CN111528179A - 超声联合微泡建立大鼠脑出血模型的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及超声联合微泡建立大鼠脑出血模型的方法，属于生物模型制备技术领域。该方法执行如下，1）SPF级雄性SD大鼠一只，体质量240‑270g；2）准备工作；3）在辅助工具帮助下,从大鼠尾静脉注入微泡造影剂，注入量依照所述大鼠的体质量决定；4）超声干预；5）对大鼠行头CT平扫；6）以白炽灯照射大鼠至少2h，保持肛温在37±0.5℃；7）对大鼠神经功能评分，并饲养观察待用。本发明通过超声靶向作用于造影剂，借助微泡瞬间空化效应，对脑内目标区局部血管产生破坏作用，使得大鼠出现脑实质内出血现象，符合自发性脑出血的研究要求，具有无创、简便、易推广的优点，是合适的可再现的生物造模方法。同时，还引入了辅助设备，使得操作更为简便可行。
Description
技术领域
本发明涉及超声联合微泡建立大鼠脑出血模型的方法，属于生物模型制备技术领域。
背景技术
脑出血（Intracerebral Hemorrhage，ICH）是神经科常见的脑血管疾病，具有致病率、致残率、复发率、致死率高的特点，并且发病率逐年上升，发病年龄趋于年轻化。脑出血的临床治疗,大多以脱水降颅压、手术减压和康复锻炼为主,但多数病人仍遗留不同程度神经功能障碍,对家庭及社会造成严重的医疗经济负担，影响患者及家庭生活质量。因此，建立可重复性高、稳定性好，与人类高度相似的脑出血动物模型，才能对脑出血的发病机制、病理生理改变、治疗等方面进行有效深入的研究。
目前已知的脑出血造模方法有以下几种，分别为胶原酶诱导脑出血模型、自体血注入形成脑出血模型、自发性脑出血动物模型、微球囊充胀脑出血模型。胶原酶诱导脑出血模型是一种弥漫性的渗血，血肿形成时间较长，不具有急性的占位效应，并且胶原酶具有细胞毒性作用，血肿周围炎性反应很重，可以直接破坏血脑屏障并损伤脑组织，这与单纯自发性脑出血对脑组织的损害存在一定差异，因此并不能完全模拟人类自发性脑出血后二次脑损伤的病理生理过程，不适合用来进行血肿周围脑组织血液循环障碍的研究，具有局限性。自体血注入形成脑出血模型形成的脑内血肿并非脑内血管破裂引起，血肿量与血肿形态没有直接关系，注射过快易有血液反流溢出，过慢会出现血液凝固在针内的情况，血肿在脑内的压力也很难固定，容易出现血肿胀裂脑组织流入脑室形成脑室内血肿的情况，所以形成的血肿在形态和大小的重复性上差。自发性脑出血动物模型不足之处是这容易出现断种、变种的情况，遗传方面存在局限性，并且饲养困难、制作成本较高、取得来源较少。微球囊充胀脑出血模型只能模拟脑出血后脑内血肿的占位效应，忽略了其他原因在脑出血后对脑组织造成的影响。
另外，为避免单一方法制作的缺点，目前也有使用复合型的方法，如胶原酶诱导＋自体血注入诱导脑出血模型、胶原酶＋肝素注入诱导脑出血模型、自体血＋肝素注入制作脑出血模型，改变遗传基因的方式＋自体血注入法结合。虽然都从一定程度上解决了原先方法中的问题，但其符合前自身所存在的缺陷均没有完全被解决，只能说是“1+1=2”的方案，完全没超越前人方案。当然还有介入穿刺式的造模方案，但实际操作中需要根据实验者对造模过程的熟练程度来保证造模的成功率，缺乏大规模应用基础，再现难度大。
自发性脑出血的发生是脑内血管破裂出血,上述方法均不能模拟该病理过程，同时存在建模过程技术要求高、有创、无法标准化等问题。所以亟需一种方法，能够从根本上解决目前对于脑出血造模这一方案中所遇到的问题。
发明内容
为了解决以上技术问题，本技术方案的目的在于解决现有技术的不足，提供一种超声联合微泡建立大鼠脑出血模型的方法。
本技术方案的超声联合微泡建立大鼠脑出血模型的方法，执行如下步骤：
1）SPF级雄性SD大鼠一只，体质量240-270g；
2）准备工作；
将大鼠固定于脑立体定位仪上，实施麻醉；以60w的白炽灯垂直距离50cm照射大鼠，在造模过程中始终保持大鼠肛温在37±0.5℃；大鼠颅顶脱毛；
