JP6340320B2

JP6340320B2 - 変形性関節症の治療において使用されるヘルパー依存性アデノウイルスベクターを含む医薬組成物

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Publication number: JP6340320B2
Application number: JP2014555328A
Authority: JP
Inventors: ブレンダンリー; キリアングーセ; チェチャオルアン
Original assignee: Baylor College of Medicine
Current assignee: Baylor College of Medicine
Priority date: 2012-02-02
Filing date: 2013-01-23
Publication date: 2018-06-06
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Description

本発明は、遺伝子工学の分野に関し、滑膜細胞中でのヒトまたは哺乳動物インターロイキン−１受容体アンタゴニスト（Ｉｌ−１Ｒａ）の長期遺伝子発現によるヒトまたは哺乳動物関節における変形性関節症の治療において使用されるヘルパー依存性アデノウイルスベクターを含む、ヒトまたは哺乳動物関節における変形性関節症の治療または予防のための医薬組成物を提供する。

変形性関節症（ＯＡ）は、ヒトまたは哺乳動物関節において生じる退行変性関節疾患であり、重度の経済的および医学的問題の一因である（非特許文献１；非特許文献２）。軟骨は、関節中の骨端を覆う頑丈な結合組織である。軟骨は、硬骨間で比較的無摩擦で高度に潤滑な表面を提供し、円滑な動作を可能とする。ＯＡ発症の間、軟骨は、異常または過剰な摩耗に起因して一部または全部損失し、骨端の露出に導き、骨端が互いに擦れ、そのことは炎症、疼痛、腫れまたは運動機能の損失をもたらす。これまで、ＯＡに導く初期の軟骨損失についての詳細な理由は不明であるが、罹患率と、年齢、肥満および関節酷使、例えば、過剰の競技活動との間に強力な相関が存在する。したがって、ＯＡは、ヒトだけでなく多くの哺乳動物、特に競走および障害飛越に参加するウマにおいても主要な問題である。

特にウマにおいて、ＯＡは、巨大な経済的影響を有する深刻な問題を構成する。ウマは、その生涯のほとんどを立って過ごし、競技目的に使用されるウマはさらに過剰な訓練を受ける。結果的に、競技馬の関節のほとんどは重度に酷使され、そのことは跛行をもたらすことが多い。跛行は、ウマが競走にも障害飛越にも参加することができない症例の約７０％を占める。この症例の約６０％は、ＯＡと直接結びつけることができる（非特許文献３）。したがって、ＯＡは、ウマが競走競技にも興行にも参加不能となる最も一般的な理由である。

治癒的治療は、ウマについても、ヒトについても、任意の他の哺乳動物種についてもＯＡに現在利用可能でない。医学的治療は、大部分、擦り減った軟骨を定着させるのではなく鎮痛薬を使用して症状の緩和を目的とする。鎮痛治療は、通常、ステロイドおよび非ステロイド抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）を含み、それは数十年間、ＯＡの治療において効力を示している。しかしながら、これらの薬物は関節炎症を抑制し得る一方、それらの多くは、ＯＡ発症の根本プロセスをさらに悪化させる軟骨に対する有害効果を有することが公知である。例えば、関節の粘弾性および潤滑性を回復させるヒアルロン酸も広く使用されている。さらに、関節中または筋肉内に注射される多硫化グルコサミノグリカンならびに経口投与されるグルコサミンおよび硫酸コンドロイチンは、いくらかの効力を示しているが、それらの作用機序は完全に理解されていない。したがって、現在使用される治療法は、ＯＡの治療において限定された効力を有するにすぎず、それらの成功は、症例の重症度に依存することが多い。さらに、これらの薬物は、高頻度で投与しなければならず、さらに互いとの組み合わせで投与しなければならないこともある。しかしながら、関節中への高頻度の薬物注射は、労力を要し、感染のリスクを有し、ウマにストレスを惹起させ、コストがかかる。さらに、手術は、一般に、ウマにおいて低い効力を示しており、典型的には、重度の進行期対象においてのみ実施される。その結果、同時に長期においてコスト効率的でもあるより有効な持続治療のための明らかな、依然として満たされていない医学的要求が存在する。

ＯＡの間、インターロイキン−１（Ｉｌ−１）は、炎症の中心的なメディエーターとして機能する（非特許文献４）。さらに、Ｉｌ−１は、軟骨によるマトリックス合成を強力に阻害し、高濃度において、マトリックス分解をトリガーする（非特許文献５）。滑膜炎症に対するＩｌ−１の効果を中和するため、インターロイキン−１受容体アンタゴニスト（Ｉｌ−１Ｒａ）による治療は、罹患変形性関節症関節の治療のための有望な概念を構成する（非特許文献５；非特許文献６）。核酸レベルについて、Ｉｌ−１Ｒａは、哺乳動物種の中でかなり保存されている。例えば、ヒトＩｌ−１Ｒａ（アクセッション番号ＮＭ＿１７３８４２）のｃＤＮＡ配列は、ネズミバリアント（アクセッション番号ＮＭ＿０３１１６７）と８２％の相同性を、ウマバリアント（アクセッション番号ＮＭ＿００１０８２５２５）と８４％の相同性を、イヌバリアント（アクセッション番号ΝΜ＿００１００３０９６）と８４％の相同性を、ウサギバリアント（アクセッション番号ＮＭ＿００１０８２７７０）と８４％の相同性を、ウシバリアント（アクセッション番号ＮＭ＿１７４３５７）と８２％の相同性を共有する。

