JP6340394B2 - β−ヒドロキシ−β−メチルブチラートを用いて脳の発達および認知機能を改善する方法 - Google Patents

Description

本開示は、β−ヒドロキシ−β−メチルブチラート（ＨＭＢ）を含む栄養製品を投与することにより、成人および高齢期成人における神経発達および認知機能を向上させるための選択された方法に関する。

標的として選択された栄養成分を含んで製造された栄養液および栄養粉末は、周知で広く入手でき、その一部は栄養素の唯一の供給源を提供することができ、その他は補助的な供給源を提供することができる。これらの栄養物には、水または他の水性液体により再構成することができる粉末、および乳または蛋白質ベースのエマルジョンまたは乳化していない液体などのすぐに飲める栄養液がある。これらの栄養液は、選択された栄養成分と共に配合されるときに特に有用である。

そのような栄養成分の１つが、β−ヒドロキシ−β−メチルブチラート（ＨＭＢ）である。ＨＭＢは、様々な栄養製品およびサプリメントにおける使用で知られるロイシンの天然由来アミノ酸代謝産物である。ＨＭＢは、選択された個体において健常な筋肉量および強度の構築または維持を助けるために、そのような製品中で使用されることが公知である。

カルシウムＨＭＢは、錠剤、カプセル、再構成可能な粉末、栄養液およびエマルジョンをはじめとする経口栄養製品中に配合される場合の、ＨＭＢの一般的使用形態である。これらのＨＭＢ含有製品のいくつかは、脂肪、炭水化物、蛋白質、ビタミン、ミネラルなどのような追加的栄養素を含有する。

近年になり、特に脳の健康および栄養状態に関して設計された栄養製品を含むいわゆる「スマートフォーミュレーション（ｓｍａｒｔ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ）」を設計および市販することに関心が高まりつつある。これらの製品の多くは、認知を改善し、認知症ならびに関連の認知機能低下状態および疾患を予防するように特別に設計されている。今日まで、これらの配合剤および製品の成功例は限られている。

そのため、一般的には認知を容易および効果的に改善するため、具体的には認知機能低下、認知欠陥および認知疾患を治療するための組成物および方法が求められている。加えて、組成物および方法が、全般的健康および身体状態とは無関係に非常に様々な個体、特に高齢期成人に使用され得るならば有益である。

（開示の要旨）
本開示は、個体、特に高齢期成人において、認知機能を改善し、ならびに／または認知機能低下、認知欠陥、および認知疾患を予防／治療／抑制する方法を対象とする。方法は、ＨＭＢの有効量を個体に投与することを含む。

一実施形態は、高齢期成人において認知を改善する方法を対象とする。方法は、高齢期成人において認知を改善するのに有効な量のＨＭＢを含む組成物を、高齢期成人に投与することを含む。

別の実施形態は、高齢期成人において神経変性疾患に伴う認知疾患を治療する方法を対象とする。方法は、高齢期成人において認知疾患を治療するのに有効な量のＨＭＢを含む組成物を、高齢期成人に投与することを含む。神経変性疾患には、例えばアルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、認知症、筋委縮性側索硬化症、卒中、および統合失調症が含まれ得る。

別の実施形態は、幼児、児童または青年の認知機能を改善する方法を対象とする。方法は、幼児、児童または青年において認知機能を改善するのに有効な量のＨＭＢを含む組成物を、幼児、児童または青年に投与することを含む。

本明細書に記載された方法は、個体の脳および神経組織への保護を与えることができ、脳および神経組織を悪化から保護し、それにより特に高齢期成人において神経変性疾患に伴う認知疾患を予防および／または治療することができる。加えて、ＨＭＢを含む栄養製品の投与により脳への神経保護を与えることにより、神経機能が向上し得る。

栄養組成物および補助物質中で用いられる他の成分を、ＨＭＢと共に含むことができる。例えば１つまたは複数の実施形態において、組成物は、蛋白質、炭水化物、脂肪、ビタミンおよびミネラルの少なくとも１種を含んでいてもよい。

実施例１１において評価された、ラット１の脳微量透析液中のＨＭＢ濃度の時間推移を示すグラフである。 実施例１１において評価された、ラット２の脳微量透析液中のＨＭＢ濃度の時間推移を示すグラフである。 実施例１２において評価された、Ｎｅｕｒｏ ２Ａ細胞中のｍＴＯＲのリン酸化状態に及ぼすＨＭＢの影響を示すグラフである。 実施例１２において評価された、Ｎｅｕｒｏ ２Ａ細胞中のＥＲＫ １／２のリン酸化状態に及ぼすＨＭＢの影響を示すグラフである。 実施例１２において評価された、Ｎｅｕｒｏ ２Ａ細胞中のＡｋｔのリン酸化状態に及ぼすＨＭＢの影響を示すグラフである。 実施例１２において評価された、Ｎｅｕｒｏ ２Ａ細胞中の蛋白質合成速度に及ぼすＨＭＢの影響を示すグラフである。 実施例１２において評価された、異なる阻害剤の非存在下または存在下での、Ｎｅｕｒｏ ２Ａ細胞中のＭＥＦ２転写因子の発現に及ぼすＨＭＢの影響を示すグラフである。 実施例１２において評価された、異なる阻害剤の非存在下または存在下での、Ｎｅｕｒｏ ２Ａ細胞中のＭＥＦ２転写因子の発現に及ぼすＨＭＢの影響を示すグラフである。 実施例１２において評価された、異なる阻害剤の非存在下または存在下での、Ｎｅｕｒｏ ２Ａ細胞中のＭＥＦ２転写因子の発現に及ぼすＨＭＢの影響を示すグラフである。 実施例１２において評価された、異なる阻害剤の非存在下または存在下での、Ｎｅｕｒｏ ２Ａ細胞中のＭＥＦ２転写因子の発現に及ぼすＨＭＢの影響を示すグラフである。 実施例１２において評価された、Ｎｅｕｒｏ ２Ａ細胞の増殖および生存能に及ぼすＨＭＢの影響を示すグラフである。 実施例１３において評価された、強制水泳検査において無動になるまでの時間により測定されたＨＭＢの抗鬱効果を示すグラフである。

