JP6410335B2 - 形質転換体及びその作出方法 - Google Patents

Description

本発明は形質転換体及びその作出方法に関し、より具体的には、成長量（バイオマス）が増大した植物等の真核生物の形質転換体（品種）及びその作出方法に関する。

国連の推計によれば、現在の世界の人口は、７１億人を越えているという。ボーローグ博士によって開始されたコムギ半矮性遺伝子を利用した多収性品種の育成「緑の革命」（１９４０−６０年代）は、従来の穀物の生産量を２．５倍に増大するために大きく貢献した。この収量の増大は、当時急増した世界人口を養うために大きな役割を果たした。

しかしながら、緑の革命品種が世界中に普及した１９９０年以降は、穀物の単位収穫量が増大しておらず、増加する人口に必要な食糧は、熱帯雨林などを切り開いて拡大した耕地で増産しているのが現状である。森林の伐採は、光合成量を減少させ、地球環境の悪化、生物多様性の減少の原因となっている。

また一方で、地球の大気や海洋の平均温度が上昇するいわゆる地球温暖化が大きな問題として取り上げられており、その主要因は石油、石炭などの化石エネルギーの燃焼によって生ずる二酸化炭素放出量の増加であると考えられている。そしてこの二酸化炭素放出量を削減するため、風力、太陽光発電、地熱、植物バイオマスなどの再生可能エネルギーへの転換が検討されている。植物バイオマスは、太陽光のエネルギーを利用し光合成により二酸化炭素を固定した有機物であるため、植物バイオマスを燃焼してエネルギーを取り出しても二酸化炭素の放出量を増加させることがない（カーボンニュートラル）。そのため、エネルギー資源の確保および二酸化炭素放出量の削減の２つの課題を同時に解決する手段として期待されている。

しかしながら、再生可能エネルギーを実用化するための問題は、化石エネルギーと比べコストパフォーマンスが悪く、特に、植物バイオマスの生産は、食糧の生産と競合するために、上記森林の伐採に関する問題だけでなく、食糧価格の上昇を招くのではないかと懸念されている。

日本の農業では、高すぎる作物の生産コストが最も大きな問題となっている。例えば、米１俵の生産コストは約１．３万円で、販売額とほぼ同じである。また、外国産のサトウキビは４，０００円／トンであるが、国産サトウキビは２０，０００円／トンである。現状、この差額の１６，０００円は補助金で補填されている。特に現在、日本は環太平洋戦略的経済連携協定（ＴＰＰ）への参加を検討しており、ＴＰＰが発効すれば、外国産の安い農産物が大量に輸入され、日本の農業に大きな打撃を与えることは間違いない。

また、急増する世界人口を背景に、現在の食糧輸出国が一転して食糧輸入国に転じるおそれもあり、将来も日本に対し食糧を供給し続けるという保障はなく、日本の食糧生産を安易に海外に依存していては、食糧安全保障の面から大変危険である。すなわち、日本国内における植物バイオマスの生産は、食糧生産を担保するためにも有効である。

上述のさまざまな課題を解決するためには、面積当りの植物バイオマスの生産量を大きく増大することが有効である。植物バイオマスの生産コストを低下させることができれば、バイオマスエネルギーの産業化を推進することができる。また、農業および野菜工場の採算化、植物を用いた物質生産の実用化などに大きく貢献できる。

ところで、植物等の真核生物の成長量を増大させる方法の一つに雑種強勢を利用した方法がある。雑種強勢とは、遠縁な両親の間の雑種が両親よりも強勢な成長を示す遺伝現象で一代雑種（Ｆ１）品種の作出方法として確立されている。

しかしながら、雑種強勢による生長量の増大は、雑種第一代においてのみ発現し、その後代には遺伝しないことが知られている。

一方、近年の遺伝子解析技術の発展に伴い、植物の多くの遺伝子の機能及び遺伝子ネットワークが解析され、そのデータが集積されてきており、これらの研究成果を利用し、植物のバイオマス生産量を強化しようとする研究が盛んに行なわれている。

