KR20240052793A - 추간판 퇴행에 대한 IL-1Ra 유전자 요법 - Google Patents
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Abstract
본 개시내용은 인간 또는 포유동물 인터루킨-1 수용체 길항제(IL-1Ra)를 코딩하는 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템을 포함하는 약제학적 조성물, 및 퇴행성 디스크 질환(DDD) 또는 DDD와 관련된 병태를 앓고 있는 대상체의 하나 이상의 추간판의 세포에서 IL-IRA를 발현하고 DDD 또는 DDD와 관련된 병태를 치료하기 위해 약제학적 조성물을 사용하는 방법에 관한 것이다.
Description
서열 목록의 참조에 의한 통합
본 출원은 EFS-Web을 통해 ASCII 형식으로 제출되었고 전체가 참조로 본원에 포함된 서열 목록을 함유한다. 2022년 8월 23일에 생성된 상기 ASCII 복사본의 이름은 "PCRTX_017WO_Sequence_Listing.xml"이고, 크기는 97.5 킬로바이트이다.
발명의 배경
허리 통증은 일생의 일부 시점에서 인구의 80%에게 영향을 미치며, 거의 절반의 사례가 추간판(IVD) 퇴행에 기인한다. IVD 퇴행은 천연 IVD 세포 자체에 의해 유발되고; 시토카인 및 이화 효소 생성의 캐스케이드는 세포외 기질(ECM)의 파괴 및 변형된 디스크 생체역학을 초래하여 IVD 기능의 상실에 기여하며, 이는 신경 내성장의 유도 및 신경영양 인자의 생성과 조합되어 등 통증에 기여하는 것으로 생각된다. 그러나, 현재까지 대부분의 치료는 단기 통증 관리, 물리 요법 및 탈출 조직의 외과적 제거에 중점을 두고 있으며, 어떠한 치료도 IVD 퇴행의 근본적인 병태생리학적 원인을 표적으로 하지 않는다. 유전자 치료 접근법은 많은 질환 치료에 새롭고 흥미로운 가능성을 제시한다.
IL-1은 자발적 디스크 퇴행을 유도한 녹아웃 모델에서 디스크 퇴행 및 IL-1Ra의 손실 동안 다면 발현성 시토카인으로 작용하는 것으로 공지되어 있다. 따라서, IVD의 세포 및 조직에서 IL-1을 차단함으로써 IVD 치료를 위한 보다 효과적이고 지속적이고 비용 효율적인 방법에 대한 명확하고 충족되지 않은 의학적 요구가 있다. 본 개시내용은 아데노바이러스 전달 및 발현 시스템(FX201, 휴먼타키노겐 하데노벡(humantakinogene hadenovec), 본원에서는 PCRX-201로도 지칭됨)을 포함하는 조성물, 및 IL-1Ra의 생성 및 방출을 증가시키기 위해 이를 사용하여 퇴행성 디스크 질환(DDD) 또는 DDD와 관련된 병태를 앓고 있는 대상체의 추간판의 세포를 포함한 인간 추간판의 세포를 감염시키는 방법, 및 DDD 또는 DDD와 관련된 병태를 치료하는 방법을 기재한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 소정량의, 임의적으로 유효량의, 인간 인터루킨-1 수용체 길항제(IL-1Ra) 단백질을 코딩하는 핵산 서열, 좌측 및 우측 역위 말단 반복부, 아데노바이러스 패키징 신호 및 비-바이러스 및 비-코딩 스터퍼 핵산 서열을 포함하는 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템(아데노바이러스 기반 벡터 또는 헬퍼 의존적 아데노바이러스 벡터)를 포함하는, 퇴행성 디스크 질환(DDD) 또는 DDD와 관련된 병태의 치료를 필요로 하는 대상체에서 상기 질환 또는 병태를 치료하기 위한 약제학적 조성물을 제공하며, 인간 IL-1Ra 유전자의 발현은 인간 IL-1Ra 단백질을 코딩하는 핵산 서열의 판독 프레임의 상류에 위치된 NF-κB 유도성 프로모터에 의해 조절되고, 프로모터, IL-1Ra를 코딩하는 핵산 서열, 좌측 및 우측 역위 말단 반복부, 아데노바이러스 패키징 신호 및 비-바이러스, 비-코딩 스터퍼 핵산 서열을 포함하는 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템의 핵산 서열은 서열번호 7의 핵산 서열과 적어도 95% 상동성이거나 동일하다.
DDD와 관련된 병태는 허리 통증, 감소된 등 근육 긴장, 등의 감소된 유연성 또는 혈전 또는 이들의 조합일 수 있다.
프로모터, IL-1Ra를 코딩하는 핵산 서열, 좌측 및 우측 역위 말단 반복부, 아데노바이러스 패키징 신호 및 비-바이러스, 비-코딩 스터퍼 핵산 서열을 포함하는 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템의 핵산 서열은 서열번호 7의 핵산 서열과 적어도 99% 상동성이거나 동일하다.
프로모터, IL-1Ra를 코딩하는 핵산 서열, 좌측 및 우측 역위 말단 반복부, 아데노바이러스 패키징 신호 및 비-바이러스, 비-코딩 스터퍼 핵산 서열을 포함하는 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템의 핵산 서열은 서열번호 7의 핵산 서열과 동일하다.
아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템의 핵산 서열 내 IL-1Ra는 서열번호 4의 핵산을 포함할 수 있다.
서열번호 4에 따른 핵산은 서열번호 6과 적어도 95% 상동성이거나 동일한 아미노산 서열의 인간 IL-1Ra 단백질을 발현할 수 있다.
일부 실시양태에서, DDD 또는 DDD와 관련된 병태의 치료를 위한 본원에 개시된 약제학적 조성물은 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템을 이를 필요로 하는 대상체의 하나 이상의 추간판의 세포에 직접적으로 전달하기 위해 제제화된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 약제학적 조성물은 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템을 하나 이상의 추간판의 연골 종판(CEP), 고도로 조직화된 섬유륜(AF) 및 중앙 젤라틴성 수핵(NP) 영역(수핵(NP) 세포) 또는 이들의 조합의 세포에 전달하기 위해 제제화된다. 이를 필요로 하는 대상체의 하나 이상의 추간판은 퇴행성 디스크 또는 비-퇴행성 디스크 또는 둘 다이다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 또한 퇴행성 디스크 질환(DDD)을 앓고 있는 대상체의 하나 이상의 추간판의 세포를 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템으로 감염시키는 방법을 제공하며, 방법은 a) 이를 필요로 하는 대상체의 하나 이상의 추간판의 세포를 소정량의, 임의적으로 유효량의, 본 개시내용의 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템을 포함하는 약제학적 조성물로 감염시키는 단계; 및 b) 하나 이상의 추간판의 세포에서 IL-1Ra를 발현시키는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법은 단계 c) (b)에서 IL-1Ra의 발현 후 대상체의 퇴행된 추간판에서 DDD의 치료 또는 진행을 모니터링하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 (d) (c)의 모니터링이 대상체의 추간판의 퇴행성 디스크 질환이 관리 또는 치료되지 않음을 나타내는 경우, (a)의 하나 이상의 추간판의 세포에 동일한 유효량의 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템을 계속 투여하는 단계; 또는 (e) (c)의 모니터링이 대상체의 추간판의 퇴행성 디스크 질환이 진행됨을 나타내는 경우, (a)의 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템의 양을 추가로 조정하고 추간판에 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
임의의 상기 측면, 또는 달리 본원에 개시된 측면은 임의의 다른 측면과 조합될 수 있다.
