试者。在一个实施方案中，氧运输物质可通过动脉内注射施用于受试者。在另一个实施方案中，氧运输物质可通过肌内注射施用于受试者。在又一个另外的实施方案中，氧运输物质可通过腹膜内注射施用于受试者。在另一个实施方案中，氧运输物质可通过心室内注射施用于受试者。在又一个实施方案中，氧运输物质可通过颅内注射施用于受试者。在另一个实施方案中，氧运输物质可通过硬膜外注射施用于受试者。在优选的实施方案中，氧运输物质可静脉内施用于受试者。

在一些实施方案中，氧运输物质可在大丸剂中施用。在另外的实施方案中，氧运输物质可连续施用。在又一些另外的实施方案中，氧运输物质可以大丸剂施用和连续施用结合施用。连续施用的非限制性例子可包括输注。

氧运输物质可单次施用于受试者或多次施用于受试者。在一些优选的实施方案中，氧运输物质可单次施用。在另外的优选的实施方案中，氧运输物质可多次施用。例如，氧运输物质可施用2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次、20次或更多次。在一些实施方案中，氧运输物质可施用2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次或10次。在另外的实施方案中，氧运输物质可施用9次、10次、11次、12次、13次、14次、15次、16次、17次、18次、19次、20次或更多次。在优选的实施方案中，氧运输物质可施用2次、3次、4次、5次或6次。

另一个优选的施用方法是通过持续的IV输注。当通过IV输注初始大丸剂或缓慢的IV推注剂量施用时，一般范围可从约0.01至约0.6cc每kg体重和2％w/vol DDFPe。更优选地负荷剂量为从约0.05至约0.3cc每kg。之后IV输注物质约1小时和长达24小时之间，且根据受试者的状况甚至更长。对于持续输注，一般以从约0.01至约0.3cc每kg或更优选的从约0.025至约0.1cc每kg每小时的速率来输注。

在受试者的治疗过程中，当多次施用时，氧运输物质可以规律的间隔或以可能变化的间隔来施用。在一些实施方案中，在受试者的治疗过程中，氧运输物质可以可能变化的间隔多次施用。在优选的实施方案中，氧运输物质可以规律的间隔多次施用。在优选的实施方案的一些可选方式中，氧运输物质可以约10分钟、20分钟、30分钟、40分钟、50分钟、60分钟、70分钟、80分钟、90分钟、100分钟、110分钟、120分钟、130分钟、140分钟、150分钟、160分钟、170分钟、180分钟或更多分钟的间隔来施用。在优选的实施方案的另外的可选方式中，氧运输物质可以约10分钟、20分钟、30分钟、40分钟、50分钟、60分钟、70分钟、80分钟、90分钟、100分钟或更多分钟的间隔来施用。在优选的实施方案的又一些另外的可选方式中，氧运输物质可以约80分钟、90分钟、100分钟或更多分钟的间隔来施用。在优选的实施方案的另外的可选形式中，氧运输物质可以约80分钟、81分钟、82分钟、83分钟、84分钟、85分钟、86分钟、87分钟、88分钟、89分钟、90分钟、91分钟、92分钟、93分钟、94分钟、95分钟、96分钟、97分钟、98分钟、99分钟、100分钟或更多分钟的间隔来施用。在示例性的实施方案中，氧运输物质可以约90分钟的间隔来施用。

氧运输物质可被施用于经历局部缺血的受试者，或在发生局部缺血之前施用，或在发生局部缺血之前施用并持续整个局部缺血性事件。例如，当受试者正在经历增加由于脉管闭塞导致的局部缺血危险的医疗操作时，或当受试者正处于发生如以上章节I(b)中所描述的闭塞的血管的危险时，对受试者施用氧运输物质可在发生局部缺血之前施用。在一些实施方案中，可将氧运输物质施用于经历局部缺血的受试者。在另外的实施方案中，可在发生局部缺血之前将氧运输物质施用于受试者。在另外的实施方案中，可在发生局部缺血之前将氧运输物质施用于受试者并持续整个局部缺血性事件。在优选的实施方案中，可在进行增加脉管闭塞的危险的医疗操作之前将氧运输物质施用于受试者。在另外优选的实施方案中，可在发生闭塞的血管的症状之前将氧运输物质施用于处于发生闭塞的血管的高危险的受试者。

在一些实施方案中，可在发生局部缺血之前约1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟、10分钟、11分钟、12分钟、13分钟、14分钟、15分钟、16分钟、17分钟、18分钟、19分钟、20分钟、21分钟、22分钟、23分钟、24分钟、25分钟、26分钟、27分钟、28分钟、29分钟、30分钟、31分钟、32分钟、33分钟、34分钟、35分钟、36分钟、37分钟、38分钟、39分钟、40分钟、41分钟、42分钟、43分钟、44分钟、45分钟、46分钟、47分钟、48分钟、49分钟、50分钟、51分钟、52分钟、53分钟、54分钟、55分钟、56分钟、57分钟、58分钟、59分钟、60分钟、61分钟、62分钟、63分钟、64分钟、65分钟、66分钟、67分钟、68分钟、69分钟、70分钟、71分钟、72分钟、73分钟、74分钟、75分钟、76分钟、77分钟、78分钟、79分钟、80分钟、81分钟、82分钟、83分钟、84分钟、85分钟、86分钟、87分钟、88分钟、89分钟、90分钟、91分钟、92分钟、93分钟、94分钟、95分钟、96分钟、97分钟、98分钟、99分钟、100分钟、101分钟、102分钟、103分钟、104分钟、105分钟、106分钟、107分钟、108分钟、109分钟、110分钟或更多分钟施用氧运输物质。在一个实施方案中，可在发生局部缺血之前约1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟、10分钟、11分钟、12分钟、13分钟、14分钟、15分钟、16分钟、17分钟、18分钟、19分钟、20分钟施用氧运输物质。在另一个实施方案中，可在发生局部缺血之前约15分钟、16分钟、17分钟、18分钟、19分钟、20分钟、21分钟、22分钟、23分钟、24分钟、25分钟、26分钟、27分钟、28分钟、29分钟、30分钟施用氧运输物质。在另一个实施方案中，可在发生局部缺血之前约25分钟、26分钟、27分钟、28分钟、29分钟、30分钟、31分钟、32分钟、33分钟、34分钟、35分钟、36分钟、37分钟、38分钟、39分钟、40分钟施用氧运输物质。在另一个实施方案中，可在发生局部缺血之前约35分钟、36分钟、37分钟、38分钟、39分钟、40分钟、41分钟、42分钟、43分钟、44分钟、45分钟、46分钟、47分钟、48分钟、49分钟、50分钟施用氧运输物质。在另一个实施方案中，可在发生局部缺血之前约45分钟、46分钟、47分钟、48分钟、49分钟、50分钟、51分钟、52分钟、53分钟、54分钟、55分钟、56分钟、57分钟、58分钟、59分钟、60分钟施用氧运输物质。在又一个实施方案中，可在发生局部缺血之前约55分钟、56分钟、57分钟、58分钟、59分钟、60分钟、61分钟、62分钟、63分钟、64分钟、65分钟、66分钟、67分钟、68分钟、69分钟、70分钟施用氧运输物质。在另一个实施方案中，可在发生局部缺血之前约65分钟、66分钟、67分钟、68分钟、69分钟、70分钟、71分钟、72分钟、73分钟、74分钟、75分钟、76分钟、77分钟、78分钟、79分钟、80分钟施用氧运输物质。在另一个实施方案中，可在发生局部缺血之前约75分钟、76分钟、77分钟、78分钟、79分钟、80分钟、81分钟、82分钟、83分钟、84分钟、85分钟、86分钟、87分钟、88分钟、89分钟、90分钟施用氧运输物质。在另一个实施方案中，可在发生局部缺血之前约85分钟、86分钟、87分钟、88分钟、89分钟、90分钟、91分钟、92分钟、93分钟、94分钟、95分钟、96分钟、97分钟、98分钟、99分钟、100分钟施用氧运输物质。在又一个实施方案中，可在发生局部缺血之前约95分钟、96分钟、97分钟、98分钟、99分钟、100分钟、101分钟、102分钟、103分钟、104分钟、105分钟、106分钟、107分钟、108分钟、109分钟、110分钟或更多分钟施用氧运输物质。在一个优选的实施方案中，可在发生局部缺血之前约25分钟、26分钟、27分钟、28分钟、29分钟、30分钟、31分钟、32分钟、33分钟、34分钟、35分钟施用氧运输物质。