関節炎の治療に遺伝子療法を使用する基本的な概念は、十分確立されている（非特許文献７）。直近の従来技術において、アデノウイルス媒介遺伝子導入を使用するウマインターロイキン−１受容体アンタゴニスト遺伝子の生体内（in vivo）送達によるウマ変形性関節症の治療が記載されている（非特許文献８）。ウマＩｌ−１ＲａＤＮＡの発現に使用されるアデノウイルスベクターは第１世代アデノウイルスベクターであり、それは生物学的に活性なウマＩｌ−１Ｒａを産生することが示された。この試験におけるウマの臨床試験は、跛行の程度により計測されるとおりＩｌ−１Ｒａの治療的発現が関節痛の徴候を有意に減少させることを示したが、生物学的に活性なウマＩｌ−１Ｒａトランス遺伝子の送達および発現の効果は短期間にすぎなかった。Ｉｌ−１Ｒａを担持する種々の量のベクターの関節内注射によるウマＩｌ−１Ｒａによるウマの治療から既に３０日後、関節中のウマＩｌ−１Ｒａの発現は通常レベルに降下した。同様の結果は、関節疾患の治療に使用されるインターロイキン−１受容体アンタゴニストをコードするアデノウイルス粒子を記載する特許文献１においても、検出された。使用されるアデノウイルス粒子は、第１世代アデノウイルスベクターであった。

マウスにおける多関節コラーゲン誘導性関節炎（ＣＩＡ）モデルにおける構成的なサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターを有するＣ３ヒト免疫不全ウイルス／転写のトランス活性化因子［Ｃ３−Ｔａｔ／ＨＩＶ］からなる２成分発現系が記載されている（非特許文献９）。この文献は、具体的には、慢性進行性自己免疫疾患として関節リウマチ（ＲＡ）を指す。これは、コラーゲン誘導性関節炎（ＣＩＡ）を、高全身用量のＩｌ−１Ｒａによりまたは生体外（ex vivo）アプローチを使用するＩｌ−１Ｒａの局所産生により阻害することができることを示す。

ヘルパー依存性アデノウイルス（ＨＤＡｄ）は、ガットレスまたは大容量アデノウイルスとしても公知であり、最新世代のアデノウイルスベクターである（非特許文献１０；非特許文献１１；非特許文献１２）。これらのベクターは、全てのウイルス配列を欠き、より免疫原性の第１世代アデノウイルスとは対照的に種々の組織中での長期遺伝子発現（例えば、肝臓中で７年間）を媒介し得る（非特許文献１３）。しかしながら、関節中でのヘルパー依存性アデノウイルス媒介遺伝子発現の長寿命は、これまで評価されなかった。

さらなるヘルパー依存性アデノウイルスベクター系およびそれらの世代も記載されている（非特許文献１４、非特許文献１５）。

特許文献２は、抗炎症性ポリペプチド、リボザイムまたはアンチセンスＲＮＡ分子をコードする遺伝子に作動可能に連結している発現制御配列を有する組換えアデノウイルスベクターを記載および特許請求している。関節への治療有効量の組換え第１世代アデノウイルスベクターの投与は、治療対象の関節中の炎症応答の低減をもたらした。ここでも、他の試験におけるように、Ｉｌ−１Ｒａの長期発現は限定された。

米国特許出願第２００３／００９１５３６Ａ１号明細書米国特許第５，７４７，０７２Ａ号明細書

Matthews, G. L., and Hunter, D. J.（２０１１）．Emerging drugs for osteoarthritis. Expert Opin. Emerging Drugs １−１３ Brooks PM. Impact of osteoarthritis on individuals and society：how much disability？Social consequences and health economic implications．Curr Opin Rheumatol ２００２；１４：５７３−５７７ Caron JP, Genovese, RL. Principals and practices of joint disease treatment. In：Ross MW And Dyson S. eds. Diagnosis and Management of Lameness in the Horse. 1st ed. Philadelphia：Saunders, ２００３：７４６−７６４ Dinarello CA. Interleukin-1 family. In：Thomson AW. Lotz MT（eds）. The Cytokine Handbook. Academic Press：London，２００３，ｐｐ６４３−６６８ Evans, C. H., Gouze. J. N., Gouze, E., Robbine, P. D., and Ghivizzani, S. C.（２００４）, Osteoarthritis gene therapy. Gene Ther １１，３７９−３８９ Caron JP等、Chondroprotective effect of intraarticular injections of interleukin-1 receptor antagonist in experimental osteoarthritis. Suppression of collagenase-1 expression. Arthritis Rheum １９９６；３９：１５３５−１５４４ Evans CH, Robbins PD, Gene therapy for arthritis, In：Wolff JA（ed.）. Gene Therapeutics：Methods and Applications of Direct Gene Transferm. Birkhauser：Boston，１９９４，ｐｐ３２０−３４３ D. D. Frisbie，S. C. Chivizzani, P. D. Robbins, C. H. Evans, C. W. Mcllwraith, Gene Ther ９，１２−２０（２００２） BAKKER A C ET AL："C3-Tan/HIV-regulated intraarticular human interleukin-1 receptor antagonist gene therapy results in efficient inhibition of collagen-induced arthritis superior to cytomegalovirus-regulated expression of the same transgene.", ARTHRITIS AND RHEUMATISM JUN ２００２ LNKD-PUBMED：１２１１５１９９，vol. ４６，no. ６，June ２００２（2002-6）, pages１６６１−１６７０ Mitani, K., Graham, F. L., Caskey, C. T. & Kochanek, S. Rescue, propagation, and partial purification of a helper virus-dependent adenovirus vector, Proc Natl Acad Sci USA ９２，３８５４−３８５８（１９９５） Parks, R. J.等 A Helper-dependent adenovirus vector system:removal of helper virus by Cre-mediated excision of the viral packaging signal. Proc Natl Acad Sci USA ９３，１３５６５−１３５７０（１９９６） Parks, R. J. Improvements in adenoviral vector technology: overcoming barriers for gene therapy. Clin. Genet. ５８，１−１１（２０００） Brunetti-Pierri, N.等 Multi-Year Transgene Expression in Nonhuman Primates Following Hepatic Transduction with Helper-Dependent Adenoviral Vectors. American Society of Gene & Cell Therapy, Annual Meeting ２０１１ Molecular Therapy Volume １９，Supplement １，May ２０１１ PALMER DONNA ET AL："Improved system for helper-dependent adenoviral vector production." MOLECULAR THERAPY: THE JOURNAL OF THE AMERICAN SOCIETY OF GENE THERAPY NOV ２００３ LNKD-PUBMED: １４５９９８１９，vol. ８，no. ５，November ２００３（２００３−１１），pages８４６−８５２ TOILEATTA GABRIELLE ET AL: "Generation of helper-dependent adenoviral vectors by homologous recombination." MOLECULAR THERAPY: THE JOURNAL OF THE AMERICAN SOCIETY OF GENE THERAPY FEB ２００２ LNDK-PUBMED: １１８２９５２８，vol. ５，no. ２，February ２００２（２００２−０２），pages２０４−２１０