本開示の方法は、特に高齢期成人において、認知機能を改善して認知機能低下、認知欠陥および認知疾患を抑制するＨＭＢ含有組成物を用いることを対象とする。本開示のこれらおよび他の必須もしくは場合による要素、または限定が本明細書の以後に詳細に記載される。

本明細書で用いられる用語「高齢期成人」は、別段の記載がない限り、少なくとも４５歳、例えば少なくとも５０歳、少なくとも５５歳、少なくとも６０歳、少なくとも６５歳、少なくとも７０歳、少なくとも７５歳、少なくとも８０歳、またはそれを超える年齢、同じく約４５歳から約８０歳、更に約５５歳から約８０歳の個体を指す。

本明細書で用いられる用語「カルシウムＨＭＢ」は、別段の記載がない限り、最も典型的には一水和物形態である、β−ヒドロキシ−β−メチルブチラート（β−ヒドロキシル−メチル酪酸、β−ヒドロキシイソ吉草酸またはＨＭＢとも称される。）のカルシウム塩を指す。カルシウムＨＭＢを特徴づけるために本明細書で用いられる重量、パーセント値および濃度の全てが、別段の記載がない限り、カルシウムＨＭＢ一水和物の重量に基づく。

本明細書で用いられる用語「噴霧乾燥粉末」は、別段の記載がない限り、製造の間にＨＭＢをはじめとする成分の大部分が均質化され、続いて噴霧乾燥工程に供されている、栄養粉末を指す。少なくともＨＭＢがそれまでに均質化および噴霧乾燥されている限り、追加的成分をドライブレンディングにより噴霧乾燥粉末に添加することができる。

本明細書で用いられる用語「脂肪」および「油」は、別段の記載がない限り、植物または動物に由来、またはこれから加工される脂質材料を指すために互換可能に用いられる。合成脂質材料がヒトへの経口投与に適する限り、これらの用語はそのような合成材料も含む。

本明細書で用いられる用語「貯蔵安定性」は、別段の記載がない限り、包装され、次いで１８−２４℃で少なくとも３ヶ月間、例えば約６ヶ月から約２４ヶ月、同じく例えば約１２ヶ月から約１８ヶ月貯蔵された後、商業的に安定したままである栄養液を指す。

本明細書で用いられる用語「神経機能」は、別段の記載がない限り、脳および神経細胞組織を機能化して認知能、例えば学習および記憶を支持および維持することを指す。これに対して、本明細書で用いられる用語「神経機能不全」は、別段の記載がない限り、記憶または認知機能の低下を指す。例えば学習能力または情報を思い出す能力の低下は、神経機能不全とみなされる。いくつかの実施形態における神経機能不全は、加齢または神経変性疾患の結果である可能性がある。

本明細書で用いられる用語「神経保護」は、別段の記載がない限り、既存の神経細胞および神経組織のアポトーシスまたは変性からの保護；既存の神経細胞および神経組織の物理的損傷に対する保護；ならびに神経細胞再生の刺激を指す。

本明細書で用いられる用語「認知」は、別段の記載がない限り、思考、理解、記憶力、判断および問題解決をはじめとする知識および理解力の増進に関与する精神プロセスを指す。「認知」は、脳の高次機能を含み、言語、想像、知覚および計画を包含する。

本明細書で用いられる用語「栄養組成物」または「栄養製品」は、別段の記載がない限り、栄養液および栄養粉末を指し、このうち後者は、再構成されて栄養液を形成することができ、両者は、ＨＭＢならびに脂肪、蛋白質および炭水化物の１種または複数を含み、人による経口消費に適している。

本明細書で用いられる用語「栄養液」は、別段の記載がない限り、すぐに飲める液形態の栄養製品および使用前に本明細書に記載された栄養粉末を再構成することにより生成される栄養液を指す。

本明細書で用いられる用語「実質的に透明な液体（ｃｌｅａｒ ｌｉｑｕｉｄ）」は、別段の記載がない限り、実質的に脂肪を含まない栄養液を指し、即ちその液体は、原材料に本来から備わる脂肪または液体の製造を補助するために低濃度で添加された脂肪以外の、添加された脂肪を含まない。本文脈において、用語「脂肪を含まない」は、液体が典型的には栄養液の重量の１．０％未満、より典型的には０．５％未満、より典型的には０．１％未満、例えばゼロ％の脂肪を含有することを意味する。これらの実質液に透明の栄養液は、約１から約２５℃で流動性または飲用可能な液体である。

本明細書で用いられるパーセント値、部および比率の全ては、別段の記載がない限り、組成物全体の重量に基づくものである。列挙された成分に関係するそのような重量は全て、別段の記載がない限り、活性レベルに基づき、それゆえ市販材料に含まれ得る溶媒または副生成物を含まない。

本開示の単数形の特徴または制限への言及は全て、別段の記載がない限り、または言及された文脈により逆の意味が明示されない限り、対応する複数形の特徴または制限、およびその逆を含む。

本明細書で用いられる方法または工程ステップの組み合わせの全ては、別段の記載がない限り、または言及された組み合わせに関する文脈により逆の意味が明示されない限り、任意の順序で実施することができる。

