ES2893834T3

ES2893834T3 - Producción y aplicación de cultivos protozoarios de Histomonas meleagridis (H. meleagridis)

Info

Publication number: ES2893834T3
Application number: ES13737171T
Authority: ES
Inventors: Michael Hess; Petra Ganas
Original assignee: Veterinaermedizinische Universitaet Wien
Current assignee: Veterinaermedizinische Universitaet Wien
Priority date: 2012-07-02
Filing date: 2013-07-02
Publication date: 2022-02-10
Anticipated expiration: 2033-07-02
Also published as: AU2013286002A1; EP2867356A1; CA2877539A1; US20180117131A1; US10350281B2; AU2013286002B2; MX363037B; JP2018148893A; US9833501B2; JP2015522269A; WO2014006018A1; US20150157698A1; MX2014016016A; EP2867356B1; EP2682457A1; BR112014032937A2; CN104471054A; CL2014003549A1; JP6386452B2

Abstract

Procedimiento para producir una formulación de vacuna que comprende un cultivo de cepa bacteriana única de Histomonas meleagridis (H. meleagridis), caracterizado por las siguientes etapas: (a) proporcionar un cultivo xénico de H. meleagridis que comprende células de H. meleagridis con una flora bacteriana de tipo natural, (b) tratar el cultivo xénico con una mezcla de antibióticos, destruyendo de ese modo la flora bacteriana de tipo natural, (c) centrifugar y lavar las células de H. meleagridis, (d) controlar la eficacia de la etapa (b), (e) resuspender las células de H. meleagridis lavadas, (f) añadir una o varias cepa(s) bacteriana(s) única(s) a las células de H. meleagridis resuspendidas, y (g) cultivar la(s) una o varias cepa(s) bacteriana(s) única(s) con las células de H. meleagridis resuspendidas para obtener un cultivo de cepa bacteriana única de H. meleagridis; en el que etapas (b), (c) y (d) se repiten si la flora bacteriana de tipo natural no se ha retirado por completo de las células de H. meleagridis; comprendiendo el procedimiento, además, la etapa de formular el cultivo de cepa bacteriana única de H. meleagridis como una forma farmacéutica adecuada para administración.

Description

DESCRIPCIÓN

Producción y aplicación de cultivos protozoarios de Histomonas meleagrídis (H. meleagridis)

La presente invención se refiere a la producción y aplicación de cultivos protozoarios de Histomonas meleagridis (H. meleagridis).

El protozoario flagelado Histomonas meleagridis es responsable de la histomoniasis (sinónimo de enfermedad de la cabeza negra) en aves de corral, una enfermedad que se produce, principalmente, en pavos y gallinas. Las características de la enfermedad son lesiones necróticas en el hígado, engrasamiento y ulceración de la pared cecal y excrementos de color azufre. La histomoniasis provoca una alta mortalidad, especialmente en bandadas de pavos. Las gallinas muestran una mayor resistencia a la histomoniasis y las lesiones se limitan habitualmente al ciego (McDougald, Avian Dis. 49 (2005), 462-476; Springer, Exp. Parasitol. 28 (1970), 383-392).

Tras la prohibición de productos farmacéuticos y aditivos alimentarios eficaces, que estaban autorizados contra flagelados en la mayoría de los países en Europa y América del Norte, el interés científico en H. meleagridis ha aumentado en la última década debido a la amenaza que representa para las bandadas de aves de corral y a las grandes pérdidas económicas asociadas con los brotes de la enfermedad.

El parásito H. meleagridis pertenece al orden Trichomonadida, familia Dientamoebidae. Entre las características comunes del protozoario se incluyen aparato parabasal con un flagelo, hidrogenosomas y vacuolas de alimentación con gránulos de almidón o bacterias. Tales características destacan la alta importancia de las interacciones entre bacterias y el parásito protozoario, tanto in vitro como in vivo (Delappe et al., Exp. Parasitol. 2 (1953), 79-86).

Goedbloed et al. (Avian Dis. 6 (1962), 302-315) dieron a conocer la adición de bacterias a cultivos de Histomonas, en los que los extractos de hígado de un pavo se habían complementado con E. coli para producir un cultivo monoxénico de H. meleagridis (“monoxénico” significa que se añade un único cultivo bacteriano exógeno al material de biopsia que contiene todas las bacterias presentes de manera natural en el material de hígado, tales como E. coli o cocos. Tales cultivos monoxénicos se han utilizado para establecer cultivos de H. meleagridis, sin embargo, siempre se consideró necesaria la presencia de un biotopo bacteriano para establecer tales cultivos (Patente EP 1721 965 A); de ello se deduce que para establecer un cultivo de H. meleagridis, es esencial la presencia de un componente bacteriano. La influencia de algunos microorganismos en la multiplicación in vitro de H. meleagridis también se describe en Stepkowski y Klimont (Wiadomosci parazytologiczne 26.6 (1980): 635-643).

A diferencia del informe de Goedbloed et al., los estudios acerca del cultivo in vitro de H. meleagridis, obtenidos a partir de cultivos existentes que contienen una flora bacteriana cecal de pavo mixta, junto con células vivas y muertas de E. coli o Escherichia freundii, demuestran que las cepas bacterianas únicas no son adecuadas para la propagación in vitro continua del protozoario (Lesser, Helminthol. Soc. Wash. 31 (1964), 265-266). En consecuencia, recientemente se ha cuestionado la capacidad de los cultivos monobacterianos para respaldar el crecimiento del parásito in vitro (Hauck et al., J. Parasitol. 96 (2010), 1-7). El asunto es extremadamente importante para los cultivos in vitro que se están estudiando en la actualidad, todos los cuales contienen la flora bacteriana cecal de tipo natural de las aves a partir de las que se aisló H. meleagridis (por ejemplo: van der Heijden et al., Avian Pathol. 34 (2005), 505-508). El establecimiento de cultivos protozoarios clonales a partir de las heces de un pavo enfermo ofrece nuevas oportunidades para el examen continuo y ampliado de las interacciones entre protozoarios y bacterias (Patente EP 1721 965 A). Tales cultivos clonales serían un buen comienzo para establecer cultivos bien definidos que contengan solo una cepa bacteriana única y, quizás, también permitan un intercambio específico de bacterias. Por otro lado, las vacunas contra infecciones por H. meleagridis requieren antígenos seguros (Lund et al., Exp. Parasitol. 18 (1966), 403-407). Un procedimiento para proporcionar antígenos seguros es proporcionar cultivos atenuados para la vacunación. Recientemente, se han puesto a disposición cultivos atenuados de H. meleagridis (Liebhart et al., Avian Pathol. 39 (2010), 399-403; Liebhart et al., Poultry Sci. 90 (2011), 996-1003; Hess et al., Vaccine 26 (2008), 4187-4193). Sin embargo, tales cultivos todavía se derivan de fuentes naturales, por ejemplo, mediante individualización utilizando micromanipulación (Hess et al., Parasitol. 133 (2006), 547-554; (más general:) Clark et al., Clin. Microb. Rev. 15 (2002), 329-341) y, por lo tanto, todavía contienen la flora bacteriana de las fuentes naturales. Recientemente, también se ha hecho posible proporcionar cultivos clonales de H. meleagridis (Patente EP 1721 965 A), sin embargo, aunque estos cultivos son clonales con respecto a Histomonas, incluso estos cultivos clonales todavía contienen un cultivo bacteriano mixto de naturaleza definida solo de manera aproximada.

Las autorizaciones de comercialización para las vacunas, también en el ámbito veterinario, requieren la composición definida de los componentes eficaces. Por lo tanto, habitualmente no es posible registrar y utilizar cultivos de composición bacteriana indefinida, que incluyen cultivos monoxénicos (tal como se notifica por Goedbloed et al., 1962), para aplicaciones industriales. Por lo tanto, es necesario proporcionar composiciones farmacéuticas que no solo contengan células de H. meleagridis atenuadas, sino que también se diseñen de manera homogénea con respecto al componente bacteriano.

Por lo tanto, un objetivo de la presente invención es establecer un cultivo definido de H. meleagridis con un componente bacteriano definido que carezca del entorno bacteriano “de tipo natural”. Más específicamente, un objetivo de la presente invención es investigar si es posible proporcionar un cultivo de H. meleagrídis en el que solo una (una única) cepa bacteriana esté presente y si es posible reemplazar o complementar una cepa de este tipo por una o varias cepas bacterianas adicionales para obtener un cultivo definido claramente de H. meleagrídis en el que no solo esté bien definido el componente de H. meleagrídis (por ejemplo, como un cultivo clonal y/o atenuado), sino también el componente bacteriano, permitiendo de ese modo un examen y un registro apropiados de una vacuna aplicable a nivel industrial contra H. meleagrídis con la utilización de cepas atenuadas de H. meleagrídis. Esto permitiría proporcionar una vacuna aplicable a nivel industrial contra H. meleagrídis, que es el objetivo principal de la presente invención. Un cultivo de H. me/eagrdfe/bacteriano bien definido de este tipo también sería beneficioso para investigar el comportamiento de crecimiento de H. meleagrídis en presencia de determinadas bacterias y para analizar la interacción entre el parásito y las bacterias in vitro e in vivo.

Por lo tanto, la presente invención da a conocer un procedimiento para producir una formulación de vacuna que comprende un cultivo de cepa bacteriana única de Histomonas meleagridis (H. meleagridis), caracterizado por las siguientes etapas:

(a) proporcionar un cultivo xénico de H. meleagridis que comprende células de H. meleagridis con una flora bacteriana de tipo natural,

(b) tratar el cultivo xénico con una mezcla de antibióticos, destruyendo de ese modo la flora bacteriana de tipo natural,

(c) centrifugar y lavar las células de H. meleagridis,

(d) controlar la eficacia de la etapa (b),

(e) resuspender las células de H. meleagridis lavadas,

(f) añadir una o varias cepa(s) bacteriana(s) única(s) a las células de H. meleagridis resuspendidas, y

(g) cultivar la(s) una o varias cepa(s) bacteriana(s) única(s) con las células de H. meleagridis resuspendidas para obtener un cultivo de cepa bacteriana única de H. meleagridis;

en el que etapas (b), (c) y (d) se repiten si la flora bacteriana de tipo natural no se ha retirado por completo de las células de H. meleagridis;

comprendiendo el procedimiento, además, la etapa de formular el cultivo de cepa bacteriana única de H. meleagridis como una forma farmacéutica adecuada para administración.

Con la presente invención se da a conocer, por primera vez, un cultivo de H. meleagridis en un medio líquido con un componente bacteriano bien definido, en el que la flora bacteriana “de tipo natural” se ha retirado por completo y se reemplazó por una o varias cepa(s) bacteriana(s) única(s). En los cultivos clonales de H. meleagridis, la flora fecal se intercambió por cepas bacterianas definidas mediante la destrucción selectiva de las bacterias iniciales con una variedad de antibióticos, manteniendo vivo el flagelado. En el transcurso de la presente invención también resultó que era posible llevar a cabo tal destrucción de bacterias sin dañar significativamente a las células protozoarias. Se descubrió que el crecimiento del parásito protozoario dependía de las bacterias, especialmente de su metabolismo energético. Se descubrió que Escherichia coli respaldaba fuertemente el crecimiento del parásito, mientras que Salmonella Typhimurium y Pseudomonas aeruginosa eran menos eficientes, pero, no obstante, funcionaban de manera excelente en la presente invención. La microscopía láser confocal mostró que H. meleagridis podía captar E. coli DH5a marcada con proteína fluorescente verde, lo que muestra que las bacterias sirven como un posible suministro de alimento para los protozoarios. Al intercambiar la flora bacteriana por E. coli DH5a en cultivos continuos de H. meleagridis sometidos a pases in vitro, fue posible mostrar que el proceso de atenuación era independiente de las bacterias, demostrado in vivo. Además, en el transcurso de la presente invención se mostró que E. coli DH5a se puede reemplazar por una o varias cepas bacterianas que permiten proporcionar vacunas bien definidas contra infecciones por H. meleagridis que comprenden un componente bacteriano de vacuna aplicable a nivel industrial. Además, también se mostró que la flora intestinal en pavos infectados no tuvo ningún efecto negativo sobre la virulencia de los protozoarios. En consecuencia, esto muestra que la atenuación no depende de las bacterias en el cultivo, sino de los pases in vitro. Con la presente invención se da a conocer una vacuna aplicable a nivel industrial bien definida contra infecciones por H. meleagridis que permite la protección eficiente de los animales y también cumple los requisitos legales y formales necesarios para el registro y la utilización veterinarios (Ganas et al., Int. J. Parasitol. 42 (2012), 893-901).