したがって、本発明の課題は、変形性関節症の治療および予防のためのヒトまたは哺乳動物関節における滑膜細胞中での生物学的に活性な組換えインターロイキン−１受容体アンタゴニスト（Ｉｌ−１Ｒａ）の長期発現を可能とする改善された医薬組成物を提供することである。この課題の解決手段は、請求項１に特許請求される特徴部を有するヘルパー依存性アデノウイルスベクターを含む医薬組成物により提供される。本発明の好ましい実施形態は、従属請求項の主題である。

本発明によるヘルパー依存性アデノウイルスベクターを含む医薬組成物は、ヒトまたは哺乳動物インターロイキン−１受容体アンタゴニスト（Ｉｌ−１Ｒａ）をコードする核酸配列、左右逆方向末端反復（ＬＩＴＲおよびＲＩＴＲ）、アデノウイルスパッケージングシグナルおよび非ウイルス非コードスタッファー核酸配列を含有するヘルパー依存性アデノウイルスベクターをベースとする。さらに、ヒトまたは哺乳動物インターロイキン−１受容体アンタゴニスト（Ｉｌ−１Ｒａ）の遺伝子は、炎症誘導性プロモーターにより制御される。本発明において使用される好ましい炎症調節プロモーターは、ＮＦ−κＢプロモーター、インターロイキン６（Ｉｌ−６）プロモーター、インターロイキン−１（Ｉｌ−１）プロモーター、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）プロモーター、シクロオキシゲナーゼ２（ＣＯＸ−２）プロモーター、補体因子３（Ｃ３）プロモーター、血清アミロイドＡ３（ＳＡＡ３）プロモーター、またはマクロファージ炎症性タンパク質−１α（ＭＩＰ−１α）プロモーターである。プロモーター配列は、クローニングされたＩｌ−１Ｒａ遺伝子のリーディングフレームの上流に存在する。本発明による炎症調節プロモーターは、免疫刺激物質、例えば、グラム陰性細菌の細胞外膜の主要成分であるリポ多糖（ＬＰＳ）のレベルの増加により特異的に活性化される。変形性関節症の間、種々の免疫刺激物質およびサイトカインが放出され、高レベルのプロモーター活性化物質がもたらされる。１つの成分は、例えば、ＮＦ−κＢプロモーターを調節するＮＦ−κＢである。したがって、そのような変形性関節症特異的活性化物質の放出は、変形性関節症病態を治療または予防するためのヒトまたは哺乳動物の関節中での遺伝子発現の制御を可能とする。

免疫誘導性プロモーターの使用は、変形性関節症組織細胞中でのＩｌ−１Ｒａ遺伝子発現の特異的制御を提供する。疾患により冒された細胞のみがＩｌ−１Ｒａ遺伝子産物を発現および分泌する一方、冒されていない細胞はサイレントのままである。炎症依存性遺伝子発現のためのＮＦ−κＢ５−ＥＬＡＭプロモーターの使用が最も好ましい。しかしながら、変形性関節症組織中でのＩｌ−１Ｒａ遺伝子産物の特異的発現をもたらす任意の他の炎症依存性プロモーターを本発明に関連して使用することができる。

本発明において使用されるヘルパー依存性アデノウイルスベクターは、宿主中での免疫応答を最小化し、変形性関節症により冒された関節中でのヒトまたは哺乳動物Ｉｌ−１Ｒａの長期遺伝子発現を付与する。

より有効とするため、本発明のヘルパー依存性アデノウイルスベクターは、好ましくは、単回注射用量で変形性関節症対象の関節中に直接投与される。関節内注射後、Ｉｌ−１Ｒａの遺伝子は滑膜細胞、例えば、シノビオサイト（synoviocyte）に送達される。炎症により冒された滑膜細胞は、炎症誘導性プロモーター、例えば、ＮＦ−κＢプロモーターの制御下で組換えＩｌ−１Ｒａタンパク質の産生を開始する。次いで、多量のＩｌ−１Ｒａが関節腔中に分泌され、そこでＩｌ−１Ｒａがシノビオサイトまたは軟骨中に埋め込まれた細胞の表面上のインターロイキン−１受容体を遮断することにより炎症を阻害し、軟骨分解を停止させ得る。最も重要なことには、高局所濃度の組換えＩｌ−１Ｒａは、いかなる副作用も示さない。

したがって、以下の実験において示されるとおり、疼痛、炎症および軟骨分解は、本発明によるアデノウイルスベースの生物学的送達および発現系を使用して有効に阻害される。高局所および低全身濃度の治療タンパク質Ｉｌ−１Ｒａが達成され、ＯＡの治療における最大効力が副作用なしでまたは最小の副作用でもたらされる。本発明のヘルパー依存性アデノウイルスベクターを含有する細胞は組換えＩｌ−１Ｒａを少なくとも１年間という拡張された期間産生し得ることがさらに例示される。結果的に、公知の短期治療において要求された高頻度の関節注射に伴う医学的および経済的負担が顕著に低減される。特に、一般に使用されるステロイドの重大な長期副作用を、本発明のヘルパー依存性アデノウイルスベクターの使用により、その軟骨保護効果に起因して回避することができる。したがって、ＯＡ治療に伴う一般的な合併症は最小化され、関節健常は長期にわたり保存され、治療される動物またはヒトの持続的な健常改善がもたらされる。