본 개시내용의 실시양태는 하기와 같은 번호가 매겨진 실시양태를 포함한다:
1. 인터루킨-1 수용체 길항제(IL-1Ra) 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템을 포함하는, 퇴행성 디스크 질환(DDD) 또는 DDD와 관련된 병태의 치료를 필요로 하는 대상체에서 이를 치료하기 위한 약제학적 조성물.
2. 실시양태 1에 있어서, 핵산이 좌측 및 우측 역위 말단 반복부, 아데노바이러스 패키징 신호 및 비-바이러스 및 비-코딩 스터퍼 핵산 서열을 추가로 포함하는 것인 약제학적 조성물.
3. 실시양태 1 또는 2에 있어서, 핵산이 IL-1Ra 단백질을 코딩하는 핵산 서열의 판독 프레임의 상류에 위치된 염증 민감성 프로모터를 추가로 포함하여, IL-1Ra 유전자의 발현이 염증 민감성 프로모터에 의해 조절되며, 임의적으로 염증 민감성 프로모터는 NF-κB, 인터루킨 6(II-6), 인터루킨-1(IL-1), 종양 괴사 인자(TNF), 사이클로옥시게나제 2(COX-2), 보체 인자 3(C3), 혈청 아밀로이드 A3(SAA3), 및 대식세포 염증 단백질-1a(MIP-1a), 또는 이의 하이브리드 구축물에 의해 유도 가능한 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 약제학적 조성물.
4. 실시양태 1 또는 3에 있어서, 핵산이 IL-1Ra 단백질을 코딩하는 핵산 서열의 판독 프레임의 상류에 위치된 NF-κB 유도성 프로모터를 추가로 포함하여 IL-1Ra 유전자의 발현이 NF-κB 유도성 프로모터에 의해 조절되는 것인 약제학적 조성물.
5. 실시양태 1 또는 4에 있어서, 핵산이 서열번호 7의 핵산 서열과 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일하거나, 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 것인 약제학적 조성물.
6. 실시양태 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, DDD와 관련된 병태가 허리 통하부 요통, 감소된 등 근육 긴장, 등의 감소된 유연성, 혈전 또는 이들의 조합인 약제학적 조성물.
7. 실시양태 1 내지 6 중 어느 하나에 있어서, IL-1Ra를 코딩하는 핵산의 서열이 서열번호 4의 핵산 서열과 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일하거나, 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 것인 약제학적 조성물.
8. 실시양태 1 내지 7 중 어느 하나에 있어서, IL-1Ra를 코딩하는 핵산의 서열이 서열번호 6의 아미노산 서열과 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일하거나, 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 IL-1Ra 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 것인 약제학적 조성물.
9. 실시양태 1 내지 8 중 어느 하나에 있어서, IL-1Ra 단백질이 인간 IL-1Ra인 약제학적 조성물.
10. 실시양태 1 내지 9 중 어느 하나에 있어서, 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템이 인터루킨-1 수용체 길항제(IL-1Ra) 단백질 이외의 단백질을 코딩하는 핵산을 추가로 포함하고, 임의적으로 추가 단백질은 치료 단백질인 약제학적 조성물.
11. 실시양태 1 내지 10 중 어느 하나에 있어서, 약제학적 조성물이 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템을 이를 필요로 하는 대상체의 하나 이상의 추간판의 세포에 직접적으로 전달하기 위해 제제화되는 것인 약제학적 조성물.
12. 실시양태 1 내지 11 중 어느 하나에 있어서, 이를 필요로 하는 대상체의 하나 이상의 추간판이 퇴행성 디스크 또는 비-퇴행성 디스크 또는 둘 다인 약제학적 조성물.
13. 실시양태 12에 있어서, 이를 필요로 하는 대상체의 하나 이상의 추간판이 퇴행성 디스크인 약제학적 조성물.
14. 실시양태 1 내지 13 중 어느 하나에 있어서, 약제학적 조성물이 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템을 하나 이상의 추간판의 연골 종판(CEP), 고도로 조직화된 섬유륜(AF) 및 중앙 젤라틴성 수핵(NP) 영역(수핵(NP) 세포) 또는 이들의 조합의 세포로 전달하기 위해 제제화되는 것인 약제학적 조성물.
15. 실시양태 14에 있어서, 약제학적 조성물이 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템을 수핵(NP) 세포로 전달하기 위해 제제화되는 것인 약제학적 조성물.
16. 실시양태 14에 있어서, 세포가 수핵(NP) 세포인 약제학적 조성물.
17. 실시양태 1 내지 16 중 어느 하나에 있어서, 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템으로 감염된 퇴행성 디스크의 세포만이 IL-1Ra를 생성하는 것인 약제학적 조성물.
18. 실시양태 1 내지 17 중 어느 하나에 있어서, 이를 필요로 하는 대상체의 하나 이상의 추간판의 세포가 적어도 2주, 적어도 1개월, 적어도 3개월, 적어도 6개월 또는 적어도 1년의 기간 동안 IL-1Ra를 발현하는 것인 약제학적 조성물.
19. 실시양태 1 내지 18 중 어느 하나에 있어서, 약제학적 조성물이 대상체에게 투여 시 대상체에서 퇴행성 디스크 질환(DDD) 및/또는 DDD와 관련된 병태를 치료하기에 효과적인 소정량의 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템을 포함하는 것인 약제학적 조성물.
20. 실시양태 1 내지 18 중 어느 하나에 있어서, 대상체가 후관절 증후군(FJS)을 갖지 않는 것인 약제학적 조성물.
21. 실시양태 1 내지 18 중 어느 하나에 있어서, 대상체가 후관절 증후군(FJS)을 갖는 것인 약제학적 조성물.
22. 퇴행성 디스크 질환(DDD) 또는 DDD와 관련된 병태를 앓고 있는 대상체의 하나 이상의 추간판의 세포에서 IL-IRA를 발현시키는 방법으로서,
a) 이를 필요로 하는 대상체의 하나 이상의 추간판의 세포를 실시양태 1 내지 21 중 어느 하나의 약제학적 조성물로 감염시키는 단계; 및
b) 하나 이상의 추간판의 세포에서 IL-1Ra를 발현시키는 단계
를 포함하는 방법.
23. 실시양태 22에 있어서, 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템이 인터루킨-1 수용체 길항제(IL-1Ra) 단백질 이외의 단백질을 코딩하는 핵산을 추가로 포함하고, 임의적으로 추가 단백질은 치료 단백질이고, 방법이 하나 이상의 추간판의 세포에서 추가 단백질을 발현시키는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
24. 실시양태 22 또는 23에 있어서, 하나 이상의 추간판의 세포가 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템으로 1회 감염되는 것인 방법.
