JP6386452B2 - ヒストモナス・メレアグリジス(h.メレアグリジス)の原虫培養物の製造及び用途 - Google Patents
ヒストモナス・メレアグリジス(h.メレアグリジス)の原虫培養物の製造及び用途 Download PDFInfo
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Description
(a)H.メレアグリジス(H. meleagridis)細胞を含むH.メレアグリジス(H. meleagridis)のゼニック培養物(xenic culture)に野生型細菌叢を供給する工程、
(b)前記ゼニック培養物を複数の抗生物質の混合物で処理することにより野生型細菌叢を死滅させる工程、
(c)前記H.メレアグリジス(H. meleagridis)細胞を遠心分離及び洗浄し、
(d)工程(b)の有効性を制御する工程、
(e)前記洗浄されたH.メレアグリジス(H. meleagridis)細胞を再懸濁する工程、
(f)前記再懸濁されたH.メレアグリジス(H. meleagridis)細胞に一又は二以上の単一細菌株を加える工程、及び、
(g)前記一又は二以上の単一細菌株を前記再懸濁されたH.メレアグリジス(H. meleagridis)細胞と共に培養することにより、H.メレアグリジス(H. meleagridis)の単一細菌株培養物を得る工程
を特徴とする方法を提供する。
(h)工程(g)で得られた前記H.メレアグリジス(H. meleagridis)の単一細菌株培養物を、工程(f)で添加された前記一又は二以上の単一細菌株を特異的に死滅させる一の抗生物質又は複数の抗生物質の混合物で処理することにより、工程(f)で添加された前記細菌株を死滅させる工程。
(i)前記H.メレアグリジス(H. meleagridis)細胞を遠心分離、洗浄及び再懸濁する工程。
(j)前記再懸濁されたH.メレアグリジス(H. meleagridis)細胞に、一又は二以上の単一細菌株を添加する工程。
(k)前記一又は二以上の単一細菌株を前記再懸濁されたH.メレアグリジス(H. meleagridis)細胞と共に培養し、H.メレアグリジス(H. meleagridis)の単一細菌株培養物を得る工程。
−ヒストモナス・メレアグリジス(Histomonas meleagridis)の弱毒化培養物からなるヒストモナス(Histomonas)成分、
−一又は二以上の単一細菌株からなる細菌成分、及び、
−医薬的に許容可能な非生物学的製剤化合物。
1.H.メレアグリジス(H. meleagridis)の培養
インビトロで増殖され、割り当てられたH.メレアグリジス(H. meleagridis Turkey/Austria/2922-C6/04の同一の単一真核生物培養物について、2種の異なる継代(10及び90回)を用いた。まず、ヒストモナス症で死亡した七面鳥の盲腸壁から掻爬された約1gの盲腸内容物及び材料から、培養物を確立した。前記材料を、アール塩、L−グルタミン、25mMのHEPES及びL−アミノ酸を含む、9mLのMedium 199(Gibco(登録商標)、Invitrogen)に添加した。更に、15%の熱不活性化ウシ胎児血清FBS(Gibco(登録商標)、Invitrogen)及び11mgの米澱粉(Sigma-Aldrich)を添加した。近年報告された手法に従い(Hess et al., 2006)、クローン化寄生生物の顕微操作及びインビトロ増殖を行い、単一真核生物培養物を確立した。液体窒素下での貯蔵後、クローン培養物を融解し、本実験に使用した。同じMedium 199に対して15%FBS、及び最大20mgまでの米澱粉を加え、H.メレアグリジス(H. meleagridis)のインビトロ培養のための標準として使用した。細胞の継代は2〜3日毎に、1mLの培養物を、9mLの新鮮な培地を含む、新しい50mLの無菌管(Sarstedt)に移送することにより行った。