在一些实施方案中，可在局部缺血发生之后约1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟、10分钟、11分钟、12分钟、13分钟、14分钟、15分钟、16分钟、17分钟、18分钟、19分钟、20分钟、21分钟、22分钟、23分钟、24分钟、25分钟、26分钟、27分钟、28分钟、29分钟、30分钟、31分钟、32分钟、33分钟、34分钟、35分钟、36分钟、37分钟、38分钟、39分钟、40分钟、41分钟、42分钟、43分钟、44分钟、45分钟、46分钟、47分钟、48分钟、49分钟、50分钟、51分钟、52分钟、53分钟、54分钟、55分钟、56分钟、57分钟、58分钟、59分钟、60分钟、61分钟、62分钟、63分钟、64分钟、65分钟、或1小时、2小时、3小时、4小时、5小时或6小时或更多小时施用氧运输物质。在一个实施方案中，可在局部缺血发生之后约1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟、10分钟、11分钟、12分钟、13分钟、14分钟、15分钟、16分钟、17分钟、18分钟、19分钟、20分钟施用氧运输物质。在另一个实施方案中，可在局部缺血发生之后约15分钟、16分钟、17分钟、18分钟、19分钟、20分钟、21分钟、22分钟、23分钟、24分钟、25分钟、26分钟、27分钟、28分钟、29分钟、30分钟施用氧运输物质。在另一个实施方案中，可在局部缺血发生之后约25分钟、26分钟、27分钟、28分钟、29分钟、30分钟、31分钟、32分钟、33分钟、34分钟、35分钟、36分钟、37分钟、38分钟、39分钟、40分钟施用氧运输物质。在另一个实施方案中，可在局部缺血发生之后约35分钟、36分钟、37分钟、38分钟、39分钟、40分钟、41分钟、42分钟、43分钟、44分钟、45分钟、46分钟、47分钟、48分钟、49分钟、50分钟施用氧运输物质。在另一个实施方案中，可在局部缺血发生之后约1小时、2小时、3小时、4小时、5小时或6小时或更多小时施用氧运输物质。在一个优选的实施方案中，可在局部缺血发生之后约45分钟、46分钟、47分钟、48分钟、49分钟、50分钟、51分钟、52分钟、53分钟、54分钟、55分钟、56分钟、57分钟、58分钟、59分钟、60分钟、61分钟、62分钟、63分钟、64分钟、或65分钟施用氧运输物质。在另一个优选的实施方案中，可在局部缺血发生之后约1小时、2小时、3小时、4小时、5小时或6小时施用氧运输物质。在一个示例性的实施方案中，可在局部缺血发生之后不到约1小时施用氧运输物质。在另一个示例性的实施方案中，可在局部缺血发生之后约1小时、2小时或3小时施用氧运输物质。

在一些实施方案中，可将氧运输物质以约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1或约1.1mL每千克受试者的量施用于受试者。在另外的实施方案中，可将氧运输物质以约0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19或约0.2mL每千克受试者的量施用于受试者。在另外的实施方案中，可将氧运输物质以约0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.2、0.21、0.22、0.23、0.24、0.25、0.26、0.27、0.28、0.29或约0.3mL每千克受试者的量施用于受试者。在又一些另外的实施方案中，可将氧运输物质以约0.21、0.22、0.23、0.24、0.25、0.26、0.27、0.28、0.29、0.3、0.31、0.32、0.33、0.34、0.35、0.36、0.37、0.38、0.39或约0.4mL每千克受试者的量施用于受试者。在另外的实施方案中，可将氧运输物质以约0.31、0.32、0.33、0.34、0.35、0.36、0.37、0.38、0.39、0.4、0.41、0.42、0.43、0.44、0.45、0.46、0.47、0.48、0.49或约0.5mL每千克受试者的量施用于受试者。在又一些另外的实施方案中，可将氧运输物质以约0.41、0.42、0.43、0.44、0.45、0.46、0.47、0.48、0.49、0.5、0.51、0.42、0.53、0.54、0.55、0.56、0.57、0.58、0.59或约0.6mL每千克受试者的量施用于受试者。在又一些另外的实施方案中，可将氧运输物质以约0.001、0.005、0.01、0.015、0.02、0.025、0.03、0.035、0.04、0.045、0.05、0.055、0.06、0.065、0.07、0.075、0.08、0.085、0.09或约0.1mL每千克受试者的量施用于受试者。在一些优选的实施方案中，可将氧运输物质以约0.6mL每千克受试者的量施用于受试者。在另外的优选的实施方案中，可将氧运输物质以约0.3mL每千克受试者的量施用于受试者。在又一些另外优选的实施方案中，可将氧运输物质以约0.1mL每千克受试者的量施用于受试者。

(c)组合方法

本发明的氧运输物质可与用于局部缺血的其他治疗或可增加组织的氧合的治疗组合施用。用于局部缺血的治疗或可增加组织的氧合的治疗的非限制性例子可包括氧吸入、血液、溶栓剂或抗凝血剂的施用和降低组织的温度。

一般而言，本发明的氧运输物质的施用可用于在使用第二种治疗解决闭塞时减少梗塞体积。重要地是，本发明的组合物可用于在局部缺血甚至未解决闭塞的过程中减少梗塞体积。因此，设想首先施用本发明的组合物以保护组织，且然后施用解决闭塞的治疗。

在一些实施方案中，本发明的氧运输物质可与血液组合施用。在另外的实施方案中，本发明的氧运输物质可与氧吸入组合施用。在又一些另外的实施方案中，本发明的氧运输物质可与一种或多种抗凝血剂组合施用。抗凝血剂的非限制性的例子可包括维生素K拮抗剂诸如醋硝香豆醇、杀鼠迷、双香豆素、双香豆素乙酯、苯丙香豆素、华法林、氯苯茚二酮、二苯乙酰茚二酮、苯茚二酮，抗血小板化合物诸如阿昔单抗、依替巴肽、替罗非班、氯吡格雷、普拉格雷、噻氯匹啶、坎格雷洛、依诺格雷、替卡格雷、贝拉普罗、前列环素、伊洛前列素、曲前列尼尔、乙酰水杨酸(阿司匹林)、阿洛普令、卡巴匹林钙、吲哚布芬、三氟醋柳酸、双嘧哌胺醇、吡考他胺、terutroban、西洛他唑、双嘧达莫、三氟醋柳酸、氯克罗孟、双苯唑醇、Xa因子的抑制剂诸如贝米肝素、舍托肝素、达肝素、依诺肝素、那屈肝素、帕肝素、瑞维肝素、亭扎肝素、磺达肝素、艾卓肝素、达那肝素、舒洛地特、硫酸皮肤素、阿哌沙班、贝曲西班、伊多塞班、奥米沙班、利伐沙班、peviparin、YM466、直接凝血酶II抑制剂诸如比伐卢定、重组水蛭素、地西卢定、阿戈托班、达比加群、美拉加群、希美加群、REG1、去纤苷、雷马曲班、抗凝血酶III和蛋白C(Drotrecogin alfa).，和血栓溶解药物诸如纤溶酶原激活剂(tPA；阿替普酶、瑞替普酶、替奈普酶)、抗链激酶(antistreptase)、尿激酶、次鲁普酶、链激酶、复合纤溶酶链激酶、盂替普酶、恩克罗特、血纤维蛋白溶酶和纤维蛋白酶。