本開示の栄養組成物の様々な実施形態はまた、残りの栄養製品が本明細書に記載された必要成分または特色の全てを、まだ含むことを前提として、本明細書に記載されたいかなる場合によるまたは選択された必須成分または特色を実質的に含まなくてもよい。この文脈において、用語「実質的に含まない」は、別段の記載がない限り、選択された栄養製品が、場合による成分を、機能的な量未満、典型的には、そのような場合によるまたは選択された必須成分の重量の１％未満、例えば０．５％未満、０．１％未満、同じくゼロ％含有することを意味する。

本明細書に記載された栄養組成物および方法は、本明細書に記載された組成物および方法の必須要素と、本明細書に記載された、あるいは栄養製品への適用において有用である、任意の追加的または場合による要素を含んでもよく、またはそれらからなってもよく、または本質的にそれらからなってもよい。

（製品形態）
本開示の方法において有用なＨＭＢを含む組成物は、経口または非経口投与として任意の公知の製品形態、あるいはそれに適した製品形態で配合することができる。必須および他の選択された成分を選択された製品形態から安全で効果的に経口送達することが可能であることを条件として、経口製品形態が、一般に好ましく、本明細書での使用に適した任意の固体、液体または粉末配合剤が含まれる。

本明細書での使用に適した固体栄養製品形態の非限定的例としては、バー、スティック、クッキーまたはブレッドまたはケーキまたは他の焼成品、凍結液、キャンディー、朝食用シリアル、粉末または顆粒固体または他の微粒子、スナックチップまたはバイト、凍結またはレトルトのアントレーなどとして配合されたものなど、スナックおよび代替食製品が挙げられる。

本明細書での使用に適した液体製品形態の非限定的例としては、スナックおよび代替食製品、高温または低温の飲料、炭酸または非炭酸飲料、ジュースまたは他の酸味のある飲料（ａｃｉｄｉｆｉｅｄ ｂｅｖｅｒａｇｅｓ）、乳性または大豆飲料、シェーク、コーヒー、茶、経腸栄養組成物などが挙げられる。これらの液体組成物は、最も典型的には懸濁液またはエマルジョンとして配合されるが、任意の他の好適な形態、例えば透明な液体、実質的に透明な液、溶液、液体ゲルなどに配合させることもできる。

好適な経口製品形態の非限定的例としては、半固形または半液体組成物（例えば、プディング、ゲル）、ならびにより従来的な製品形態、例えばカプセル、錠剤、カプレット、丸薬などが挙げられる。ＨＭＢの有効量を標的使用者に提供するための組成物の量は、個別の剤形の１つまたは複数、例えば１日あたり１回または複数回投与され得る１つの錠剤または複数の錠剤に含有されてもよい。

ロゼンジ、錠剤（例えば、チュワブル、コート錠など）、ペーストまたはゲルなどの製品形態では、アミノ酸ブレンドは、最も典型的には賦形剤または他の成分、例えば炭水化物、酸味料、香味剤、および着色剤全てを組み合わせた製品形態の重量の約５％から約５０％、例えば約１５％から約３３％、同じく約１５％から約２５％の範囲内の濃度で配合されてもよい。

ＨＭＢを含む組成物は、十分な種類および量の栄養素と共に配合されて、単独の、主な、もしくは補助的な栄養供給源を提供してもよく、または特定の疾患もしくは状態に罹患した個体における使用のための、または目的の栄養的な利点を有する、専用の栄養製品を提供することができる。

（β−ヒドロキシ−β−メチルブチラート（ＨＭＢ））
本開示の方法において使用される組成物はＨＭＢを含み、これは組成物がＨＭＢを、最も典型的にはカルシウム一水和物として加えて配合する、そうでなければ最終生成物中にカルシウムおよびＨＭＢを含有するように調製されていることを意味する。最終生成物がＨＭＢを含有することが前提であれば、ＨＭＢの任意の供給源が本明細書における使用に適するが、そのような供給源は、好ましくはカルシウムＨＭＢであり、そのため最も典型的には配合の間に組成物に添加される。

本明細書で用いられる用語「添加されたカルシウムＨＭＢ」は、栄養製品に添加されるＨＭＢ供給源としてのＨＭＢのカルシウム塩、最も典型的にはＨＭＢのカルシウム塩一水和物を意味する。

カルシウムＨＭＢ一水和物は、本明細書における使用に好ましいＨＭＢ供給源であるが、他の好適な供給源が、遊離酸、塩、無水塩、エステル、ラクトン、あるいは栄養製品からのＨＭＢの生物学的利用性形態を提供する他の製品形態としてＨＭＢを含んでいてもよい。本明細書における使用に適したＨＭＢの塩の非限定的例としては、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、クロム、カルシウムの水和物もしくは無水のＨＭＢ塩、または他の非毒性塩形態が挙げられる。カルシウムＨＭＢ一水和物が好ましく、Ｓａｌｔ Ｌａｋｅ Ｃｉｔｙ， ＵｔａｈのＴｅｃｈｎｉｃａｌ Ｓｏｕｒｃｉｎｇ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ （ＴＳＩ）から市販されている。

方法における使用に適した栄養液体組成物中のＨＭＢの濃度は、栄養液体組成物の重量の１０％まで、例えば約０．０１％から１０％、同じく約０．１％から約５．０％、同じく約０．５％から約２．０％、同じく約０．４％から約１．５％の範囲内であってもよい。特定の一実施形態において、ＨＭＢは、栄養液体組成物中に、栄養液体組成物の重量の約０．６７％の量で存在する。