細菌学的調査のために、ゼニック培養物のアリコートを、5%の羊血液を有するSchaedler寒天(SCS)、5%羊血液を補充したColumbia寒天(COS)(BioMerieux)、MaCConkey寒天(McC)(LABM)、及びColiform寒天(CF)に移送した。全ての寒天プレートを、37℃で24時間、好気条件下でインキュベートした。但し、SCSプレートは嫌気条件下でインキュベートした。単離された全ての細菌株について、Bauer et al. Am. J. Clin. Pathol. 45 (1966), 493-496に従って抗生物質感受性試験を行った。次の抗生物質ディスクを使用した:クロラムフェニコール30μg、コトリモキサゾール(cotrimoxazol)25μg、ジフロキサシン10μg、エンロフロキサシン5μg、カナマイシン30μg、リンコマイシン15μg、マルボフロキサシン5μg、メロペネム10μg、ネオマイシン30μg、リファンピシン30μg、スペクチノマイシン100μg及びストレプトマイシン25μg。感受性試験の結果を用いて、ゼニック培養物における細菌を死滅させるための抗生物質を選択した。
寒天プレート上のコロニー形成単位(cfu)のPCR及び計数を用いて、ゼニック培養物内の細菌叢を死滅させる上での抗生物質処理の有効性を評価した。元のゼニック培養物の細胞材料、抗生物質処理の前後に再懸濁された細胞ペレット、又は3回の洗浄工程後に再懸濁された細胞ペレットを、DNA抽出に供した。試料を500×gで5分間遠心分離し、上清液を除去した後、ペレットを−20℃で凍結した。これをRTで融解し、200μlのPBSに再懸濁した上で、動物血液又は細胞由来の総DNA精製プロトコル(スピンカラムプロトコル)に従って、DNeasy(登録商標)Blood及びTissue Kit(Qiagen)を用いてDNA抽出を行った。
Hmf 5'−GAAAGCATCTATCAAGTGGAA−3' (配列番号1)
及び
Hmr 5'−GATCTTTTCAAATTAGCTTTAAA−3'(配列番号2)
(Grabensteiner et al., Parasitology 142 (2006), 223-230)を、H.メレアグリジス(H. meleagridis)18S rRNA遺伝子用として用い、ユニバーサル対である:
16S F 5'−GGCGGCRKGCCTAAYACATGCAAGT−3'(配列番号3)
及び
16S R 5'−GACGACARCCATGCASCACCTGT−3' (配列番号4)
(Carroll et al., J. Clin. Microbiol. 38 (2000), 1753-1757)を、細菌16S rRNA遺伝子に用いた。増幅は、25μlの反応混合物を用い、HotStarTaq Master Mix Kit(Qiagen)により行った。反応混合物の組成は、12.5μlのHotStarTaq Master Mix、8μlの蒸留水、1μlの前方向プライマー、1μlの逆方向プライマー(何れのプライマーも10pモル/μl濃度で使用した)、及び2.5μlのDNA鋳型とした。95℃で15分間の初期変性工程後、反応混合物を、Biometra T3サーモサイクラーを用いて、40サイクルの94℃での30秒の熱変性、Hmf/Hmrについて、55℃での、及び16S F/16S Rについて60℃での1分間のプライマーアニーリング、及び72℃での1.5分のDNA伸長、続く72℃で10分間の最終伸長工程に供した。得られたPCR生成物を、アガロースゲル電気泳動により分析した。
細胞懸濁における鞭毛虫の数に依存して、20〜30μlの体積のMedium 199における合計100個のH.メレアグリジス(H. meleagridis)細胞を用いて、無菌の1.5mLのエッペンドルフ管における単一細菌株培養物を接種した。生存原虫を、血球計数器を用いて計数した。試料を、等量のトリパンブルー株0.4%(Invitrogen)と共に混合し、生存細胞と死亡細胞とを区別した。