En el transcurso de la presente invención, la expresión “cepa bacteriana única” o “cultivo de cepa bacteriana única (de H. meleagridis)’’ significa que el componente bacteriano se compone de los descendientes de un único aislamiento en cultivo puro y, habitualmente, se deriva de una colonia única inicial (Dijkshoorn et al., J. Med. Microbiol. 49 (2000), 397-401). Esta es, habitualmente, la unidad operacional básica en bacteriología y, a menudo, también se denomina “la cepa en el sentido taxonómico”. La “cepa bacteriana única” no es un concepto natural, ya que estos demandados de una colonia única inicial “natural” se han mantenido en cultivo artificial. Esta definición no deja lugar a dudas sobre la identidad de la cepa. Aunque en la naturaleza puede haber un homólogo a la cepa en el sentido taxonómico, la “cepa bacteriana única”, según la presente invención, se puede distinguir claramente de cualquier flora bacteriana de tipo natural en cultivos de H. meleagridis, por ejemplo, por su pureza (principalmente por la composición de diversas especies bacterianas en el entorno natural de H. meleagridis), por su identidad genética (por ejemplo, con respecto a mutaciones, pérdidas o adquisición de plásmidos, etc.), etc. Por lo tanto, también resulta claro que la presencia de más de una cepa bacteriana única en los cultivos de la presente invención es distinguible claramente de una flora bacteriana de tipo natural de H. meleagrídis. Aunque el número de cepas bacterianas únicas que se pueden añadir al cultivo de H. meleagrídis es variable, para proporcionar un producto de vacuna aplicable a nivel industrial, no es preferente añadir más de cinco cepas bacterianas únicas. En cambio, es preferente específicamente proporcionar el cultivo de H. meleagrídis, según la presente invención, con solo una cepa bacteriana única. Sin embargo, pueden ser preferentes las realizaciones con no más de cuatro, preferentemente no más de tres, especialmente no más de dos, cepas bacterianas únicas por algunos motivos (por ejemplo, para proporcionar un mejor entorno para H. meleagridis).

A diferencia del cultivo de H. meleagridis con la (una o varias) “cepa bacteriana única”, el término cultivo “xénico” (de H. meleagridis), según la presente invención, se refiere a un cultivo de H. meleagridis hechas crecer o presentes en asociación con una microbiota desconocida, especialmente con una flora bacteriana procedente del entorno natural a partir del cual se han tomado las células de H. meleagridis. Además, el término “monoxénico” (utilizado por Goedbloed et al., 1962) se refiere únicamente a la adición de un cultivo bacteriano exógeno único a un cultivo de H. meleagridis tomado de un entorno natural (por ejemplo, tejido hepático), que todavía contiene la totalidad o parte de las bacterias presentes de manera natural. Incluso los cultivos clonales de H. meleagridis dados a conocer en Hess et al., 2006 todavía contienen, como mínimo, parte de la mezcla bacteriana del entorno inicial.

Según la presente invención, la completa retirada del entorno bacteriano natural (“de tipo natural”) se garantiza mediante una variedad de etapas, entre otras, una aplicación combinada de antibióticos o etapas de control. Los antibióticos se seleccionan, preferentemente, mediante el examen previo de la flora bacteriana del cultivo de H. meleagridis que se debe purificar a partir de tal flora bacteriana de tipo natural. Por consiguiente, la etapa (a) está acompañada, preferentemente, por un análisis de la flora bacteriana del cultivo xénico. Tal examen se puede realizar mediante cualquier técnica adecuada, por ejemplo, mediante pruebas clásicas de crecimiento bacteriano, que incluyen pruebas de resistencia, o aplicando procedimientos de biología molecular, tales como PCR. Después de tal examen, la mezcla de antibióticos se puede optimizar dependiendo del tipo de bacterias que están presentes en el cultivo de H. meleagridis. Habitualmente, es preferente utilizar antibióticos con mecanismos de antibiótico diferentes en la mezcla aplicada en la etapa (b) del presente procedimiento. La mezcla de antibióticos utilizada en la etapa (b) en el procedimiento, según la presente invención, contiene, como mínimo, dos antibióticos diferentes. La mezcla se selecciona siempre en vista de la flora bacteriana analizada o esperada y se compone, preferentemente, de antibióticos de clases de compuesto diferentes para conseguir el efecto más potente sobre la destrucción de la flora bacteriana de tipo natural. Según los cultivos de H. meleagridis investigados en el transcurso de la presente invención, una realización preferente del procedimiento, según la presente invención, emplea una mezcla de antibióticos que contiene, como mínimo, tres antibióticos diferentes. Una combinación de doripenem, neomicina y rifampicina mostró efectos beneficiosos específicos sobre la destrucción de manera eficiente de la flora bacteriana de tipo natural.

Para la presente invención, prácticamente cualquier aislado de H. meleagridis se puede transformar en un cultivo de cepa bacteriana única. Puesto que también es habitualmente preferente la homogeneidad del componente de H. meleagridis del cultivo obtenido, una realización preferente de la presente invención es comenzar con un cultivo clonal de H. meleagridis, preferentemente un cultivo clonal establecido mediante micromanipulación de un cultivo de H. meleagridis. Tales cultivos clonales se han dado a conocer, por ejemplo, en la Patente EP 1721 965 A y contienen solo H. meleagridis derivada de una única célula. Por lo tanto, tales cultivos son homogéneos con respecto al componente parásito del cultivo y específicamente preferentes para elaborar vacunas definidas contra infecciones por H. meleagridis.

Una etapa esencial en el procedimiento, según la presente invención, es la etapa de control (d) en la que se controla el efecto del tratamiento con antibióticos. Mientras que una mezcla de antibióticos optimizada basada en un análisis previo de la flora bacteriana es habitualmente eficaz para destruir todas las bacterias presentes, este puede no ser necesariamente el caso para otros casos o en casos en los que están contenidas cepas bacterianas resistentes en la muestra o el cultivo inicial. Por lo tanto, si la etapa de control tiene como resultado la detección de bacterias restantes, se deben repetir el tratamiento con antibióticos y las etapas posteriores de centrifugación y lavado. Por ejemplo, la etapa (f) se puede realizar añadiendo, adicionalmente, otra mezcla de antibióticos (por supuesto, una mezcla para la que la cepa bacteriana única añadida es resistente), de modo que la etapa (b) repetida se realiza entonces junto con, o después de, la etapa (f). Preferentemente, el tratamiento con antibióticos de una etapa (b) “repetida” de este tipo se realiza con una mezcla de antibióticos diferente que también se ajusta, preferentemente, a la naturaleza de las bacterias supervivientes. La naturaleza de las bacterias supervivientes también se puede analizar antes de modificar la composición de la mezcla de antibióticos.

En cuanto a la investigación de la fauna bacteriana inicial (véase anteriormente), también para la etapa de control (d), se puede aplicar cualquier técnica analítica para procariotas adecuada (por ejemplo, pruebas clásicas de crecimiento bacteriano o aplicando procedimientos de biología molecular, tales como PCR); un procedimiento preferente aplica la determinación de unidades formadoras de colonias después de la etapa (b) o (c). Especialmente en el caso de que se deban repetir las etapas (b) y (c), es preferente repetir también la etapa (d), es decir, si la flora bacteriana de tipo natural no se ha retirado por completo de las células de H. meleagridis en la primera aplicación de la mezcla de antibióticos.

Las etapas (a) a (g), especialmente las etapas (b) a (g), no se deben realizar necesariamente en el orden alfabético (aunque, por supuesto, la etapa (a) sería habitualmente la etapa inicial y la etapa (g) la etapa final para obtener el cultivo). Por ejemplo, la adición de la(s) cepa(s) bacteriana(s) única(s) (etapa (f)) también se puede realizar antes de las etapas (c), (d) o (e). Esta adición también se puede llevar a cabo durante estas etapas, por ejemplo, incluso durante la etapa (b) (por ejemplo, cerca del final), la etapa (c) (por ejemplo, después de centrifugar y antes de lavar) o durante la etapa (e)). La adición de la(s) cepa(s) bacteriana(s) única(s) durante la etapa (b), por supuesto, también depende de las propiedades de resistencia a los antibióticos de la(s) cepa(s) bacteriana(s) única(s) en comparación con la mezcla de antibióticos aplicada, de modo que se garantiza la supervivencia de las bacterias añadidas. La etapa de control (d) también se puede realizar, por ejemplo, después de la etapa (b), (e), (f) o (g) (o durante estas etapas, por ejemplo, durante la etapa (b) (por ejemplo, cerca del final), la etapa (c) (por ejemplo, después de centrifugar y antes de lavar) o durante la etapa (e)); o incluso realizarse más de una vez, por ejemplo, después de (o durante) las etapas (c), (e), (f) y/o (g).

También es posible repetir las etapas (b) y (c) si la etapa de control (d) revela que la flora bacteriana de tipo natural no se ha retirado por completo de las células de H. meleagrídis. Sin embargo, se debe tener cuidado en que repetir estas etapas permita una supervivencia adecuada de la mezcla que comprende las células de H. meleagrídis y las bacterias (presentes o añadidas). Esto se puede optimizar para un material de partida dado monitorizando de manera continua la supervivencia de las células de H. meleagrídis y las células bacterianas durante todo el presente procedimiento. Por ejemplo, se puede aplicar tinción con azul de tripano para diferenciar entre células de H. meleagrídis vivas y muertas; las células bacterianas se pueden someter a prueba, por ejemplo, mediante procedimientos de prueba microbianos clásicos, tales como pruebas en placas de agar (y recuento de colonias). Preferentemente, el presente procedimiento se monitoriza con respecto a células de H. meleagrídis y células bacterianas para prevenir un desequilibrio no fisiológico entre bacterias y protozoarios que pondría en riesgo la supervivencia de las células de H. meleagrídis.

La naturaleza de la cepa bacteriana única que se va a utilizar en el transcurso de la presente invención es crítica en la medida en que debe permitir una supervivencia y un crecimiento apropiados de las células de H. meleagrídis. Se sabe que un componente bacteriano es esencial para cultivar células de H. meleagrídis. En el transcurso de la presente invención, se pudo observar que solo las cepas bacterianas que son anaerobias facultativas muestran un buen rendimiento. Con el fin de mostrar tal rendimiento de supervivencia/crecimiento satisfactorio con respecto a las células de H. meleagrídis, es necesario proporcionar una cepa bacteriana única de especies anaerobias o aerobias facultativas, es decir, bacterias que realizan una respiración aerobia. Los estudios realizados en el transcurso de la presente invención mostraron que, específicamente, se pueden obtener resultados buenos si el/los uno o varios cultivo(s) de cepa bacteriana única de una cepa bacteriana seleccionada entre Escherichia coli, Salmonella Typhimurium, Staphylococcus aureus y/o Pseudomonas aeruginosa se añade(n) en la etapa (f).