方法における使用に適した栄養固体組成物中のＨＭＢの濃度は、栄養固体組成物の重量の１０％まで、例えば約０．０１％から１０％、同じく約０．１％から約７．０％、同じく約１．０％から約５．０％、同じく約１．０％から約４．０％の範囲内であってもよい。特定の一実施形態において、ＨＭＢは、栄養固体中に、栄養固体組成物の重量の約３．２％の量で存在する。

本明細書に記載された、個体に投与される栄養組成物は、約０．１から約１０グラム／日のＨＭＢ、例えば約０．１から約５．０グラム／日のＨＭＢを提供してもよい。したがって栄養組成物は、１回あたりに約０．５から約２．５グラム、例えば約１．０から約１．７グラム、例えば約１．５グラムのＨＭＢを提供してもよく、１回に、約２４０ｍｌのすぐに与えられる（ｒｅａｄｙ ｔｏ ｆｅｅｄ）栄養液、または約２４０ｍｌの再構成されている栄養固体であってもよい。特定の一実施形態において、ＨＭＢは、約１．５８グラム／２４０ｍｌのレベルで提供される。個体は、栄養組成物から所望の量のＨＭＢを受けるために、１日１回、１日２回、１日３回または１日４回、またはそれを超える回数で投与されてもよい。

（主要栄養素）
方法で用いられるＨＭＢを含む本明細書に開示された組成物は、本明細書に記載されたＨＭＢに加えて、脂肪供給源、炭水化物供給源、および蛋白質供給源全てを含む１種または複数の他の主要栄養素を更に含んでいてもよい。

他の必須または追加的成分と組み合わせられる、場合による主要栄養素は、１回または投与あたり１０００ｋｃａｌまで、例えば１回または投与あたり、最も適切には１回の非分割供給または投与あたり、約２５ｋｃａｌから約９００ｋｃａｌ、同じく例えば約７５ｋｃａｌから約７００ｋｃａｌ、同じく例えば約１００ｋｃａｌから約５００ｋｃａｌ、同じく例えば約１５０ｋｃａｌから約４００ｋｃａｌ、同じく例えば約２００ｋｃａｌから約３００ｋｃａｌを提供してもよい。

選択された栄養素が、経口投与に安全で効果的であり、必須および他の添加された成分と適合性があることを条件として、蛋白質、脂質および炭水化物の多くの異なる供給源、ならびにタイプが公知であり、本明細書に記載されたＨＭＢ含有組成物中で用いることができる。

組成物中での使用に適した炭水化物は、単純、複合またはこれらの変形もしくは組み合わせであってもよい。好適な炭水化物の非限定的例としては、加水分解または化工デンプンまたはコーンスターチ、マルトデキストリン、グルコースポリマー、スクロース、コーンシロップ、固形コーンシロップ、米由来炭水化物、グルコース、フルクトース、ラクトース、高フルクトースコーンシロップ、軟消化性オリゴ糖（例えば、フルクトオリゴ糖）、可溶性または不溶性繊維、蜂蜜、糖アルコール（例えば、マルチトール、エリトリトール、ソルビトール）およびこれらの組み合わせが挙げられる。

本明細書に記載されたＨＭＢ成分に加えて、組成物中での使用に適した蛋白質としては、加水分解された、部分加水分解されたまたは加水分解されていない蛋白質または蛋白質供給源が挙げられ、任意の公知の、あるいは好適な供給源、例えば乳（例えば、カゼイン、ホエー）、動物（例えば、肉、魚）、穀物（例えば、米、トウモロコシ）、野菜（例えば、大豆）またはこれらの組み合わせから得られてもよい。

組成物中での使用に適した脂肪としては、ココナッツ油、分留ココナッツ油、大豆油、コーン油、オリーブ油、サフラワー油、高オレイン酸サフラワー油、ＭＣＴ油（中鎖トリグリセリド）、ヒマワリ油、高オレイン酸ヒマワリ油、パームおよびパーム核油、パームオレイン、キャノーラ油、海産動物油、綿実油、ならびにこれらの組み合わせが挙げられる。

本開示の組成物中の脂肪、蛋白質および炭水化物の量の濃度は、特定の製品形態（例えば、固体、液体、粉末）ならびに様々な他の配合剤および目標とする食物の必要性に応じてかなり変動してもよい。これらの主要栄養素は、最も典型的には以下の表に記載された任意のカロリー範囲（実施形態Ａ−Ｄ）内で配合される。

（場合による成分）
ＨＭＢを含む栄養組成物は、標的集団中で用いられる場合に、製品の物理的、栄養的、化学的、快楽的もしくは加工的特性を改良する可能性があり、または薬学的もしくは追加的栄養成分として作用する可能性がある、他の場合による成分を更に含んでいてもよい。そのような場合による成分の多くは、他の栄養組成物中での使用が知られている、あるいはその使用に適しており、そのような場合による成分が経口投与に安全で効果的であり、選択された製品形態中の必須成分および他の成分と適合性があることが前提であれば、本明細書に記載された栄養組成物中で用いられてもよい。

そのような場合による成分の非限定的例としては、防腐剤、抗酸化剤、乳化剤、緩衝剤、フルクトオリゴ糖、ピコリン酸クロム、医薬活性剤、本明細書に記載された追加的栄養素、着色剤、香味剤、増粘剤および安定化剤などが挙げられる。

組成物は、ビタミンまたは関連の栄養素を更に含んでいてもよく、その非限定的例としては、ビタミンＡ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＫ、チアミン、リボフラビン、ピリドキシン、ビタミンＢ１２、カロテノイド、ナイアシン、葉酸、パントテン酸、ビオチン、ビタミンＣ、コリン、イノシトール、これらの塩および誘導体、ならびにそれらの組み合わせが挙げられる。