異なる細菌株を有する単一細菌株H.メレアグリジス(H. meleagridis)培養物を生成するべく、大腸菌(E. Coli)DH5αを含む単一細菌株培養物10mLを、ドリペネム50μg/mL、ネオマイシン500μg/mL及びリファンピシン300μg/mLの抗生物質により、40℃で20時間に亘って処理した。細胞ペレットの洗浄、細胞懸濁液の調製後、各々異なる細菌株を有する複数の単一細菌株培養物を1.5mLエッペンドルフ管に入れ、これに上記のように100個のH.メレアグリジス(H. meleagridis)細胞を接種した。
共焦点レーザー顕微鏡検査のための試料を、大腸菌(E. Coli)DH5α pGFPuvを含むH.メレアグリジス(H. meleagridis)の培養物10mLから得た。2日間の培養物に対して、アンピミリン100μg/mLを有するLB寒天プレートから追加の大腸菌(E. Coli)DH5α pGFPuvを接種し、40℃で20時間インキュベートした。培養物を2665×gで10分間遠心分離し、培地中の米澱粉により結合されたペレットを生成した。斯かるペレットを生検包埋カセットに配置し、3.5%ホルマリンでRTで3時間固定化し、パラフィンに包埋し、10μm厚切片化した。その切片をSuperfrost Ultra Plus slides(Menzel-Glaeser, Braunschweig, Germany)上に配置し、Neoclear(Merck)で脱蝋し、段階的濃度の複数のエタノール(100%、96%及び70%)及び蒸留水で再水和化した。このスライドを、1.5%過酸化水素を補充したメタノール中で30分間インキュベートし、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)pH7.4により20分間洗浄し、保湿チャンバー内でRTで1時間に亘り、PBS中10%正常ヤギ血清によるブロックを行った。血清を除き、切片を1:10,000希釈の精製ポリクローナルウサギ抗ヒストモナス血清で被覆し、保湿チャンバー内で4℃で一晩インキュベートした。PBSによる洗浄後、切片を1:500希釈Alexa Fluor 568(Invitrogen)結合抗ウサギIgGと共に、保湿チャンバー内でRTで1時間インキュベートし、続いてPBSにより洗浄し、4’、6−ジアミジノ−2−フェニルインドール(DAPI、Roche)により5分間染色した。切片を再びPBSで洗浄した後、スライドをAquatex(Merck)によりカバースリップ下にマウントした。共Zeiss 510 METAレーザー走査モデル(Carl Zeiss, Germany)を備えたZeiss Axiovert 200Mを用いて焦点顕微鏡写真を撮影した。画像スタックの走査は、63倍/1.4油浸対物レンズを用い、1024×1024ピクセル及び0.318μmのZ軸増分で行った。最終画像の明るさ及びコントラストを、Adobe Photoshop CS2 (Adobe Systems, San Jose, CA)を用いて調節した。
この実験では、生後1日齢の七面鳥(Converter, Hybrid Europe, Malguenac, France)30羽を、藁を深く敷いた囲い内に収容し、圧力下で飼育した。個々の鳥を番号付けタグ(Swiftack(登録商標); Heartland Animal Health Inc., Fair Play, MO)によりマークした。飼料(市販の七面鳥用スタータ飼料)及び水は自由に提供したが、感染直後に5時間の食餌制限を行った。
1.野生型細菌叢の交換、及び大腸菌(E.coli)DH5αを有する単一細菌株培養物の提供
