JP6400857B2 - 皮膚美白活性を有するペプチド及びその用途 - Google Patents
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Description
クロロトリチルクロライドレジン(Chloro trityl chloride resin;CTL resin、Nova biochem Cat No.01−64−0021)700mgを反応容器に入れ、メチレンクロライド(MC)10mlを加えて3分間撹拌した。次いで、溶液を除去し、ジメチルホルムアミド(DMF)10mlを入れて3分間撹拌した後、再び溶媒を除去した。反応器に10mlのジクロロメタン溶液を入れ、Fmoc−Asp(OtBu)−OH(Bachem,Swiss)200mmole及びジイソプロピルエチルアミン(DIEA)400mmoleを入れた後、撹拌してよく溶かし、1時間撹拌しながら反応させた。反応後、洗浄し、メタノールとDIEA(2:1)とをDCM(dichloromethane)に溶かして10分間反応させ、過量のDCM/DMF(1:1)で洗浄した。溶液を除去し、ジメチルホルムアミド(DMF)を10ml入れて3分間撹拌した後、再び溶媒を除去した。脱保護溶液(20%のピペリジン(Piperidine)/DMF)10mlを反応容器に入れ、10分間常温で撹拌した後、溶液を除去した。同量の脱保護溶液を入れ、再び10分間反応を保持した後、溶液を除去し、それぞれ3分ずつDMFで2回、MCで1回、DMFで1回洗浄して、Asp−CTLレジン(Resin)を製造した。新たな反応器に10mlのDMF溶液を入れ、Fmoc−Gly−OH(Bachem,Swiss)200mmole、HoBt200mmole及びBop200mmoleを入れた後、撹拌してよく溶かした。反応器に400mmoleのDIEAを分画で2回にわたって入れた後、あらゆる固体が溶けるまで少なくとも5分間撹拌した。溶かしたアミノ酸混合溶液を脱保護されたレジンがある反応容器に入れ、1時間常温で撹拌しながら反応させた。反応液を除去し、DMF溶液で3回5分ずつ撹拌した後、除去した。反応レジンを少量取ってカイザーテスト(Nihydrin Test)を用いて反応程度を点検した。脱保護溶液で、前記のように同様に2回脱保護反応させて、Gly−Asp−CTLレジンを製造した。DMFとMCとで十分に洗浄し、もう一度カイザーテストを行った後、前記と同様に、下記のアミノ酸付着実験を行った。選定されたアミノ酸配列に基づいて、Fmoc−Arg(Pbf)−OH、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−Tyr(tBu)−OH、Fmoc−Gln(Trt)−OH、Fmoc−Thr(tBu)−OH、Fmoc−Asp(OtBu)−OH、Fmoc−Leu−OH、Fmoc−Ser(tBu)−OH、Fmoc−Trp−OH、及びFmoc−Ile−OH順に連鎖反応させた。Fmoc−保護基を脱保護溶液で10分ずつ2回反応させた後、よく洗浄して除去した。引き続き活性化されたバルプロ酸(valproic acid)を結合させた後、製造されたペプチジルレジンをDMF、MC及びメタノールでそれぞれ3回を洗浄し、窒素空気を徐々に流して乾燥した後、P2O5下で真空に減圧して完全に乾燥した後、脱漏溶液[トリフルオロ酢酸(Trifluroacetic acid)81.5%、蒸留水5%、チオアニソール(Thioanisole)5%、フェノール(Phenol)5%、EDT2.5%、及びTIS1%]30mlを入れた後、常温で時々振りながら2時間反応を保持した。フィルタリングを行ってレジンを濾し、レジンを少量のTFA溶液で洗浄した後、母液と合わせた。減圧を用いて全体体積の半分程度残るように蒸留し、50mlの冷たいエーテルを加えて沈澱を誘導した後、遠心分離して沈澱を集め、2回さらに冷たいエーテルで洗浄した。母液を除去し、窒素下で十分に乾燥して、精製前、Valprooyl−Ile−Trp−Ser−Leu−Asp−Thr−Gln−Tyr−Gly−Gly−Arg−Gly−Asp−COOHペプチド1(配列番号1)を0.8g合成(収率:89.0%)した。分子量測定器を用いて測定時に、前記ペプチドの分子量1593.7(理論値:1593.7)が得られた。
48ウェル培養用平板に、分周されたメラニン形成細胞(B16F10 cell line)を37℃培養器で24時間培養した後、各板の培地を除去し、無血清培地に取り替えた後、本ペプチドを濃度別(1、10、50、100、150、200uM)に処理した。次いで、72時間培養した後、MTT試薬を入れ、4時間反応させた後、生成されたホルマザンをDMSOで溶かし、560nmで吸光度を測定した。