25. 실시양태 22 또는 23에 있어서, 하나 이상의 추간판의 세포가 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템으로 2회 이상 감염되는 것인 방법.
26. 실시양태 25에 있어서, 하나 이상의 추간판의 세포가 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템으로 2회 이상 감염되는 경우, 각각의 감염이 상이한 수의 게놈 카피의 아데노바이러스 기반 벡터를 포함하는 것인 방법.
27. 실시양태 25에 있어서, 하나 이상의 추간판의 세포가 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템으로 2회 이상 감염되는 경우, 각각의 감염이 동일한 수의 게놈 카피의 아데노바이러스 기반 벡터를 포함하는 것인 방법.
28. 실시양태 25 내지 27 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 추간판의 세포가 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템으로 2회 이상 감염되는 경우, 각각의 감염이 대상체의 동일한 추간판에서 수행되는 것인 방법.
29. 실시양태 25 내지 27 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 추간판의 세포가 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템으로 2회 이상 감염되는 경우, 모든 제2 및 후속 감염이 이전 감염이 수행된 추간판과 상이한 대상체의 추간판에서 수행되는 것인 방법.
30. 실시양태 22 내지 29 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 추간판의 세포를 감염시키는 것이 약제학적 조성물을 하나 이상의 추간판의 연골 종판(CEP) 영역, 고도로 조직화된 섬유륜(AF) 영역 또는 중앙 젤라틴성 수핵(NP) 영역(수핵(NP) 세포) 또는 이들의 조합에 주사하는 것을 포함하는 것인 방법.
31. 실시양태 30에 있어서, 하나 이상의 추간판의 세포를 감염시키는 것이 약제학적 조성물을 하나 이상의 추간판의 수핵(NP) 영역에 주사하는 것을 포함하는 것인 방법.
32. 실시양태 22 내지 31 중 어느 하나에 있어서, 방법이 대상체에서 퇴행성 디스크 질환(DDD) 및/또는 DDD와 관련된 병태를 치료하는 것인 방법.
33. 실시양태 22 내지 32 중 어느 하나에 있어서,
c) (b)에서 IL-1Ra의 발현 후 대상체의 퇴행된 추간판에서 DDD 또는 DDD와 관련된 병태의 치료 또는 진행을 모니터링하는 단계
를 추가로 포함하는 것인 방법.
34. 실시양태 33에 있어서, DDD 또는 DDD와 관련된 병태의 치료 또는 진행을 모니터링하는 것이 환자 보고된 통증 및/또는 기능 측정으로부터 점수를 결정함으로써 수행되는 것인 방법.
35. 실시양태 34에 있어서, 환자 보고된 통증으로부터 점수를 결정하는 것이 시각적 아날로그 척도(VAS)를 사용하여 수행되는 것인 방법.
36. 실시양태 22 내지 35 중 어느 하나에 있어서, 대상체의 VAS 점수가 약제학적 조성물로 대상체의 하나 이상의 추간판의 세포를 감염시킨 후 더 낮은 것인 방법.
37. 실시양태 34 내지 36 중 어느 하나에 있어서, 환자 기능 측정으로부터 점수를 결정하는 것이 오스웨스트리 장애 지수(ODI)를 사용하여 수행되는 것인 방법.
38. 실시양태 22 내지 37 중 어느 하나에 있어서, 대상체의 VAS 점수가 약제학적 조성물로 대상체의 하나 이상의 추간판의 세포를 감염시킨 후 더 낮은 것인 방법.
39. 실시양태 33에 있어서, DDD 또는 DDD와 관련된 병태의 치료 또는 진행을 모니터링하는 것이 NGF, NT-3, VEGF, 물질 P, 시토카인, 아그레칸, 콜라겐 유형 II, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 대상체의 마커의 수준을 결정하는 것을 포함하는 것인 방법.
40. 실시양태 39에 있어서, 시토카인이 IL-1β, IL-6, IL-8, TNF α, MMP 3, MMP 13, ADAMTS 4, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
41. 실시양태 22 내지 40 중 어느 하나에 있어서, 약제학적 조성물로 대상체의 하나 이상의 추간판의 세포를 감염시킨 후 하나 이상의 추간판에서
(a) NGF, NT-3, VEGF, 물질 P, IL-1β, IL-6, IL-8, TNF α, MMP 3, MMP 13, 또는 ADAMTS 4, 또는 이들의 조합 중 하나 이상의 수준이 감소 또는 변화하지 않거나;
(b) 아그레칸 또는 콜라겐 유형 II 또는 이들의 조합의 수준이 증가하거나;
(c) 둘 다
가 발생하는 것인 방법.
42. 실시양태 22 내지 41 중 어느 하나에 있어서, 약제학적 조성물로 대상체의 하나 이상의 추간판의 세포를 감염시킨 후 하나 이상의 추간판에서 아그레칸의 수준이 증가하는 것인 방법.
43. 실싱양태 33에 있어서, DDD 또는 DDD와 관련된 병태의 치료 또는 진행을 모니터링하는 것이 약제학적 조성물로 대상체의 하나 이상의 추간판의 세포를 감염시킨 후 하나 이상의 추간판에 대해 인간 추간판 퇴행에 대한 조직병리학적 채점 시스템에 기초한 점수의 변화를 결정함으로써 수행되는 것인 방법.
44. 실시양태 22 내지 43 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 추간판에 대해 인간 추간판 퇴행에 대한 조직병리학적 채점 시스템에 기초한 점수의 감소가 약제학적 조성물로 대상체의 하나 이상의 추간판의 세포를 감염시킨 후 발생하는 것인 방법.
45. 실시양태 33 내지 44 중 어느 하나에 있어서,
(d) (c)의 모니터링이 대상체의 추간판의 퇴행성 디스크 질환이 관리 또는 치료되지 않음을 나타내는 경우, (a)의 하나 이상의 추간판의 세포에 동일한 양의 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템을 계속 투여하는 단계; 또는
(e) (c)의 모니터링이 대상체의 추간판의 퇴행성 디스크 질환이 진행됨을 나타내는 경우, (a)의 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템의 양을 추가로 조정하고 이를 필요로 하는 대상체의 하나 이상의 추간판의 세포에 투여하는 단계
를 추가로 포함하는 것인 방법.
46. 실시양태 22 내지 45 중 어느 하나에 있어서, 방법이 대상체의 추간판에 코르티코스테로이드 및/또는 국소 마취제의 투여를 추가로 포함하는 것인 방법.
47. 실시양태 46에 있어서, 코르티코스테로이드 및/또는 국소 마취제가 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템과 동시에 투여되도록 코르티코스테로이드 및/또는 국소 마취제가 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템과 함께 단일 약제학적 제제에 있는 것인 방법.
48. 실싱양태 46에 있어서, 코르티코스테로이드 및/또는 국소 마취제가 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템 전 및/또는 후에 투여되도록 코르티코스테로이드 및/또는 국소 마취제가 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템과 함께 단일 약제학적 제제에 있지 않는 것인 방법.