H.メレアグリジス(H. meleagridis)の単一細菌株培養物を生成するには、ゼニック培養物中の細菌叢の特性決定をする必要がある。元のゼニック培養物は109の細胞/mLの細胞数を有し、大腸菌(E.coli)、連鎖球菌属(Streptococcus sp.)及びプロテウス属(Proteus sp.)を寒天プレート上で単離した。感受性試験により、細菌株がメロペネム、ネオマイシン及びリファンピシンを除く殆どの抗生物質に耐性であることが分かった。その結果、これらの抗生物質を単一細菌株培養物の供給のために使用した。また、ドリペネムはカルバペネムの分類に属し、メロペネムに非常に類似した作用を示すことから、調製に使用した。種々の濃度のドリペネム(20〜50μg/mL)、ネオマイシン(50〜500μg/mL)及びリファンピシン(200〜300μg/mL)を用いて、細菌叢を死滅させる試験を行った。細菌の殆どを死滅させるが、原虫細胞は生存したまま維持し得る最良の結果は、ドリペネム50μg/mL、ネオマイシン500μg/mL及びリファンピシン300μg/mLの混合物により得られた。抗生物質処理及び洗浄後のコロニー形成単位(cfu)の計数値によれば、寒天プレート上で増殖された大腸菌(E. coli)及びプロテウス属(Proteus sp.)の単一コロニー数は少数(120個の細菌/mL)であった。プライマー対Hmf/HmrによるPCRにより、H.メレアグリジス(H. meleagridis)が細菌懸濁液にまだ存在することを確認した(図1)。プライマー対16S F/16S RによるPCRにより、細菌DNAが低下したことが示された。この知見は、半定量的PCRの結果により支持された。単一細菌株培養物の生成時に、抗生物質ナリジクス酸及びペニシリンGを添加することにより、残留細菌叢が完全に除去されたことが、寒天プレート上で示された。大腸菌(E. coli)DH5αが単一細菌株培養物にまだ存在していることを、lacz遺伝子の特異的な部分欠失に基づく増殖挙動により同定した。単一細菌株培養物の確立に成功し、2.0mLのエッパンドルフ管からの50mLの管へ変更した後、連続した継代培養における大腸菌(E. coli)DH5αと共に増殖された原虫細胞の数は、継代培養レベルに関係なく、ゼニック培養物における数と同等であった(約50×104細胞/mL)。
種々の細菌株と共にH.メレアグリジス(H. meleagridis)の単一細菌株培養物の供給に続いて、生存原虫の細胞の存在を、血球計数器を用いて顕微鏡的に調べた。
共焦点蛍光顕微鏡を用いて、H.メレアグリジス(H. meleagridis)細胞における大腸菌(E. coli)DH5α pGFPuvの存在を調査し、原虫内での分布を研究した。GFP発現細菌は、H.メレアグリジス(H. meleagridis)の表面に付着され、鞭毛中により包囲されることが分かった(図4)。DAPIはH.メレアグリジス(H. meleagridis)の核を染色し、原虫内及び培養培地中で、細菌DNAに対応する多くの細長いプロフィールを示した。DAPI陽性細菌の一部は、緑色蛍光タンパク質の安定性が限定ていたために、GFPシグナルを欠いていた。
ヒストモナス症により死亡し、或いは安楽死された七面鳥の累積死亡率を、図5に示す。感染後2及び3日目に共食いにより死亡したグループBの2羽の鳥は、分析から排除した。単一細菌株H.メレアグリジス(H. meleagridis)培養物の20代のインビトロ継代培養物に感染させたグループBの他の全ての鳥、及び、ゼニックH.メレアグリジス(H. meleagridis)培養物の20代のインビトロ継代培養物に感染させたグループCの全ての鳥は、ヒストモナス症の臨床学的症状、例えば波状の羽、傾眠及び硫黄色の下痢を示した。グループBとCとの間には、臨床学的症状の出現及び死亡率に、約1週間の遅延が存在した。ヒストモナス症から死亡した両グループ由来の全ての鳥を倍検したところ、盲腸及び肝臓に重度の破壊が見受けられ、病変評点は最高の4であった。グループA及びDの七面鳥は何れも、研究期間中、何の臨床的症状も示さなかった。それらは、感染後5週間の実験の終了時に屠殺された。剖検により、盲腸壁の散発的肥厚化(病変評価1)が、単一細菌株H.メレアグリジス(H. meleagridis)培養物の295代インビトロ継代培養物に感染したグループAの鳥10羽中4羽に検出され、1羽は両盲腸壁の強い肥厚化を有した(病変評点3)。他の5羽の鳥は何れも、盲腸の炎症の症状を何ら示さなかった(病変評点0)。更に、何れの鳥も肝臓は正常であった(病変評価0)。大腸菌(E. coli)DH5α培養物に感染したグループDの鳥の盲腸及び肝臓は、臨床学的異常性を示さなかった(病変評点0)。