さらに、本発明のベクターの炎症依存性Ｉｌ−１Ｒａ産生は、変形性関節症病態の発症の予防を可能とする。それというのも、本発明のアデノウイルスベクターにより感染された滑膜細胞は、ＮＦ−κＢ５−ＥＬＡＭプロモーターまたは任意の他の炎症依存性プロモーターを活性化させ得る免疫刺激物質の不存在下でサイレントのままであるためである。変形性関節症病態が始まる場合にのみ、炎症の結果としてプロモーターが活性化され、続いてＩｌ−１Ｒａが産生および分泌される。したがって、本発明のアデノウイルス送達および発現系を使用することにより、この機序は、変形性関節症の発症の早期予防を可能とする。

本発明のベクターの炎症依存性Ｉｌ−１Ｒａ産生は、例えば、変形性関節症病態が消散または消失した場合にＩｌ−１Ｒａがもはや産生されないことを確認するための安全特性として捉えることもできる。

本発明において使用されるヘルパー依存性アデノウイルスベクターは、左右逆方向末端反復（ＩＴＲ）およびアデノウイルスパッケージングシグナルを除き、いかなるウイルス配列も有さない。本発明において使用することができる好ましいヘルパー依存性アデノウイルスベクターは、PalmerおよびNg（Palmer, D., and Ng, P. （２００３）．Improved system for helper-dependent adenoviral vector production. Mol Ther ８，８４６−８５２．）ならびにToietta等（Toietta, G., Pastore, L., Cerullo, V., Finegold, M., Beaudet, A. L., and Lee, B.（２００２）．Generation of helper-dependent adenoviral vectors by homologous recombination. Mol Ther ５，２０４−２１０．）により開発されたヘルパーウイルスおよびヘルパー依存性骨格系をベースとするものである。本発明による好ましいアデノウイルス送達および発現系は、配列番号２もしくは配列番号３に記載の核酸配列、または生物学的に有効なその部分を含む。配列番号２の核酸配列は、ネズミヘルパー依存性アデノウイルスベクターを記載し、配列番号３に記載の配列は、ウマヘルパー依存性アデノウイルスベクターを記載し、両方ともネズミおよびウマＩｌ−１Ｒａ遺伝子をそれぞれ担持する。好ましくは、本発明の系は、配列番号２または配列番号３に記載のベクターと少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％の配列相同性を有する。

本発明に関連する「生物学的に有効な」は、アデノウイルス送達および発現系の遺伝子産物が滑膜炎症に対するＩｌ−１の効果を中和するための関節内活性を有するＩｌ−１Ｒａの全部または一部のポリペプチド配列を含むことを意味する。

本発明のヘルパー依存性アデノウイルスベクターは、好ましくは、炎症誘導性プロモーターにより制御されるＩｌ−１ＲａのｃＤＮＡ配列を含有する。Ｉｌ−１Ｒａは種特異的核酸配列を含有するが、アデノウイルスベクターは、任意の哺乳動物種またはヒトからのインターロイキン−１受容体アンタゴニスト（Ｉｌ−１Ｒａ）を発現し得る。好ましくは、クローニングに使用される哺乳動物インターロイキン−１受容体アンタゴニスト（Ｉｌ−１Ｒａ）のｃＤＮＡは、ネズミＩｌ−１Ｒａ、ウマＩｌ−１Ｒａ、イヌＩｌ−１Ｒａ、ネコＩｌ−１Ｒａ、ウサギＩｌ−１Ｒａ、ハムスターＩｌ−１Ｒａ、ウシＩｌ−１Ｒａ、ラクダＩｌ−１Ｒａまたは他の哺乳動物種のそれらのホモログからなる群から選択されるｃＤＮＡである。

滑膜細胞中のゲノムベクター配列の存在をモニタリングするため、本発明によるヘルパー依存性アデノウイルスベクターは、好ましくは、可視的または装置的に検出可能なマーカー遺伝子をさらに含む。好ましいマーカー遺伝子は、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）またはルシフェラーゼ酵素である。

一例として、本発明において使用されるネズミＩｌ−１Ｒａの核酸配列は、配列番号１に記載の配列表に示される。上記のとおり、任意の哺乳動物またはヒト種の生物学的に活性なＩｌ−１Ｒａタンパク質をもたらす任意の核酸配列を本発明に関連して使用することができる。さらに、同一アミノ酸、ポリペプチドまたはタンパク質をコードする保存核酸配列も本発明の範囲内である。従来技術において説明されるとおり、種々の種のＩｌ−１Ｒａ遺伝子は、互いの間で高い相同性を共有する。好ましくは、本発明によるヘルパー依存性アデノウイルスベクターは、配列番号１に示される核酸配列と少なくとも５０％、６０％、８０％、９０％の配列相同性を有するＩｌ−１Ｒａの核酸配列（例えば、ｃＤＮＡ）を含有する。本発明は、Ｉｌ１Ｒａの全長核酸配列の他にＩｌ−１Ｒａの生物学的に活性な核酸配列またはその断片も含む。

本発明は、ヒトまたは哺乳動物インターロイキン−１受容体アンタゴニスト（Ｉｌ−１Ｒａ）をコードする核酸配列、左右逆方向末端反復（ＬＩＴＲおよびＲＩＴＲ）、パッケージングシグナルおよび非ウイルス非コードスタッファー核酸配列を含有するヘルパー依存性アデノウイルスベクターを含む医薬組成物であって、滑膜細胞内でのヒトまたは哺乳動物インターロイキン−１受容体（Ｉｌ−１Ｒａ）遺伝子の発現は、炎症誘導性プロモーターにより調節される、変形性関節症の治療または予防のための医薬組成物をさらに含む。本発明に関連して使用される好ましいプロモーターは、ＮＦ−κＢプロモーター、インターロイキン６（Ｉｌ−６）プロモーター、インターロイキン−１（Ｉｌ−１）プロモーター、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）プロモーター、シクロオキシゲナーゼ２（ＣＯＸ−２）プロモーター、補体因子３（Ｃ３）プロモーター、血清アミロイドＡ３（ＳＡＡ３）プロモーター、マクロファージ炎症性タンパク質−１α（ＭＩＰ−１α）プロモーター、または上記のハイブリッド構築物である。