3）在辅助工具帮助下,从大鼠尾静脉注入微泡造影剂，注入量依照所述大鼠的体质量决定；
4）超声干预，启动超声设备，用超声耦合剂将超声探头与大鼠的颅骨紧密结合，实施超声干预，使微泡造影剂达到瞬间空化阈值；
5）对大鼠行头CT平扫，明确脑出血部位和出血量；
6）以60w的白炽灯垂直距离50cm照射大鼠至少2h，保持大鼠肛温在37±0.5℃；
7）对大鼠神经功能评分，符合评分标准的大鼠即为造模成功大鼠，并饲养观察待用。
上述方案的进一步改进是：步骤3）中，微泡造影剂的注入量为0.1mL/kg。
上述方案的进一步改进是：步骤4）中，超声干预的频率为2Mhz,能量为5-10W/cm2,作用时间120s。
上述方案的进一步改进是：所述微泡造影剂为六氟化硫微泡。
上述方案的进一步改进是：步骤2）中，用质量分数为10%的水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，300—400mg/kg。
上述方案的进一步改进是：步骤7）大鼠神经功能评分的方法采用如下的一种或多种，神经行为学检查Longa评分法、Berderson评分法姿势反射测验、 攀绳实验、网屏测验、肢体放置测验、开野试验法、MNSS、转动杆测验、Rotation、肢体对称试验评分法、rotarodtest、adhesive-removal somatosensory test、Spontaneous Activity、Symmetry in theMovement of Four Limbs、Forepaw Outstretching、Climbing、Body Proprioception、Response to Vibrissae Touch。
上述方案的进一步改进是：神经功能评分过程，由至少3位参加试验的人员分别以单盲法对试验的大鼠进行打分和记录.然后将至少3组的记分结果进行平均后的得分进行统计计算。
本发明技术方案具有如下有益效果：本发明通过超声靶向作用于造影剂，借助微泡瞬间空化效应，对脑内目标区局部血管产生破坏作用，使得大鼠出现脑实质内出血现象，符合自发性脑出血的研究要求，具有无创、简便、易推广的优点，是合适的可再现的生物造模方法。同时，还引入辅助设备，降低实施难度，使得操作更为简便可行。
具体实施方式
本实施例的超声联合微泡建立大鼠脑出血模型的方法，造模过程中对动物的处置符合2009年《Ethical issues in animal experimentation》相关动物伦理学标准的条例；执行如下步骤：
1）SPF级雄性SD大鼠一只，体质量240-270g；
大鼠饲养环境：24℃恒温，7:00-19:00开灯，晚间关灯，保持通风。可在造模前 12 h，对大鼠禁食、禁水，以便浓缩动物血液成分，使血液处于高凝状态，容易形成血肿；
设备器械准备；
荧光显微镜：OLYMPUS BX51,日本；
荧光数码摄像头：Penguin Camera 150CL，Pixera，美国；
图像采集软件：
VIEWFINDER 3.0,Pixera，美国；
IMAGE Pro-Plus4.5.0.19，Media Cybernetics，Inc，美国；
视图软件：
STUDIO 3.0,Media Cybernetics，Inc，美国；
图像分析软件专用图像采集卡：IMAGE Pro-Plus，Media Cybernetics，Inc，美国；
图像采集卡加密狗：SN:41N45000-34584,Media Cybernetics,Inc,美国；
电脑：配有大内存的兼容电脑；
超声发生装置：Sequoia 512，Acuson，美国；
TS-2 超声发生器，中国人明解放军第一军医大学医疗仪器研制所，中国；
恒温循环器：HX-1050 恒温循环器，北京博益康实验仪器有限公司，中国；
透明垫水槽：自制；
微量注射泵：Terumo Terufusion syringe pump TE311，TERUMO Corporation，日本；