H.メレアグリジス(H. meleagridis)は、前世紀の初めからインビトロで培養されてきた。広範囲の種類の培養培地及び条件が使用されてきたが、良好且つ急速な増殖が補助されたのは、盲腸から単離された便材料由来の一定の生存細菌が培養物に存在する場合のみであった(例えば、Hauck et al., 2010)。これらの細菌は液胞にも観察されたことから、鞭毛虫の食料として機能すると推測される。また、H.メレアグリジス(H. meleagridis)細胞の電子顕微鏡試験により、細菌がファゴサイトーシスを介して原虫に摂取されることが示された(Mazet et al., Int. J. Parasitol. 38 (2008), 177-190)。本出願に報告される、大腸菌(E. coli)DH5α pGFPuvと共に増殖されたH.メレアグリジス(H. meleagridis)の共焦点レーザー顕微鏡分析により、原虫細胞内に細菌が存在することが明確に確認され、また、組込まれる細菌株の1つが大腸菌(E.coli)であることが示された。
本発明の好ましい態様を以下に定義する。
(a)H.メレアグリジス(H. meleagridis)細胞を含むH.メレアグリジス(H. meleagridis)のゼニック培養物(xenic culture)に野生型細菌叢を供給する工程、
(b)前記ゼニック培養物を複数の抗生物質の混合物で処理することにより野生型細菌叢を死滅させる工程、
(c)前記H.メレアグリジス(H. meleagridis)細胞を遠心分離及び洗浄し、
(d)工程(b)の有効性を制御する工程、
(e)前記洗浄されたH.メレアグリジス(H. meleagridis)細胞を再懸濁する工程、
(f)前記再懸濁されたH.メレアグリジス(H. meleagridis)細胞に一又は二以上の単一細菌株を加える工程、及び、
(g)前記一又は二以上の単一細菌株を前記再懸濁されたH.メレアグリジス(H. meleagridis)細胞と共に培養することにより、H.メレアグリジス(H. meleagridis)の単一細菌株培養物を得る工程
を特徴とする方法。
(h)工程(g)で得られた前記H.メレアグリジス(H. meleagridis)の単一細菌株培養物を、工程(f)で添加された前記一又は二以上の単一細菌株を特異的に死滅させる一の抗生物質又は複数の抗生物質の混合物で処理することにより、工程(f)で添加された前記細菌株を死滅させる工程、
(i)前記H.メレアグリジス(H. meleagridis)細胞を遠心分離、洗浄及び再懸濁する工程、
(j)前記再懸濁されたH.メレアグリジス(H. meleagridis)細胞に、一又は二以上の単一細菌株を添加する工程、及び、
(k)前記一又は二以上の単一細菌株を前記再懸濁されたH.メレアグリジス(H. meleagridis)細胞と共に培養し、H.メレアグリジス(H. meleagridis)の単一細菌株培養物を得る工程
により、一又は二以上の他の単一細菌株に置換される、態様1〜8の何れか一項に記載の方法。
一又は二以上の単一細菌株からなる細菌成分、及び、
医薬的に許容可能な非生物学的製剤化合物
からなるワクチン製剤。
Claims (28)
- ヒストモナス・メレアグリジス(Histomonas meleagridis, H. meleagridis)の単一細菌株培養物を含むワクチン製剤を産生する方法であって、
(a)H.メレアグリジス(H. meleagridis)細胞と共に野生型細菌叢を有するH.メレアグリジス(H. meleagridis)のゼニック培養物(xenic culture)を供給する工程、
(b)前記ゼニック培養物を複数の抗生物質の混合物で処理することにより野生型細菌叢を死滅させる工程、