例えば、Ｅｒｉｋｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０１０）は、ジベレリン生合成系の調節遺伝子を高発現させたポプラ形質転換体の地上部のバイオマスが７０％程増大するというデータを示している。

また、Ｉｓｈｉｍａｒｕ ｅｔ ａｌ．（２０１２）は、イネの種子で発現するＩＡＡ−ｇｌｕｃｏｓｅ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ遺伝子を欠損させると、粒重が増大し１５％の収量増加できることを報告している。

また、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（２０１３）は、細胞内の過酸化物の処理能力を高めるＯｓＤＨＡＲ遺伝子を導入したイネの形質転換体は、収量が約１５％増加することを報告している。

また最近、Ｙｏｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．（２０１２）は、イネの穂の二次枝梗の分化を促進するｔａｗ１−Ｄ遺伝子を見出しており、この遺伝子を交配により導入したコシヒカリは種子粒数が倍増し、約５０％程度の収量増加となるのではないかと見込まれている。

上記各報告は確かに効果的ではあるが、生物全体の成長量（乾物重量）を数倍に増大した研究例はこれまでに知られていない。

そこで、本発明は、遺伝子導入によって、植物等の真核生物の生長量（バイオマス）を数倍に増大する形質転換体の作出方法および当該技術により作出された形質転換体を提供することを目的とする。

上記課題を解決する本発明の一の観点に係る真核生物である植物の形質転換体の作出方法は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩにより転写されるユビキチン遺伝子のプロモータ配列に、異なる種から単離したイネの４５Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を連結した構築物を含む形質転換用ベクターを用いる。また、前記植物がアラビドプシスであると望ましい。

また、本発明の他の一観点に係る真核生物である植物の形質転換体は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩにより転写されるユビキチン遺伝子のプロモータ配列に、異なる種から単離したイネの４５Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を連結した構築物を含む形質転換用ベクターを用いて作出される。また、前記植物がアラビドプシスであることを特徴とする形質転換体であると望ましい。

上記課題を解決する他の一の観点に係る真核生物の形質転換体は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩにより転写される遺伝子のプロモータ配列に、異なる種から単離した４５Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を連結した構築物を含む形質転換用ベクターを用いて作出されるものである。

以上、本発明により、遺伝子導入によって、植物等の真核生物の生長量（バイオマス）を数倍に増大する形質転換体の作出方法および当該技術により作出された形質転換体を提供することが可能となる。

特に、本発明によると、４５Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を、ＲＮＡポリメラーゼＩＩで転写する形質転換体を作出することによりバイオマスを２倍以上に増大できるというものであって、手法および結果ともに上記の研究とは全く異なる独創的なものとなっている。

また本発明によると、様々な植物の原系統（品種）の特性を損なうことなく、生長量（バイオマス）を数倍に増大した形質転換体を作出することが可能になる。単位面積当りの生産量を数倍に増大することができれば、生産コストを数分の１にすることができるため、サトウキビ、ユーカリなどを用いたバイオマスエネルギーのコストパフォーマンスを改善できる。また、バイオマスを増大することができれば、穀物、野菜、薬用植物の生産量を増大することができる。また、植物工場など施設園芸作物生産の採算化に貢献できる。さらに、植物などの培養細胞を用いた有用物質の物質生産の効率を高めることが可能になる。ランやリンゴなどの植物は、開花までに数年間を要しているが、この年限を短縮することも期待することができる。