組成物は、ミネラルを更に含んでいてもよく、その非限定的例としては、リン、マグネシウム、カルシウム、鉄、亜鉛、マンガン、銅、ナトリウム、カリウム、モリブデン、クロム、セレン、塩素およびこれらの組み合わせが挙げられる。

組成物は、１種または複数の調味料またはマスキング剤を含んでいてもよい。好適な調味料またはマスキング剤としては、天然および人工甘味料、塩化ナトリウムなどのナトリウム供給源、ならびにヒドロコロイド、例えばグアーガム、キサンタンガム、カラギーナン、ゲランガム、アラビアガムおよびこれらの組み合わせが挙げられる。

（製造方法）
ＨＭＢ含有栄養液体組成物は、乳性栄養エマルジョンなどのエマルジョンをはじめとし、栄養液を製造するための任意の公知方法、あるいは好適な方法により製造してもよい。

好適な一製造工程において、栄養液は、油中蛋白質（ＰＩＦ）スラリー、炭水化物−ミネラル（ＣＨＯ−ＭＩＮ）スラリーおよび水中蛋白質（ＰＩＷ）スラリーをはじめとする少なくとも３種の別個のスラリーを用いて調製される。ＰＩＦスラリーは、選択された油（例えば、キャノーラ油、コーン油など）を加熱および混合し、その後、連続して加熱および撹拌しながら乳化剤（例えば、レシチン）、脂溶性ビタミンおよび総蛋白質の一部（例えば、乳性蛋白質濃縮物など）を添加することにより形成される。ＣＨＯ−ＭＩＮスラリーは、加熱および撹拌しながら、水にミネラル（例えば、クエン酸カリウム、リン酸二カリウム、クエン酸ナトリウムなど）、微量および超微量ミネラル（ＴＭ／ＵＴＭプレミックス）、増粘剤または懸濁剤（例えば、Ａｖｉｃｅｌ、ゲラン、カラギーナン）、ならびにＨＭＢを添加することにより形成される。得られたＣＨＯ−ＭＩＮスラリーは、１０分間連続して加熱および撹拌した後、追加的ミネラル（例えば、塩化カリウム、炭酸マグネシウム、ヨウ化カリウムなど）および／または炭水化物（例えば、フルクトオリゴ糖、スクロース、コーンシロップなど）を添加する。その後、ＰＩＷスラリーが、加熱および撹拌しながら残りの蛋白質（例えば、カゼインナトリウム、大豆蛋白質濃縮物など）を水中に混合することにより形成される。

その後、得られたスラリーを加熱撹拌しながら一緒にブレンドして、ｐＨを所望の範囲、典型的には６．６−７．０に調整し、その後、組成物を高温短時間（ＨＴＳＴ）処理に供して組成物を加熱処理し、乳化および均質化し、その後、放冷する。水溶性ビタミンおよびアスコルビン酸を添加し、必要に応じてｐＨを再度、所望の範囲に調整し、香味剤を添加し、水を添加して所望の総固形水準を実現する。その後、組成物を無菌包装して、無菌包装栄養エマルジョンを形成させるまたは組成物をレトルトの安定した容器に添加し、その後、レトルト殺菌に供して、レトルト殺菌栄養エマルジョンを形成させる。

栄養エマルジョンの製造工程を、本開示の趣旨および範囲を逸脱せずに本明細書に示されたもの以外の方法で実施してもよい。それゆえ本実施形態は、全ての点で例示的および非制限的とみなすべきであり、その全ての変更および均等物もまた本開示の説明に含まれる。

噴霧乾燥された栄養粉末などの栄養固体は、噴霧乾燥された栄養粉末を製造および配合させるのに適した任意の公知の技術、もしくは効果的な技術により調製されてもよい。

噴霧乾燥ステップは、同様に栄養粉末の製造における使用について公知の、あるいは使用に適した、任意の噴霧乾燥技術を含んでいてもよい。多くの異なる噴霧乾燥法および技術が、栄養分野での使用に関して公知であり、その全てが、本明細書の噴霧乾燥栄養粉末の製造における使用に適している。

噴霧乾燥された栄養粉末を調製する一方法は、ＨＭＢ、ならびに場合によって蛋白質、炭水化物および脂肪を含む水性スラリーまたは液体を形成させて均質化し、その後、スラリーまたは液体を噴霧乾燥して噴霧乾燥された栄養粉末を製造することを含む。方法は、噴霧乾燥のステップ、ドライミックスのステップ、あるいは本明細書に記載された成分のいずれか１種または複数をはじめとする追加の栄養成分を、噴霧乾燥された栄養粉末に添加するステップを更に含んでいてもよい。

製造方法は、好ましくはカルシウムＨＭＢを配合させ、最も典型的には方法で使用されるＨＭＢ供給源としてカルシウムＨＭＢ一水和物を配合させる。

（使用方法）
本明細書に記載されたＨＭＢを含む組成物は、一般には認知を改善するために、または特定の認知疾患もしくは状態、例えば高齢期成人における神経変性疾患に伴う認知疾患を治療するために、一般には個体に、具体的には成人、高齢期成人、幼児、児童および青年などに、投与されてもよい。個体は、一般的に健康であってもよく、または認知機能低下、認知欠陥（軽度認知障害（ＭＣＩ）など）、記憶の欠落、一般的な回想力の問題、認知障害または神経変性疾患、例えばアルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、認知症、筋委縮性側索硬化症、卒中、および統合失調症に罹患していてもよい（または罹患するリスクがあってもよい。）。具体的には幼児、児童および青年に関して、ＨＭＢ含有組成物は、全般的認知機能および脳の発達を改善し得る。