アデノウイルス送達および発現系が関節内投与された場合に関節中に特異的に局在することは、本発明の大きな利益である。最も重要なことに、計測可能な濃度のベクター配列を、本発明のアデノウイルス系により治療されたマウスの肝臓中で検出することができない。したがって、Ｉｌ−１Ｒａ濃度は、本発明のベクターが注射された関節中で最大であると予測される一方、顕著な副作用はいかなる他の臓器中でも予測されない。

本発明を下記の実施例においてさらに説明する。

（実施例）
高レベルのＩｌ−１Ｒａが、本発明のヘルパー依存性アデノウイルスベクター（ＨＤＡｄ）により感染された滑膜細胞の上清中で計測された。以下に示されるとおり、リポ多糖（ＬＰＳ）による炎症の誘導は、未誘導試料と比較してＩｌ−１Ｒａ濃度の大幅な増加に導いた。Ｉｌ−１Ｒａは、未感染試料（モック）中でも対照ベクター（ＨＤＡｄ−ＧＦＰ）により感染された試料中でも検出されなかった。実験は、ＨＤＡｄ−ｍＩｌ−１Ｒａにより感染された細胞が高レベルのＩｌ−１−ＲＡを産生し得ることを実証する。これは、Ｉｌ−１Ｒａがそれらの細胞から有効に分泌されること、および炎症病態がＮＦ−κＢ５−ＥＬＡＭプロモーターを活性化させ、Ｉｌ−１Ｒａレベルの増加に導くことをさらに示す。

本発明のヘルパー依存性アデノウイルスベクターの産生
図１は、本発明のＨＤＡｄベクターの遺伝子地図を示す。完全ベクター配列を配列番号２または配列番号３に示す。この２つのベクター間の唯一の差異は、ＧＱ−２０１がＩｌ−１Ｒａのウマバリアントを有する一方、ＨＤＡｄ−ｍＩｌ−ＲａがネズミＩｌ−１Ｒａバリアントを有することである。両方のベクターは、配列番号１によるＩｌ−１ＲａのｃＤＮＡの上流の炎症誘導性ＮＦ−κＢ５−ＥＬＡＭプロモーターならびに逆方向末端反復（ＩＴＲ）およびアデノウイルスパッケージングシグナルを含有する。ベクターを以下の方針に従って標準的な消化／ライゲーション反応によりクローニングした。ＮＦ−κＢ５−ＥＬＡＭプロモーターにより駆動されるルシフェラーゼｃＤＮＡを含有するプラスミドであるｐＮｉｆｔｙ−ｌｕｃ中のルシフェラーゼｃＤＮＡを、ＮｃｏＩおよびＮｈｅＩにより切り取り、ウマまたはネズミＩｌ−１ＲａについてのｃＤＮＡをこの位置中にライゲートした。ＮＦ−κＢ５−ＥＬＡＭプロモーター−ネズミＩｌ−１ＲａまたはＮＦ−κＢ５−ＥＬＡＭプロモーター−ウマＩｌ−１ＲａカセットをＮｏｔＩおよびＰａｃＩまたはＥｃｏＲＩおよびＰａｃＩにより切り取り、平滑末端化し、ｐＬＰＢＬシャトルプラスミド中に挿入し、それをＳａｌＩにより線形化および平滑末端化した。次いで、ＮＦ−κＢ５−ＥＬＡＭプロモーター−ネズミＩｌ−１ＲａまたはＮＦ−κＢ５−ＥＬＡＭプロモーター−ウマＩｌ−１ＲａカセットをＡｓｃＩにより切り取り、マルチプルクローニング部位の両側をフランキングし、ＡｓｃＩにより線形化されたｐΔ２８プラスミド（Toietta, G., Pastore, L., Cerullo, V., Finegold, M., Beadet, A. L., and Lee, B.（２００２）．Generation of helper-dependent adenoviral vectors by homologous recombination. Mol Ther ５，２０４−２１０．）中にライゲートし、ゲノムプラスミドｐΔ２８−ｍＩｌ−１ＲａおよびｐΔ２８−ｅｑＩｌ−１Ｒａを得た。これらのプラスミドをＰｍｅＩにより消化してベクターを線形化し、逆方向末端反復を遊離させ、細菌耐性遺伝子を切り取った。ヘルパーウイルスＡｄＮＧ１６３Ｒ−２および１１６の細胞工場を使用して以前に記載のとおりベクターをレスキューし、増幅させた（Palmer, D., and Ng, P.（２００３）．Improved system for helper-dependent adenoviral vector production. Mol Ther ８，８４６−８５２; Suzuki, M., Cela, R., Clarke, C., Bertin, T. K., Mourino, S., and Lee, B.（２０１０）．Large-scale production of high-quality helper-dependent adenoviral vectors using adherent cells in cell factories, Hum Gene Ther ２１，１２０−１２６．）。

ＨＤＡｄは、関節中での長期マーカー遺伝子発現を媒介する
長期遺伝子発現を関節中で最大１年間測定するため、マウスに本発明のヘルパー依存性アデノウイルスベクター（ＨＤＡｄ）、および比較のため、ホタルルシフェラーゼ（ｌｕｃ）をＣＭＶプロモーターの制御下で発現する第１世代アデノウイルス（Ａｄ）ベクターを関節内注射した。生体内（in vivo）生物発光イメージングを使用してｌｕｃ発現を経時的に追跡した。強力な初期ｌｕｃシグナルが両方のベクターの注射３日後に検出された（図２Ａ）。その後、発現は両方のベクターについて減少し、第１世代ベクターＡｄ−ｌｕｃについては１ヵ月後に検出不能であった（図２Ｂ）。しかしながら、ＨＤＡｄ−ｌｕｃルシフェラーゼ発現は、１０日目に安定し、３８０日間このレベルであった。