イネの４５Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のＰＣＲ増幅とバイナリーベクターの構築について説明する図である。 アラビドプシス形質転換体の作出についての模式図である。トウモロコシのユビキチン遺伝子プロモータにイネの４５Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を連結して、ハイグロマイシン抵抗性遺伝子を含むバイナリーベクターに組み込み、Ｆｌｏｒａｌ ｄｉｐ法によりアラビドプシス形質転換体を作出した。この形質転換体では、イネの４５Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子は、Ｐｏｌ ＩＩにより転写される。 アラビドプシス形質転換体のＰＣＲおよびサザン解析の結果を示す図である。イネの４５Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を４コピーおよび３コピー導入したアラビドプシスの形質転換体をそれぞれ２系統および３系統作出した。 形質転換体２系統（４５−２、４５−３）のＴ２後代と対照（Ｃｏｌ−０）系統の生育試験、展開葉数およびロゼット葉の最大直径の径時的変化を示す図である。 形質転換２系統（４５Ｓ−２、４５Ｓ−３）のＴ２後代の開花期におけるロゼット葉の最大直径（Ｄ．Ｍ．）、地上部の乾物重（Ｄ．Ｗ）．対照（Ｃｏｌ−０）系統の乾物重を１００とした値（Ｄ．Ｗ．ｒａｔｉｏ）。を示す図である。

以下、本発明を実施するための形態について詳細に検討する。ただし、本発明は多くの異なる形態による実施が可能であり、以下に示す実施形態、実施例の例示にのみ限定されるわけではない。

本実施形態に係る真核生物の形質転換体の作出方法は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（Ｐｏｌ ＩＩ）により転写される遺伝子のプロモータ配列に、異なる種から単離した４５Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の少なくとも一部を連結した構築物を含む形質転換用ベクターを用いる。

また本実施形態に係る真核生物の形質転換体は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩにより転写される遺伝子のプロモータ配列に、異なる種から単離した４５Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の少なくとも一部を連結した構築物を含む形質転換用ベクターを用いて作出される。

本実施形態において、プロモータ配列は、Ｐｏｌ ＩＩにより転写される遺伝子のものであれば、どんな遺伝子のプロモータ配列も利用可能であるが、カリフラワーモザイクウィルスなどの強い遺伝子発現を誘導できるプロモータ配列であることが好ましい。

また本実施形態において、４５Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子は、限定されるわけではないが、遺伝子を導入する宿主生物と異なる属の生物から単離したものを用いることが好ましい。

Ｐｏｌ ＩＩにより認識されるプロモータ配列及びターミネータ配列に連結した異種の４５Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を目的遺伝子カセットとして、直接又は間接形質転換法を用いて当該遺伝子カセットを導入した植物等の形質転換体を作出することができる。

上記形質転換法としては、限定されるわけではないが、遺伝子銃（パーティクルガン）法などの直接形質転換法およびアグロバクテリウム媒介法などの間接形質転換法のいずれかの方法を用いることができる。

なお本実施形態に係る強勢成長を示す形質転換体の作出方法は、双子葉、単子葉を含む被子植物、裸子植物、シダ類、コケ類、藻類などのすべての植物に適応できる。以下具体的な手順については、植物を例に説明するが、原理上、植物以外の真核生物にも応用可能である。

［４５Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子単離］
本方法には、植物の４５Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の少なくとも一部を用いる。４５Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子は、ＰＣＲ法により増幅すること、又は、ゲノムＤＮＡより切り出すことができる。また、植物以外の真核生物から単離した４５Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を用いることも可能である。

［形質転換用ベクターの構築方法］
単離した４５Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の全長又はその一部をＲＮＡポリメラーゼＩＩにより転写される遺伝子のプロモータ配列及びターミネータ配列の間に挿入して融合遺伝子を作製する。プロモータ配列としては限定されるわけではないが、カリフラワーモザイクウィルスの３５Ｓ転写物プロモータ等、遺伝子発現量の高いプロモータ配列を用いることが好ましい。また、上記のとおり、植物以外の真核生物のプロモータ配列も使用可能である。

そして、作製した融合遺伝子を抗生物質等の選抜マーカー遺伝子を含むベクターに組み込む。形質転換植物を作出するためには、アグロバクテリウムで複製可能なバイナリーベクターに組み込むことが好ましい。しかし、直接遺伝子導入法を用いて形質転換体を作出することも可能である。

また、形質転換植物を作出するためには、Ｔｉプラスミドを保持したアグロバクテリウム（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）を用いることが好ましい。なお、パーテクルガン、マイクロインジェクション、リポソーム、ポリエチレングリコールなどを用いて形質転換体を作出することも可能である。