49. 실시양태 22 내지 48 중 어느 하나에 있어서, 방법이 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템 후에 대상체의 추간판에 유체의 투여를 추가로 포함하고, 임의적으로 유체의 양은 하기이거나, 약 하기이거나, 하기 미만이거나, 약 하기 미만이거나, 하기 초과이거나, 약 하기 초과인 방법: 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 μl, 또는 이전 값 중 임의의 2개에 의해 정의된 범위, 임의적으로 25-1000, 25-500, 25-200, 50-150, 500-1000, 200-800, 200-600, 400-800, 또는 600-800 μl.
50. 실시양태 49에 있어서, 유체가 식염수인 방법.
51. 실시양태 46 내지 50 중 어느 하나에 있어서, 추가 투여가 코르티코스테로이드 및/또는 국소 마취제 및/또는 유체의 추간판내 주사를 포함하는 것인 방법.
52. 실시양태 22 내지 51 중 어느 하나에 있어서, 대상체가 후관절 증후군(FJS)을 갖지 않는 것인 방법.
53. 실시양태 22 내지 51 중 어느 하나에 있어서, 대상체가 후관절 증후군(FJS)을 갖는 것인 방법.
54. 실시양태 22 내지 53 중 어느 하나에 있어서, 방법이 약제학적 조성물의 추간판내 주사를 포함하는 것인 방법.
55. 실시양태 51 또는 54에 있어서, 추간판내 주사가 중앙 젤라틴성 수핵(NP) 영역에 대한 것인 방법.
56. 실시양태 22 내지 55 중 어느 하나에 있어서, 방법이 약제학적 조성물의 힘줄내, 근육내, 관절내, 또는 견봉하 주사를 포함하지 않는 것인 방법.
57. 실시양태 1 내지 56 중 어느 하나에 있어서, 약제학적 제제 중 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템의 농도가 1 x 108 내지 5 x 1011 VP/ml, 2 x 108 내지 2 x 1011 VP/ml, 2 x 109 내지 2 x 1011 VP/ml, 1 x 108 내지 2 x 109 VP/ml, 또는 1 x 109 VP/ml 미만이거나, 약 1 x 108 내지 5 x 1011 VP/ml, 2 x 108 내지 2 x 1011 VP/ml, 2 x 109 내지 2 x 1011 VP/ml, 1 x 108 내지 2 x 109 VP/ml, 또는 1 x 109 VP/ml 미만인 조성물 또는 방법.
58. 실시양태 1 내지 56 중 어느 하나에 있어서, 약제학적 제제 중 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템의 농도가 1 x 108 내지 5 x 1011 GC/ml, 2 x 108 내지 2 x 1011 GC/ml, 2 x 109 내지 2 x 1011 GC/ml, 1 x 108 내지 2 x 109 GC/ml, 또는 1 x 109 GC/ml 미만이거나, 약 1 x 108 내지 5 x 1011 GC/ml, 2 x 108 내지 2 x 1011 GC/ml, 2 x 109 내지 2 x 1011 GC/ml, 1 x 108 내지 2 x 109 GC/ml, 또는 1 x 109 GC/ml 미만인 조성물 또는 방법.
59. 실시양태 1 내지 58 중 어느 하나에 있어서, 척추내 디스크에 투여되는 약제학적 조성물의 단일 용량이 하기이거나, 약 하기이거나, 하기 미만인 양인 조성물 또는 방법: 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 1, 2, 3, 4, 또는 5 ml, 또는 이전 값 중 임의의 2개에 의해 정의된 범위, 임의적으로 0.1 ml 내지 5 ml, 0.5 ml 내지 5 ml, 0.5 ml 내지 2 ml, 1 ml 내지 5 ml, 2 ml 내지 5 ml, 4 ml 내지 5 ml, 또는 3 ml 내지 5 ml.
60. 실시양태 17 내지 59 중 어느 하나에 있어서, 감염된 세포가 NP 세포를 포함하는 것인 조성물 또는 방법.
61. 실시양태 1 내지 60 중 어느 하나에 있어서, 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템이 FX201/PCRX-201을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어지는 것인 조성물 또는 방법.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 개시내용을 고려하여 읽을 때 본 개시내용이 속하는 기술 분야의 통상의 기술자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 개시내용에서, 단수 형태는 문맥상 달리 명시하지 않는 한 복수형도 포함하며; 예로서, 단수 형태의 용어는 단수 또는 복수인 것으로 이해되고, 용어 "또는"은 포괄적인 것으로 이해된다. 예컨대, "요소"는 하나 이상의 요소를 의미한다. 명세서 전반에 걸쳐, 단어 "포함하는" 또는 "포함하다"와 같은 변형은 언급된 요소, 정수 또는 단계, 요소의 그룹, 정수들 또는 단계들의 포함을 의미하고 임의의 다른 요소, 정수 또는 단계, 요소의 그룹, 정수들 또는 단계들을 배제하지 않는 것으로 이해될 것이다. 약은 언급된 값의 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05% 또는 0.01% 이내로 이해될 수 있다. 문맥상 달리 명확하지 않는 한, 본원에 제공된 모든 수치는 용어 "약"으로 수식된다.
본원에 기재된 용어 "퇴행성 디스크 질환"은 용어 "추간판성 허리 통증", "내부 디스크 파열" 또는 "추간판 퇴행" 또는 "퇴행된 추간판 질환"과 상호교환적으로 사용된다.
본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 재료가 본 개시내용의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 재료가 하기에 기술된다. 본원에 언급된 모든 공개문, 특허 출원, 특허 및 다른 참조문헌은 본원에서 논의되는 특정 정보에 대해 전체 내용이 참조로 포함된다. 본원에 인용된 참조문헌은 청구된 개시내용에 대한 선행 기술인 것으로 인정되지 않는다. 상충되는 경우 정의를 포함한 본원이 통제할 것이다. 또한, 재료, 방법 및 실시예는 예시일 뿐이며 제한하려는 의도는 아니다. 본 개시내용의 다른 특색 및 이점은 하기의 상세한 설명 및 청구범위로부터 명백해질 것이다.
도 1은 휴먼타키노겐 하데노벡 (FX201, 일명 PCRX-201)의 게놈 맵을 도시한다. ITR = 역위 말단 반복부(5'에서 1-103 bp; 3'에서 29,158-29,260 bp), Ψ = 패키징 신호(240-375 bp), HPRT 스터퍼 = 인간 히포잔틴 포스포리보실트랜스퍼라제(463-16,518 bp), 인간 코스미드 삽입물 = 인간 코스미드(16,532-27,637 bp), SV40 폴리 A = 시미안 바이러스 40 폴리 A(27,750-28,020 bp), huIL-1Ra = 인간 인터루킨-1 수용체 길항제, 관심 게놈(28,033-28,566 bp), NF-κB5-ELAM 프로모터 = NΦ-κBινδυχιβλε 프로모터(28,581-28,842 bp).