ＨＤＡｄは、関節内注射後に滑膜細胞をトランスデュースする
マウス関節中でのＨＤＡｄトランスダクションを詳細に評価するため、マウスにＬａｃＺ発現ＨＤＡｄを関節内注射した。強力なＬａｃＺ発現が滑膜中で見られたが、発現をコンドロサイト中で観察することはできなかった（図３）。本発明者らは、これらの動物の肝臓も分析してウイルスが関節から逃避するか否か、または注射の間に流出するか否かを評価した。最も重要なことに、バックグラウンドを超える検出可能なベクター濃度を定量的ＰＣＲにより計測することができなかった（データ示さず）。したがって、ベクターは、関節中で特異的に局在し、関節に残留し、そのことは最小の副作用を示唆するため変形性関節症病態の治療または予防において大きな利益である。

ＨＤＡｄ−Ｉｌ−１Ｒａ感染細胞は、Ｉｌ−１Ｒａを分泌する
炎症誘導性ＮＦ−κＢ５−ＥＬＡＭプロモーターの制御下でＩｌ−１Ｒａを発現するＨＤＡｄを生成し、その機能性をインビトロで試験した。高レベルのＩｌ−１ＲａがＨＤＡｄ−Ｉｌ−１Ｒａ感染細胞の上清中で３日目に計測された（図４）。リポ多糖（ＬＰＳ）による炎症の誘導は、未誘導試料と比較してＩｌ−１Ｒａ濃度の大幅な増加に導いた。Ｉｌ−１Ｒａは、未感染試料（モック）中でも対照ベクター（ＨＤＡｄ−ＧＦＰ）により感染された試料中でも検出されなかった。

ＨＤＡｄ−Ｉｌ−１Ｒａは、マウスにおいてＯＡの発症を予防する
Ｉｌ−１Ｒａを発現するＨＤＡｄがＯＡの発症を予防し得るか否かを評価するため、マウスの膝関節にＨＤＡｄ−Ｉｌ−１ＲａまたはＧＦＰ発現対照ベクター（ＨＤＡｄ−ＧＦＰ）を関節内注射した。注射２日後、十字靭帯切断を実施してＯＡ発症を誘導した。この変形性関節症モデルは、Dr. Brendan Leeの研究グループにおいて開発され、いくつかの実験においてバリデートされた（Ruan, Z., Dawson, B., Jiang M. M., Gannon, F., Heggenes, M., Lee, B.（２０１２）．Quantitative volumetric imaging of murine osteoarthritic cartilage by phase contrast micro-computed tomography, submitted）。このモデルは、重度のＯＡの発症に導く膝関節の前および後十字靭帯の切断を含む。マウスをＯＡ誘導１ヵ月後に安楽死させ、関節を組織学的に調製し、サフラニンＯにより染色した。ＯＡの発症を盲検化された病理学者によりＯＡＲＳＩ（Osteoarthritis Research Society International）規格（１〜６のスケールのスコアの割り当て、１：ＯＡの徴候が全く見られない、６：最大のＯＡ）に従ってスコアリングした。ＨＤＡｄ−Ｉｌ−１Ｒａ処理関節は、ＨＤＡｄ−ＧＦＰ処理または未処理関節よりも有意に低いＯＡスコアを有し、そのことは、ＨＤＡｄ−Ｉｌ−１ＲａがＯＡの発症を予防したことを示唆する（図５）。対照ベクターＨＤＡｄ−ＧＦＰは、平均ＯＡスコアが未処理群のスコアと同等であったため、ＯＡの発症に対するいかなる効果も有さないと考えられた。

ＨＤＡｄ−ｍＩｌ−１Ｒａは、疾患のネズミモデルにおいてＯＡを治療する
ＯＡの治療におけるＨＤＡｄ−ｍＩｌ−１Ｒａの効力を、上記のネズミ疾患モデルにおいて評価した。このモデルを使用してＨＤＡｄ−Ｉｌ１−ＲａがＯＡを有効に治療し得るか否かを評価した。したがって、ＯＡを十字靭帯切断により誘導し（未切断群を除く）、ＯＡを２週間発症させた。次いで、ＨＤＡｄ−Ｉｌ−１Ｒａ、対照ベクター（ＨＤＡｄ−ＧＦＰ）またはビヒクルを注射し、さらに６週間後にマウスを安楽死させて関節を分析した。ＨＤＡｄ−ＧＦＰ処理および未注射マウスはＯＡを同一程度発症し、平均スコアは約４．５であった（図６Ａ）。しかしながら、ＨＤＡｄ−Ｉｌ−１Ｒａ処理マウスは、ＨＤＡｄ−ＧＦＰおよびモック処理と比較して有意に低いＯＡスコアを有した。ＨＤＡｄ−Ｉｌ−１Ｒａと未切断（ＯＡ不含）マウスとの間に有意差は見出されず、そのことは、疾患の有効な治療またはその予防を示唆する。本発明者らは、この実験において関節をマイクロコンピュータ断層撮影（μＣＴ）分析によりさらに評価した。この技術は、高分解能（０．５ミクロンまで）ｘ線ＣＴ走査を位相差光学試験と組み合わせ、小動物関節中の軟骨の可視化を可能とする。関節の３次元再構築およびコンピュータによる組織分析ツールを使用していくつかの軟骨パラメータ、例えば、体積および表面積を定量することができる。ＨＤＡｄ−Ｉｌ−１Ｒａ処理関節は、ＨＤＡｄ−ＧＦＰおよびモック処理関節と比較して有意に高い軟骨体積を実証した（図６Ｂ）。ＨＤＡｄ−Ｉｌ−１Ｒａと未切断（ＯＡ不含）群との間に有意差は見られなかった。さらに、軟骨表面積は、ＨＤＡｄ−Ｉｌ−１Ｒａ処理マウスにおいてＨＤＡｄ−ＧＦＰおよびモック群と比較して有意に大きかった（図６Ｃ）一方、ＨＤＡｄ−Ｉｌ−１Ｒａと未切断（ＯＡ不含）関節との間に有意差は見られなかった。