アグロバクテリウムを用いる形質転換法としては、限定されるわけではないがバイナリーベクター法が好ましい。バイナリーベクター法とは、Ｔ−ＤＮＡ領域のボーダー（ＬＢ及びＲＢ）を有するプラスミドのＴ−ＤＮＡ領域に目的の外来遺伝子を組み込んだプラスミドをアグロバクテリウムに導入して植物に感染させることにより、目的遺伝子を植物ゲノムに挿入する方法である。

バイナリーベクター法を利用した発現カセットは、Ｔ−ＤＮＡ領域に、目的遺伝子の４５Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子、及び当該遺伝子が導入された細胞を選抜するための選抜マーカー遺伝子、レポーター遺伝子を含んでいる。また、マーカーフリー（ＭＡＴ） ベクターを利用することもできる。

ここでプロモータ配列としては、植物において強い遺伝子発現を誘導するカリフラワーモザイクウィルスの３５Ｓ ＲＮＡ、ノパリンシンターゼ（ｎｏｓ）、アクチン並びにβ−ファゼオリン、ナピン、ユビキチン遺伝子のプロモータなどが挙げられる。また、植物以外の真核生物のプロモータ配列も利用できる。

また、ターミネータ配列としては、プロモータにより転写された遺伝子の転写を終結できる配列であればよく、例えば、オクトビン合成酵素（ｏｃｓ）、カリフラワーモザイクウィルスの３５Ｓ ＲＮＡ遺伝子のターミネータが挙げられ、ノパリン合成酵素（ｎｏｓ）遺伝子のターミネータが好ましい。

また、選抜マーカー遺伝子としては、抗生物質や除草剤のような薬剤に対する抵抗性を付与する遺伝子が用いられる。具体的には、カナマイシン耐性遺伝子、パロモマイシンＢ耐性遺伝子、またはビスピリバックナトリウム塩（ＢＳ）、ビアラフォス、グルフォシネート及びグリフォセートのような除草剤に対する抵抗性遺伝子等が挙げられる。また、ＭＡＴベクターシステムのようなマーカーフリーベクターの使用も可能である。

また本実施形態では、必要に応じて、さらにエンハンサー配列などを含んでもよい。エンハンサーは、目的遺伝子の発現効率を高めるために用いられるものであって、限定されるわけではないが、カリフラワーモザイクウィルスの３５Ｓ ＲＮＡ遺伝子のプロモータ内の上流側の配列を含むエンハンサー領域等を例示することができる。

また、バイナリーベクターとしては、上記発現カセットをＴ−ＤＮＡ領域に含むものであって、具体的には、ｐＥＫＨ又はｐＥＫＢベクターに上記発現カセットを組み入れたものが好ましいが、ｐＢＩ系、ｐＲＩ系、ｐＰＺＰ系、ｐＳＭＡ系、ｐＧＷ系などの市販ベクターに上記発現カセットを組み入れたものも用いることができる。

そして、以上のような構成を有するバイナリーベクターを、トリペアレンタルメイティング法やｆｒｅｅｓｅ−ｔｈａｗ（凍結融解）法、エレクトロポレーション法等によりアグロバクテリウムに導入することにより、遺伝子導入用アグロバクテリウムを調製できる。

〔アグロバクテリウム接種液の調製〕
遺伝子導入用のアグロバクテリウム接種液としては、例えば２×ＹＴ培地、ＡＢ培地、ＹＥＰ培地、ＬＢ培地などにより外来遺伝子を保持したアグロバクテリウムを、１５〜２４時間程度培養した培養液を用いてもよく、また、培養したアグロバクテリウム属細菌を集菌し、ＭＥＳ、アセトシリンゴンを含むＭＳ培地に懸濁することにより調製してもよく、また、上記培養液をそのまま、接種液として用いてもよい。

また接種液には、限定されるわけではないが、さらに界面活性剤を含有することが好ましい。界面活性剤は、水の表面張力を低下させ、これにより、アグロバクテリウム懸濁液を植物組織の内部へ浸透させることができる。