Cultivo(s) de cepa bacteriana única específicamente preferente(s) de una cepa bacteriana se puede(n) seleccionar entre Clostridium spp., preferentemente Clostridium perfringens sp., especialmente cepa de campo de Clostridium perfringens PA10/2010 descrita en el presente documento, Enterococcus spp., preferentemente Enterococcus faecalis sp., especialmente Enterococcus faecalis ATCC29212, Salmonella spp., preferentemente Salmonella enterica serovariedad Typhimurium sp., especialmente Salmonella enterica serovariedad Typhimurium ATCC14028, Salmonella spp., preferentemente Salmonella enterica serovariedad Enteritidis sp., especialmente Salmonella enterica serovariedad Enteritidis ATCC13076, Escherichia coli sp., especialmente Escherichia coli ATCC25922, Escherichia coli DH5a o Escherichia coli transformada con vector pGFPuv, Staphylococcus spp., preferentemente Staphylococcus aureus, especialmente cepa de campo de Staphylococcus aureus PA10/10643 descrita en el presente documento, y/o Pseudomonas spp., preferentemente Pseudomonas aeruginosa sp., especialmente Pseudomonas aeruginosa ATCC27853.

El cultivo de cepa bacteriana única, según el presente procedimiento, contiene, además, todos los componentes de cultivo que son necesarios para el crecimiento/la supervivencia de las células de H. meleagrídis. Por lo tanto, las células de H. meleagridis se mantienen, preferentemente, en un medio de cultivo que comprende suero bovino fetal, preferentemente que contiene, además, un tampón, aminoácidos y una fuente de hidratos de carbono, especialmente almidón. Tales medios resultaron ser específicamente adecuados para el procedimiento, según la presente invención.

Aunque el procedimiento, según la presente invención, se puede aplicar para cualquier cultivo de H. meleagridis, es preferente proporcionar tales cultivos con propósitos de vacunación. Para los propósitos de vacunación, es preferente utilizar formas atenuadas del patógeno (H. meleagridis), preferentemente un cultivo clonal atenuado de H. meleagridis, especialmente H. meleagridis Turkey/Austria/2922-C6/04. Tales formas atenuadas se han puesto a disposición recientemente (Liebhart et al., Avian Pathol. 39 (2010), 399-403; Liebhart et al., Poultry Sci. 90 (2011), 996-1003; Hess et al., Vaccine 26 (2008), 4187-4193) y se pueden transformar en cultivos de cepa bacteriana única aplicando el procedimiento, según la presente invención, a tales cultivos.

El procedimiento, según la presente invención, reemplaza la flora bacteriana de tipo natural por una cepa bacteriana única. Es conveniente utilizar una cepa modificada genéticamente para la etapa (f), porque la presencia o ausencia de tales células bacterianas es más fácil de controlar utilizando características de tecnología génica, que incluyen genes resistentes a antibióticos o genes marcadores. Por lo tanto, la etapa (f) se llevó a cabo en la sección de ejemplos con E. coli DH5a. Sin embargo, en muchos casos, no se desea la presencia de bacterias manipuladas genéticamente en una vacuna. Por lo tanto, se puede desear proporcionar un cultivo de cepa bacteriana única de H. meleagrídis que contenga solo bacterias que no se han manipulado genéticamente, es decir, cepas que se han derivado de fuentes naturales. Con el fin de proporcionar tales cultivos, la etapa (f) se puede realizar con tales cepas bacterianas únicas que no se manipulan genéticamente. Por el contrario, en el transcurso de la presente invención también resultó que es posible reemplazar una cepa bacteriana única en el cultivo por otra cepa bacteriana única. Por ejemplo, una cepa modificada genéticamente se puede reemplazar por una cepa que no se ha modificado genéticamente. De hecho, resultó ser más fácil, más controlable y más seguro realizar la etapa (f) con una cepa bacteriana única modificada genéticamente y, a continuación, reemplazar esta cepa modificada genéticamente por una o varias cepas bacterianas únicas que no se han modificado genéticamente. Una forma preferente del procedimiento, según la presente invención, se realiza, por lo tanto, de un modo en el que la(s) una o varias cepa(s) bacteriana(s) única(s) añadida(s) en la etapa (f) se reemplaza(n) por una o varias de otra(s)cepa(s) bacteriana(s) única(s) mediante las siguientes etapas:

(h) tratar el cultivo de cepa bacteriana única de H. meleagrídis obtenido en la etapa (g) con un antibiótico o una mezcla de antibióticos específicos para destruir la(s) una o varias cepa(s) bacteriana(s) única(s) añadida(s) en la etapa (f), destruyendo de ese modo la(s) cepa(s) bacteriana(s) añadida(s) en la etapa (f),

(i) centrifugar, lavar y resuspender las células de H. meleagrídis,

(j) añadir una o varias cepa(s) bacteriana(s) única(s) a las células de H. meleagrídis resuspendidas, y

(k) cultivar la(s) una o varias cepa(s) bacteriana(s) única(s) con las células de H. meleagrídis resuspendidas para obtener un cultivo de cepa bacteriana única de H. meleagrídis.

Preferentemente, la cepas añadidas en la etapa (j) son cepas que son cepas no modificadas genéticamente (principalmente debido a motivos regulatorios; sin embargo, esto también puede cambiar con el tiempo y el país). Las siguientes cepas bacterianas únicas son específicamente preferentes para su utilización en la etapa (j): (con la condición de que solo se utilizan cepas no modificadas genéticamente) Clostrídium spp., preferentemente Clostrídium perfringens sp., especialmente cepa de campo de Clostrídium perfríngens PA10/2010 descrita en el presente documento, Enterococcus spp., preferentemente Enterococcus faecalis sp., especialmente Enterococcus faecalis ATCC29212, Salmonella spp., preferentemente Salmonella enterica serovariedad Typhimurium sp., especialmente Salmonella enterica serovariedad Typhimurium ATCC14028, Salmonella spp., preferentemente Salmonella enterica serovariedad Enteritidis sp., especialmente Salmonella enterica serovariedad Enteritidis ATCC13076, Escherichia coli sp., especialmente Escherichia coli ATCC25922, Staphylococcus spp., preferentemente Staphylococcus aureus, especialmente cepa de campo de Staphylococcus aureus PA10/10643 descrita en el presente documento, y/o Pseudomonas spp., preferentemente Pseudomonas aeruginosa sp., especialmente Pseudomonas aeruginosa ATCC27853.

Según una realización preferente del presente procedimiento, la mezcla de antibióticos en la etapa (b) se aplica en una concentración de 5 a 500, preferentemente de 10 a 100, especialmente de 30 a 70 |xg/ml de doripenem, de 50 a 5.000, preferentemente de 100 a 1.000, especialmente de 300 a 700 |xg/ml de neomicina y de 30 a 3.000, preferentemente de 50 a 1.500, especialmente de 100 a 500 |xg/ml de rifampicina.

Preferentemente, la mezcla de antibióticos en la etapa (b) comprende, como mínimo, dos, preferentemente, como mínimo, tres antibióticos seleccionados entre cloranfenicol, cotrimoxazol, difloxacina, doripenem, enrofloxacina, kanamicina, lincomicina, marbofloxacina, meropenem, neomicina, rifampicina, espectinomicina y estreptomicina. En general, es necesario que la etapa (b) y, opcionalmente, la etapa (k) se realicen a una temperatura y durante un periodo de tiempo que sea suficiente para destruir por completo las células bacterianas pero no demasiado largo como para poner en peligro significativamente la supervivencia del cultivo de H. meleagridis (véase, por ejemplo, el ejemplo 4 de Goedbloed et al., 1962, en el que se ha notificado que todos los protozoarios se destruyen después de 12 h).

En una realización preferente del presente procedimiento, como mínimo, la etapa (g) y, opcionalmente, la etapa (k) se realizan a una temperatura de 35 a 45 °C, preferentemente de 38 a 42 °C.

En una realización preferente del presente procedimiento, la etapa (b) y, opcionalmente, la etapa (h) se realizan a una temperatura de 35 a 45 °C, preferentemente de 38 a 42 °C.

En una realización preferente del presente procedimiento, la etapa (b) y, opcionalmente, la etapa (h) se realizan durante, como mínimo, 1 h, preferentemente, como mínimo, 5 h, especialmente, como mínimo, 10 h. Una duración de, aproximadamente, 20 h ha resultado ser una duración óptima.

Tal como ya se indicó anteriormente, la cepa bacteriana única es, preferentemente, una cepa bacteriana anaerobia o aerobia facultativa.

Tal como ya se indicó anteriormente, la cepa bacteriana única añadida en la etapa (f) es, preferentemente, una cepa bacteriana modificada genéticamente; además, la cepa bacteriana única añadida en la etapa (j) es, preferentemente, una cepa bacteriana que no está modificada genéticamente.

La solución de lavado aplicada en la etapa (c) y, opcionalmente, la etapa (i) es, preferentemente, idéntica o, como mínimo, se deriva de la solución de cultivo en la que las células de H. meleagridis se cultivan habitualmente en el transcurso del presente procedimiento, especialmente en la etapa (g) y, opcionalmente, la etapa (k). Tales soluciones de cultivo son bien conocidas por un experto en la materia y se pueden derivar, por ejemplo, de los documentos citados en el presente documento. Por lo tanto, la etapa de lavado se realiza, preferentemente, con una solución de cultivo.

El procedimiento, según la presente invención, es un procedimiento muy fiable para proporcionar cultivos bacterianos de cepa única de H. meleagrídis. Sin embargo, también es posible obtener tales cultivos omitiendo una o varias de las etapas (c), (d) y (e) y/o utilizando solo un único antibiótico en lugar de una mezcla de antibióticos en la etapa (b). Sin embargo, un procedimiento de este tipo también puede tener como resultado bacterias restantes del cultivo inicial, porque algunos miembros de la flora bacteriana de tipo natural dentro de un cultivo de H. meleagrídis pueden ser resistentes a un único antibiótico de este tipo.

Según otro aspecto, la presente invención también se refiere a una formulación de vacuna que consiste en

- un componente de Histomonas que consiste en un cultivo atenuado de Histomonas meleagrídis,

- un componente bacteriano que consiste en uno o varios cultivos de una cepa bacteriana única, y

- compuestos de formulación no biológicos aceptables farmacéuticamente,

en la que el número de las cepas bacterianas únicas no es mayor de cinco;

en la que el componente de Histomonas y el componente bacteriano se proporcionan como un cultivo de cepa bacteriana única de H. meleagrídis que se puede obtener según el procedimiento según la presente invención. La presente formulación de vacuna no solo contiene un componente de H. meleagrídis bien definido (tal como permitió recientemente la Patente EP 1721 965 A), sino también, además, un componente bacteriano bien definido. El componente bacteriano consiste en un cultivo de una cepa bacteriana única (en determinados casos, se puede(n) proporcionar más de una (algunas) cepa(s) bacteriana(s) única(s) en el componente bacteriano), permitiendo de ese modo una formulación de vacuna bien definida y bien caracterizada para ambos componentes. El componente bacteriano también permite una clara distinción de la flora bacteriana natural de los cultivos de H. meleagrídis, porque la vacuna con el componente bacteriano, tal como se define en la presente invención, no se puede derivar de fuentes naturales. Esto es detectable fácilmente a partir de la naturaleza y composición del componente bacteriano de cualquier vacuna contra H. meleagrídis que contiene bacterias mediante investigación de la naturaleza y composición de la flora bacteriana de una vacuna de la técnica anterior de este tipo. Es imposible que una vacuna que comprende un componente de cepa bacteriana única, según la presente invención, se pueda derivar de cultivos de H. meleagrídis conocidos sin la previa destrucción de la flora bacteriana inicial.