神経機能は、一般に年齢と共に低下するため、ＨＭＢ含有栄養組成物は、実質的に神経機能の向上により利益を受ける可能性のある高齢期成人などの個体において、神経機能を向上させる。具体的には神経機能不全に罹患した高齢の成人は、ＨＭＢ含有組成物から特に利益を受け得る。

特定の実施形態において、ＨＭＢ含有組成物を受ける個体は、認知障害を有する高齢期成人もしくはこれを発症するリスクのある高齢期成人、または認知機能低下もしくは認知欠陥（ＭＣＩなど）を発症するリスクのある高齢期成人であってもよい。認知機能低下または認知障害もしくは欠陥を発症する「リスクのある」個体としては、ＡＰＯＥ−ｅ４と呼ばれる遺伝子の特定の形態、高血圧、糖尿病、鬱病、血圧の上昇、高コレステロール、ならびに／または年齢による認知機能低下、認知欠陥、および／もしくは認知障害／疾患の家族歴を有する個体が挙げられる。

ＨＭＢ含有組成物を用いる本明細書に記載された方法は、最も典型的には約１ヶ月から約１０年間、例えば約１ヶ月から約１年間、更に約１ヶ月から約６ヶ月間の長期間にわたる毎日の使用の後の、そのような組成物を投与された個体に：（１）成人および高齢期成人の神経機能の支持および維持；（２）成人および高齢期成人における神経機能の向上；（３）成人および高齢期成人への神経保護；（４）成人および高齢期成人における神経変性疾患に伴う認知疾患の予防／治療；（５）成人および高齢期成人における認知機能低下または認知欠陥の予防／治療；ならびに（６）幼児、児童および青年における認知能力の改善、のうちの１つまたは複数を付与することを更に対象とする。一実施形態において、ＨＭＢ含有組成物は少なくとも１年間、毎日投与される。

栄養製品は、必要に応じて経口投与されて、所望のレベルの栄養を、最も典型的には１日１回から２回として、１日に１回または２回またはそれを超える分割投与で、例えば典型的には約１００から約３００ｍｌ、例えば約１５０から約２５０ｍｌ、例えば約１９０ｍｌから約２４０ｍｌの範囲内の分量で提供してもよい。

以下の実施例は、本開示のＨＭＢ含有栄養組成物および方法の具体的実施形態および／または特色を例示する。実施例は、本開示の趣旨および範囲を逸脱せずに多くの変更が可能であるため、例示を目的として示されているに過ぎず、本開示の限定とみなしてはならない。例示された量は全て、別段の記載がない限り、組成物の総重量に基づく重量％である。

例示されたＨＭＢ含有組成物は、栄養エマルジョンおよび噴霧乾燥された栄養粉末を調製するための栄養業界で周知の製造方法により調製された栄養製品である。

［実施例１−５］
実施例１−５は、本開示の方法での使用に適した噴霧乾燥された栄養ＨＭＢ含有粉末を示し、その成分を、以下の表に列挙する。これらの製品は、別個のバッチで噴霧乾燥法により調製され、使用前に水で所望の標的成分濃度に再構成される。成分量は全て、別段の記載がない限り、製品の１０００ｋｇバッチあたりのｋｇとして列挙している。

［実施例６−１０］
実施例６−１０は本開示のＨＭＢ含有栄養エマルジョン実施形態を示し、その成分を、以下の表に列挙する。量は全て、別段の記載がない限り、製品の１０００ｋｇバッチあたりのｋｇとして列挙している。

［実施例１１］
この実施例では、ＨＭＢの外観および脳間質液中のその濃度の時間推移が、ＨＭＢの経口投与後に分析された。

最初、体重４００−５００ｇのスプラグー・ドゥーリーラット（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ，Ｆｒａｎｃｅ）が、規則的な１２時間明／暗周期計画の下、一定の室温（２２±２℃）および湿度４５−５５％のケージで飼育された。飼料および水は、自由に摂取された。動物およびそのケアを含む手順は、Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ（ＲＤ ２１０１−２００５，８６／６０９／ＣＥＥ）に関する国際法およびＥＣ政策を遵守する施設のガイドラインに適合させながら実施された。

ガイドカニューレが、ラットの定位アトラスに記載された座標で、各麻酔ラットの海馬領域に定位的に挿入された。ラットは、少なくとも３日間、手術から回復させた。実験の初日に、脳の微量透析プローブ（ＭＤ２２０４、ＢＲ−４、４ｍｍ膜、ＢＡＳｉ， Ｗｅｓｔ Ｌａｆａｙｅｔｔｅ， Ｉｎｄｉａｎａから入手可能）が、各ラットのガイドカニューレ内に挿入された。プローブに、リンガー液を２μｌ／分の一定速度で灌流した（ａＣＦＳ Ｈａｒｖａｒｄ装置， ＃５９７３１６）。ラットは、比較的自由に運動できる空間のあるケージに放置された。透析試料が、２０分ごとに自動で回収された。ＨＭＢのボーラス用量（２５０ｍｇ／ｋｇ体重）が、実験開始の１００分後に強制経口投与により与えられて、試料採取が更に１６０−２２０分間継続された。

ＨＭＢが、ＵＰＬＣ−ＭＳを用いて測定された。具体的にはＣＳＦ中の３０−４０μｌの試料が、０．２μｍナイロンフィルターにより精密ろ過され、同量の水で希釈され、その後、ＵＰＬＣ−ＴＱＤ（Ａｃｕｉｔｙ−ＴＱＤ ｓｙｓｔｅｍ、Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｍｉｌｆｏｒｄ， Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓから入手可能）内に注入された。ＢＥＨ Ｈｉｌｌｉｃカラム１．７μｍ；２．１×１５０ｍｍが用いられ、Ｈ_２Ｏ：ＭｅＣＮ ０．１％ギ酸からなる勾配を利用されて、ＨＭＢが分析された。質量分析計は、Ｉｏｎ Ｍｏｄｅ ＥＳ＋に設定された。