また、使用する界面活性剤としては、水の表面張力を低下させて、接種液の植物組織への浸透を促進できるものであればよく、例えば、形質転換用試薬として市販されているＳＩＬＷＥＴ Ｌ−７７、Ｔｗｅｅｎ ８０、Ｔｗｅｅｎ ２０、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００等を例示することができる。また界面活性剤の濃度は、界面活性剤の種類にもよるが、０．００５〜０．０２％水溶液が好ましく用いられる。

〔外植体の調製〕
遺伝子導入に供される植物の組織は、葉片、胚軸、及びカルス等である。これらの組織は、無菌的に維持している植物体から調製することが好ましい。しかし、温室等で育成した植物体から殺菌処理により直接調製することも可能である。また、直接遺伝子導入法を用いて形質転換体を作出する場合には、上記に加え培養細胞を用いることができる。

〔遺伝子導入〕
上記のように外植体を調製し、目的遺伝子を保持するアグロバクテリウム接種液に浸漬することによりアグロバクテリウムが保持する目的遺伝子を植物細胞へ導入する。また、直接遺伝子導入法では、目的遺伝子を含むＤＮＡ断片を物理的に目的とする真核生物の細胞内へ導入する。

４５Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子が導入された細胞は、当代より強勢成長を示す。しかし、後代系統を育成して４５Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子をホモに持つ系統を選抜することが好ましい。これにより強勢成長を遺伝的に固定した形質転換体を作出することが可能になる。

本手法において用いる４５Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子は、目的とする植物（宿主）とは異なる分類群の種から単離することが好ましい。このことは同種から単離した４５Ｓ ｒＲＮＡにより強勢成長が誘導されることを否定するものではないが、同種であるとＲＮＡポリメラーゼＩとＩＩにより転写される４５Ｓ ｒＲＮＡを識別することができないため、強勢成長との因果関係を証明することが困難である。

以上、本実施形態により、遺伝子導入によって、植物等の真核生物の生長量（バイオマス）を数倍に増大する形質転換体の作出方法および当該技術により作出された形質転換体を提供することが可能となる。また本発明による生長量の増大は、後代に遺伝するので、遺伝的に固定した品種を作出することができる。

特に、本発明によると、４５Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を、ＲＮＡポリメラーゼＩＩで転写する形質転換体を作出することによりバイオマスを２倍以上に増大できるというものであって、手法および結果ともに上記の研究とは全く異なる独創的なものとなっている。

また本実施形態によると、様々な植物の原系統（品種）の特性を損なうことなく、生長量（バイオマス）を数倍に増大した形質転換体を作出することが可能になる。単位面積当りの生産量を数倍に増大することができれば、生産コストを数分の１にすることができるため、サトウキビ、ユーカリなどを用いたバイオマスエネルギーのコストパフォーマンスを改善できる。また、バイオマスを増大することができれば、穀物、野菜、薬用植物の生産量を増大することができる。また、植物工場など施設園芸作物生産の採算化に貢献できる。さらに、植物などの培養細胞を用いた有用物質の物質生産の効率を高めることが可能になる。ランやリンゴなどの植物は、開花までに数年間を要しているが、この年限を短縮することも期待することができる。

以下、実際に上記方法を実践し、本発明の効果を確認した。以下具体的に説明する。下記実施例は一例であり、本発明の範囲を限定するものではない。

〔４５Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子単離〕
まず、イネの栽培種（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ｌ．）のインド型系統Ｎ１６の葉よりＣＴＡＢ法（Ｄｏｙｌｅ ａｎｄ Ｄｏｙｌｅ １９８７）によってゲノムＤＮＡを抽出した。

次いで、ＰＣＲ法により４５Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の全長（５．８ｋｂ）を増幅して、４５Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子をＰＣＲ増幅した。なお増幅プライマーは下記のものを使用した。そして９４℃３分後、９４℃１分５８℃１分６８℃５分のサイクルを３０回繰り返し、得られたＰＣＲ産物にアデニンを付加し、ＴＯＰＯ ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを用いて、ＰＣＲ２．１ベクターにクローニングした（図１参照）。