El procedimiento, según la presente invención, permite proporcionar simultáneamente el componente de Histomonas y el componente bacteriano como cultivo de cepa bacteriana única de H. meleagrídis. Por lo tanto, es preferente que la presente vacuna contenga un cultivo de cepa bacteriana única de H. meleagrídis, especialmente como cultivo de cepa bacteriana única de H. meleagrídis, que se puede obtener según el procedimiento según la presente invención. En una realización preferente de la presente formulación de vacuna, el componente bacteriano contiene un cultivo de una cepa bacteriana única, preferentemente una cepa bacteriana seleccionada entre Clostrídium spp., preferentemente Clostrídium perfríngens sp., especialmente cepa de campo de Clostrídium perfríngens PA10/2010 descrita en el presente documento, Enterococcus spp., preferentemente Enterococcus faecalis sp., especialmente Enterococcus faecalis ATCC29212, Salmonella spp., preferentemente Salmonella enterica serovariedad Typhimurium sp., especialmente Salmonella enterica serovariedad Typhimurium ATCC14028, Salmonella spp., preferentemente Salmonella enterica serovariedad Enteritidis sp., especialmente Salmonella enterica serovariedad Enteritidis ATCC13076, Escherichia coli sp., especialmente Escherichia coli ATCC25922, Escherichia coli DH5a o Escherichia coli transformada con vector pGFPuv, Staphylococcus spp., preferentemente Staphylococcus aureus, especialmente cepa de campo de Staphylococcus aureus PA10/10643 descrita en el presente documento, y/o Pseudomonas spp., preferentemente Pseudomonas aeruginosa sp., especialmente Pseudomonas aeruginosa ATCC27853; preferentemente una cepa no modificada genéticamente seleccionada entre las mismas.

Según una realización preferente de la presente formulación de vacuna, la H. meleagridis atenuada es un cultivo clonal atenuado de H. meleagridis, especialmente H. meleagridis Turkey/Austria/2922-C6/04. Para un cultivo atenuado de este tipo, es esencial que sea estable, es decir, que sea estable con respecto al crecimiento a lo largo de, como mínimo, cinco pases. “Crecimiento estable” significa que las propiedades de crecimiento no varían significativamente a lo largo de los pases, por ejemplo, que las velocidades de crecimiento no se desvían en más del 20 %.

La formulación de vacuna, según la presente invención, ha resultado ser específicamente ventajosa para la prevención de histomoniasis, preferentemente en aves de corral, especialmente en pavo y gallina, y en aves de caza, especialmente faisán, perdiz, gallina de Guinea y codorniz.

Según una realización preferente de la presente formulación de vacuna, el número de las cepas bacterianas únicas no es mayor de cuatro, preferentemente no mayor de tres, más preferentemente no mayor de dos, especialmente una.

El compuesto de formulación no biológico aceptable farmacéuticamente en la formulación de vacuna, según la presente invención, puede ser cualquier compuesto contenido habitualmente en una vacuna (por supuesto, distinto de un componente de Histomonas y un componente bacteriano, tal como se definen en el presente documento), especialmente en una vacuna para aves de corral. Por lo tanto, el compuesto de formulación no biológico aceptable farmacéuticamente puede ser un tampón, un adyuvante, especialmente hidróxido de aluminio, un conservante, una carga, un estabilizante, un nutriente, y consiste habitualmente en una combinación de dos o varios de tales compuestos.

La formulación de vacuna se puede formular en cualquier forma adecuada para una vacuna, por ejemplo, como un comprimido, especialmente un comprimido revestido, una cápsula, una emulsión de agua en aceite, un producto alimenticio, una formulación de pulverización, una formulación líquida, especialmente un aditivo para agua potable, una formulación inyectable, especialmente ya envasada en una jeringa, como gel, como almohadilla de gel o combinaciones de los mismos.

La formulación de vacuna, según la presente invención, comprende, como mínimo, un vehículo o diluyente aceptable farmacéuticamente, tal como agua, solución salina, líquido de cultivo, estabilizantes, hidratos de carbono, proteínas, agentes que contienen proteínas, tales como suero bovino o leche desnatada, y tampones, o cualquier combinación de los mismos, como compuesto de formulación no biológico aceptable farmacéuticamente. El estabilizador puede ser SPg A. SPGA contiene sacarosa 0,218 M (74,62 g), KH2PO40,00376 M (0,52 g), K2HPO4 0,0071 M (1,25 g), glutamato de potasio 0,0049 M (0,912 g) y albúmina sérica al 1 % (10 g). Diversas modificaciones de las cantidades anteriores de los ingredientes de SPGA son conocidas por los expertos en la materia y, con frecuencia, el glutamato de sodio se sustituye por glutamato de potasio, pero las composiciones modificadas se siguen denominando SPGA. Por ejemplo, un estabilizante de SPGA puede contener glutamato de monosodio en lugar de glutamato de monopotasio; otro estabilizante de SPGA contiene, por litro de agua destilada estéril, 74,62 g de sacarosa, 0,45 g de KH2PO4, 1,35 g de K2HPO4, 0,956 g de L-glutamato de monosodio y 40 ml de una solución al 25 % de albuminosol (albúmina humana). En general, un estabilizante de SPGA contiene desde, aproximadamente, el 2 hasta, aproximadamente, el 10 % de azúcar, por ejemplo, sacarosa; desde, aproximadamente, el 0,05 hasta, aproximadamente, el 0,3 % de una sal de fosfato monobásico o dibásico de metal alcalino, o una mezcla de las mismas, por ejemplo, KH2PO4, K2HPO4, NaH2PO4 o Na2HPO4; desde, aproximadamente, el 0,05 hasta, aproximadamente, el 0,2 % de una sal de metal alcalino de ácido glutámico, por ejemplo, glutamato de sodio o potasio; y desde, aproximadamente, el 0,5 % hasta, aproximadamente, el 2 % de albúmina sérica, por ejemplo, albúmina sérica bovina o albúmina humana. Se pueden realizar diversas sustituciones de componentes en la formulación del estabilizante de SPGA. Por ejemplo, un hidrolizado de almidón, por ejemplo, glucosa o dextrano, puede sustituir completa o parcialmente a sacarosa y caseína, o la PVP puede sustituir completa o parcialmente a albúmina. Entre los hidratos de carbono se incluyen, por ejemplo, sorbitol, manitol, almidón, sacarosa, glucosa, dextrano o combinaciones de los mismos. Además, proteínas tales como albúmina o caseína, o agentes que contienen proteínas tales como suero bovino o leche desnatada, pueden ser útiles como vehículo o diluyente aceptable farmacéuticamente. Entre los tampones para su utilización como vehículos o diluyentes aceptables farmacéuticamente se incluyen maleato, fosfato, CABS, piperidina, glicina, citrato, malato, formiato, succinato, acetato, propionato, piperazina, piridina, cacodilato, succinato, MES, histidina, bis-tris, fosfato, etanolamina, ADA, carbonato, ACES, PIPES, imidazol, BIS-TRIS propano, BES, MOPS, HEPES, TES, MOPSO, MOBS, DIPSO, TAPSO, Tea , pirofosfato, HEPPSO, POPSO, tricina, hidrazina, glicilglicina, TRIS, EPPS, bicina, HEPBS, TAPS, AMPD, TABS, AMPSO, taurina, borato, CHES, glicina, hidróxido de amonio, CAPSO, carbonato, metilamina, piperazina, CAPS o cualquier combinación de los mismos. La formulación de vacuna se puede liofilizar o secar por congelación. En algunas realizaciones, la formulación de vacuna, según la presente invención, puede comprender, además, como mínimo, un adyuvante. Entre los ejemplos de adyuvantes se incluyen adyuvante completo de Freund o adyuvante incompleto de Freund, vitamina E, polímeros de bloque no iónicos, muramildipéptidos, saponinas, aceite mineral, aceite vegetal, Carbopol, hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, óxido de aluminio, emulsiones de aceite (por ejemplo, de Bayol F® o Marcol 52®), saponinas o solubilizados de vitamina E, o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, la formulación de vacuna puede comprender adyuvantes particularmente útiles para aplicación a la mucosa, por ejemplo, la toxina termolábil de E. colio la toxina del cólera.

La formulación de vacuna, según la presente invención, se puede administrar por vía oftálmica, en el huevo, por vía intradérmica, por vía intraperitoneal, por vía intravenosa, por vía subcutánea, por vía oral, mediante aerosol (vacunación por pulverización), a través de la cloaca o por vía intramuscular. La administración mediante colirio, en el huevo y mediante aerosol son preferentes cuando el individuo es un ave de corral. La administración mediante aerosol es preferente particularmente para administrar la formulación de vacuna a un gran número de individuos. Es específicamente preferente proporcionar la vacuna, según la presente invención, en forma encapsulada o revestida. Esto permite una conservación adecuada de la mezcla de bacterias/protozoarios.

Según una realización preferente, la formulación de vacuna, según la presente invención, contiene una cepa única atenuada de una cepa bacteriana patógena, preferentemente una cepa de Salmonella Enteritidis y/o Salmonella Typhimurium única atenuada, al igual que el/los uno o varios cultivo(s) de una cepa bacteriana única.

La formulación de vacuna, según la presente invención, contiene preferentemente de 1x102 a 1x106, preferentemente de 1x10 a 5x10, especialmente de 5x10 a 1x10 células de H. meleagridis y/o de 1x10 a 1x10 , preferentemente de 1x107 a 5x1010, especialmente de 5x107 a 1x1010 células bacterianas.

Según una realización preferente, la formulación de vacuna, según la presente invención, se formula como una forma farmacéutica, es decir, ya se formula para su administración sin etapas de partición/formulación/separación adicionales.

La presente invención se describe, además, mediante los siguientes ejemplos y las siguientes figuras, aun así sin limitarse a los mismos.

La figura 1 muestra la PCR para demostrar la presencia de H. meleagridis y la reducción de bacterias en diferentes etapas del procedimiento para obtener cultivos de cepa bacteriana única. ADN aislado de (1) cultivo xénico, (2) suspensión celular antes del tratamiento con antibióticos, (3) suspensión celular después del tratamiento con antibióticos y (4) suspensión celular después de las etapas de lavado. Cebadores específicos para H. meleagridis (A) y bacterias (B). M: marcador de tamaño molecular (marcador de 100 pb).

La figura 2 muestra el comportamiento de crecimiento de diferentes pases (P1-P3) de H. meleagridis hecha crecer con diversas cepas bacterianas, con (B+) y sin (B) enriquecimiento de las bacterias. (A) Porcentaje de cultivos de cepa bacteriana única que contienen H. meleagridis. (B) Número de células (media ± DE) de H. meleagridis en cultivos de cepa bacteriana única con diversas cepas bacterianas.

La figura 3 muestra curvas de crecimiento de las cepas bacterianas sometidas a prueba en cultivos de cepa bacteriana única de H. meleagridis (A) sin y (B) con enriquecimiento de las bacterias. El número de células se determinó contando las unidades formadoras de colonias (ufc) al comienzo del experimento de cultivo conjunto y después de una incubación durante 3 días.