在另外的实施方案中，本发明的氧运输物质可与一种或多种溶栓剂组合施用。溶栓剂的非限制性的例子可包括纤溶酶原激活剂(tPA；阿替普酶、瑞替普酶、替奈普酶)、抗链激酶、尿激酶、次鲁普酶、链激酶、复合纤溶酶链激酶、孟替普酶、恩克罗特、血纤维蛋白溶酶和纤维蛋白酶。

在一些优选的实施方案中，本发明的氧运输物质可与选自由组织纤溶酶原激活剂、抗链激酶、链激酶、尿激酶和其组合组成的组的抗凝血剂或溶栓剂组合施用。在优选的实施方案的一个可选形式中，本发明的氧运输物质可与tPA组合施用。在示例性的实施方案中，可在施用本发明的氧运输物质之后施用tPA，然后第二次给药如例子中所描述的氧运输物质。

在另外的实施方案中，本发明的组合物可与降低经受局部缺血性事件的组织的温度相结合。然而，在所有情况下，降低组织温度不低于29℃。例如，可将组织温度降低为约30、31、32、33、34、35或36℃。

III.组合组合物

在一些方面，本公开内容提供了包含十二氟戊烷乳液和溶栓剂的组合。十二氟戊烷乳液和溶栓剂如以上章节(I)中所描述。在一些实施方案中，组合包含选自由组织纤溶酶原激活剂、抗链激酶、链激酶、尿激酶和其组合组成的组的溶栓剂。在优选的实施方案中，组合包含十二氟戊烷乳液和tPA。一般而言，tPA的有效量可利用本领域中通常已知的方法来确定。

包括了以下的实施例以说明本发明的优选的实施方案。本领域中的那些技术人员应理解在以下实施例中所公开的技术代表发明人所发现的在本发明的实践中运作良好的技术。然而，本领域中的那些技术人员根据本公开内容应理解在所公开的特定的实施方案中可进行许多改变且仍获得相像的或相似的结果，而不脱离本发明的精神和范围，因此所列的所有物质或在附图中所显示的所有物质应被解释为阐释性的且无限制含义。

实施例

以下的实施例示出了本发明的不同的描述。

实施例1.十二氟戊烷(DDFP)、全氟萘烷(PFD)和全氟溴辛烷(PFOB)在促进氧交换中的体外比较。

需要开发一种在某些临床和领域情况下(例如，出血性休克)可增加呼吸气体的交换的静脉注射剂[1，2]。熟知的是身体需要恒定地供给氧和有效的除去二氧化碳以使细胞维持健康的代谢过程。此外，从有效的氧和二氧化碳交换的受益的程度可取决于在缺氧事件(局部缺血再灌注)之后重建该交换过程的时间[3，4]。可方便的补充这些需要的产品的可能应用是广泛的，包括肿瘤放射敏化[5]、减压病中组织氮的消除[6]、一氧化碳中毒的治疗[7]和导致细胞损伤的多种缺氧病症的治疗。中风是可导致神经损伤的严重的和普遍的病症。已知该损伤部分地由局部脑细胞交换氧和二氧化碳的机会的减少所导致。用于中风的目前批准的治疗，比如阿司匹林，其被设计以限制血栓形成的过程，但未被设计以重建组织生存力。诸如组织纤溶酶原激活剂(tPA)的剂当较晚施用时，由于增高的颅内出血的发生率，目前仅可用于在导致的中风的发作后4.5小时的时间段[8，9]。若剂可用于延长组织生存力的时间段，从而血栓溶解或再通救生治疗方案可超越目前限制而使用，其将是有趣的且非常有利的。开发了2％w/v十二氟戊烷(DDFP)(也称作全氟戊烷)的亚微乳液并已显示对人类是安全的[10]。Lundgren等人[11]在严重贫血大鼠中证明了该乳液进行呼吸气体运输和维持组织生存力以及正常生理过程。并且，Koch等人[5]已显示该制剂通过协助缺氧肿瘤细胞的氧合，可使那些细胞有氧，从而使其对辐射敏感。本文详细描述的体外实验证明了物理特性和气体运输机制，其表明该2％w/v DDFP乳液(DDFPe)如何可起作用以帮助维持组织氧灌注。数据还可供理解制剂在中风或心脏病发作过程中如何可用作细胞保护剂。当以相对小的量施用时，这些亚微粒化的颗粒(比红细胞小5-10×)可能能够越过血管比赛而灌注，且当血细胞无能力时提供生命必需的氧。

血红蛋白是体内氧的唯一天然运载体。通过体积比较，已知氟化碳比其他流体或浓缩红细胞更有效地溶解气体[12]。这样，研究了用于气体运输的其他氟化碳乳液。这些开发中的其他产物包含相对大的、非挥发性的全氟化碳(PFC)比如全氟萘烷(PFD)和全氟溴辛烷(PFOB)[13]，均具有142℃-144℃的沸点。其以高浓度配制(20％至60％w/v)以提供足够的氧[14-16]。据报道在PFD和PFOB中氧的溶解度分别为42％和50％v/v[17，18]。还已知这两种PFC由于其强疏水性经历大分布容量。当其不被脂质吸引时，受到水的氢键的强烈排斥，使其强烈疏水但仅相对疏脂。因此，其主要分布到组织，由RES巨噬细胞显著吸收，由于高度积累，其表现出相对长的二次相半衰期[19，20]。这使其作为氧治疗剂的能力有些受限。可选地，因为DDFP分子较小，溶解较高浓度的氧(80％v/v)，具有29℃的沸点，且因此在生物温度下在一定程度上可挥发(进一步增强了氧负载)，需要其小得多的体积以在体内提供足够的氧[6，21，22]。此外，研究显示静脉施用后DDFP在血中具有2分钟半衰期，且在2小时内在肺中99％被清除[23]。虽然该短的半衰期可能似乎是不利的，动物研究表明以IV输注一次施用低剂量的约0.7cc每kg的DDFPe对于严重贫血的动物的复苏可能是足够的[6，11]。另一考虑是氧治疗物不必替代血液；其可能在进行另外的决定性治疗(例如，输血)之前对于患有严重贫血或局部缺血的患者进行稳定具有有用的作用。如先前所述的，已证明DDFP由于其短的线性链长度[1，17]和低的沸点[6，21]在溶解气体上具有超越许多其他PFC的优点。这种更有效的氧吸收可归因于DDFP与较长链全氟化碳(PFD和PFOB)相比较具有一级CF₃基团与二级CF₂基团的最高比率的事实。CF₃基团，具有强负电性，是吸引气体的主要原因[24]。因此，以体积为基准，液体DDFP比其他线性液体PFC可溶解更多呼吸气体。对于载氧能力更重要的是在生物温度下DDFP从液体膨胀为气体状态[7，25，26]并因此在局部压力梯度的基础上运输气体的事实。据认为DDFP的气体状态不仅与其自身的液体状态相比较，还与其他较大的PFC的液体状态相比较可吸收、递送和交换多得多的氧[21，27]。该实施例的目的是将2％w/v DDFPe的能力与PFD和PFOB的相当的乳液关于其吸收氧的能力相比较，从而模拟其中氧将是可被运载且递送到缺氧环境中的情形。并且，强调了DDFPe的物理稳定性。

方法

产物的制备

如Lundgren等人[6]先前所描述的制备三个不同批次的2％w/vPFC(DDFP、PFD和PFOB)。并且，以和3个乳液相同但无任何PFC的方式制备空白制剂。具体地，对于每个1升批次，利用与Avestin Emulsiflex-C5匀浆器相连接的定制的半封闭不锈钢密封系统将3克PEG-Telomer B和20克PFC(除空白外)与33％蔗糖溶液一起搅匀。将每个匀浆物在14,000下6次穿过小室进行处理，且然后最终无菌过滤紧接注入5mL小瓶中。将管塞上并旋紧，且然后在室温下贮存。