6ウェル培養用平板に、分周されたメラニン形成細胞(B16F10 cell line)を37℃培養器で24時間培養した後、各板の培地を除去し、新たな培地(2%血清培地)に取り替えた後、α−MSH(200ng/ml)、アルブチン(200、500uM)及び本ペプチドを濃度別(50、100、200uM)に処理した。次いで、72時間培養した後、培養液を除去し、細胞を取り外した後、1.5mlチューブに移して、13,000rpmで3分間遠心分離して、上澄み液を除去し、細胞ペレットを回収してメラニンを観察した。細胞ペレットを2M NaOH 150μlずつ入れて、60℃で30分間細胞内メラニンを溶解させた。次いで、96ウェル平板の各ウェルに溶解させて得た上澄み液を100μlずつ入れて、490nmで吸光度を測定して、その結果を図2a及び図2bに示した。
6ウェル培養用平板に、分周されたメラニン形成細胞(B16F10 cell line)を37℃培養器で24時間培養した後、各板の培地を除去し、新たな培地(10%血清培地)に取り替えた後、α−MSH(200ng/ml)、アルブチン(500uM)及び本ペプチドを濃度別(50、100、200uM)に処理する。72時間培養した後、光学顕微鏡を通じて形成されたメラニンを観察した結果を図3に示した。
黒色腫細胞株(B16F10)細胞を6ウェル培養用平板に24時間培養し、α−MSH(200ng/ml)と濃度別ペプチド(50、100、200uM)または陽性対照群であるアルブチン(200、500uM)とを処理して72時間培養した。次いで、氷の上に6ウェル培養用平板を載せ、冷たいPBSで洗浄した後、1%Triton X−100が含有された0.1M リン酸ナトリウムバッファ(pH6.8、lysis buffer)を300μl入れ、細胞を1.5mlチューブに集めて、−270℃に急速冷凍させた後、解凍させる反応を5回繰り返して細胞膜を破壊した。次いで、13,000rpmで20分間遠心分離した後、上澄み液を他の1.5mlチューブに集め、この試料のタンパク質を定量した。試料のタンパク質濃度が同じ濃度になるように希釈して、96ウェル培養用平板に3個ウェルずつ分周し、10mM L−dopa 20μlを添加して37℃で1時間培養後、475nmで吸光度を測定して、その結果を図4に示した。
6ウェル培養用平板に、分周されたメラニン形成細胞(B16F10 cell line)を37℃培養器で24時間培養した後、各板の培地を除去し、新たな培地(10%血清培地)に取り替えた後、α−MSH(200ng/ml)及び本ペプチドを濃度別(50、100uM)に処理した。次いで、48時間培養し、チロシナーゼ抗体(Santa cruz biotechnology,米国)及びFITC付着2次IgG抗体(Santa cruz biotechnology,米国)を用いて細胞内発現タンパク質を染色し、蛍光顕微鏡を通じて発現程度を肉眼観察して、その結果を図5に示した。
メラニン形成細胞(B16F10 cell line)を6ウェル培養用平板に24時間培養後、α−MSH(200ng/ml)、アルブチン(500uM)及び本ペプチドを濃度別(100、200uM)に処理する。24時間培養された細胞のRNA抽出後、cDNAを製作した。次いで、メラニン形成に関与する因子であるMITF及びチロシナーゼに対するそれぞれの特異的な下記表2のプライマーを用いてPCRし、各遺伝子の発現変化を観察して、その結果を図6に示した。
メラニン形成細胞(B16F10 cell line)を6ウェル培養用平板に24時間培養後、α−MSH(200ng/ml)及び本ペプチドを濃度別(50、100uM)に処理した。次いで、72時間培養した後、細胞を溶解してメラニン形成に関与する核心因子であるMITF(Santa cruz biotechnology,米国)及びチロシナーゼ(Santa cruz biotechnology,米国)の発現を特異的な抗体を用いたウェスタンブロット方法を用いて観察して、その結果を図7に示した。
メラニン形成細胞(B16F10 cell line)を6ウェル培養用平板に24時間培養後、α−MSH(200ng/ml)及び本ペプチドを濃度別(50、100uM)に処理した。次いで、10分間細胞を培養した後、細胞を溶解してメラニン形成に関与する信号伝逹物質であるCREBのリン酸化程度を特異的な抗体(Santa cruz biotechnology,米国)を用いたウェスタンブロット方法を用いて観察して、その結果を図8に示した。
ヒト角質形成細胞株(HaCaT)を6ウェル培養用平板に24時間培養後、活性を誘導する物質であるトリプシン(Trypsin 4 Unit、Soybean trypsin inhibitor 10 Unit)及び本ペプチドを濃度別(100、200uM)に処理した。次いで、16時間培養された細胞のRNA抽出後、cDNAを製作した。