ラット２匹が、異なる日にアッセイされた。強制経口投与は、分画５で実施された。図１に示す通り、ＨＭＢは、投与後４０分目にラット１の脳に認められ（分画７）、その後、急速に増加した。分画は、強制経口投与後２．５時間を超えるまで採取された。その時点で、ＨＭＢ濃度レベルは、減少していなかった。測定されたＨＭＢの最大濃度は、１０．５ｐｐｍであった。

図２は、ラット２の結果を示す。この場合、ＨＭＢ濃度の減少を検出するために、分画がより長期間採取された。ラット２の脳微量透析中のＨＭＢ濃度の時間推移は、ラット１と類似のパターンに従った。ＨＭＢは、最初、分画７で検出され、投与後２時間２０分の間（分画１２−１３）に急速に増加し、そこで最大濃度（４ｐｐｍ超）に達した。ＨＭＢ濃度レベルはその後減少したが、実験の終了時に（強制経口投与後の３．５時間超）基底レベルには達しなかった。

結果によれば、経口投与されたＨＭＢは、脳の間質液中に認められ、そのことは、ＨＭＢが、相対的に親水性であるにもかかわらず、ラットの微量透析に実験モデルにおいて血液脳関門を通過し得たことを意味している。

［実施例１２］
この実施例では、神経細胞（Ｎｅｕｒｏ ２Ａ）における蛋白質合成および細胞増殖に関連するシグナル伝達カスケードの調節に及ぼすＨＭＢの影響が、分析された。特に神経発達および可塑性を誘導し、そして神経保護を付与する栄養成分としてのＨＭＢの影響が、分析された。

神経発達およびシナプス伝達は、細胞外および細胞内の状態を変化させることにより影響を受ける可塑プロセスである。プロテインキナーゼは、これらの現象の調節にとって不可欠であり、それらのいくつか（例えば、有糸分裂活性化プロテインキナーゼ（ＥＲＫ）、ホスホイノシチド−３’キナーゼ／ＡＫＴ（ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ）およびカルシウム／カルモジュリン依存性キナーゼ（ＣａＭＫ））は、神経細胞の発達およびシナプス可塑性の両方において、確立された役割を有する。近年になり、哺乳類ラパマイシン標的蛋白質（ｍＴＯＲ）であるセリン／トレオニンプロテインキナーゼへの関心が高まりつつある。事実、ｍＴＯＲは、神経細胞の発達の異なる段階の調節物質として、ならびに軸索ガイダンス樹状突起棘の形態発生、および長期シナプス可塑性の複数の形態において、不可欠の役割を有する。

筋細胞エンハンサー因子２（ＭＥＦ２）も、神経細胞の存続において重要な役割を担う。神経細胞の存続においてＭＥＦ２活性を調節する経路は、ホルモン／因子または膜脱分極のいずれかによる刺激時のｐ３８ ＭＡＰＫ（ＥＲＫ）およびＰＩ３−ＡＫＴリン酸化を含む。更に神経変性疾患においては、マクロオートファジーが、ＭＥＦ２変性またはｍＴＯＲ経路の抑制のいずれかにより強く誘導され、神経細胞死をもたらす。ｍＴＯＲがＭＥＦ２を調節するメカニズムは未知であるが、複数の観察から、ｍＴＯＲＣ２およびＡＫＴ／ＰＫＢによるシグナル伝達の組み合わせが、ＭＥＦ２が惹起した神経細胞存続機構に必要となり得ることが指摘された。

この実施例におけるトランスフェクション実験において、Ｎｅｕｒｏ−２Ａ細胞が、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で増殖されて８０−９０％コンフルエンスで用いられた。細胞は、ファイアフライルシフェラーゼをコードするＤＮＡの配列の前にＭＥＦ２Ｄが結合したＤＮＡ配列をタンデムに４コピー含むプラスミドｐＧＬ３−４×ＭＥＦに、５時間暴露された。エフェクターが、培地に１８時間添加され、ルシフェラーゼ活性が決定された。シグナル伝達因子の阻害の試験では、ホスファチジルイノシトール３キナーゼ（ＬＹ２９４００２）、ＥＲＫ １／２（ＰＤ９８０５９）およびｍＴＯＲＣ１活性化の阻害剤（ラパマイシン）が、細胞に添加された。

Ｎｅｕｒｏ−２Ａ細胞中の蛋白質合成速度に及ぼすＨＭＢの影響が、細胞蛋白質プールへの［３Ｈ］−チロシン取り込みを測定することにより決定された。ｍＴＯＲおよびアップ／ダウン−プロテインキナーゼ（ｕｐ／ｄｏｗｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅｓ）（Ａｋｔ、ＥＲＫ １／２）のリン酸化状態が、ウェスタンブロットにより決定された。細胞増殖／生存能が、ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾル−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）比色アッセイで決定された。

データは、平均±ＳＥＭとして表した。スチューデントｔ検定が、結果を解析するために利用された。

図３Ａ−図３Ｃは、Ｎｅｕｒｏ ２Ａ細胞中のｍＴＯＲおよび上流の調節物質のリン酸化に及ぼすＨＭＢの影響を示す。上記の細胞培養条件の下で、ＨＭＢは、ｍＴＯＲのリン酸化を著しく増加させた（図３Ａ）。更にＨＭＢは、この細胞株において、哺乳類細胞のｍＴＯＲシグナル伝達経路の２つの主な上流調節物質であるＡｋｔ（図３Ｃ）およびＥＲＫ １／２（図３Ｂ）のリン酸化状態を増加させた。その上、ＨＭＢにより誘導されたｍＴＯＲ活性化が増加する程、蛋白質合成の増加が促進された（２０％ＨＭＢ 対対照、図４）。