この図は、本発明のヘルパー依存性アデノウイルスベクターの基本遺伝子地図を示す。ベクター骨格は、左右逆方向末端反復（ＩＴＲ）、アデノウイルスパッケージングシグナル（Ψ）および非コード非ウイルススタッファー配列（ＩＴＲ間の残りの無標識配列）からなる。ネズミＩｌ−１ＲａのｃＤＮＡを使用されるアデノウイルスベクターのウイルス左右ＩＴＲ間でクローニングする。Ｉｌ−１Ｒａの遺伝子を炎症誘導性ＮＦ−κＢ５−ＥＬＡＭプロモーターにより制御する。ヘルパー依存性および第１世代アデノウイルスベクターは、同一レベルのマーカー遺伝子発現を媒介する。マウスにルシフェラーゼ発現ヘルパー依存性（ＨＤＡｄ−ｌｕｃ）またはそれぞれの第１世代（Ａｄ−ｌｕｃ）アデノウイルスベクターの１０^８のウイルス粒子（ＶＰ）を関節内注射した。３日後、ＩＶＩＳ２００シリーズイメージングシステム（Caliper Life Sciences, Hopkintom ＭＡ）を使用してマウスをイメージングした。強力な生物発光シグナルが、ＨＤＡｄ−ｌｕｃおよびＡｄ−ｌｕｃアデノウイルスベクターの両方が注射された関節中で検出した。１群当たり４匹のマウスの両方の膝関節に注射し；それぞれの群の２匹のマウスのそれぞれの写真を示す。ヘルパー依存性アデノウイルスベクターは、関節中での長期マーカー遺伝子発現を媒介する。Ａに記載のマウスのルシフェラーゼ発現を生物発光イメージングの繰り返しにより追跡し、ＬｉｖｉｎｇＩｍａｇｅ２．５ソフトウェア（Caliper Life Sciences）を使用して定量した。発現は、第１世代のアデノウイルスベクター（Ａｄ−ｌｕｃ）について減少し、３０日間までに検出不能であった。ヘルパー依存性アデノウイルスベクター（ＨＤＡｄ−ｌｕｃ）についても発現が低落したが、１０日間でプラトーになり、３８０日間ほぼこのレベルであった。ヘルパー依存性アデノウイルスベクターは、シノビオサイトに有効に感染する。マウスにＬａｃＺ発現ＨＤＡｄの１０^８のＶＰを関節内注射した。１日後、マウスを安楽死させ、切片化関節上のＬａｃＺ染色を実施した。強力な発現（紺青色染色）が滑膜中で見られた一方、染色をコンドロサイト中で観察することはできなかった。右写真は、左写真（５×）の枠内領域のより高い倍率の写真（４０×）である。ＨＤＡｄ−Ｉｌ−１Ｒａにより感染された細胞は、多量のＩｌ−１Ｒａを産生する。ヒト胚腎細胞（ＨＥＫ２９３）を、ＨＤＡｄ−Ｉｌ−１Ｒａ、ＨＤＡｄ−ＧＦＰまたはモックの細胞当たり１００ＶＰにより感染させた。２日後、Ｉｌ−１ＲａのＥＬＩＳＡを細胞培養上清について実施した。約７００ｐｇ／ｍｌの濃度がＨＤＡｄ−Ｉｌ−１Ｒａ感染細胞について計測された一方、ＨＤＡｄ−ＧＦＰ感染細胞の上清中でもモック感染細胞の上清中でもＩｌ−１Ｒａは検出不能であった。炎症反応を誘導するため、リポ多糖（ＬＰＳ、１００μｇ／ｍｌ）を試料の半分に添加し、この場合においてもＩｌ−１Ｒａ濃度を１日後（４日目）に測定した。ＨＤＡｄ−Ｉｌ−１Ｒａ試料のレベルが約１６００ｐｇ／ｍｌに増加した一方、未誘導細胞は前日と比較して少ないＩｌ−１Ｒａを産生した。Ｉｌ−１Ｒａ発現は、対照試料（ＨＤＡｄ−ＧＦＰおよびモック）のいずれにおいても検出されなかった。ＨＤＡｄ−Ｉｌ−１Ｒａは、ＯＡの発症を予防する。マウスに、膝関節中にＨＤＡｄ−Ｉｌ−１Ｒａ、ＨＤＡｄ−ＧＦＰまたはモックの１０^８のＶＰを関節内注射し、ＯＡを２日後に十字靭帯トランスダクション（transduction）により誘導した。マウスを４週間後に安楽死させ、関節を組織学的に調製し、切片化し、サフラニンＯにより染色した。盲検化された病理学者は、ＯＡＲＳＩ（Osteoarthritis Research International）規格（１〜６のスケールのスコアの割り当て、１：ＯＡの徴候が全く見られない、６：最大のＯＡ）に従ってＯＡのレベルを評価した。ＨＤＡｄ−Ｉｌ−１Ｒａにより処理されたマウスは、ＨＤＡｄ−ＧＦＰおよびモックにより処理されたマウスと比較して有意に低いＯＡスコアを有した（^＊は、一元ＡＮＯＶＡによる有意差：ｐ＜０．０５を示す；１群当たりｎ＝１０の関節）。ＨＤＡｄ−Ｉｌ−１Ｒａは、マウスにおいてＯＡを有効に治療する。ＨＤＡｄ−Ｉｌ−１Ｒａ処理関節は、対照と比較して有意に低いＯＡスコアを有する。ＯＡを、マウス膝関節中で十字靭帯切断により誘導し、疾患を発症させた。切断の２週間後、マウスにＨＤＡｄ−Ｉｌ−１Ｒａ、ＨＤＡｄ−ＧＦＰまたはモックの１０^８のＶＰを関節内注射した。マウスを６週間後に安楽死させ、関節を組織学的に調製し、切片化し、サフラニンＯにより染色した。盲検化された病理学者は、ＯＡＲＳＩ（Osteoarthritis Research International）規格（１〜６のスケールのスコアの割り当て、１：ＯＡの徴候が全く見られない、６：最大のＯＡ）に従ってＯＡのレベルを評価した。ＨＤＡｄ−Ｉｌ−１Ｒａにより処理されたマウスは、ＨＤＡｄ−ＧＦＰおよびモックにより処理されたマウスと比較して有意に低いＯＡスコアを有した。ＨＤＡｄ−Ｉｌ−１−Ｒａ群と年齢が合致する未切断（ＯＡ誘導なし）マウスとの間に有意差は見出されなかった（^＊は、一元ＡＮＯＶＡによる有意差：ｐ＜０．０５を示す；１群当たりｎ＝８の関節）。ＨＤＡｄ−Ｉｌ−１Ｒａは、マウスにおいてＯＡを有効に治療する。ＨＤＡｄ−Ｉｌ−１Ｒａ処理関節は、対照と比較して有意に高い軟骨体積を実証する。上記の同様の手法で処理されたマウスの膝関節全体を電子顕微鏡固定剤中で固定し、パラフィン中で包埋した。Ｘ−ｒａｄｉａマイクロＸＣＴスキャナ（Xradia, Pleasanton, ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して試料を走査し、４ミクロンの分解能において可視化した。関節のコンピュータによる３Ｄ再構築を実施し、ＴＲＩＢＯＮソフトウェア（ラトックシステムエンジニアリング、東京、日本）を使用して軟骨体積および表面積を半自動的に定量した。対照と比較して有意に高い軟骨体積がＨＤＡｄ−Ｉｌ−１Ｒａ処理関節中で計測された。ＨＤＡｄ−Ｉｌ−１Ｒａ関節は、未切断（健常）関節と同様の体積を有した。（^＊は、有意差：ｐ＜０．０５を示す、一元ＡＮＯＶＡ、ｎ＝６の関節／群）。ＨＤＡｄ−Ｉｌ−１Ｒａは、マウスにおいてＯＡを有効に治療する。ＨＤＡｄ−Ｉｌ−１Ｒａ処理関節は、対照と比較して有意に大きな軟骨表面積を実証する。軟骨表面積を上記のとおり計測した。ＨＤＡｄ−Ｉｌ−１Ｒａ処理は、対象と比較して有意に高い軟骨表面積をもたらした。ＨＤＡｄ−Ｉｌ−１Ｒａ処理関節の表面積は、未切断（健常）対照のものと同様であった。（^＊は、有意差：ｐ＜０．０５を示す、一元ＡＮＯＶＡ、ｎ＝６の関節／群）。