そして、単離したイネ４５Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の全長の両端にあるＥｃｏＲＩサイトをパーシャルダイジェッションし、アガロース電気泳動を行い、イネの４５Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を含む断片をゲル抽出した。その後、抽出した断片を平滑末端処理し、Ｓｕｂ２２１ｓベクターのＢａｍＨＩサイトおよびＳａｌＩサイトを切断し、平滑末端処理を行い、トウモロコシのユビキチン遺伝子のプロモータ配列とアグロバクテリウムのノパリン合成酵素遺伝子のターミネータ配列との間に挿入し融合遺伝子（ＵｂｉＰ：：４５Ｓ ｒＲＮＡ）を作成した（図１参照）。

そして、バイナリーベクター（ｐＥＫＨ２）が保持するカナマイシンおよびハオグロマイシン抵抗性遺伝子カセットの間にあるＨｉｎｄＩＩＩサイトに、同じくＨｉｎｄＩＩＩで切断した融合遺伝子を含むプラスミッドを挿入してｐＥＫＨ２ ＵｂｉＰ：：４５Ｓ ｒＲＮＡを構築した。Ｓｕｂ２２１ｓベクターには、スペクチノマイシン抵抗性遺伝子が含まれているので、目的遺伝子を含むバイナリーベクターを効率良く選抜できた（図１参照）。

そして、構築したバイナリーベクターｐＥＫＨ２ ＵｂｉＰ：：４５Ｓ ｒＲＮＡを含む大腸菌を用いてＴｒｉｐａｒｅｎｔａｌ ｍａｔｉｎｇ法によりアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）菌株ＥＨＡ１０１にｐＥＫＨ２−ＵｂｉＰ：：４５Ｓ ｒＲＮＡを導入した。

そして、スペクチナマイシン５０ｍｇ／ｌ、カナマイシン２５ｍｇ／ｌ、クロラムフェニコール２５ｍｇ／ｌを含む抗生物質を含まない２×ＹＴ培地に、イネ４５Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を含むアグロバクテリウムを接種して１６時間培養した。菌液を４，０００ｒｐｍ、２５℃、３分遠心した。その後、上澄みを捨て、５％スクロースおよびＭＥＳを添加した１／２ＭＳ培地に再懸濁後、０．０２％になるようＬ−７７を加え、よく撹拌した。アグロバクテリウム濃度（ＯＤ６００）は、１．０程度に調整した。

〔形質転換植物の作出方法〕
モデル植物シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ Ｃｏｌｏｍｂｉａ−０）の種子を３％スクロース含有１／２ＭＳ培地に無菌播種して、発芽後２週間の幼苗を鉢上げし、２２℃、１６時間明期８時間暗期に調整したグロースチャンバー内で栽培した。鉢上げ後、３週間程度の蕾をアグロバクテリウムの接種に用いた。

そして、上記は種後３５日目のアラビドプシスの花序の先端に、ピペットマンを用いて１０から２０μｌのアグロバクテリウムの懸濁液を滴下した。アグロバクテリウムの接種後、３０日程度でシロイヌナズナの完熟種子（Ｔ１世代）が採種できた。

本手法により作出するアラビドプシス形質転換体において、アラビドプシス４５Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子はＲＮＡポリメラーゼＩにより、導入したトウモロコシのユビキチン遺伝子のプロモータ配列に連結したイネの４５Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子はＲＮＡポリメラーゼＩＩにより転写されると考えられる（図２参照）。

〔形質転換種子の選抜〕
一晩冷蔵庫で保管することにより上記で得られた種子の休眠を打破し、２０ｍｇ／ｌの濃度でハイグロマイシンを添加した３％スクロースを含む１／２ＭＳ培地に無菌播種を行なった。