도 2는 본 개시내용의 헬퍼 의존적 아데노바이러스 벡터의 실시양태의 기본 유전자 맵을 도시한다. 벡터 백본은 좌측 및 우측 역위 말단 반복부(ITR), 아데노바이러스 패키징 신호(Ψ) 및 비-코딩, 비-바이러스 스터퍼 서열(ITR 사이의 남아 있는 표시되지 않은 서열)로 이루어진다. 인간 IL-1Ra, 말 IL-1Ra(GQ-201), 또는 뮤린 IL-1Ra의 cDNA는 사용된 아데노바이러스 기반 벡터의 바이러스 좌측 및 우측 ITR 사이에 클로닝된다. IL-1-Ra의 유전자의 발현은 염증 민감성 NF-κB5-ELAM 프로모터에 의해 조절된다.
도 3a-3d는 감염 후 24시간(도 3a), 48시간(도 3b), 72시간(도 3c) 및 1주(도 3d)에 다양한 MOI의 PCRX-201로 감염된 인간 NP 세포의 대사 활성의 실시양태를 도시한다(*=P<0.05).
도 4는 알기네이트 배양에서 21일 후, 피코 그린 DNA 정량화 키트를 사용하여 측정된 알기네이트 비드 배양당 총 DNA 함량의 실시양태를 도시한다(*=P<0.05).
도 5a-5b는 PCRX-201(일명 FX201)로 감염된 단층 인간 NP 세포에 의한 IL-1Ra 생성의 실시양태를 도시한다. (n=7 환자로부터의) 단층 배양된 인간 NP 세포의 세포 배양 상등액 내의 IL-1Ra 생성은 10 ng IL-1β로 자극한 지 2일 ± 1일 후(도 5a), 및 10 ng IL-1β으로 자극한 지 5일 ± 4일 후(도 5b)에 나타난다. x축은 표시된 바와 같이 PCRX-201 및 PCRX-201 + IL-1β의 상이한 자극 MOI를 도시하며, y축은 ELISA로 결정된 세포 배양 상층액 중의 pg/ml의 IL-1Ra의 농도를 도시한다. 시험된 7명의 환자 각각으로부터의 NP 세포에 의해 생성된 IL-1Ra의 농도는 표시된 바와 같이 점으로 표시된다. 특정 자극 그룹에서 NP 세포에 의해 생성된 IL-1Ra의 평균 수준도 표시된다. 상이한 자극 그룹 간의 단백질 농도 차이의 유의성이 표시된다(*).
도 6a-6d는 PCRX-201로 감염된 3D 인간 NP 세포에 의한 IL-1Ra 생성의 실시양태를 도시한다. 세포 배양 상층액 내의 PCRX-201(MOI 0, 750 및 3000)로 감염된 (n=6 환자로부터의) 3D 배양된 인간 NP 세포에 의한 IL-1Ra의 생성을 감염 후 2일(도 6a), 감염 후 7일(도 6b), 감염 후 14일(도 6c), 및 감염 후 21일 ± 10 ng IL-1β 자극으로 자극 후 7일(도 6d) 후에 나타낸다. x축은 표시된 바와 같이 PCRX-201 및 PCRX-201 + IL-1β의 상이한 자극 MOI를 도시하며, y축은 ELISA로 결정된 세포 배양 상층액 중의 pg/ml의 단백질 농도를 도시한다. 시험된 6명의 환자 각각으로부터의 NP 세포에 의해 생성된 IL-1Ra의 농도는 표시된 바와 같이 점으로 표시된다. 특정 자극 그룹에서 NP 세포에 의해 생성된 IL-1Ra의 평균 농도도 표시된다. 상이한 자극 그룹 간의 단백질 농도 차이의 유의성이 표시된다(*).
도 7a-7h는 PCRX-201로 감염된 퇴행성 NP 세포로부터 IL-1Ra 생성의 장기간 유지의 실시양태를 도시한다. 퇴행성 디스크 조직으로부터 단리된 NP 세포, 비-감염된 대조군 세포 및 MOI 3000의 PCRX-201로 감염된 세포에 의한 IL-1Ra 생성. 2일(도 7a), 1주(도 7b), 2주(도 7c), 3주(도 7d), 4주(도 7e), 6주(도 7f), 8주(도 7g), 10주(도 7h) 동안 3D 알기네이트 비드에서 배양하기 전 48시간 동안 감염된 NP 세포, (*=P<0.05).
도 8은 MOI 750 또는 3000의 PCRX-201로 48시간 감염시킨 후 퇴행성 디스크로부터 단리되고 추가 1주일 동안 100 pg/ml IL-1β 자극 전 14일 동안 알기네이트에서 배양된 NP 세포에서 18s 및 비처리된 대조군에 대해 정규화된 NGF에 대한 상대적 유전자 발현의 실시양태를 도시한다.
도 9a-9d는 PCRX-201로 감염된 3D 인간 NP 세포에 의한 VEGF 생성의 실시양태를 도시한다. 세포 배양 상층액 내의 PCRX-201(MOI 0, 750 및 3000)로 감염된 (n=6 환자로부터의) 3D 배양된 인간 NP 세포에 의한 VEGF 생성을 감염 후 2일(도 9a), 감염 후 7일(도 9b), 감염 후 14일(도 9c), 및 감염 후 21일 ± 10 ng IL-1β 자극으로 자극 후 7일(도 9d) 후에 나타낸다. x축은 표시된 바와 같이 PCRX-201 및 PCRX-201 + IL-1β의 상이한 자극 MOI를 도시하며, y축은 ELISA로 결정된 세포 배양 상층액 중의 pg/ml의 단백질 농도를 도시한다. 시험된 6명의 환자 각각으로부터의 NP 세포에 의해 생성된 VEGF의 농도는 표시된 바와 같이 점으로 표시된다. 특정 자극 그룹에서 NP 세포에 의해 생성된 VEGF의 평균 수준도 표시된다. 상이한 자극 그룹 간의 단백질 농도 차이의 유의성이 표시된다(*).
도 10a-10d는 PCRX-201로 감염된 3D 인간 NP 세포에 의한 IL-1β 생성의 실시양태를 도시한다. 세포 배양 상층액 내의 PCRX-201(MOI 0, 750 및 3000)로 감염된 (n=6 환자로부터의) 3D 배양된 인간 NP 세포에 의한 IL-1β 생성을 감염 후 2일(도 10a), 감염 후 7일(도 10b), 감염 후 14일(도 10c), 및 감염 후 21일 ± 10 ng IL-1β 자극으로 자극 후 7일(도 10d) 후에 나타낸다. x축은 표시된 바와 같이 PCRX-201 및 PCRX-201 + IL-1β의 상이한 자극 MOI를 도시하며, y축은 ELISA로 결정된 세포 배양 상층액 중의 pg/ml의 단백질 농도를 도시한다. 시험된 6명의 환자 각각으로부터의 NP 세포에 의해 생성된 IL-1β의 농도는 표시된 바와 같이 점으로 표시된다. 특정 자극 그룹에서 NP 세포에 의해 생성된 IL-1β의 평균 수준도 표시된다. 상이한 자극 그룹 간의 단백질 농도 차이의 유의성이 표시된다(*).