La figura 4 muestra micrografías láser confocales de un cultivo de cepa bacteriana única de H. meleagridis hecha crecer con E. coli DH5a pGFPuv. Series de ocho secciones consecutivas (apilamiento z, incremento en el eje z de 0. 318 |o.m) a través de una célula de H. meleagridis marcada con suero de anticuerpo anti-Histomonas policlonal (visualizado mediante Alexa Fluor 568, rojo) y E. coli DH5a pGFPuv (verde). Núcleo del parásito y ADN bacteriano teñidos con DAPI (azul). Las bacterias positivas para GFP se hallan unidas a la superficie de H. meleagridis (A-B, G-H; flechas) y encerradas por los protozoarios (C-F, punta de flecha). Barra de escala, 2 pmi.

La figura 5 muestra la mortalidad acumulada debida a histomoniasis de pavos infectados con cultivo de cepa bacteriana única de H. meleagridis in vitro, pase 295 (HM+DH5a P295), cultivo de cepa bacteriana única de H. meleagridis in vitro, pase 20 (HM+DH5a P20), cultivo xénico de H. meleagridis in vitro, pase 20 (HM xénico P20) y cultivo de E. coli DH5a (DH5a).

EJEMPLOS

Materiales y procedimientos

1. Cultivo de H. meleagridis

Se utilizaron dos pases diferentes (10 y 290 veces) del mismo cultivo monoeucariota propagado in vitro y asignado como H. meleagridis Turkey/Austria/2922-C6/04. Originalmente, el cultivo se estableció a partir de, aproximadamente, 1 g de contenido cecal y material raspado a partir de la pared cecal de pavos que murieron de histomoniasis. El material se colocó en 9 ml de medio 199 que contenía sales de Earle, L-glutamina, HEPES 25 mM y L-aminoácidos (Gibco™, Invitrogen). Además, se añadieron suero bovino fetal, FBS, inactivado por calor al 15 % (Gibco™, Invitrogen) y 11 mg de almidón de arroz (Sigma-Aldrich). El cultivo monoeucariota se desarrolló mediante micromanipulación y propagación in vitro de los parásitos clonados tal como se ha descrito recientemente (Hess et al., 2006). Después del almacenamiento en nitrógeno líquido, el cultivo clonal se descongeló y se utilizó para los presentes experimentos. Se utilizó el mismo medio 199 con FBS al 15 % y un aumento de almidón de arroz hasta 20 mg como patrón para el cultivo in vitro de H. meleagrídis. Las células se sometieron a pases cada 2-3 días transfiriendo 1 ml de cultivo a un tubo de 50 ml estéril nuevo (Sarstedt) que contenía 9 ml de medio recién preparado.

2. Caracterización y destrucción de la flora bacteriana en los cultivos clonales xénicos

Para la investigación bacteriológica, se transfirieron alícuotas de los cultivos xénicos a agar Schaedler con sangre de oveja al 5 % (SCS), agar Columbia complementado con sangre de oveja al 5 % (COS) (BioMérieux), agar MacConkey (McC) (LABM) y agar Coliform (CF) (Merck). Todas las placas con agar se incubaron en condiciones aerobias a 37 °C durante 24 horas, excepto las placas con SCS, que se incubaron en condiciones anaerobias. Se realizaron pruebas de susceptibilidad a antibióticos con todas las cepas bacterianas aisladas, según Bauer et al. Am. J. Clin. Pathol. 45 (1966), 493-496). Se utilizaron los siguientes discos de antibióticos: 30 pg de cloranfenicol, 25 pg de cotrimoxazol, 10 pg de difloxacina, 5 pg de enrofloxacina, 30 pg de kanamicina, 15 pg de lincomicina, 5 pg de marbofloxacina, 10 pg de meropenem, 30 pg de neomicina, 30 pg de rifampicina, 100 pg de espectinomicina y 25 pg de estreptomicina. Los resultados de las pruebas de sensibilidad se utilizaron para seleccionar los antibióticos para destruir las bacterias en el cultivo xénico.

Para preparar células flageladas para establecer un cultivo con una cepa bacteriana única, se centrifugaron 10 ml de cultivo xénico a 300xg durante 5 minutos a temperatura ambiente (TA), se retiró el sobrenadante y se resuspendió el sedimento en 9 ml de medio 199 con FBS al 15 %, recién preparado. Para destruir las bacterias, la suspensión celular se trató con la mezcla de antibióticos doripenem 50 pg/ml, neomicina 500 pg/ml y rifampicina 300 pg/ml durante 20 horas a 40 °C. Después de la incubación, la suspensión celular se centrifugó a 300xg durante 5 minutos a TA. El sedimento celular se lavó tres veces con 5 ml de medio 199 complementado con FBS al 15 %, recién preparado, y se resuspendió en 9 ml de medio recién preparado.

3. Destrucción de bacterias

Se utilizaron PCR y recuento de unidades formadoras de colonias (ufc) sobre placas con agar para evaluar la eficiencia del tratamiento con antibióticos para destruir la flora bacteriana en los cultivos xénicos. Para la extracción de ADN, se utilizó 1 ml de material celular del cultivo xénico original, el sedimento celular resuspendido antes y después del tratamiento con antibióticos o el sedimento celular resuspendido después de las tres etapas de lavado. Las muestras se centrifugaron a 500xg durante 5 minutos y, después de retirar el sobrenadante, se congelaron los sedimentos a -20 °C. Se descongelaron a TA y se resuspendieron en 200 pl de PBS para la extracción de ADN utilizando el kit de sangre y tejido DNeasy® (Qiagen) siguiendo el protocolo para la purificación de ADN total a partir de sangre o células animales (protocolo de columna de centrifugación).

Los pares de cebadores utilizados para amplificar partes de los genes de ARN ribosómico de subunidades pequeñas para la PCR fueron: el par

Hmf 5'-GAAAGCATCTATCAAGTGGAA-3' (SEQ.ID.NO.1) y

Hmr 5'- GATCTTTTCAAATTAGCTTTAAA-3' (SEQ.ID.NO.2)

(Grabensteiner et al., Parasitology 142 (2006), 223-230) para el gen de ARNr 18S de H. meleagridis y el par universal

16S F 5'- GGCGGCRKGCCTAAYACATGCAAGT-3' (SEQ.ID.NO.3) y

16S R 5'- GACGACARCCATGCASCACCTGT-3' (SEQ.ID.NO.4)

(Carroll et al., J. Clin. Microbiol. 38 (2000), 1753-1757) para el gen de ARNr 16S bacteriano. Las amplificaciones se llevaron a cabo en 25 pl de mezclas de reacción empleando el kit de mezcla maestra HotStarTaq (Qiagen). Una mezcla de reacción consistía en 12,5 pl de mezcla maestra HotStarTaq, 8 pl de agua destilada, 1 pl de cebador directo, 1 pl de cebador inverso (todos los cebadores se utilizaron a concentraciones de 10 pmol/pl) y 2,5 pl de molde de ADN. Después de la etapa de desnaturalización inicial a 95 °C durante 15 minutos, las mezclas de reacción se sometieron a 40 ciclos de desnaturalización térmica a 94 °C durante 30 segundos, hibridación de cebadores a 55 °C para Hmf/Hmr y a 60 °C para 16S F/16S R durante 1 minuto y alargamiento del ADN a 72 °C durante 1,5 minutos, seguido de la etapa de alargamiento final a 72 °C durante 10 minutos, utilizando el termociclador Biometra T3. Los productos de PCR se analizaron mediante electroforesis en gel de agarosa.

Para evaluar los resultados de PCR, se realizó una PCR semicuantitativa utilizando diluciones 1:10 en serie del ADN aislado del cultivo xénico original como molde, el par de cebadores 16S F/16S R y el programa apropiado para la amplificación.

Para determinar las unidades formadoras de colonias, se esparcieron con asa de siembra 100 pl del material de cultivo después del tratamiento con antibióticos y las tres etapas de lavado sobre agar COS (BioMérieux) y CF (Merck). Las placas con agar COS se incubaron en condiciones microaerobias y las placas con agar CF en condiciones aerobias a 37 °C durante 24 horas.

4. Establecimiento de un cultivo de cepa bacteriana única con E. co liDH5a y DH5a pGFPuv

Se utilizaron un total de 100 células de H. meleagrídis en un volumen de 20-30 |j.l de medio 199, dependiendo del número de flagelados en la suspensión celular, para inocular los cultivos de cepa bacteriana única en tubos Eppendorf de 1,5 ml estériles. Se contaron los protozoarios vivos utilizando un hemocitómetro. Las muestras se mezclaron con una misma cantidad de tinte azul de tripano al 0,4 % (Invitrogen) para diferenciar entre células vivas y muertas.

Para los experimentos de cultivo conjunto con H. meleagrídis, las cepas bacterianas E. coli DH5a (Invitrogen) y DH5a transformada con el vector pGFPuv (Clontech; que proporciona la expresión de proteína fluorescente verde y resistencia a Amp) se hicieron crecer hasta la fase estacionaria en 9 ml de medio 199 complementado con FBS al 15 % y 20 mg de almidón de arroz a 37 °C durante 20 horas, agitado a 225 rpm. Después de la adición de FBS al 15 % recién preparado y los antibióticos ácido nalidíxico 100 |xg/ml y penicilina G 100 |xg/ml para DH5a y ácido nalidíxico 100 |xg/ml y ampicilina 100 |xg/ml para DH5a pGFPuv, los cultivos bacterianos se dividieron en alícuotas de 500 |j.l en tubos Eppendorf de 1,5 ml. A continuación, se añadieron las células de H. meleagrídis. Los antibióticos se utilizaron para destruir las bacterias restantes de la flora cecal de tipo natural sin influir en el crecimiento de DH5a y DH5a pGFPuv. Los cultivos se incubaron a 40 °C durante 3 días. El éxito de establecer un cultivo de cepa bacteriana única se monitorizó mediante examen microscópico para determinar la presencia de protozoarios. La presencia de bacterias se detectó esparciendo con asa de siembra el material de cultivo sobre agar COS (BioMérieux) y CF (Merck). Las placas con agar COS se incubaron en condiciones microaerobias y las placas con agar CF en condiciones aerobias a 37 °C durante 24 horas. Los cultivos se sometieron a pases tres veces cada 2-3 días transfiriendo 100 |j.l de cultivo antiguo a un tubo Eppendorf de 2,0 ml estéril nuevo (Sarstedt) que contenía 900 |j.l de medio 199 con FBS al 15 %, recién preparado, 2 mg de almidón de arroz y los antibióticos ácido nalidíxico 100 |xg/ml y penicilina G 100 |xg/ml o ácido nalidíxico 100 |xg/ml y ampicilina 100 |xg/ml. Los pases posteriores se realizaron cada 2-3 días transfiriendo 1 ml de cultivo antiguo a un tubo Eppendorf de 50 ml estéril nuevo (Sarstedt) que contenía 9 ml de medio recién preparado.

5. Establecimiento de un cultivo de cepa bacteriana única con diferentes cepas bacterianas

Para generar cultivos de cepa bacteriana única de H. meleagrídis con diferentes cepas bacterianas, se trataron 10 ml del cultivo de cepa bacteriana única que contenía E. coli DH5a con la mezcla de antibióticos doripenem 50 |xg/ml, neomicina 500 |xg/ml y rifampicina 300 |xg/ml durante 20 horas a 40 °C. Después de lavar el sedimento celular y preparar la suspensión celular, los cultivos de cepa bacteriana única con diferentes cepas bacterianas en tubos Eppendorf de 1,5 ml se inocularon con 100 células de H. meleagrídis tal como se describió anteriormente.