产物分析

颗粒分选。随机从每个配制的批次中选择三个小瓶。将小瓶涡旋5秒并通过注射器移出10μL小份的液体制剂，注入到含2mL磷酸盐缓冲盐水稀释剂(已知粘度)的3mL比色皿中，并在冰浴中冷冻。盖上比色皿并轻轻颠倒3次。然后测量样品的温度，并在所确定的温度和粘度下利用Malvern Zetasizer HS100分析每个样品。一次逐个检查9个选择的小瓶，直至Malvern给出错误信息，在这种情况下重复检查直到获得通过测试。仅监测DDFPe粒度6个月时间。

pH分析。使用Symphony SB21pH计和Symphony850pH探针确定最终制剂的pH。在三个重复中进行氢离子浓度的分析。用pH标准物在4.0和7.0处校准测量计，以证实批次间一致性，在每个批次的开始、中间和最后选择1个小瓶用于测量。

统计分析。所有统计数字，比如粒径、pH、氧摄取和体积膨胀的平均值和标准偏差利用Microsoft Excel2003Data Analysis Kit来进行。

体外性能测试

氧运输。图1显示了测量制剂的氧摄取的体外装置，修改自Lundgren等人[11]。将300mL带有搅拌棒的烧杯装满250mL的去离子水并置于温度控制的水浴中。将水浴设置在搅拌电炉的顶部。将手提式氧测量计浸入到烧杯中并使溶解的氧读数稳定。确定稳定后，先用盘覆盖在水表面，且然后在中封闭以消除任何顶部空间并防止与大气的任何气体交换。使用针和注射器将5mL的制剂通过石蜡膜并注入到250mL体积的水中(1：50，v：v)。每次用粘合带重新密封注射孔。每次注射后在计算机上利用定制的通信端口数据记录器软件以30秒间隔记录溶解的氧读数[28]1小时。在20℃和37℃的温度下以三个重复关于DDFPe、PFDe、PFOBe和空白制剂进行该程序。

体积膨胀。因为预期DDFP在37℃下挥发，利用图2中显示的压力计装置检验注射后每个制剂的体积膨胀。在平行实验中，将5mL的DDFPe、PFDe、PFOBe、空白制剂和去离子水注射到250mL的搅拌的DI水中，同时将塞好的含250mL DI水的250mLErlenmeyer烧瓶维持37℃。将25mL滴定管通过塞子插入并将其末端浸入到水中从而任何体积增加将会上压入到滴定管中且然后可进行测量。

结果

颗粒分选。确定了DDFPe、PFDe和PFOBe的初始平均颗粒直径分别为215+56nm、103+8nm和155+6nm。图3显示在室温下(23℃+2℃)DDFPe粒径保持稳定在400nm以下的直径持续6个月。注意空心菱形代表样品中少于颗粒的2％，且这些双峰分布仅在前2个月观察到。

pH分析。发现DDFPe、PFDe和PFOBe的pH值分别为5.5、6.1和5.7。

氧运输。图4显示了所测试的全部样品和对照的氧摄取数据。在两个测试温度21℃和37℃下确定PFDe和PFOBe制剂吸收氧不超过空白制剂。对比之下，在两个温度下DDFPe比PFDe、PFOBe、和空白制剂吸收显著多的氧。具体地，在60分钟时，在21℃时DDFPe吸收大约3倍多氧(p＝0.03)，和在37℃下吸收7倍多氧(p＝0.001)。这可归因于两个重要的事情。一个是DDFPe对比PFC重量含大约两倍摩尔量的全氟化碳，和另一个为与其他制剂相比较每单位体积存在较高比率的三氟甲基。

体积膨胀。图5显示了当导入到37℃半密封的烧瓶中时，所有样品和对照的体积膨胀的差异。虽然利用PFDe和PFOBe观察到了膨胀，其均不显著大于相同注射的水的膨胀(对于PFDe和PFOBe分别为p＝0.35和p＝0.06)。PFOBe和空白制剂的体积增加似乎存在不大的差异(p＝0.01)，但水和空白制剂之间并非如此(p＝0.12)。空白和PFOBe之间的明显差异的原因是未知的；然而，可能的是在升高的温度下PFOB膨胀得比PFD多。在DDFPe的膨胀中看到了最显著的结果。其显著(p＜0.00001)高于所有其他测试注射至少5倍。

结论

制备2％w/v DDFP乳液并针对PFD和PFOB的相当的乳液浓度关于氧吸收能力进行测试。最终DDFPe具有5.5的pH，呈乳白色，且初始粒径为215+56nm。发现2％DDFPe比PFD或PFOB的2％w/v乳液携带7倍多的氧。确定这些差异在p＝0.001置信水平上是显著的。因此，在生理温度下DDFP膨胀的能力似乎为其提供了超越PFD和PFOB的显著优点以递送较高有效负载的氧。这最可能是用于氧递送的PFD和PFOB的制剂通常以40％至60％浓度来配制。清楚的是DDFP提供了超越PFD和PFOB的有力的优势，因为可施用PFC小得多的剂量来达到需要的结果。这不仅对于患者而且对于环境是更少侵害的，因为已明确记载PFC通过肺排出身体。本文的数据支持了Burkard和Van Liew[21]以及Lundgren等人[6，11]的论点，因为DDFP由于其在生理温度下从液体膨胀为气体，应该能够提供超越其他PFC的增强的氧递送。这些体外研究联合Lundgren等人在大鼠中获得的体内结果[11]似乎表明小剂量的DDFP乳液也可用于在急性缺氧事件中控制组织的保存。并且，结果可表明在心血管事故或中风的缺氧事件过程中支持神经保护的其他用途。

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实施例2.在兔局部缺血性中风模型中十二氟戊烷乳液减少了梗塞体积

涉及失血、局部缺血或缺氧的许多不同的情形导致引起发病和死亡的器官和组织损伤。这些情形包括常规手术和介入操作以及创伤和自然疾病状态。这些事件通常呈现为心血管梗塞、广泛遍及全身和肢端分布的其他缺氧或局部缺血症状，以及局部缺血性中风。另外地，包括手术和血管造影术的临床操作可产生导致沉默或亚临床脑局部缺血或实际中风的微栓子(1)。神经保护化合物、高压氧、基于血红蛋白的血液替代物、其他方法和基于液体全氟化碳(PFC)的氧载体已显示前景但大部分不能在这些情形下进行补偿(2-7)。立即的血管再生和氧合的血流的重建目前仍是临床中风治疗的首要焦点。

另一氧运输物质可具有治疗潜力：由于PFC固有的高度亲电子氟含量和分子间吸引力，PFC乳液具有物理上溶解、运输和递送显著的量的氧和其他富电子的呼吸气体的能力(8，9)。精密的技术允许产生具有极小颗粒的稳定的PFC乳液。这样的小尺寸液滴允许穿过阻塞8μm红细胞的许多血管闭塞，且甚至允许灌注到否则将不会通过闭塞的动脉供给来进行氧合的微循环和组织的最小区域中。

十二氟戊烷(DDFP)乳液(DDFPe)是250-nm液滴的稳定的乳液，其在37℃下体外施用时，经历膨胀为气体状态(10和实施例1)。在PFC中该膨胀对于DDFP是独特的。DDFP具有大约29℃的沸点；因此，在37℃下，在DDFPe液滴中张开大的分子间“口袋”，从而高浓度的呼吸气体可快速地被吸入。在体外，DDFP液滴最终膨胀而形成微泡。然而，在体内，当静脉注射DDFPe时，其不会膨胀为真正的泡形式(实施例1)。该血管内压力阻碍完全的泡膨胀，但偶然地允许液滴的鼓起和收缩的交换，对于当液滴穿过血流而未达到微泡大小时吸收和释放呼吸气体是必需的。液体的PFC不具有该能力，这使其相对限于其气体溶解能力。三种PFC乳液的体外比较表明了气体状态的DDFPe显著优良的氧递送(图4)。在体内，DDFPe发挥作用大约2小时，且DDFPe通过正常呼吸呼出而不长期滞留在体内(12)。