도 11a-11c는 PCRX-201로 감염된 3D 인간 NP 세포에 의한 IL-6 생성의 실시양태를 도시한다. 세포 배양 상층액 내의 PCRX-201(MOI 0, 750 및 3000)로 감염된 (n=6 환자로부터의) 3D 배양된 인간 NP 세포에 의한 IL-6 생성을 감염 후 7일(도 11a), 감염 후 14일(도 11b), 및 감염 후 21일 ± 10 ng IL-1β 자극으로 자극 후 7일(도 11c) 후에 나타낸다. x축은 표시된 바와 같이 PCRX-201 및 PCRX-201 + IL-1β의 상이한 자극 MOI를 도시하며, y축은 ELISA로 결정된 세포 배양 상층액 중의 pg/ml의 단백질 농도를 도시한다. 시험된 6명의 환자 각각으로부터의 NP 세포에 의해 생성된 IL-6의 농도는 표시된 바와 같이 점으로 표시된다. 특정 자극 그룹에서 NP 세포에 의해 생성된 IL-6의 평균 수준도 표시된다. 상이한 자극 그룹 간의 단백질 농도 차이의 유의성이 표시된다(*).
도 11d-11f는 PCRX-201로 감염된 3D 인간 NP 세포에 의한 IL-8 생성의 실시양태를 도시한다. 세포 배양 상층액 내의 PCRX-201(MOI 0, 750 및 3000)로 감염된 (n=6 환자로부터의) 3D 배양된 인간 NP 세포에 의한 IL-8 생성을 감염 후 7일(도 11d), 감염 후 14일(도 11e), 및 감염 후 21일 ± 10 ng IL-1β 자극으로 자극 후 7일(도 11f) 후에 나타낸다. x축은 표시된 바와 같이 PCRX-201 및 PCRX-201 + IL-1β의 상이한 자극 MOI를 도시하며, y축은 ELISA로 결정된 세포 배양 상층액 중의 pg/ml의 IL-8의 농도를 도시한다. 시험된 6명의 환자 각각으로부터의 NP 세포에 의해 생성된 IL-8의 농도는 표시된 바와 같이 점으로 표시된다. 특정 자극 그룹에서 NP 세포에 의해 생성된 IL-8의 평균 수준도 표시된다. 상이한 자극 그룹 간의 단백질 농도 차이의 유의성이 표시된다(*).
도 12a는 PCRX-201로 감염된 3D 인간 NP 세포에 의한 MMP3 생성의 실시양태를 도시한다. 세포 배양 상층액 내의 PCRX-201(MOI 0, 750 및 3000)로 감염된 (n=6 환자로부터의) 3D 배양된 인간 NP 세포에 의한 MMP3 생성을 감염 후 21일 ± 10 ng IL-1β 자극으로 자극 후 7일(도 12a) 후에 나타낸다. x축은 표시된 바와 같이 PCRX-201 및 PCRX-201 + IL-1β의 상이한 자극 MOI를 도시하며, y축은 ELISA로 결정된 세포 배양 상층액 중의 pg/ml의 MMP3의 농도를 도시한다. 시험된 6명의 환자 각각으로부터의 NP 세포에 의해 생성된 MMP3의 농도는 표시된 바와 같이 점으로 표시된다. 특정 자극 그룹에서 NP 세포에 의해 생성된 MMP3의 평균 수준도 표시된다. 상이한 자극 그룹 간의 단백질 농도 차이의 유의성이 표시된다(*).
도 12b는 PCRX-201로 감염된 3D 인간 NP 세포에 의한 ADAMTS4 생성의 실시양태를 도시한다. 세포 배양 상층액 내의 PCRX-201(MOI 0, 750 및 3000)로 감염된 (n=6 환자로부터의) 3D 배양된 인간 NP 세포에 의한 ADAMTS4 생성을 감염 후 21일 ± 10 ng IL-1β 자극으로 자극 후 7일(도 12b) 후에 나타낸다. x축은 표시된 바와 같이 PCRX-201 및 PCRX-201 + IL-1β의 상이한 자극 MOI를 도시하며, y축은 ELISA로 결정된 세포 배양 상층액 중의 pg/ml의 단백질의 농도를 도시한다. 시험된 6명의 환자 각각으로부터의 NP 세포에 의해 생성된 ADAMTS4의 농도는 표시된 바와 같이 점으로 표시된다. 특정 자극 그룹에서 NP 세포에 의해 생성된 ADAMTS4의 평균 수준도 표시된다. 상이한 자극 그룹 간의 단백질 농도 차이의 유의성이 표시된다(*).
도 13a-13e는 PCRX-201 감염된 세포의 측분비 효과의 실시양태를 도시한다. PCRX-201 감염된 세포로부터의 환자 매칭된 조건화된 배지로부터의 조건화된 배지와 함께/없이 처리된 퇴행성 디스크로부터 유래된 인간 NP 세포의 처리 후 IL-1Ra(도 13a), IL-1β(도 13b), IL-6(도 13c), MMP 3(도 13d), ADAMTS4(도 13e)에 대한 단백질 생성(*=P<0.05).
도 14는 반구속형 배양 시스템에서 인간 NP 조직 외식편의 실시양태를 도시한다.
도 15a-15b는 배지로 방출된 IL-1Ra 단백질 농도(도 15a) 및, 주사되지 않은 대조군과 함께, ~ MOI 3000의 PCRX-201로 주사된 퇴행성 IVD 샘플로부터의 인간 NP 체외식편에서 IL-1Ra에 대해 면역양성 염색된 세포의 수(도 15b)의 실시양태를 도시한다(*=P<0.05).
도 16a-16g는, 주사되지 않은 대조군과 함께, ~ MOI 3000의 PCRX-201이 주사된 퇴행성 IVD 샘플로부터의 인간 NP 외식편으로부터 배지로 방출된 VEGF(도 16a), IL-1β(도 16b), IL-6(도 16c), MMP 3(도 16d), ADAMTs4(도 16e), 콜라겐 유형 II(도 16f) 및 아그레칸(도 16g)의 농도의 실시양태를 도시한다(*=P<0.05).
도 17a-17f는, 주사되지 않은 대조군과 함께, ~ MOI 3000의 PCRX-201이 주사된 퇴행성 IVD 샘플로부터의 인간 NP 외식편으로부터 배지로 방출된 VEGF(도 17a), NGF(도 17b), IL-1β(도 17c), MMP 3(도 17d), ADAMTs4(도 17e) 및 콜라겐 유형 II(도 17f)에 대한 면역양성 백분율의 실시양태를 도시한다(*=P<0.05).
도 2는 본 개시내용의 헬퍼 의존적 아데노바이러스 벡터의 실시양태의 기본 유전자 맵을 도시한다. 벡터 백본은 좌측 및 우측 역위 말단 반복부(ITR), 아데노바이러스 패키징 신호(Ψ) 및 비-코딩, 비-바이러스 스터퍼 서열(ITR 사이의 남아 있는 표시되지 않은 서열)로 이루어진다. 인간 IL-1Ra, 말 IL-1Ra(GQ-201), 또는 뮤린 IL-1Ra의 cDNA는 사용된 아데노바이러스 기반 벡터의 바이러스 좌측 및 우측 ITR 사이에 클로닝된다. IL-1-Ra의 유전자의 발현은 염증 민감성 NF-κB5-ELAM 프로모터에 의해 조절된다.