Las cepas bacterianas cepa de campo de Clostrídium perfríngens PA10/2010 (número de diagnóstico interno, clínica para medicina de aves, reptiles y peces, Universidad de Veterinaria de Viena), Enterococcus faecalis ATCC29212, Salmonella enterica serovariedad Typhimurium ATCC14028, Salmonella enterica serovariedad Enteritidis ATCC13076, Escherichia coli ATCC25922, cepa de campo de Staphylococcus aureus PA10/10643 y Pseudomonas aeruginosa ATCC27853 se hicieron crecer en 9 ml de medio 199 complementado con FBS al 15 % y 20 mg de almidón de arroz a 40 °C durante 20 horas sin agitación. Se midió la densidad óptica a 600 nm y, si era necesario, se diluyeron las suspensiones bacterianas con medio 199 complementado con FBS al 15 % para dar un número de células dentro del intervalo de 5x108 a 9x108 células/ml. Después de la adición de FBS al 15 % recién preparado, los cultivos bacterianos se dividieron en alícuotas de 500 |j.l en tubos Eppendorf de 1,5 ml estériles antes de añadir las células de H. meleagrídis. Los cultivos se incubaron a 40 °C durante 3 días.

El número exacto de bacterias al comienzo del experimento de cultivo conjunto se determinó contando las unidades formadoras de colonias (ufc). Se llevaron a cabo investigaciones bacteriológicas para C. perfringens sobre agar SCS (BioMérieux), para E. faecalis, S. aureus y P. aeruginosa sobre agar COS (BioMérieux), para S. Typhimurium y S. Enteritidis sobre agar CF (Merck) y para E. coli sobre agar McC (LABM). Excepto para las placas con agar SCS, todas las placas se incubaron a 37 °C en condiciones aerobias durante 24 horas. Las placas con SCS se incubaron en condiciones anaerobias a 37 °C durante 24 horas. Los cultivos se sometieron a pases dos veces cada 2-3 días transfiriendo 100 |j.l del cultivo antiguo a un tubo Eppendorf de 2,0 ml estéril nuevo (Sarstedt) que contenía 900 |j.l de medio 199 con fBs al 15 %, recién preparado, y 2 mg de almidón de arroz.

Para verificar la naturaleza de la cepa bacteriana única durante los tres pases, se contaron las células de H. meleagridis vivas a partir de los cultivos utilizando un hemocitómetro y tinte azul de tripano al 0,4 % (Invitrogen). Para las investigaciones bacteriológicas, se contaron las unidades formadoras de colonias utilizando las placas con agar descritas anteriormente. Cada estudio de crecimiento se realizó cuatro veces por quintuplicado. Se utilizó la media de los recuentos para las 20 muestras para evaluar el comportamiento de crecimiento tanto de protozoarios como de bacterias. Se utilizó el programa SPSS para el análisis estadístico.

Se realizó el mismo experimento de crecimiento con C. perfringens, E. faecalis, S. aureus, S. Typhimurium y S. Enteritidis en la condición de enriquecimiento de células bacterianas en los cultivos. Durante el primer periodo de crecimiento, que duró hasta 3 días, las células bacterianas (que oscilaban entre 2x108 y 5x108 células en 200 pl de medio 199) se añadieron al cultivo de cepa bacteriana única cada 24 horas. Para el segundo periodo de crecimiento, se transfirieron 100 pl del cultivo antiguo a un tubo Eppendorf de 2,0 ml estéril nuevo (Sarstedt) que contenía 900 pl del cultivo bacteriano apropiado en lugar de medio 199 recién preparado. Para el tercer periodo de crecimiento, se sometieron a pases 100 pl de los cultivos en 900 pl de medio 199 complementado con FBS al 15 %, recién preparado, y 2 mg de almidón de arroz.

6. Microscopía láser confocal

Las muestras para microscopía láser confocal se obtuvieron a partir de un cultivo de 10 ml de H. meleagridis con E. coli DH5a pGFPuv. Se inoculó un cultivo de 2 días con E. coli DH5a pGFPuv adicional a partir de una placa con agar LB con ampicilina 100 pg/ml y se incubó a 40 °C durante 20 horas. El cultivo se centrifugó durante 10 minutos a 2.665xg para producir un sedimento unido por el almidón de arroz en el medio. El sedimento se colocó en un casete de inclusión de biopsias para la fijación en formalina al 3,5 % durante 3 horas a TA, se incluyó en parafina y se cortaron secciones de 10 pm. Se colocaron las secciones en portaobjetos Superfrost illtra Plus (Menzel-Glaser, Braunschweig, Alemania), se desparafinaron en Neoclear (Merck) y se rehidrataron en una serie de etanol graduado (100 %, 96 % y 70 %) y agua destilada. Los portaobjetos se incubaron en metanol complementado con peróxido de hidrógeno al 1,5 % durante 30 minutos, se lavaron en solución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7,4, durante 20 minutos y se bloquearon con suero de cabra normal al 10 % en PBS durante 1 hora a TA en una cámara húmeda. Se retiró el suero y se cubrieron las secciones con suero de anticuerpo de conejo anti-Histomonas policlonal purificado, se diluyeron 1:10.000 y se incubaron a 4 °C durante una noche en una cámara húmeda. Después de lavar en PBS, las secciones se incubaron con anticuerpo anti-IgG de conejo acoplado con Alexa Fluor 568 (Invitrogen), se diluyeron 1:500, durante 1 hora a TA en una cámara húmeda, seguido de lavados en PBS y tinción con 4’,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI, Roche) durante 5 minutos. Las secciones se lavaron de nuevo en PBS antes de montar los portaobjetos bajo cubreobjetos con Aquatex (Merck). Se tomaron micrografías confocales utilizando un dispositivo Zeiss Axiovert 200M equipado con un módulo de barrido láser Zeiss 510 META (Carl Zeiss, Alemania). El barrido de los apilamientos de imágenes se realizó con un objetivo de inmersión en aceite 63x/1.4 a 1.024 x 1.024 píxeles y un incremento en el eje z de 0,318 pm. El brillo y el contraste de las imágenes finales se ajustaron utilizando Adobe Photoshop CS2 (Adobe Systems, San José, California).

7. Experimento in vivo con cultivos de cepa bacteriana única de H. meleagridis

En el experimento, se alojaron 30 pavos de un día de edad (Converter, Hybrid Europe, Malguénac, Francia) en jaulas sobre lecho profundo bajo presión negativa. Las aves fueron marcadas individualmente con etiquetas numeradas (Swiftack™; Heartland Animal Health Inc., Fair Play, Missouri). Se proporcionaron pienso (pienso de iniciación para pavos comercial) y agua a voluntad, excepto durante un periodo de 5 horas de restricción de pienso inmediatamente después de la infección.

El experimento con animales fue analizado y aprobado por el comité de ética institucional y autorizado por la ley austriaca (número de autorización BMWF-68.205/0256-BrGT/2005).

El cultivo xénico de H. me/eagrdfe/Turkey/Austria/2922-C6/04 (Hess et al., 2006) con la flora bacteriana de tipo natural se cultivó durante 10 y 290 pases in vitro antes de generar los cultivos de cepa bacteriana única con E. coli DH5a. Después de 10 y 5 pases in vitro adicionales (20 y 295 pases in vitro en total), los cultivos de cepa bacteriana única se utilizaron como inóculos para la infección. Además, el pase 20 del cultivo xénico de H. meleagridis in vitro y un cultivo durante una noche de E. coli DH5a se utilizaron como controles. Para la infección, se administraron a las aves, a través de la cloaca, 104 células de los protozoarios en 300 pl de medio 199 complementado con FBS al 15 % y 0,66 mg de almidón de arroz o 300 pl del cultivo bacteriano hecho crecer en el mismo medio, utilizando una pipeta Eppendorf convencional.

El experimento se configuró con 4 grupos diferentes. Los grupos A y B contenían 10 aves infectadas con los pases 295 y 20 in vitro de cultivos de cepa bacteriana única de H. meleagridis, respectivamente. Como controles, cada una de las 5 aves de los grupos C y D fue infectada con el pase 20 in vitro del cultivo xénico y con el cultivo de E. coli DH5a, respectivamente. Todas las aves recibieron los inóculos el día 14 de vida.

Los signos clínicos se registraron a diario. Se tomaron frotis de la cloaca para un nuevo aislamiento in vitro del parásito los días 0, 2, 5, 9, 12, 16 y 19 tras la infección, según el protocolo convencional (Hess et al., Avian Pathol.

35 (2006), 280-235 (“Hess et al., (2006b)”). Se recogieron frotis de la cloaca adicionales los días 0, 2 y 5 tras la infección para investigaciones bacteriológicas sobre agar CF (Merck). Todas las placas con agar se incubaron en condiciones aerobias a 37 °C durante 24 horas. Se realizó la autopsia de todos los pavos que murieron o que se tuvieron que sacrificar debido a enfermedad grave o que se sacrificaron al final del experimento. Se examinaron los ciegos y los hígados de las aves para detectar cambios patológicos indicativos de histomoniasis. La gravedad de las lesiones halladas en los órganos se diferenció utilizando puntuaciones de lesión establecidas previamente (Windisch et al., Paras. Immunol. 32 (2010), 29-35; Zahoor et al., Avian Dis. 55 (2011), 29-34). Se realizó la investigación bacteriológica de los ciegos y los hígados de pavos infectados con los cultivos de cepa bacteriana única de H. meleagrídis (5 aves del grupo A y todas las aves del grupo B) o el cultivo bacteriano de E. coli DH5a solo (3 aves del grupo D). El material tisular de los órganos se esparció con asa de siembra sobre diferentes placas con agar. Las placas con agar CF (Merck) y McC (LABM) se incubaron en condiciones aerobias a 37 °C durante 24 horas, mientras que las placas con agar SCS (BioMérieux) se incubaron en condiciones anaerobias a 37 °C durante 24 horas.

Resultados

I. Intercambio de la flora bacteriana de tipo natural y provisión del cultivo de cepa bacteriana única con E. co liDH5a

Para generar cultivos de cepa bacteriana única de H. meleagrídis, se tuvo que caracterizar la flora bacteriana en los cultivos xénicos. El cultivo xénico original tenía un número de células de 109 bacterias/ml, y se aislaron E. coli, Streptococcus sp. y Proteus sp. sobre las placas con agar. Las pruebas de susceptibilidad mostraron que las cepas bacterianas eran resistentes a la mayoría de los antibióticos, excepto a meropenem, neomicina y rifampicina, de modo que estos antibióticos se utilizaron adicionalmente para la provisión del cultivo de cepa bacteriana única. Dado que doripenem también pertenece al grupo de carbapenemas y actúa de manera muy similar a meropenem, se utilizó en las preparaciones. Se sometieron a prueba diversas concentraciones de doripenem (de 20 a 50 |xg/ml), neomicina (de 50 a 500 |xg/ml) y rifampicina (de 200 a 300 |xg/ml) para destruir la flora bacteriana. Los mejores resultados para la destrucción de la gran mayoría de las bacterias, pero manteniendo vivas las células protozoarias, se obtuvieron con una mezcla de doripenem 50 |xg/ml, neomicina 500 |xg/ml y rifampicina 300 |xg/ml. Los recuentos de unidades formadoras de colonias (ufc) después del tratamiento con antibióticos y el lavado demostraron un bajo número de colonias individuales de E. coli y Proteus sp. hechas crecer sobre las placas con agar (120 bacterias/ml). La PCR con el par de cebadores Hmf/Hmr confirmó que H. meleagridis todavía estaba presente en la suspensión celular (figura 1). La PCR con el par de cebadores 16S F/16S R mostró una reducción del ADN bacteriano, y este hallazgo estaba respaldado por los resultados de la PCR semicuantitativa. La adición de los antibióticos ácido nalidíxico y penicilina G durante la generación de los cultivos de cepa bacteriana única tuvo como resultado una completa eliminación de la flora bacteriana residual, tal como se demostró sobre placas con agar. E. coli DH5a todavía estaba presente en el cultivo de cepa bacteriana única y se pudo identificar por su comportamiento de crecimiento basándose en la deleción parcial específica del gen lacZ. Después de establecer con éxito los cultivos de cepa bacteriana única y el cambio de tubos Eppendorf de 2,0 ml a tubos de 50 ml, los números de células protozoarias hechas crecer con E. coli DH5a en pases sucesivos fueron comparables a los de los cultivos xénicos (aproximadamente 50x104 células/ml), independientemente del nivel de pase.