図５Ａは、Ｎｅｕｒｏ ２ＡにおけるＭＥＦ２転写因子の発現に対するＨＭＢの影響を示す。培地へのＨＭＢの補充は、ＭＥＦ２−依存性転写ルシフェラーゼ活性の著しい上昇をもたらした。ＭＥＦ２転写因子に及ぼすＬＹ２９４００２、ＰＤ９８０５９およびラパマイシン阻害剤の影響も、図５Ｂ−図５Ｄに示す。ＬＹ２９４００２またはＰＤ９８０５９のいずれかは、ＨＭＢを介したＭＥＦ２の増加を全体的に遮断した。しかしラパマイシンは、ＨＭＢによるＭＥＦ２発現への影響を有さなかった。ＬＹ２９４００２およびＰＤ９８０５９は、ｍＴＯＲの上流で作用して、発現を遮断する。これは、ｍＴＯＲ活性の全てではないにしろほとんどを抑制する。これに対してラパマイシンは、ｍＴＯＲ基質の相互作用にアロステリックに影響を及ぼし、ｍＴＯＲＣ１複合体により仲介されるｍＴＯＲ活性のサブセットのみを選択的に遮断し、ｍＴＯＲＣ２により仲介されるそれ以外のサブセットは遮断しない。これは、ラパマイシンは神経細胞の存続、樹状突起の成長および複雑度、またはＰＩ３／ＡＫＴ活性化が目標とする活動電位を妨害しないという知見と一致している。上記データから、Ｒａｓ／ＥＲＫおよびＰＩ３／ＡＫＴ経路が、両者ともＨＭＢを介したＭＥＦ２活性に必要であり、Ｒａｓ／ＥＲＫおよびＰＩ３／ＡＫＴ経路の下流エフェクターとしてＭＥＦ２を配置させ得ることを示している。

図６は、神経細胞増殖および生存能に及ぼすＨＭＢの影響を示す。図６に示す通り、神経細胞増殖および生存能は、ＨＭＢにより刺激された。

Ｎｅｕｒｏ ２Ａ細胞を用いたこの実施例のデータから、ＨＭＢが、重要なシグナル伝達経路を調整し得るエフェクターとして、例えば蛋白質合成および増殖などの重要な基本的細胞プロセスを調節するｍＴＯＲラプター／リクター−ＭＥＦ２として作用することが実証される。したがってＨＭＢは、神経細胞シグナル伝達経路を調節することにより神経系の発達ならびに神経変性疾患の管理を支援し得る。

［実施例１３］
この実施例では、ラットの不安／鬱行動に及ぼすＨＭＢの影響を分析した。

この実施例は、Ｐｏｒｓｏｌｔら， １９７８により記載された鬱病強制水泳検査（ＦＳＴ）に基づく。実験を開始するために、ラットが、２５℃の水を３０ｃｍ含む垂直シリンダー（高さ４０ｃｍ；口径２１．５ｃｍ）の内部に個別に１５分間入れられた（即ち、予備水泳）。この予備水泳期間の後、ラットが取り出され、加熱した容器内で乾燥された後、ケージに戻された。その後、２５０ｍｇ／ｋｇ体重または５００ｍｇ／ｋｇ体重のいずれかの用量のＨＭＢが、ラットに経口投与された。

２４時間後に、ラットが再度シリンダーに５分間入れて検査水泳に供され、合計無動時間および逃避行動が評価された。検査水泳がビデオ撮影され、次に、無動、即ち運動が観察されなくなり、ラットが「死体」の姿勢（即ち、頭を上げ、尾を下げ、前脚をわずかに丸く曲げ、後脚を下に向ける。）を取った時点までの時間について評価された。検査水泳４時間前および１時間前に、２５０ｍｇ／ｋｇ体重または５００ｍｇ／ｋｇ体重のいずれかの各用量のＨＭＢが、ラットに経口投与された。

図７に示す通り、高用量のＨＭＢは、無動になるまでの時間を増加させた（ｐ＝０．０７）。このデータから、ＨＭＢの投与が抗鬱様効果を有することが示される。

Claims (9)

1. 高齢期成人における認知疾患を治療するための医薬を製造するための、β−ヒドロキシ−β−メチルブチラートの使用。
2. 幼児、児童または青年における認知機能を治療するための医薬を製造するための、β−ヒドロキシ−β−メチルブチラートの使用。
3. β−ヒドロキシ−β−メチルブチラートを毎日投与される、請求項１または２に記載の使用。
4. β−ヒドロキシ−β−メチルブチラートが、０．１ｇ／日から１０ｇ／日の用量、または０．１ｇ／日から５．０ｇ／日の用量で投与される、請求項３に記載の使用。
5. β−ヒドロキシ−β−メチルブチラートが、少なくとも１年間投与される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用。
6. β−ヒドロキシ−β−メチルブチラートが、栄養粉末、栄養エマルジョン、および透明な液体からなる群より選択される形態である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用。
7. 高齢期成人が、認知機能低下に罹患している、または高齢期成人が、神経機能不全に罹患している、請求項１および３〜６のいずれか一項に記載の使用。
8. 高齢期成人が、認知欠陥、記憶の欠落または認知障害に罹患している、請求項１および３〜６のいずれか一項に記載の使用。
9. β−ヒドロキシ−β−メチルブチラートが、カルシウムβ−ヒドロキシ−β−メチルブチラートである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の使用。

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