도 3a-3d는 감염 후 24시간(도 3a), 48시간(도 3b), 72시간(도 3c) 및 1주(도 3d)에 다양한 MOI의 PCRX-201로 감염된 인간 NP 세포의 대사 활성의 실시양태를 도시한다(*=P<0.05).
도 4는 알기네이트 배양에서 21일 후, 피코 그린 DNA 정량화 키트를 사용하여 측정된 알기네이트 비드 배양당 총 DNA 함량의 실시양태를 도시한다(*=P<0.05).
도 5a-5b는 PCRX-201(일명 FX201)로 감염된 단층 인간 NP 세포에 의한 IL-1Ra 생성의 실시양태를 도시한다. (n=7 환자로부터의) 단층 배양된 인간 NP 세포의 세포 배양 상등액 내의 IL-1Ra 생성은 10 ng IL-1β로 자극한 지 2일 ± 1일 후(도 5a), 및 10 ng IL-1β으로 자극한 지 5일 ± 4일 후(도 5b)에 나타난다. x축은 표시된 바와 같이 PCRX-201 및 PCRX-201 + IL-1β의 상이한 자극 MOI를 도시하며, y축은 ELISA로 결정된 세포 배양 상층액 중의 pg/ml의 IL-1Ra의 농도를 도시한다. 시험된 7명의 환자 각각으로부터의 NP 세포에 의해 생성된 IL-1Ra의 농도는 표시된 바와 같이 점으로 표시된다. 특정 자극 그룹에서 NP 세포에 의해 생성된 IL-1Ra의 평균 수준도 표시된다. 상이한 자극 그룹 간의 단백질 농도 차이의 유의성이 표시된다(*).
도 6a-6d는 PCRX-201로 감염된 3D 인간 NP 세포에 의한 IL-1Ra 생성의 실시양태를 도시한다. 세포 배양 상층액 내의 PCRX-201(MOI 0, 750 및 3000)로 감염된 (n=6 환자로부터의) 3D 배양된 인간 NP 세포에 의한 IL-1Ra의 생성을 감염 후 2일(도 6a), 감염 후 7일(도 6b), 감염 후 14일(도 6c), 및 감염 후 21일 ± 10 ng IL-1β 자극으로 자극 후 7일(도 6d) 후에 나타낸다. x축은 표시된 바와 같이 PCRX-201 및 PCRX-201 + IL-1β의 상이한 자극 MOI를 도시하며, y축은 ELISA로 결정된 세포 배양 상층액 중의 pg/ml의 단백질 농도를 도시한다. 시험된 6명의 환자 각각으로부터의 NP 세포에 의해 생성된 IL-1Ra의 농도는 표시된 바와 같이 점으로 표시된다. 특정 자극 그룹에서 NP 세포에 의해 생성된 IL-1Ra의 평균 농도도 표시된다. 상이한 자극 그룹 간의 단백질 농도 차이의 유의성이 표시된다(*).
도 7a-7h는 PCRX-201로 감염된 퇴행성 NP 세포로부터 IL-1Ra 생성의 장기간 유지의 실시양태를 도시한다. 퇴행성 디스크 조직으로부터 단리된 NP 세포, 비-감염된 대조군 세포 및 MOI 3000의 PCRX-201로 감염된 세포에 의한 IL-1Ra 생성. 2일(도 7a), 1주(도 7b), 2주(도 7c), 3주(도 7d), 4주(도 7e), 6주(도 7f), 8주(도 7g), 10주(도 7h) 동안 3D 알기네이트 비드에서 배양하기 전 48시간 동안 감염된 NP 세포, (*=P<0.05).
도 8은 MOI 750 또는 3000의 PCRX-201로 48시간 감염시킨 후 퇴행성 디스크로부터 단리되고 추가 1주일 동안 100 pg/ml IL-1β 자극 전 14일 동안 알기네이트에서 배양된 NP 세포에서 18s 및 비처리된 대조군에 대해 정규화된 NGF에 대한 상대적 유전자 발현의 실시양태를 도시한다.
도 9a-9d는 PCRX-201로 감염된 3D 인간 NP 세포에 의한 VEGF 생성의 실시양태를 도시한다. 세포 배양 상층액 내의 PCRX-201(MOI 0, 750 및 3000)로 감염된 (n=6 환자로부터의) 3D 배양된 인간 NP 세포에 의한 VEGF 생성을 감염 후 2일(도 9a), 감염 후 7일(도 9b), 감염 후 14일(도 9c), 및 감염 후 21일 ± 10 ng IL-1β 자극으로 자극 후 7일(도 9d) 후에 나타낸다. x축은 표시된 바와 같이 PCRX-201 및 PCRX-201 + IL-1β의 상이한 자극 MOI를 도시하며, y축은 ELISA로 결정된 세포 배양 상층액 중의 pg/ml의 단백질 농도를 도시한다. 시험된 6명의 환자 각각으로부터의 NP 세포에 의해 생성된 VEGF의 농도는 표시된 바와 같이 점으로 표시된다. 특정 자극 그룹에서 NP 세포에 의해 생성된 VEGF의 평균 수준도 표시된다. 상이한 자극 그룹 간의 단백질 농도 차이의 유의성이 표시된다(*).
도 10a-10d는 PCRX-201로 감염된 3D 인간 NP 세포에 의한 IL-1β 생성의 실시양태를 도시한다. 세포 배양 상층액 내의 PCRX-201(MOI 0, 750 및 3000)로 감염된 (n=6 환자로부터의) 3D 배양된 인간 NP 세포에 의한 IL-1β 생성을 감염 후 2일(도 10a), 감염 후 7일(도 10b), 감염 후 14일(도 10c), 및 감염 후 21일 ± 10 ng IL-1β 자극으로 자극 후 7일(도 10d) 후에 나타낸다. x축은 표시된 바와 같이 PCRX-201 및 PCRX-201 + IL-1β의 상이한 자극 MOI를 도시하며, y축은 ELISA로 결정된 세포 배양 상층액 중의 pg/ml의 단백질 농도를 도시한다. 시험된 6명의 환자 각각으로부터의 NP 세포에 의해 생성된 IL-1β의 농도는 표시된 바와 같이 점으로 표시된다. 특정 자극 그룹에서 NP 세포에 의해 생성된 IL-1β의 평균 수준도 표시된다. 상이한 자극 그룹 간의 단백질 농도 차이의 유의성이 표시된다(*).