2. Crecimiento de H. meleagridis en cultivos de cepa bacteriana única con diferentes cepas bacterianas

Tras la provisión del cultivo de cepa bacteriana única de H. meleagridis junto con diversas cepas bacterianas, se investigó microscópicamente la presencia de células protozoarias vivas utilizando un hemocitómetro.

El número más alto de muestras que contenían células de H. meleagridis se halló en cultivos incubados conjuntamente con E. coli (del 30 % al 45 %), seguido de S. Typhimurium (del 5 % al 20 %) y P. aeruginosa (10 %) (figura 2A). En los cultivos de cepa bacteriana única con S. Enteritidis, las células protozoarias solo se pudieron detectar después del primer pase (5 %), y con C. perfringens solo después del tercer pase (10 %). En ninguno de los cultivos que contenían E. faecalis o S. aureus se pudieron hallar células protozoarias. Los números de células más altos de los flagelados, hasta 61x104 células/ml, se contaron en los cultivos de cepa bacteriana única con P. aeruginosa (figura 2B). Los números de células de los protozoarios fueron prácticamente idénticos en los cultivos con E. coli y S. Typhimurium, hasta 19,4x104 células/ml y 16,6x104 células/ml, respectivamente.

En un segundo conjunto de experimentos, se analizó el crecimiento de H. meleagridis en cultivos de cepa bacteriana única con C. perfringens, E. faecalis, S. aureus, S. Typhimurium y S. Enteritidis, tras el enriquecimiento de las células bacterianas. Casi todos los cultivos (del 80 % al 86,7 %) con S. aureus contenían células protozoarias (figura 2A). Dependiendo del número de pases, se halló que eran positivas del 26,7 % al 66,7 % y del 6,7 % al 53,3 % de las muestras incubadas conjuntamente con S. Typhimurium o S. Enteritidis. No se pudieron detectar células de H. meleagridis en ninguno de los cultivos con C. perfringens y E. faecalis. Se contaron hasta 20x104 células protozoarias/ml en los cultivos de cepa bacteriana única con S. Typhimurium y hasta 12,6x104 células/ml en los cultivos con S. Enteritidis (figura 2B). El número máximo de células flageladas en los cultivos con S. aureus fue de 9,8x104 células/ml.

El número de bacterias en los cultivos de cepa bacteriana única se determinó contando las unidades formadoras de colonias (ufc) al comienzo del experimento de cultivo conjunto con H. meleagridis y después de un periodo de incubación de 3 días. El aumento más alto de bacterias se logró para S. Typhimurium, seguido de P. aeruginosa y E. coli (figura 3A). El número de células para S. Enteritidis, E. faecalis, S. aureus y C. perfringens permaneció aproximadamente estable durante la incubación. Desde el inicio, el número de células de S. aureus y C. perfringens en los cultivos de cepa bacteriana única fue inferior a los números de células de las demás cepas bacterianas debido a que estas bacterias no crecen bien en condiciones optimizadas para el crecimiento in vitro de H. meleagridis. Para ambas cepas, el experimento de cultivo conjunto se comenzó con el número más alto de células disponibles. Tras el enriquecimiento de las bacterias en los cultivos de cepa bacteriana única, S. Typhimurium fue la única bacteria que aumentó su número a lo largo del tiempo (figura 3B). Los números de S. Enteritidis, E. faecalis, S. aureus y C. perfringens disminuyeron más o menos pronunciadamente.

3. Microscopía de fluorescencia confocal

Se utilizó microscopía de fluorescencia confocal para investigar la presencia de E. coli DH5a pGFPuv en células de H. meleagridis y para estudiar su distribución dentro del protozoario. Las bacterias que expresan GFP se hallaron unidas a la superficie de H. meleagridis así como encerradas por los flagelados (figura 4). DAPI tiñó el núcleo de H. meleagridis y, dentro del protozoario y en el medio de cultivo, numerosos perfiles alargados correspondientes al ADN bacteriano. Algunas de las bacterias positivas para DAPI carecían de la señal de GFP debido a la estabilidad limitada de la proteína fluorescente verde.

4. Experimento in vivo con cultivos de cepa bacteriana única de H. meleagridis

La mortalidad acumulada de los pavos que murieron o que se tuvieron que sacrificar debido a histomoniasis se presenta en la figura 5. Dos aves del grupo B que murieron en los días 2 y 3 tras la infección debido a canibalismo se excluyeron del análisis. Las demás aves del grupo B infectadas con el pase 20 in vitro del cultivo de cepa bacteriana única de H. meleagridis y todas las aves del grupo C infectadas con el pase 20 in vitro del cultivo xénico de H. meleagridis mostraron signos clínicos de histomoniasis, tales como plumas erizadas, somnolencia y diarrea de color azufre. Hubo un retraso de, aproximadamente, una semana en la aparición de signos clínicos y la mortalidad entre los grupos B y C. La autopsia de todas las aves de ambos grupos que murieron por histomoniasis mostró una grave destrucción de los ciegos y los hígados, con la puntuación de lesión más alta, 4. Ninguno de los pavos en los grupos A y D mostró ningún signo clínico durante el estudio. Se sacrificaron al final del experimento 5 semanas tras la infección. Durante la necropsia, se mostró un engrosamiento esporádico de la pared cecal (puntuación de lesión 1) para 4 de las 10 aves del grupo A infectadas con el pase 295 in vitro del cultivo de cepa bacteriana única de H. meleagridis y un ave tuvo un engrosamiento pronunciado de la pared de ambos ciegos (puntuación de lesión 3). Ninguna de las otras 5 aves mostró ningún signo de inflamación cecal (puntuación de lesión 0). Además, los hígados de todas las aves eran normales (puntuación de lesión 0). Los ciegos y los hígados de aves del grupo D infectadas con el cultivo de E. coli DH5a no presentaron ninguna anomalía clínica (puntuación de lesión 0).

Las células protozoarias vivas se volvieron a aislar a partir de diferentes pavos de cada uno de los grupos infectados con un cultivo particular de H. meleagridis. Tal como se esperaba, todas las muestras de las aves del grupo D de control permanecieron negativas.

Las investigaciones bacteriológicas de los frotis de la cloaca tomados los días 0, 2 y 5 tras la infección sobre agar CF mostraron la presencia de E. coli de tipo natural y Citrobacter sp., pero no se pudo hallar E. coli DH5a. Además, no se pudo aislar E. coli DH5a a partir del material tomado de los ciegos y de los hígados de pavos infectados con los cultivos de cepa bacteriana única de H. meleagridis o el cultivo bacteriano de E. coli DH5a. Sin embargo, además de E. coli de tipo natural, se observaron cepas bacterianas cocoides en los ciegos de todas las aves sometidas a prueba. Se halló P. aeruginosa en los ciegos de dos aves infectadas con el pase 20 in vitro del cultivo de cepa bacteriana única de H. meleagridis (grupo B) y se detectó C. perfringens en los ciegos de otra ave. La investigación bacteriológica de los hígados mostró la presencia de cepas bacterianas cocoides en todas las aves sometidas a prueba. Además, se pudo aislar E. coli de tipo natural en el 62,5 % de las muestras de hígados de aves del grupo B.

Discusión

H. meleagridis se ha cultivado in vitro desde comienzos del siglo pasado. Se ha utilizado una amplia variedad de medios y condiciones de cultivo, pero un crecimiento bueno y rápido solo ha sido respaldado si estaban presentes en los cultivos determinadas bacterias vivas a partir del material fecal aislado de los ciegos (por ejemplo Hauck et al., 2010). Supuestamente, estas bacterias sirven como alimento para los flagelados, porque también se observaron en las vacuolas. Exámenes por microscopía electrónica de las células de H. meleagridis también han indicado la ingestión de bacterias mediante fagocitosis en el protozoario (Mazet et al., Int. J. Parasitol. 38 (2008), 177-190). El análisis por microscopía láser confocal de H. meleagridis hecha crecer con E. coli DH5a pGFPuv, notificado en la presente solicitud, confirma claramente la presencia de bacterias dentro de las células protozoarias y demuestra que E. coli es una de las cepas bacterianas que se va a incorporar.

En la presente investigación, se halló que E. coli fomentaba más fuertemente el crecimiento de los protozoarios, seguida de S. Typhimurium. El efecto positivo de E. coli es acorde con estudios anteriores. Goedbloed et al. (1962) describieron la transferencia exitosa de H. meleagridis desde material hepático recién obtenido de pavos que habían muerto por histomoniasis a los medios de cultivo de Boeck-Drbohlav y Dobell-Laidlaw inoculados previamente con E. coli vivas. Escherichia y Salmonella pertenecen a la familia Enterobacteriaceae y son bacterias Gram-negativas, anaerobias facultativas, con forma de bacilo, que utilizan respiración aerobia o anaerobia para obtener energía. En condiciones anaerobias y en ausencia de los aceptores de electrones finales, su crecimiento es impulsado por la fermentación. Por lo tanto, un motivo para la influencia positiva en el crecimiento de H. meleagrídis en las condiciones experimentales es la alta velocidad de división de las bacterias, que producen de ese modo material celular que digieren los protozoarios. Además, las bacterias consumen eficazmente el oxígeno en los tubos de cultivo. Por tanto, mejoran la condición para el metabolismo anaerobio de H. meleagrídis, que es crucial ya que H. meleagrídis es un flagelado anaerobio y el oxígeno inhibe su crecimiento.

Curiosamente, S. Enterítidis es inferior a S. Typhimuríum en cuanto al fomento del crecimiento de H. meleagrídis. Una explicación para este hallazgo es la menor velocidad de crecimiento de S. Enterítidis en las condiciones utilizadas. Previamente se ha mostrado que los protozoarios intestinales de los géneros Naegleria, Acanthamoeba y Hartmanella se diferencian antigénicamente entre las diversas serovariedades de Salmonella enterica, lo que tiene como resultado discriminación y selección de presas.

P. aeruginosa es una bacteria Gram-negativa, anaerobia facultativa, con forma de bacilo, de la familia Pseudomonadaceae. Habitualmente se describe como favorecedora de las condiciones de crecimiento aerobias pero, en condiciones con oxígeno limitado, puede utilizar respiración o fermentación anaerobia para obtener energía. A pesar del metabolismo energético similar a E. coliy una alta velocidad de crecimiento, en el experimento de cultivo conjunto con P. aeruginosa solo el 10 % de las muestras eran positivas para H. meleagrídis. Una explicación es la capacidad de P. aeruginosa de formar biopelículas, lo que puede prevenir el efecto de respaldo. Los experimentos con el flagelado Rhynchomonas nasuta mostraron que la formación de microcolonias en la biopelícula bacteriana, que es inducida por el flagelado, permite a las células procariotas resistir al apacentamiento protozoario.