在该实施例中，急性局部缺血性中风的兔模型中的静脉内乳液治疗通过颈内动脉(ICA)的分支的永久性血管造影闭塞来引起。目的是确定在未重建血流的情况下是否可提供神经保护。

材料和方法

所有动物操作获国家动物管理和使用委员会(institutional animalcare and use committee)批准。在该研究中使用了新西兰白兔(总共n＝95)。手术和血管造影操作如先前所描述(13，14)。简言之，利用肌内注射开他敏30mg/kg(Ketaset；Fort Dodge，Fort Dodge，Iowa)和甲苯噻嗪3mg/kg(AnaSed；Lloyd Laboratories，Shenandoah，Iowa)镇静兔并利用异氟烷(Novaplus；Hospira，Lake Forest，Illinois)麻醉兔。手术暴露股动脉，经由标准血管造影技术推进修改的65-cm倾斜尖端3-F导管(Slip-Cath；Cook，Bloomington，Indiana)以选择ICA。

在栓塞之前和栓塞之后1分钟进行超选择放大雪光造影术以记载脑脉管系统的准确闭塞(图6)。通过利用单面C-臂数字移动成像系统(OEC9800；GE Healthcare；Salt Lake City，Utah)进行成像。埋入ICA的具有直径为700-900μm的两个或三个单独的微球体进行的栓塞闭塞了一些支管，通常为大脑中动脉(MCA)和/或大脑前动脉(ACA)。1分钟之后重复血管造影术确证了脉管闭塞和在局部缺血性区域中压迫液流。为提供一致性缺陷，具有其他闭塞或血管造影并发症的兔(n＝31)从研究中弃去。

通过利用耳静脉导管通道(Instyle-W；Becton Dickinson，Sandy，Utah)根据组计划起始治疗。栓塞后四小时或7小时，利用1.5mL的静脉内戊巴比妥(Euthasol；Virbac，Fort Worth，Texas)使兔安乐死。

为进行治疗，在4小时研究中将兔随机分为七组：(i)对照，不进行治疗的栓塞(n＝7)；(ii)在栓塞前30分钟利用DDFPe进行预治疗(n＝7)；(iii)立即的DDFPe(n＝8)；(iv)中风后30分钟的DDFPe(n＝5)；(v)中风后1小时的DDFPe(n＝7)；(vi)中风后2小时的DDFPe(n＝5)；和(vii)中风后3小时的DDFPe(n＝6)。治疗的施用是在指定的组时间缓慢地推注静脉剂量的DDFPe(2％重量/体积DDFP，0.6mL/kg；NuvOx Pharma，Tucson，Arizona)并在使其安乐死之前随时间推移每90分钟进行重复。

为观察治疗效率的极限，利用与另一对照组相比较十分延迟的治疗进行平行研究。组为对照兔(n＝6)、在中风1小时后用DDFPe处理兔，且每90分钟进行追加剂量(n＝8)，和在中风后6小时开始用DDFPe处理兔(n＝5)。这些动物在栓塞7小时后被实施安乐死。

安乐死之后，收获脑，立即在盐溶液中冷冻，且然后通过利用冰冻的脑模型以4.0-mm间隔冠向切开(RBM-7000C；ASI Instruments，Warren，Michigan)。将脑部分(n＝8)置于37℃下的1％2，3，5-氯化三苯基四氮唑(Sigma-Aldrich，St.Louis，Missouri)持续45分钟，在10％甲醛溶液中固定，并进行数码拍照(图7)。由对治疗组不知情的技师通过利用数码分析(ImageJ软件，National Institutes of Health，Bethesda，Maryland)测量脑尺寸和梗塞的面积。将梗塞体积计算为全脑的百分比。

将固定的脑部分包埋在石蜡中并以4μm进行切片。在标准的苏木精和伊红染色之后，分析切片且然后如红血球的外渗和进入到细胞外空间的流体所确定的，关于颅内出血(ICH)进行评分(15)。由对治疗组不知情的兽医病理学家记录ICH的存在和定位。

将利用DDFPe的治疗组合到用于分析的三个重要的组中：在栓塞前30分钟进行预处理，在症状发作后1小时之内进行超急性处理，和在发作后1-3小时进行急性治疗。

因为梗塞体积不是正常分布的，利用SAS软件(SAS，Cary，North Carolina)的PROC GLM(即，Kruskal-Wallis等效的)功能分析梗塞体积百分比的等级。在每个DDFPe组对比对照的比较中使用Dunnett校正的P值。通过利用软件包StatXact(Cytel，Cambridge，Massachusetts)中的“exact”程序进行4小时和7小时对照组的比较，和急性处理亚组和超急性处理亚组内的处理组的比较。通过利用χ²检验和Fisher精确检验比较中风区域内部或外部的出血的发生率。

结果

九十五只兔经历血管造影操作；11只导致了ICA的血管痉挛和84只兔具有MCA和/或ACA的永久性闭塞的成功栓塞。这些中的二十只还具有大脑后动脉或小脑上动脉的闭塞，且从研究中弃去，留下64只用于分析。操作和处理期间成功维持所有的兔在正常的氧合生理状态和心脏功能下。

在4小时研究中(表1)，用DDFPe(n＝38)处理的与对照相比较(0.30％对比3.20％)中值梗塞体积降低了(P＝0.001，精确Mann-Whitney检验)。与对照相比较超急性组中值(n＝13；图8)显著减少了(0.30％)(P＝0.021，Dunnett校正的等级比较；未校正的P＝0.008)。急性组中值(n＝18)也减小了(0.30％；P＝0.005，Dunnett校正的等级排序；未校正的P＝0.002)。超急性类别和急性类别中的单独的组彼此无差异(分别为P＝0.54和P＝0.92，精确Kruskal-Wallis检验)。

在7小时研究中(表2)，对照梗塞体积与4小时对照相似，具有3.88％的平均值和2.2％的中值(P＝0.70，精确Mann-whitney检验)。1小时治疗动物具有八只中的七只值处于或低于最低的对照值，且6小时治疗动物具有五只中的三只值处于或低于最低对照值。

在4小时研究中中风区域中(P＝0.85)和中风区域外(P＝0.32)所有组(n＝44)中的显微镜下的出血率是相似的。在14％的对照动物(n＝7只中的1只)中、14％的DDFPe预处理组(n＝7只中的1只)、14％的立即DDFPe组(n＝7只中的1只)、20％的30分钟DDFPe组(n＝5只中的1只)、1小时DDFPe组中没有(n＝7)、20％的2一小时DDFPe组(n＝5只中的1只)、和3小时DDFPe组中没有(n＝6)。在这些组中中风的外部的出血的发生率分别为14％、57％、28％、0％、14％、20％和17％。

7小时的对照兔与4小时对照动物相比较具有数字上更大的总体出血率，但未达到显著性水平(83％对比29％；P＝0.10)。在1小时时用DDFPe进行处理且每90分钟进行处理直至在7小时时安乐死与对照相比较中风内的出血的发生率趋于下降(P＝0.06)。在67％的对照动物中(n＝6只中的4只)、1小时DDFPe组中没有(n＝6)、和60％的6小时DDFPe组(n＝5只中的3只)观察到中风内的出血。这些组中发生的中风外的出血分别为50％、20％和33％，且组间无差异(P＝0.82)。

接受一个DDFPe剂量(n＝11)、两个剂量(n＝25)、三个剂量(n＝7)、四个剂量(n＝8)和0个剂量(即，对照；n＝13)的动物均存活至计划的安乐死而无明显的不利事件。

讨论

对于神经保护剂用于急性中风的研究是多年来的重点。对于血液替代物的平行研究已包括了血红蛋白替代物和液体形式的PFC。这些物质在缺氧和局部缺血中的用途的大量研究已遭遇了副作用和严重的并发症，且所研究的所有剂不能转化为成功的人类治疗。一些氧自由基清除器和其他新颖的技术在校动物中风模型，通常在小鼠或大鼠中已显示了良好的前景。尚未有任何转化为人类中风的治疗(4)。这里，在无血栓溶解的可能性的栓塞性中风模型中测试了新颖的氧运输方法。该中风的兔模型与组织纤溶酶原激活剂(TPA)中风治疗的成功开发中所用的模型相似(16)。虽然该模型比大鼠和小鼠更昂贵，其规模上的优势可以是重要的，且必须注意到其他成功已转化为人类结果。这包括抗氧化剂NXY-059在中风急性局部缺血性NXY-059试验(17，18)中的失败的预测。