そして、２０日後にハイグロマイシンに耐性のある５個体を選抜し、メトロミックスとルーフソイルを１対１で配合した用土を２号ポットに詰めた鉢に移植した。

鉢上げ後、１０日経過した個体から葉をサンプリングし、ＣＴＡＢ法によりＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡを鋳型としてハイグロマイシン（ｈｙｇ）遺伝子を増幅するプライマーを用いてＰＣＲ法を実施した。ＰＣＲ条件は９４℃３分後、９４℃１分５９℃１分６８℃１分のサイクルを３０回繰り返した。ＰＣＲ増幅産物をアガロースゲル電気泳動法にかけたところ、５個体すべてにおいてｈｙｇ遺伝子が検出できた（図３参照）。

そして、ＰＣＲ法により、イネの４５Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子と一緒に導入した選抜マーカー（ｈｙｇ）遺伝子断片の増幅が確認された５系統についてゲノムＤＮＡを制限酵素により切断し、アガロース電気泳動法にかけ、サザン法により導入されたｈｙｇ遺伝子のコピー数を解析したところ、２系統（４５Ｓ−１、４５Ｓ−２）には４コピー、残りの３系統（４５Ｓ−３、４５Ｓ−４、４５Ｓ−５）には３コピーのｈｙｇ遺伝子が導入されていた（図３参照）。なおサザンブロッティング法はＲｏｃｈｅ社のＤＩＧアプリケーションマニュアルに従って行った。

得られた５系統の形質転換体のなかで、３系統は生育が不良であったが、残りの２系統（４５Ｓ-２、４５Ｓ-３）は、順調に生育したため、自殖させてＴ２世代および Ｔ３世代の完熟種子を採種した。

更に、一晩冷蔵庫で保管することによりＴ３世代の種子の休眠を打破し、２０ｍｇ／ｌハイグロマイシンを含む１／２ＭＳ培地に無菌播種した。対照に用いたＣｏｌ−０系統はハイグロマイシンを含まない条件で同様に行った。

そして、無菌播種１５日後、形質転換体２系統および対照のＣｏｌ−０系統を８個体ずつメトロミックスとルーフソイルを１対１で配合した用土を２号ポットに詰めた鉢に移植した。

そして、移植した形質転換体２系統（４５Ｓ−２、４５Ｓ−３）および対照系統（Ｃｏｌ−０）の展開した本葉の枚数を播種後２５日目までカウントした。また、ロゼット葉の最大直径を２日毎に播種後４０日目まで測定した（図４参照）。

そして、播種後４０日目、開花期に達した植物体のロゼット葉の最大直径を計測した。また、全地上部を収穫して、１２０℃で１時間および６５℃で１２時間乾燥し、精密天秤を用いて乾物重を測定した。

この結果、イネの４５Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を導入した２系統（４５Ｓ−２、４５Ｓ−３）は、播種後４０日目のロゼット葉の最大直径および地上部乾物重において、原系統のＣｏｌ−０と比べて有意に大きな値を示した。特に、４５Ｓ−２系統の乾物重は、対照と比べて２．８倍であった（図５参照）。

以上、本手法のＲＮＡポリメラーゼＩＩが転写するプロモータ配列に異種の４５Ｓ ｒＲＮＡを連結した融合遺伝子を導入した形質転換体を作出することにより、強勢成長を示す植物体を作出することができることを確認した。本手法は、真核生物の基礎的な原理に従っているので 、すべての植物種および植物以外の真核生物の種においても強勢成長を示す形質転換体を提供できる。

本発明は、形質転換体及びこの作出方法として産業上の利用可能性がある。

Claims (2)

1. ＲＮＡポリメラーゼＩＩにより転写されるユビキチン遺伝子のプロモータ配列に、異なる種から単離したイネの４５Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の全長を連結した構築物を含む形質転換用ベクターを用いる真核生物である植物の形質転換体の作出方法において、前記植物がアラビドプシスであることを特徴とする形質転換体の作出方法。
2. ＲＮＡポリメラーゼＩＩにより転写されるユビキチン遺伝子のプロモータ配列に、異なる種から単離したイネの４５Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の全長を連結した構築物を含む形質転換用ベクターを用いて作出される真核生物である植物の形質転換体において、前記植物がアラビドプシスであることを特徴とする形質転換体。