多功能稳压器：TM88，广东省中山市东凤大高电子设备厂，中国；
显微手术器械：显微手术镊、显微手术剪、显微手术持针器，上海医疗器械有限公司手术器械厂，中国；
PE50、PE30透明多聚酯导管，美国；
5,10,20,50ml注射器若干、普通手术器械，中国；
MP120-2电子天平：上海第二天平仪器厂，中国。
尾部辅助注射装置：S4-RGDQ2 有机玻璃大鼠固定器，DN50，思科诺思生物科技（北京）有限公司，中国；CN201420106282.9一种尾部辅助注射装置；
S3-TMQ 大鼠剃毛器：思科诺思生物科技（北京）有限公司，中国；
不锈钢大鼠代谢笼：思科诺思生物科技（北京）有限公司，中国；
2）准备工作；
将大鼠固定于脑立体定位仪上，以质量分数为10%的水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠（300mg/kg）实施麻醉；以60w的白炽灯垂直距离50cm照射大鼠，在造模过程中始终保持大鼠肛温在37±0.5℃；大鼠颅顶脱毛；
3）通过尾部辅助注射装置,借由微量注射泵匀速持续从大鼠尾静脉注入微泡造影剂，微泡造影剂为六氟化硫微泡（瑞士Bracco Suisse SA），注入量依照所述大鼠的体质量决定，具体为0.1mL/kg；
4）超声干预，启动超声设备，用超声耦合剂将超声探头与大鼠的颅骨紧密结合，实施超声干预，使达到六氟化硫微泡的瞬间空化阈值；超声干预的频率为2Mhz,能量为10W/cm2,作用时间120s；
5）对大鼠行头CT平扫，明确脑出血部位和出血量；
6）以60w的白炽灯垂直距离50cm照射大鼠至少2h，保持大鼠肛温在37±0.5℃；
7）对大鼠神经功能评分，符合评分标准的大鼠即为造模成功大鼠，并饲养观察待用。
大鼠神经功能评分的方法有很多种，如神经行为学检查Longa评分法、Berderson评分法姿势反射测验、 攀绳实验、网屏测验、肢体放置测验、开野试验法、MNSS、转动杆测验、Rotation、肢体对称试验评分法、rotarod test、adhesive-removal somatosensorytest、Spontaneous Activity、Symmetry in the Movement of Four Limbs、ForepawOutstretching、Climbing、Body Proprioception、Response to Vibrissae Touch。
以神经行为学检查Longa评分法为例，该评分法的标准如下：0 分，无神经缺损症状；1 分，左前肢不能完全伸直；2 分，向左旋转，出现转圈；3 分，行走时身体向偏瘫侧倾倒；4分，不能自发行走，意识丧失。评分为2-3分者定为造模成功。
本实施例的神经功能评分过程，由至少3位参加试验的人员分别以单盲法对试验的大鼠进行打分和记录.然后将至少3组的记分结果进行平均后的得分进行统计计算。
本实施例的方法所得到的的模型介于渗血的脑出血生物模型到具有急性占位效应的脑出血模型之间的生物模型。超声干预的能量控制在5—10W/cm2之间，声压强0.48—2.4MPa,其中，0.64MPa、0.8Mpa、1.2MPa有突出的效果。当能量接近5w/cm2时，所得到的生物模型更接近于渗血的脑出血生物模型。但由于每个大鼠个体不完全相同，造成每个个体的造影剂注入量不同，因此能量与生物模型间并不存在明确的关系。因此需要对大鼠行头CT平扫，明确脑出血部位和出血量。
本实施例所采用的微泡造影剂为六氟化硫微泡（瑞士Bracco Suisse SA），以上数据是基于该微泡造影剂给出的。若采取不同的微泡造影剂，相应的参数需随之变化，可根据微泡造影剂厂家所提供的参数和微泡造影剂的稳定性和气体类型等特性进行变化。但其具体结果和变换量实质是可以预期的改变。在此就不一一赘述。
除本实施例步骤2）中提到的质量分数为10%的水合氯醛用量300mg/kg，可以根据需要逐步增加注射量，但注射总量不应超过400mg/kg。