血液具有递送氧的有限的能力，部分需要红细胞通过毛细管。在下降的血流或闭塞的情况下，该限制变得严峻，导致梗塞，伴随某些区域中几乎立即的细胞死亡和另外的区域中无立即的细胞死亡的局部缺血性损伤。该受威胁的区域为半影区。在许多中风中，可能有活力的脑组织的局部缺血性半影区若可将氧递送到那里则可能得救。

包括液体基于PFC的氧载体的先前治疗大部分不能补偿氧缺失。然而，在体温时作为气体的DDFPe常常比液体PFC运输每体重体积更多的氧(图4)。DDFPe的静脉剂量小于其他基于PFC的剂的静脉剂量的1％。毫微化的液滴和泡如TPA一样穿过小于红细胞的空间并将氧运输到从整体血流中受阻的局部缺血性区域。其他PFC剂需要更大的剂量且在长期的基础上在体内存留。在人类药代动力学研究中，作为单一较小剂量的静脉内DDFPe是良好耐受的，且通过呼气快速清除而无显著残余或副作用(12)。在大鼠和猪中，较大剂量作用长达2小时(19)。

当静脉内施用时，DDFPe可在治疗时间段处“暂停时钟”几小时，作为桥梁起作用以进行可能大大延迟超过目前治疗时间段的进一步的急性中风治疗。本兔研究显示了不仅当在闭塞前或在超急性时期(即，从0到30分钟)中施用DDFPe，而且还在1-3小时延迟的情况下与未处理的对照相比较在降低的中风体积上的显著益处。然而中风前施用可模仿高危险操作中的预防性治疗，和0-30分钟治疗可模仿医原性局部缺血性事件，后面的组模仿常规中风治疗，其更加延迟(20)。在本研究中在3小时时持续改善的转归在临床范围中非常有前景，因为最常用的人类治疗，静脉内TPA施用在该时间框内开始失去效力，且血管内再通，其可能在发作长达6小时后进行，受限于主要医疗中心。该3小时改善提高了DDFPe除阻止另外的损伤之外实际上逆转非致死性损伤的可能性。该7小时模型显示了关于利用在6小时时施用的这些小样品尺寸具有的统计学显著的治疗益处损伤已进步了很多。重要地，该模型显示了在1小时时的施用可利用多次施用成功进行至7小时，这点超越了目前应用的大部分目前血栓溶解方案。长期的成功也是可能的。然而，未在人类中证实多次大剂量的安全性，且在狗中存在问题性，其中DDFPe的快速给药导致肺动脉高血压和严重的症状(21)。

中风后4小时颅内出血(ICH)的测量结果在所有组中是相似的。在7小时时对照兔中增高的出血速率的趋势表明发作后的该几小时时间段在显微镜下流血的发展中是重要的。尤其鼓舞人心的是从1小时时用DDFPe处理的7小时组中不存在ICH(15,22)。这提高了该治疗中的保护性方面的可能性，但需要利用更大量的动物研究来证实(23和图9)。

除局部缺血性和出血性急性中风之外，临床应用还可包括高危险心脏和颈动脉手术或神经血管或心脏介入的预处理，在医原性局部缺血性事件过程中提供了几小时的改善的组织氧合。可彻底避免由暂时性凝血块、泡或缺氧导致的许多中风、认知缺陷或心肌梗塞。与手术或血管或心脏介入相关联的气体栓塞和灌注不足事件是暂时的现象，且可在DDFPe处理后不需要另外的治疗。因为人类单剂量经验显示是安全的，该测试可快速的发展。

除需要全面研究DDFPe的有效性的时间过程外，本研究的另一局限是缺少治疗剂量检验。这些研究使用了已确定的剂量水平进行超声成像，且需要在兔和人中进行治疗剂量水平的优化。虽然在所选择的剂量和时间点处证明了可观的益处，需要比较其他人工氧载体和全面表征处理作用的另外的研究。并且，必须在血栓栓塞性中风模型中检查DDFPe作为与静脉内TPA血栓溶解、动脉内介入或利用微泡和超声(US)的超声血栓溶解相组合的用途。这里，将评价安全性和协同性或加成效应。若持续的临床前研究克服了这些局限，急性中风中的人类可行性测试可快速的进展。

可进一步优化人类剂量、时间选择、效力和安全性。这将通过在2,000多个患者中DDFPe作为US造影剂的先前研究和其作为超声造影剂由欧洲药品评价署(现称作欧洲医药局)的批准所促进(24,25)。目前的单一剂量与用作人类造影剂的剂量相似，且尚未进行治疗应用的剂量优化和多剂量的安全测试。虽然DDFPe作为造影剂的报道是非常乐观的，研究由于经济原因而停止，且此时DDFPe并非商业上可用的。

静脉内DDFPe可能通过降低缺氧的程度保护脑组织免于局部缺血。其降低了中风中的梗塞体积，且利用重复给药效果可持续数小时。在人类中未证明安全性。在中风时期、失血、局部缺血和缺氧，以及在诸如高危险操作的一些预防性环境中的过程中作为治疗氧递送剂的另外的动物研究和快速开发是需要的。

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实施例3在兔局部缺血性中风模型中十二氟戊烷乳液降低了梗塞体积

使用了新西兰白兔(n＝40)。动物操作如以上实施例2中所描述。简言之，利用肌内注射开他敏30mg/kg和甲苯噻嗪3mg/kg镇静兔并利用异氟烷麻醉兔。手术暴露股动脉，经由标准血管造影技术推进修改的65-em倾斜尖端3F导管以选择ICA。埋入ICA的三个700-900μm的栓塞球(Embosphere Microspheres；Biosphere MedicalInc.)闭塞了一些支管，通常为大脑中动脉(MCA)和大脑前动脉(ACA)。为提供一致性缺陷，具有其他闭塞的兔被弃去。

利用耳静脉导管根据组计划起始处理。栓塞后四小时，利用IV1.5-mL戊巴比妥对兔进行安乐死。

将兔随机分成4组：1)对照，非治疗(n＝7)；2)立即DDFPe(n＝8)；3)30分钟时DDFPe(n＝6)；4)60分钟时DDFPe(n＝7)。治疗为在设定的组时间2％w/v DDFPe IV、0.6mL/kg的一次剂量和90分钟之后的第二次相同的剂量。

安乐死之后，收获脑，立即在盐溶液中冷冻，且然后利用冰冻的脑模型以0.4-cm间隔冠向切开。将脑部分(n＝8)置于37℃下的1％2,3,5-氯化三苯基四氮唑持续45分钟，在10％甲醛溶液中固定，并进行数码拍照。以不知情的方式利用数码分析(NIH ImageJ)测量脑尺寸和梗塞的面积。计算百分比梗塞体积。

因为梗塞体积不是正常分布的，利用SAS(Kruskal-Wallis等效的)的PROC GLM分析梗塞体积的等级。在每个DDFPe组与对照的比较中使用Dunnett校正的p-值。

结果和讨论

在40只兔中，在6只中血管造影术失败，通常由于痉挛所导致，且34只具有成功的血管造影术和利用MCA或ACA的闭塞进行的栓塞，并表现出梗塞(图9)。六只还具有大脑前动脉或小脑上动脉的闭塞，并被弃去，留下28只用于分析。用DDFPe(0.30％)处理的所有的兔与对照相比较(3.20％)梗塞体积百分比的中值降低了(P＝0.0054).所有个体组中值低于对照(2＝0.20％，p＝0.033；3＝0.35％，p＝0.071；4＝0.30％，p＝0.039)(图10)。