(c)前記H.メレアグリジス(H. meleagridis)細胞を遠心分離及び洗浄し、
(d)工程(b)の有効性を制御する工程、
(e)前記洗浄されたH.メレアグリジス(H. meleagridis)細胞を再懸濁する工程、
(f)前記再懸濁されたH.メレアグリジス(H. meleagridis)細胞に一又は二以上の単一細菌株を加える工程、及び、
(g)前記一又は二以上の単一細菌株を前記再懸濁されたH.メレアグリジス(H. meleagridis)細胞と共に培養することにより、H.メレアグリジス(H. meleagridis)の単一細菌株培養物を得る工程
を含むと共に、
前記H.メレアグリジス(H. meleagridis)の単一細菌株培養物を、投与に適した剤型に製剤する工程を更に含み、
ここで、前記H.メレアグリジス(H. meleagridis)のゼニック培養物が、H.メレアグリジス(H. meleagridis)のクローン培養物である、方法。 - 前記H.メレアグリジス(H. meleagridis)のクローン培養物が、H.メレアグリジス(H. meleagridis)培養物の顕微操作(micro-manipulation)により確立されたクローン培養物である、請求項1に記載の方法。
- 前記複数の抗生物質の混合物が、少なくとも3種の異なる抗生物質の混合物である、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記複数の抗生物質の混合物が、ドリペネム、ネオマイシン及びリファンピシンの混合物を含む、請求項3に記載の方法。
- 工程(d)が工程(b)又は(c)の後にコロニー形成単位を決定することにより実施される、請求項1〜4の何れか一項に記載の方法。
- 前記野生型細菌叢がH.メレアグリジス(H. meleagridis)細胞から完全に除去されていなかった場合に、工程(d)が繰り返される、請求項1〜5の何れか一項に記載の方法。
- 工程(f)において、大腸菌(Eschericia coli)、ネズミチフス菌(Salmonella Typhimurium)、ゲルトネル菌(Salmonella Typhimurium)、黄色ブドウ球菌(Staphlyococcus aureus)、ウェルシュ菌(Clostridium perfringens)、大便連鎖球菌(Enterococcus faecalis)及び/又は緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)から選択される細菌株の一又は二以上の単一細菌株培養物が添加される、請求項1〜6の何れか一項に記載の方法。
- 工程(f)において、クロストリジウム(Clostridium)属、腸球菌(Enterococcus)属、サルモネラ(Salmonella)属、大腸菌(Escherichia coli)種、ブドウ球菌(Staphylococcus)属、及び/又はシュードモナス(Pseudomonas)属から選択される細菌株の一又は二以上の単一細菌株培養物が添加される、請求項1〜6の何れか一項に記載の方法。
- 前記H.メレアグリジス(H. meleagridis)細胞が、ウシ胎児血清を含む培地内に維持される、請求項1〜8の何れか一項に記載の方法。
- 前記ウシ胎児血清を含む培地が、更に緩衝剤、アミノ酸及び炭化水素源を含む、請求項9に記載の方法。
- 前記炭化水素源が澱粉を含む、請求項10に記載の方法。
- 前記H.メレアグリジス(H. meleagridis)のゼニック培養物が、弱毒化H.メレアグリジス(H. meleagridis)である、請求項1〜11の何れか一項に記載の方法。
- 前記弱毒化H.メレアグリジス(H. meleagridis)が、H.メレアグリジス(H. meleagridis)の弱毒化クローン培養物である、請求項12に記載の方法。
- 前記H.メレアグリジス(H. meleagridis)が、H.メレアグリジス(H. meleagridis)Turkey/Austria/2922-C6/04である、請求項12又は13に記載の方法。