Cuando se utilizó S. aureus para el experimento de cultivo conjunto, solo fue posible establecer cultivos de cepa bacteriana única tras el enriquecimiento de las células bacterianas. S. aureus pertenece a la familia Staphylococcaceae. La bacteria Gram-positiva cocoide es anaerobia facultativa y su metabolismo energético se basa en respiración aerobia o anaerobia. Por lo tanto, cumple el requisito de reducir el nivel de oxígeno en el tubo de cultivo. La adición de bacterias nuevas a las muestras durante la incubación compensó la baja velocidad de crecimiento de la bacteria en las condiciones experimentales y respaldó el crecimiento del flagelado en los cultivos de cepa bacteriana única. También se debe tener en cuenta que una única célula de E. coli es hasta 10 veces tan grande como una célula de S. aureus, por lo que se necesitaría un mayor número de células de S. aureus para satisfacer las necesidades nutricionales del protozoario.

Las dos bacterias C. perfringens y E. faecalis son procariotas Gram-positivas, anaerobia o anaerobia facultativa, respectivamente, de las familias Clostridaceae y Enterococcaceae, cuyo metabolismo energético depende de la fermentación. En consecuencia, no consumen el oxígeno en los tubos de cultivo y no pueden respaldar el crecimiento de H. meleagrídis. El bajo número de cepa bacteriana única de H. meleagridis observado en el cultivo conjunto con C. perfringens después del tercer pase se pudo explicar mediante el modo de fermentación utilizado por esta cepa bacteriana. Durante la fermentación butírica, se produce dióxido de carbono y puede reemplazar parte del oxígeno en el cultivo, lo que hace que las condiciones sean menos aerobias. Sin embargo, el reemplazo solo funciona a un bajo nivel y C. perfringens no creció muy bien en los cultivos conjuntos porque es un anaerobio estricto. En cambio, E. faecalis, un anaerobio aerotolerante, creció mucho mejor. Esta bacteria utiliza fermentación homoláctica para producir energía, convirtiendo glucosa en lactato sin la formación de dióxido de carbono. Por lo tanto, el nivel de oxígeno en el cultivo permanece inalterado, lo que explica por qué no se observó crecer H. meleagridis en un cultivo de cepa bacteriana única de este tipo.

Tras establecer con éxito los cultivos de cepa bacteriana única de H. meleagridis con diferentes cepas bacterianas, se realizó un ensayo en animales para investigar la influencia de E. coli DH5a en la patogenia del flagelado. Todas las aves que recibieron el cultivo xénico o de cepa bacteriana única de H. meleagridis sometido a pases 20 veces in vitro murieron o se tuvieron que sacrificar debido a histomoniasis. La autopsia mostró una inflamación grave con necrosis en los ciegos y los hígados que presentaban la puntuación de lesión máxima. El hecho de que las aves sometidas, tras la infección con parásitos, a pases in vitro solo algunas veces contrajeran posteriormente signos clínicos es acorde con experimentos previos (Hess et al., (2006b); Hess et al., 2008). Goedbloed et al. (1962) también mostraron que los pavos infectados con un cultivo de cepa bacteriana única de H. meleagridis hecha crecer junto con E. coli contrajeron histomoniasis. Además, la presencia de una cepa bacteriana definida, tal como E. coli o Escherichia intermedia, en el intestino es suficientes para que el protozoario exprese su infectividad y patogenia. En cambio, los experimentos con pavos gnotobióticos y pavos con ciegos libres de gérmenes mostraron que la presencia de bacterias en el tracto intestinal, y especialmente en el ciego, es necesaria para producir histomoniasis.

Se observó un retraso de, aproximadamente, 1 semana en la aparición de signos clínicos y la mortalidad comparando las aves en los grupos infectados con un cultivo de cepa bacteriana única o con un cultivo xénico de H. meleagridis, ambos sometidos a pases durante un corto periodo de tiempo. Se puede suponer que las bacterias presentes en el cultivo xénico son similares a la flora bacteriana intestinal de los pavos utilizados en el experimento. Además, el cultivo xénico de H. meleagridis contenía un mayor número de células bacterianas que el cultivo de cepa bacteriana única, ya que E. coli DH5a creció de manera menos eficiente en estas condiciones. Como consecuencia, H. meleagridis tuvo unas condiciones de crecimiento algo mejores en el tracto intestinal de aves infectadas con el

Claims

REIVINDICACIONES

1. Procedimiento para producir una formulación de vacuna que comprende un cultivo de cepa bacteriana única de Histomonas meleagrídis (H. meleagridis), caracterizado por las siguientes etapas:

(c) centrifugar y lavar las células de H. meleagridis,

(d) controlar la eficacia de la etapa (b),

(e) resuspender las células de H. meleagridis lavadas,

(f) añadir una o varias cepa(s) bacteriana(s) única(s) a las células de H. meleagridis resuspendidas, y (g) cultivar la(s) una o varias cepa(s) bacteriana(s) única(s) con las células de H. meleagridis resuspendidas para obtener un cultivo de cepa bacteriana única de H. meleagridis;

2. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que el cultivo xénico de H. meleagridis es un cultivo clonal de H. meleagridis, preferentemente un cultivo clonal establecido mediante micromanipulación de un cultivo de H. meleagridis.

3. Procedimiento, según la reivindicación 1 o 2, en el que la mezcla de antibióticos contiene, como mínimo, tres antibióticos diferentes, preferentemente una mezcla de doripenem, neomicina y rifampicina.

4. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que etapa (d) se realiza determinando las unidades formadoras de colonias después de la etapa (b) o (c).

5. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que uno o varios cultivo(s) de cepa bacteriana única de una cepa bacteriana seleccionada entre Eschericia coli, Salmonella Typhimurium, Salmonella enteritidis, Staphylococcus aureus, Clostridium perfringens, Enterococcus faecalis y/o Pseudomonas aeruginosa se añade(n) en la etapa (f).

6. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que uno o varios cultivo(s) de cepa bacteriana única de una cepa bacteriana seleccionada entre Clostridium spp., preferentemente Clostridium perfringens sp., Enterococcus spp., preferentemente Enterococcus faecalis sp., especialmente Enterococcus faecalis ATCC29212, Salmonella spp., preferentemente Salmonella enterica serovariedad Typhimurium sp., especialmente Salmonella enterica serovariedad Typhimurium ATCC14028, Salmonella spp., preferentemente Salmonella enterica serovariedad Enteritidis sp., especialmente Salmonella enterica serovariedad Enteritidis ATCC13076, Escherichia coli sp., especialmente Escherichia coli ATCC25922, Escherichia coli DH5a o Escherichia coli transformada con vector pGFPuv, Staphylococcus spp., preferentemente Staphylococcus aureus y/o Pseudomonas spp., preferentemente Pseudomonas aeruginosa sp., especialmente Pseudomonas aeruginosa ATCC27853 se añade(n) en la etapa (f).

7. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que las células de H. meleagridis se mantienen en un medio de cultivo que comprende suero bovino fetal, preferentemente que contiene, además, un tampón, aminoácidos y una fuente de hidratos de carbono, especialmente almidón.

8. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el cultivo xénico de H. meleagridis es una H. meleagridis atenuada, preferentemente un cultivo clonal atenuado de H. meleagridis, especialmente H. meleagridis Turkey/Austria/2922-C6/04.

9. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la(s) una o varias cepa(s) bacteriana(s) única(s) añadida(s) en la etapa (f) se reemplaza(n) por una o varias de otra(s) cepa(s) bacteriana(s) única(s) mediante las siguientes etapas:

(h) tratar el cultivo de cepa bacteriana única de H. meleagridis obtenido en la etapa (g) con un antibiótico o una mezcla de antibióticos específicos para destruir la(s) una o varias cepa(s) bacteriana(s) única(s) añadida(s) en la etapa (f), destruyendo de ese modo la(s) cepa(s) bacteriana(s) añadida(s) en la etapa (f),

(i) centrifugar, lavar y resuspender las células de H. meleagridis,

(j) añadir una o varias cepa(s) bacteriana(s) única(s) a las células de H. meleagridis resuspendidas, y

(k) cultivar la(s) una o varias cepa(s) bacteriana(s) única(s) con las células de H. meleagridis resuspendidas para obtener un cultivo de cepa bacteriana única de H. meleagridis.

10. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que uno o varios cultivo(s) de cepa bacteriana única de una cepa bacteriana seleccionada entre Clostridium spp., preferentemente Clostridium perfringens sp., Enterococcus spp., preferentemente Enterococcus faecalis sp., especialmente Enterococcus faecalis ATCC29212, Salmonella spp., preferentemente Salmonella enterica serovariedad Typhimurium sp., especialmente Salmonella enterica serovariedad Typhimurium ATCC14028, Salmonella spp., preferentemente Salmonella enterica serovariedad Enteritidis sp., especialmente Salmonella enterica serovariedad Enteritidis ATCC13076, Escherichia coli sp., especialmente Escherichia coli ATCC25922, Staphylococcus spp., preferentemente Staphylococcus aureus, y/o Pseudomonas spp., preferentemente Pseudomonas aeruginosa sp., especialmente Pseudomonas aeruginosa ATCC27853 se añade(n) en la etapa (j).

11. Formulación de vacuna, que consiste en

- un componente de Histomonas que consiste en un cultivo atenuado de Histomonas meleagridis,

- un componente bacteriano que consiste en una o varias cepa(s) bacteriana(s) única(s), y

- compuestos de formulación no biológicos aceptables farmacéuticamente;

en la que el número de las cepas bacterianas únicas no es mayor de cinco;

en la que el componente de Histomonas y el componente bacteriano se proporcionan como un cultivo de cepa bacteriana única de H. meleagridis que se puede obtener según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.

12. Formulación de vacuna, según la reivindicación 11, en la que el componente bacteriano contiene un cultivo de una cepa bacteriana única, preferentemente una cepa bacteriana seleccionada entre Clostridium spp., preferentemente Clostridium perfringens sp., Enterococcus spp., preferentemente Enterococcus faecalis sp., especialmente Enterococcus faecalis ATCC29212, Salmonella spp., preferentemente Salmonella enterica serovariedad Typhimurium sp., especialmente Salmonella enterica serovariedad Typhimurium ATCC14028, Salmonella spp., preferentemente Salmonella enterica serovariedad Enteritidis sp., especialmente Salmonella enterica serovariedad Enteritidis ATCC13076, Escherichia coli sp., especialmente Escherichia coli ATCC25922, Staphylococcus spp., preferentemente Staphylococcus aureus, y/o Pseudomonas spp., preferentemente Pseudomonas aeruginosa sp., especialmente Pseudomonas aeruginosa ATCC27853.

13. Formulación de vacuna, según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 12, en la que la H. meleagridis atenuada es un cultivo clonal atenuado de H. meleagridis, especialmente H. meleagridis Turkey/Austria/2922-C6/04.

14. Formulación de vacuna, según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, en la que la formulación se utiliza para la prevención de histomoniasis, preferentemente en aves de corral, especialmente en pavo y gallina, y en aves de caza, especialmente faisán, perdiz, gallina de Guinea y codorniz.

15. Formulación de vacuna, según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14, en la que el número de las cepas bacterianas únicas no es mayor de cuatro, preferentemente no mayor de tres, más preferentemente no mayor de dos, especialmente una.