体温下的十二氟戊烷(DDFPe)比利用基于液体氟化碳的氧载体诸如液体全氟化碳(PFC)的很大程度上不能补偿氧缺陷的先前治疗每重量体积运输许多倍的更多的氧。DDFPe的单纯的IV剂量小于其他基于PFC的剂的1/100。毫微尺寸的液滴和泡如tPA一样穿过小于红细胞的空间并将氧运输到整体血流受阻的局部缺血性区域。其他PFC剂需要更大的剂量且在体内长期存留。在人类药代动力学研究中IV DDFPe是良好耐受的，作用约2小时，且在几小时内通过呼气清除。

该兔研究显示了不仅当立即施用时，而且在30或60分钟延迟的情况下的施用与未处理的对照相比较在降低的中风体积上的显著益处。立即施用可模仿高危险操作中的预防性治疗，延迟的组模仿常规中风。

除局部缺血性和出血性急性中风之外，临床应用还可包括高危险心脏和颈动脉手术或神经血管或心脏介入的预处理，在医原性局部缺血性事件过程中提供了几小时的改善的组织氧合。可彻底避免由暂时性凝血块、泡或缺氧导致的许多中风、认知缺陷或心肌梗塞。气体栓塞和灌注不足事件均是暂时的现象，且在DDFPe处理后可不需要另外的治疗。

实施例4.栓塞后3小时的DDFPe处理

手术操作、利用DDFPe进行的血管造影术处理、梗塞和梗塞体积的测量如以上实施例2中所描述。随机将兔分成6组：1)对照，无治疗；2)立即DDFPe；3)30分钟时的DDFPe；4)1小时时的DDFPe，5)2小时时的DDFPe，和6)3小时时的DDFPe。

与对照相比较，甚至在栓塞后3小时，利用DDFPe处理的所有兔的梗塞体积百分比的中值显著降低了(图11)。

实施例5.利用DDFPe进行预处理和在栓塞后7小时进行处理

手术操作、利用DDFPe进行的血管造影术处理、梗塞和梗塞体积的测量如以上实施例2中所描述。随机将兔分成8组：1)对照，无治疗；2)对照，在栓塞前7小时用DDFPe预处理，3)立即DDFPe；4)30分钟时的DDFPe；5)1小时时的DDFPe，6)2小时时的DDFPe，7)3小时时的DDFPe，和8)6小时时的DDFPe。

利用DDFPe处理直至栓塞后3小时的兔与对照相比较梗塞体积百分比的中值显著降低了(图12)。

实施例6.栓塞后超急性和急性DDFPe处理

手术操作、利用DDFPe进行的血管造影术处理、梗塞和梗塞体积的测量如以上实施例2中所描述。随机将兔分成3组：1)对照，无治疗(7只兔)；2)栓塞后0至30分钟时利用DDFPe进行超急性处理，和3)栓塞后1至3小时利用DDFPe进行急性处理。

利用DDFPe进行的超急性和急性处理中利用DDFPe处理的所有兔与对照相比较梗塞体积百分比中值显著降低了(图13)。

实施例7.DDFPe的效力在7小时时维持在较低剂量

在另一个实验中，进行了7小时时效力的剂量等级排序的永久性球体闭塞模型。闭塞模型和DDFPe的施用如以上实施例中所描述的。结果显示了较低剂量的DDFPe比以上实施例中所描述的更有效，在0.3ml/kg和在0.1ml/kg时均有阳性结果(对于每一个P＝＜0.01)。

实施例8.DDFPe和tPA治疗的组合

在该实施例中，利用进行栓塞后一小时0.6ml/kg IV DDFPe，然后标准IV tPA治疗一小时的施用的老化凝血块进行了组合研究。在90分钟时施用IV DDFPe的第二剂量。这些动物存活至24小时。对照(n＝13)显示了3.04％的平均梗塞体积，而DDFPe动物，n＝6，为0.43％。这些结果显示了当闭塞性凝血块溶解时DDFPe(限于约5小时覆盖范围的两个剂量)和tPA治疗的组合确实产生改善，且在再灌注的情况下无流血发生。

实施例9.在无血管再生的情况下DDFPe施用可维持神经保护24小时

用永久性球体闭塞模型在24小时期间每90分钟施用0.1ml/kgIV DDFPe，持续总15次剂量。DDFPe施用开始于栓塞后一小时。利用6只动物重复实验。平均梗塞体积(梗塞的脑部分)与对照中的2.87％相比较为0.55％，p＝0.01。所有动物存活达24小时。因此，神经保护在无血管再生的情况下可维持达24小时。此外，这些实验显示了DDFPe的该剂量在兔中可以被耐受。

Claims (96)

1.一种用于在经历由局部缺血性事件导致的局部缺血的受试者的组织中减少梗塞体积的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的包含全氟化碳乳液的组合物，其中所述全氟化碳具有约100℃以下的沸点，其中所述梗塞体积在不解决所述局部缺血性事件的情况下减少。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述包含全氟化碳乳液的组合物在范围从紧接所述局部缺血性事件起始之后至症状发作之后7小时的时间内被施用。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述包含全氟化碳乳液的组合物在范围从症状发作之后1小时至症状发作之后24小时的时间内被施用。

4.如权利要求1所述的方法，其中所述包含全氟化碳乳液的组合物被静脉内施用。

5.如权利要求1所述的方法，其中将约1％至约5％w／v的全氟化碳乳液的组合物以所述受试者的约0.01ml／kg至约1ml／kg的量施用于所述受试者。

6.如权利要求5所述的方法，其中将约2％w／v的全氟化碳乳液的组合物以所述受试者的约0.01ml／kg至约1ml／kg的量施用于所述受试者。

7.如权利要求4所述的方法，其中所述组合物在一个以上的时间点被施用。

8.如权利要求4所述的方法，其中所述组合物在两个以上的时间点被施用。

9.如权利要求4所述的方法，其中所述组合物在三个以上的时间点被施用。

10.如权利要求4所述的方法，其中所述组合物在十五个以上的时间点被施用。

11.如权利要求1所述的方法，其中所述包含全氟化碳乳液的组合物以大丸剂被施用。

12.如权利要求1所述的方法，其中所述包含全氟化碳乳液的组合物被连续施用。

13.如权利要求1所述的方法，其中所述受试者还被施用抗凝血剂。

14.如权利要求13所述的方法，其中所述受试者还被施用血栓溶解剂。

15.如权利要求14所述的方法，其中所述血栓溶解剂是tPA。

16.如权利要求1所述的方法，其中所述受试者还被施用氧吸入。

17.如权利要求1所述的方法，其中所述包含全氟化碳乳液的组合物还包含表面活性剂。

18.如权利要求1所述的方法，其中所述受试者的体温在29℃和37℃之间。

19.如权利要求1所述的方法，其中所述包含全氟化碳乳液的组合物改善了所述组织的氧合从而在不增加脑出血的发生率的情况下减少了所述梗塞体积。

20.如权利要求1所述的方法，还包括解决所述局部缺血性事件。

21.如权利要求1所述的方法，其中所述受试者经历由于中风导致的局部缺血。

22.如权利要求1所述的方法，其中所述局部缺血性事件是低血压。

23.如权利要求1所述的方法，其中所述局部缺血性事件是缺氧。

24.如权利要求1所述的方法，其中所述全氟化碳是DDFPe。

25.如权利要求1所述的方法，其中所述局部缺血性事件是中风，所述全氟化碳是DDFPe，且所述组合物经由至少一次大丸剂注射被静脉内施用。

26.一种用于在处于局部缺血性组织损伤的危险的受试者中改善组织氧合的方法，所述方法包括在导致所述受试者处于局部缺血性组织损伤的高危险的医疗操作之前向所述受试者施用有效量的包含全氟化碳乳液的组合物。