- 工程(f)で添加される前記一又は二以上の単一細菌株が、(h)工程(g)で得られた前記H.メレアグリジス(H. meleagridis)の単一細菌株培養物を、工程(f)で添加された前記一又は二以上の単一細菌株を特異的に死滅させる一の抗生物質又は複数の抗生物質の混合物で処理することにより、工程(f)で添加された前記細菌株を死滅させる工程、(i)前記H.メレアグリジス(H. meleagridis)細胞を遠心分離、洗浄及び再懸濁する工程、(j)前記再懸濁されたH.メレアグリジス(H. meleagridis)細胞に、一又は二以上の単一細菌株を添加する工程、及び、(k)前記一又は二以上の単一細菌株を前記再懸濁されたH.メレアグリジス(H. meleagridis)細胞と共に培養し、H.メレアグリジス(H. meleagridis)の単一細菌株培養物を得る工程により、一又は二以上の他の単一細菌株に置換される、請求項1〜14の何れか一項に記載の方法。
- 工程(j)において、クロストリジウム(Clostridium)属、腸球菌(Enterococcus)属、サルモネラ(Salmonella)属、大腸菌(Escherichia coli)種、ブドウ球菌(Staphylococcus)属、及び/又はシュードモナス(Pseudomonas)属から選択される細菌株の一又は二以上の単一細菌株培養物が添加される、請求項15に記載の方法。
- ヒストモナス・メレアグリジス(Histomonas meleagridis)の弱毒化培養物からなるヒストモナス(Histomonas)成分、1以上5以下の単一細菌株からなる細菌成分、及び、医薬的に許容可能な非生物学的製剤化合物からなるワクチン製剤であって、
ここで、前記弱毒化H.メレアグリジス(H. meleagridis)が、H.メレアグリジス(H. meleagridis)の弱毒化クローン培養物の弱毒化クローン培養物である、ワクチン製剤。 - 前記ヒストモナス(Histomonas)成分及び前記細菌成分が、H.メレアグリジス(H. meleagridis)の単一細菌株培養物として含有される、請求項17に記載のワクチン製剤。
- 前記H.メレアグリジス(H. meleagridis)の単一細菌株培養物が、請求項1〜16の何れか一項に記載の方法に従って得られるものである、請求項18に記載のワクチン製剤。
- 前記細菌成分が、クロストリジウム(Clostridium)属、腸球菌(Enterococcus)属、サルモネラ(Salmonella)属、大腸菌(Escherichia coli)種、ブドウ球菌(Staphylococcus)属、及び/又はシュードモナス(Pseudomonas)属から選択される細菌株の単一培養物を含む、請求項17〜19の何れか一項に記載のワクチン製剤。
- 前記H.メレアグリジス(H. meleagridis)の弱毒化クローン培養物が、H.メレアグリジス(H. meleagridis)Turkey/Austria/2922-C6/04の弱毒化クローン培養物である、請求項17〜20の何れか一項に記載のワクチン製剤。
- 前記製剤が、家禽又は狩猟鳥における、ヒストモナス症(histomonosis)の予防に用いられる、請求項17〜21の何れか一項に記載のワクチン製剤。
- 前記家禽が、シチメンチョウ又はニワトリであり、前記狩猟鳥が、キジ、ヤマウズラ、ホロホロチョウ、又はウズラである、請求項22に記載のワクチン製剤。
- 前記単一細菌株の数が最大5種である、請求項17〜23の何れか一項に記載のワクチン製剤。
- 前記単一細菌株の数が最大4種である、請求項24に記載のワクチン製剤。
- 前記単一細菌株の数が最大3種である、請求項25に記載のワクチン製剤。
- 前記単一細菌株の数が最大2種である、請求項26に記載のワクチン製剤。
- 前記単一細菌株の数が1種である、請求項27に記載のワクチン製剤。
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