Claims

ヒトまたは他の哺乳動物インターロイキン−１受容体アンタゴニスト（Ｉｌ−１Ｒａ）をコードする核酸配列、左右逆方向末端反復（ＬＩＴＲおよびＲＩＴＲ）、アデノウイルスパッケージングシグナルおよび非ウイルス非コードスタッファー核酸配列を含有し、変形性関節症対象の関節中に直接投与されるヘルパー依存性アデノウイルスベクターを含む、変形性関節症の治療または予防のための医薬組成物であって、前記ヒトまたは他の哺乳動物Ｉｌ−１Ｒａ遺伝子の発現は、ヒトまたは他の哺乳動物Ｉｌ−１Ｒａをコードする前記核酸配列のリーディングフレームの上流に局在し、かつ免疫刺激物質により活性化される一成分炎症誘導性プロモーターにより調節される、医薬組成物。
前記炎症誘導性プロモーターは、ＮＦ−κＢプロモーター、インターロイキン６（Ｉｌ−６）プロモーター、インターロイキン−１（Ｉｌ−１）プロモーター、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）プロモーター、シクロオキシゲナーゼ２（ＣＯＸ−２）プロモーター、補体因子３（Ｃ３）プロモーター、血清アミロイドＡ３（ＳＡＡ３）プロモーター、またはマクロファージ炎症性タンパク質−１α（ＭＩＰ−１α）プロモーターからなる群から選択される、請求項１に記載の医薬組成物。
前記ヘルパー依存性アデノウイルスベクターは、配列番号２もしくは配列番号３に記載の核酸配列、または生物学的に有効なその部分を含み、
前記有効な部分は、配列番号２または配列番号３を含むベクターと配列相同性を有し、Ｉｌ−１Ｒａを発現することによってＩｌ−１の効果を中和するための活性を有する、請求項１または２に記載の医薬組成物。
前記哺乳動物Ｉｌ−１Ｒａは、ネズミＩｌ−１Ｒａ、ウマＩｌ−１Ｒａ、イヌＩｌ−１Ｒａ、ネコＩｌ−１Ｒａ、ウサギＩｌ−１Ｒａ、ハムスターＩｌ−１Ｒａ、ウシＩｌ−１Ｒａ、ラクダＩｌ−１Ｒａまたは他の哺乳動物種のそれらのホモログからなる群から選択される、請求項１に記載の医薬組成物。
前記ヘルパー依存性アデノウイルスベクターは、ベクターゲノムのモニタリングを可能とするマーカー遺伝子をさらに含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
前記ヘルパー依存性アデノウイルスベクターは、配列番号１に記載の核酸配列またはその核酸配列によってコードされるアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列をコードする保存核酸配列を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
Ｉｌ−１Ｒａは、配列番号１に記載の核酸配列と少なくとも９０％の配列相同性を有し、生物学的に活性なＩｌ−１Ｒａタンパク質をコードする核酸配列を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
非ヒト哺乳動物関節における、変形性関節症または変形性関節症の状態の治療または予防のための、請求項１〜７のいずれか一項に記載の医薬組成物の使用。