27.如权利要求26所述的方法，其中所述医疗操作选自由心脏手术、开放手术、矫形手术和骨骼手术、血管成形术、支架术、装置植入术和切除术组成的组。

28.如权利要求26所述的方法，其中所述包含全氟化碳乳液的组合物被静脉内施用。

29.如权利要求26所述的方法，其中约1％至约5％w／v的全氟化碳乳液的组合物以所述受试者的约0.01ml／kg至约1ml／kg的量被施用于所述受试者。

30.如权利要求29所述的方法，其中约2％w／v的全氟化碳乳液的组合物以所述受试者的约0.01ml／kg至约1ml／kg的量被施用于所述受试者。

31.如权利要求28所述的方法，其中所述组合物在一个以上的时间点被施用。

32.如权利要求28所述的方法，其中所述组合物在两个以上的时间点被施用。

33.如权利要求28所述的方法，其中所述组合物在三个以上的时间点被施用。

34.如权利要求28所述的方法，其中所述组合物在十五个以上的时间点被施用。

35.如权利要求28所述的方法，其中所述包含全氟化碳乳液的组合物以大丸剂被施用。

36.如权利要求28所述的方法，其中所述包含全氟化碳乳液的组合物被连续施用。

37.如权利要求26所述的方法，其中所述受试者还被施用抗凝血剂。

38.如权利要求37所述的方法，其中所述受试者还被施用血栓溶解剂。

39.如权利要求38所述的方法，其中所述血栓溶解剂是tPA。

40.如权利要求26所述的方法，其中所述受试者还被施用氧吸入。

41.如权利要求26所述的方法，其中所述包含全氟化碳乳液的组合物还包含表面活性剂。

42.如权利要求26所述的方法，还包括在所述医疗操作期间和／或之后施用所述组合物。

43.如权利要求26所述的方法，其中所述受试者的体温在29℃和37℃之间。

44.如权利要求26所述的方法，其中所述包含全氟化碳乳液的组合物改善了所述组织的氧合从而在不增加脑出血的发生率的情况下减少了所述梗塞体积。

45.如权利要求26所述的方法，其中所述全氟化碳是DDFPe。

46.一种用于在处于局部缺血性组织损伤的危险的受试者中提高神经保护的方法，所述方法包括在导致所述受试者处于神经局部缺血性组织损伤的高危险的医疗操作之前向所述受试者施用有效量的包含全氟化碳乳液的组合物。

47.如权利要求46所述的方法，其中所述医疗操作选自由心脏手术、开放手术、矫形手术和骨骼手术、血管成形术、支架术、装置植入术和切除术组成的组。

48.如权利要求46所述的方法，其中所述包含全氟化碳乳液的组合物被静脉内施用。

49.如权利要求46所述的方法，其中约1％至约5％w／v的全氟化碳乳液的组合物以所述受试者的约0.01ml／kg至约1ml／kg的量被施用于所述受试者。

50.如权利要求49所述的方法，其中约2％w／v的全氟化碳乳液的组合物以所述受试者的约0.01ml／kg至约1ml／kg的量被施用于所述受试者。

51.如权利要求49所述的方法，其中所述组合物在一个以上的时间点被施用。

52.如权利要求49所述的方法，其中所述组合物在两个以上的时间点被施用。

53.如权利要求49所述的方法，其中所述组合物在三个以上的时间点被施用。

54.如权利要求49所述的方法，其中所述组合物在十五个以上的时间点被施用。

55.如权利要求46所述的方法，其中所述包含全氟化碳乳液的组合物以大丸剂被施用。

56.如权利要求46所述的方法，其中所述包含全氟化碳乳液的组合物被连续施用。

57.如权利要求46所述的方法，还包括在所述医疗操作期间和/或之后施用所述组合物。

58.如权利要求46所述的方法，其中所述受试者还被施用抗凝血剂。

59.如权利要求58所述的方法，其中所述受试者还被施用血栓溶解剂。

60.如权利要求59所述的方法，其中所述血栓溶解剂是tPA。

61.如权利要求46所述的方法，其中所述受试者还被施用氧吸入。

62.如权利要求46所述的方法，其中所述包含全氟化碳乳液的组合物还包含表面活性剂。

63.如权利要求46所述的方法，其中所述受试者的体温在29℃和37℃之间。

64.如权利要求46所述的方法，其中所述局部缺血性事件被进一步解决。

65.如权利要求46所述的方法，其中所述全氟化碳是DDFPe。

66.一种用于治疗出血性中风的方法，所述方法包括向需要出血性中风的治疗的受试者施用有效量的包含全氟化碳乳液的组合物。

67.如权利要求66所述的方法，其中所述包含全氟化碳乳液的组合物在范围从所述出血性中风的起始之前至症状发作之后7小时的时间内被施用。

68.如权利要求66所述的方法，其中所述包含全氟化碳乳液的组合物在范围从症状发作之后1小时至症状发作之后24小时的时间内被施用。

69.如权利要求66所述的方法，其中所述包含全氟化碳乳液的组合物被静脉内施用。

70.如权利要求66所述的方法，其中将约1％至约5％w/v的全氟化碳乳液的组合物以所述受试者的约0.01ml/kg至约1ml/kg的量施用于所述受试者。

71.如权利要求69所述的方法，其中将约2％w/v的全氟化碳乳液的组合物以所述受试者的约0.01ml/kg至约1ml/kg的量施用于所述受试者。

72.如权利要求69所述的方法，其中所述包含全氟化碳乳液的组合物以大丸剂被施用。

73.如权利要求69所述的方法，其中所述包含全氟化碳乳液的组合物被连续施用。

74.如权利要求69所述的方法，其中所述组合物在一个以上的时间点被施用。

75.如权利要求69所述的方法，其中所述组合物在两个以上的时间点被施用。

76.如权利要求69所述的方法，其中所述组合物在三个以上的时间点被施用。

77.如权利要求69所述的方法，其中所述组合物在十五个以上的时间点被施用。

78.如权利要求66所述的方法，其中所述包含全氟化碳乳液的组合物还包含表面活性剂。

79.如权利要求66所述的方法，其中所述全氟化碳是DDFPe。

80.一种用于降低由颅内脑出血导致的梗塞大小的方法，所述方法包括向需要颅内脑出血的治疗的受试者施用有效量的包含全氟化碳乳液的组合物。

81.如权利要求80所述的方法，其中所述包含全氟化碳乳液的组合物在范围从所述颅内脑出血的起始之前至症状发作之后7小时的时间内被施用。

82.如权利要求80所述的方法，其中所述包含全氟化碳乳液的组合物在范围从症状发作之后1小时至症状发作之后24小时的时间内被施用。

83.如权利要求80所述的方法，其中所述包含全氟化碳乳液的组合物被静脉内施用。

84.如权利要求80所述的方法，其中将约1％至约5％w/v的全氟化碳乳液的组合物以所述受试者的约0.01ml/kg至约1ml/kg的量施用于所述受试者。

85.如权利要求83所述的方法，其中将约2％w/v的全氟化碳乳液的组合物以所述受试者的约0.01ml/kg至约1ml/kg的量施用于所述受试者。

86.如权利要求83所述的方法，其中所述包含全氟化碳乳液的组合物以大丸剂被施用。

87.如权利要求83所述的方法，其中所述包含全氟化碳乳液的组合物被连续施用。

88.如权利要求83所述的方法，其中所述组合物在一个以上的时间点被施用。

89.如权利要求83所述的方法，其中所述组合物在两个以上的时间点被施用。

90.如权利要求83所述的方法，其中所述组合物在三个以上的时间点被施用。

91.如权利要求83所述的方法，其中所述组合物在十五个以上的时间点被施用。

92.如权利要求80所述的方法，其中所述包含全氟化碳的组合物还包含表面活性剂。

93.如权利要求80所述的方法，其中所述全氟化碳是DDFPe。

94.一种组合，所述组合包含组合物和血栓溶解剂，所述组合物包含全氟化碳乳液。

95.如权利要求94所述的组合，所述组合包含组合物和tPA，所述组合物包含全氟化碳乳液。

96.如权利要求94所述的组合，其中所述全氟化碳是DDFPe。