本实施例的神经功能评分方法除了采用步骤7）中已使用的神经行为学检查Longa评分法外，还可采用以下方法进行，如Berderson评分法姿势反射测验、 攀绳实验、网屏测验、肢体放置测验、开野试验法、MNSS、转动杆测验、Rotation、肢体对称试验评分法、rotarod test、adhesive-removal somatosensory test、Spontaneous Activity、Symmetry in the Movement of Four Limbs、Forepaw Outstretching、Climbing、BodyProprioception、Response to Vibrissae Touch。
最后需要说明的是，所描述的实施例仅是本发明的具体应用范例之一，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，实际应用过程中均可根据具体情况酌情选择和调整部分步骤的顺序，但对本技术方案的保护范围不构成任何限制，且所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.超声联合微泡建立大鼠脑出血模型的方法，其特征在于，执行如下步骤：
1）SPF级雄性SD大鼠一只，体质量240-270g；
2）准备工作；
将大鼠固定于脑立体定位仪上，实施麻醉；以60w的白炽灯垂直距离50cm照射大鼠，在造模过程中始终保持大鼠肛温在37±0.5℃；大鼠颅顶脱毛；
3）在辅助工具帮助下,从大鼠尾静脉注入微泡造影剂，注入量依照所述大鼠的体质量决定；
4）超声干预，启动超声设备，用超声耦合剂将超声探头与大鼠的颅骨紧密结合，实施超声干预，使微泡造影剂达到瞬间空化阈值；
5）对大鼠行头CT平扫，明确脑出血部位和出血量；
6）以60w的白炽灯垂直距离50cm照射大鼠至少2h，保持大鼠肛温在37±0.5℃；
7）对大鼠神经功能评分，符合评分标准的大鼠即为造模成功大鼠，并饲养观察待用。
2.根据权利要求1所述的超声联合微泡建立大鼠脑出血模型的方法，其特征在于：步骤3）中，微泡造影剂的注入量为0.1mL/kg。
3.根据权利要求1所述的超声联合微泡建立大鼠脑出血模型的方法，其特征在于：所述微泡造影剂为六氟化硫微泡。
4.根据权利要求3所述的超声联合微泡建立大鼠脑出血模型的方法，其特征在于：步骤4）中，超声干预的频率为2Mhz,能量为5-10W/cm2,作用时间120s。
5.根据权利要求1所述的超声联合微泡建立大鼠脑出血模型的方法，其特征在于：步骤2）中，用质量分数为10%的水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，300—400mg/kg。
6.根据权利要求1所述的超声联合微泡建立大鼠脑出血模型的方法，其特征在于：步骤7）大鼠神经功能评分的方法采用如下的一种或多种，神经行为学检查Longa评分法、Berderson评分法姿势反射测验、攀绳实验、网屏测验、肢体放置测验、开野试验法、MNSS、转动杆测验、Rotation、肢体对称试验评分法、rotarod test、adhesive-removalsomatosensory test、Spontaneous Activity、Symmetry in the Movement of FourLimbs、Forepaw Outstretching、Climbing、Body Proprioception、Response toVibrissae Touch。
7.根据权利要求6所述的超声联合微泡建立大鼠脑出血模型的方法，其特征在于：神经功能评分过程，由至少3位参加试验的人员分别以单盲法对试验的大鼠进行打分和记录.然后将至少3组的记分结果进行平均后的得分进行统计计算。
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