ヒト角質形成細胞株(HaCaT)を6ウェル培養用平板に24時間培養し、無血清培養培地にマウス黒色腫細胞株(B16F10)から分離したメラノソームを3時間前処理し、濃度別ペプチド(10、50、100、200uM)または陽性対照群であるアルブチン(200uM)を処理して48時間培養した。次いで、PBSで洗浄して、流入されていないメラノソームを除去し、角質形成細胞を収集、沈澱した後、得たペレットに1M NaOHを添加し、80℃オーブンでペレットを溶解させた後、490nmでOD値を測定した。配列番号1のアミノ酸配列のN末端にバルプロ酸が結合したペプチドからなるペプチドの濃度別メラノソーム流入抑制効果を観察するために、黒色腫から分離したメラノソームを用いて角質細胞食菌作用アッセイを行って、その結果を図10に示した。
ヒト角質形成細胞株(HaCaT)を6ウェル培養用平板に24時間培養し、無血清培養培地にマウス黒色腫細胞株(B16F10)から分離したメラノソームを3時間前処理し、濃度別ペプチド(10、50、100、200uM)または陽性対照群であるアルブチン(200uM)を処理して48時間培養した。次いで、PBSで洗浄して、流入されていないメラノソームを除去し、フォンタナ・マッソン染色(fontana−masson stain)して、角質形成細胞のメラノソーム食菌作用抑制を顕微鏡を通じて観察した。配列番号1のアミノ酸配列のN末端にバルプロ酸が結合したペプチドからなるペプチドの濃度別メラノソーム流入抑制効果を観察するために、黒色腫から分離したメラノソームを用いて角質細胞食菌作用アッセイを行って、その結果を図11に示した。
ヒト角質形成細胞株(HaCaT)を24ウェル培養用平板に24時間培養し、0.5%FBS培養培地に濃度別ペプチド(100、200uM)または陽性対照群であるアルブチン(200uM)を処理して24時間培養する。後に、Vybrant.Phagocytosis Assay Kit(V−6694)を使ってヒト角質形成細胞株の食菌作用抑制を蛍光顕微鏡を通じて観察した。配列番号1のアミノ酸配列のN末端にバルプロ酸が結合したペプチドからなるペプチドの濃度別メラノソーム流入抑制効果を観察するために、蛍光−結合生体粒子を用いて角質細胞食菌作用アッセイを行って、その結果を図12に示した。
ヒト角質形成細胞株(HaCaT)を6ウェル培養用平板に24時間培養し、無血清培養培地にマウス黒色腫細胞株(B16F10)から分離したメラノソームを48時間処理した後、PBSで洗浄して、流入されていないメラノソームを除去し、濃度別ペプチド(100、200uM)または陽性対照群であるアルブチン(200uM)及びTGF β−1を処理して72時間培養した。角質形成細胞で食菌作用されたメラノソームの分解を測定するために、角質形成細胞を収集、沈澱した後、得たペレットに1M NaOHを添加し、80℃オーブンでペレットを溶解させた後、490nmでOD値を測定して、その結果を図13に示した。
8週齢のC57BL/6ラットのしっぽにリポソーム化ペプチド(5,000ppm)及び陽性対照群であるアルブチンを1日に1回ずつ塗布して、約8週間実験を進行した。実験終了後にラットを犠牲して、しっぽ皮膚組織を摘出し、それをパラフィンで包埋してパラフィンブロックを製作する。そして、パラフィン切片に作ってフォンタナ・マッソン染色して形態学的に観察して、その結果を図14aないし図14cに示した。
8週齢のC57BL/6ラットの背中部位の毛をワクシングして除去した後、リポソーム化されたペプチドを1日に1回ずつ17日間塗布して、毛髪成長速度を観察して、その結果を図15に示した。
Claims (7)
- 配列番号1のアミノ酸配列のN末端にバルプロ酸が結合したペプチドからなる皮膚美白活性を有するペプチド。
- 配列番号1のアミノ酸配列のN末端にバルプロ酸が結合したペプチドからなるペプチドを有効成分として含む皮膚美白用組成物。
- 配列番号1のアミノ酸配列のN末端にバルプロ酸が結合したペプチドからなるペプチドを有効成分として含む毛髪成長の抑制用組成物。
- 配列番号1のアミノ酸配列のN末端にバルプロ酸が結合したペプチドからなるペプチドを被験体に塗布する皮膚美白方法(ただし、ヒトに対する医療行為を除く)。
- 配列番号1のアミノ酸配列のN末端にバルプロ酸が結合したペプチドからなるペプチドを被験体に塗布する毛髪成長の抑制方法(ただし、ヒトに対する医療行為を除く)。
- 配列番号1のアミノ酸配列のN末端にバルプロ酸が結合したペプチドからなるペプチドの皮膚美白のための使用(ただし、ヒトに対する医療行為を除く)。
- 配列番号1のアミノ酸配列のN末端にバルプロ酸が結合したペプチドからなるペプチドの毛髪成長の抑制のための使用(ただし、ヒトに対する医療行為を除く)。
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