도 11a-11c는 PCRX-201로 감염된 3D 인간 NP 세포에 의한 IL-6 생성의 실시양태를 도시한다. 세포 배양 상층액 내의 PCRX-201(MOI 0, 750 및 3000)로 감염된 (n=6 환자로부터의) 3D 배양된 인간 NP 세포에 의한 IL-6 생성을 감염 후 7일(도 11a), 감염 후 14일(도 11b), 및 감염 후 21일 ± 10 ng IL-1β 자극으로 자극 후 7일(도 11c) 후에 나타낸다. x축은 표시된 바와 같이 PCRX-201 및 PCRX-201 + IL-1β의 상이한 자극 MOI를 도시하며, y축은 ELISA로 결정된 세포 배양 상층액 중의 pg/ml의 단백질 농도를 도시한다. 시험된 6명의 환자 각각으로부터의 NP 세포에 의해 생성된 IL-6의 농도는 표시된 바와 같이 점으로 표시된다. 특정 자극 그룹에서 NP 세포에 의해 생성된 IL-6의 평균 수준도 표시된다. 상이한 자극 그룹 간의 단백질 농도 차이의 유의성이 표시된다(*).
도 11d-11f는 PCRX-201로 감염된 3D 인간 NP 세포에 의한 IL-8 생성의 실시양태를 도시한다. 세포 배양 상층액 내의 PCRX-201(MOI 0, 750 및 3000)로 감염된 (n=6 환자로부터의) 3D 배양된 인간 NP 세포에 의한 IL-8 생성을 감염 후 7일(도 11d), 감염 후 14일(도 11e), 및 감염 후 21일 ± 10 ng IL-1β 자극으로 자극 후 7일(도 11f) 후에 나타낸다. x축은 표시된 바와 같이 PCRX-201 및 PCRX-201 + IL-1β의 상이한 자극 MOI를 도시하며, y축은 ELISA로 결정된 세포 배양 상층액 중의 pg/ml의 IL-8의 농도를 도시한다. 시험된 6명의 환자 각각으로부터의 NP 세포에 의해 생성된 IL-8의 농도는 표시된 바와 같이 점으로 표시된다. 특정 자극 그룹에서 NP 세포에 의해 생성된 IL-8의 평균 수준도 표시된다. 상이한 자극 그룹 간의 단백질 농도 차이의 유의성이 표시된다(*).
도 12a는 PCRX-201로 감염된 3D 인간 NP 세포에 의한 MMP3 생성의 실시양태를 도시한다. 세포 배양 상층액 내의 PCRX-201(MOI 0, 750 및 3000)로 감염된 (n=6 환자로부터의) 3D 배양된 인간 NP 세포에 의한 MMP3 생성을 감염 후 21일 ± 10 ng IL-1β 자극으로 자극 후 7일(도 12a) 후에 나타낸다. x축은 표시된 바와 같이 PCRX-201 및 PCRX-201 + IL-1β의 상이한 자극 MOI를 도시하며, y축은 ELISA로 결정된 세포 배양 상층액 중의 pg/ml의 MMP3의 농도를 도시한다. 시험된 6명의 환자 각각으로부터의 NP 세포에 의해 생성된 MMP3의 농도는 표시된 바와 같이 점으로 표시된다. 특정 자극 그룹에서 NP 세포에 의해 생성된 MMP3의 평균 수준도 표시된다. 상이한 자극 그룹 간의 단백질 농도 차이의 유의성이 표시된다(*).
도 12b는 PCRX-201로 감염된 3D 인간 NP 세포에 의한 ADAMTS4 생성의 실시양태를 도시한다. 세포 배양 상층액 내의 PCRX-201(MOI 0, 750 및 3000)로 감염된 (n=6 환자로부터의) 3D 배양된 인간 NP 세포에 의한 ADAMTS4 생성을 감염 후 21일 ± 10 ng IL-1β 자극으로 자극 후 7일(도 12b) 후에 나타낸다. x축은 표시된 바와 같이 PCRX-201 및 PCRX-201 + IL-1β의 상이한 자극 MOI를 도시하며, y축은 ELISA로 결정된 세포 배양 상층액 중의 pg/ml의 단백질의 농도를 도시한다. 시험된 6명의 환자 각각으로부터의 NP 세포에 의해 생성된 ADAMTS4의 농도는 표시된 바와 같이 점으로 표시된다. 특정 자극 그룹에서 NP 세포에 의해 생성된 ADAMTS4의 평균 수준도 표시된다. 상이한 자극 그룹 간의 단백질 농도 차이의 유의성이 표시된다(*).
도 13a-13e는 PCRX-201 감염된 세포의 측분비 효과의 실시양태를 도시한다. PCRX-201 감염된 세포로부터의 환자 매칭된 조건화된 배지로부터의 조건화된 배지와 함께/없이 처리된 퇴행성 디스크로부터 유래된 인간 NP 세포의 처리 후 IL-1Ra(도 13a), IL-1β(도 13b), IL-6(도 13c), MMP 3(도 13d), ADAMTS4(도 13e)에 대한 단백질 생성(*=P<0.05).
도 14는 반구속형 배양 시스템에서 인간 NP 조직 외식편의 실시양태를 도시한다.
도 15a-15b는 배지로 방출된 IL-1Ra 단백질 농도(도 15a) 및, 주사되지 않은 대조군과 함께, ~ MOI 3000의 PCRX-201로 주사된 퇴행성 IVD 샘플로부터의 인간 NP 체외식편에서 IL-1Ra에 대해 면역양성 염색된 세포의 수(도 15b)의 실시양태를 도시한다(*=P<0.05).
도 16a-16g는, 주사되지 않은 대조군과 함께, ~ MOI 3000의 PCRX-201이 주사된 퇴행성 IVD 샘플로부터의 인간 NP 외식편으로부터 배지로 방출된 VEGF(도 16a), IL-1β(도 16b), IL-6(도 16c), MMP 3(도 16d), ADAMTs4(도 16e), 콜라겐 유형 II(도 16f) 및 아그레칸(도 16g)의 농도의 실시양태를 도시한다(*=P<0.05).
도 17a-17f는, 주사되지 않은 대조군과 함께, ~ MOI 3000의 PCRX-201이 주사된 퇴행성 IVD 샘플로부터의 인간 NP 외식편으로부터 배지로 방출된 VEGF(도 17a), NGF(도 17b), IL-1β(도 17c), MMP 3(도 17d), ADAMTs4(도 17e) 및 콜라겐 유형 II(도 17f)에 대한 면역양성 백분율의 실시양태를 도시한다(*=P<0.05).
본 개시내용은 퇴행성 디스크 질환(DDD) 또는 DDD와 관련된 병태를 앓고 있는 대상체의 추간판의 세포를 포함한 추간판의 세포에서 생물학적 활성 재조합 인터루킨-1 수용체 길항제(IL-1Ra)의 장기간 발현을 가능하게 하는 개선된 전달 및 발현 시스템을 위한 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 이들 조성물은 퇴행성 디스크 질환(DDD) 또는 DDD와 관련된 병태의 치료에 사용된다. DDD 또는 DDD와 관련된 병태의 환자의 치료를 위해 개발 중인 추간판에 투여하기 위한 신규한 IL-1Ra 유전자 요법(FX201, 휴먼타키노겐 하데노벡, PCRX-201로도 지칭됨)이 본원에 개시된다. FX201(휴먼타키노겐 하데노벡, PCRX-201)은 DDD 또는 DDD와 관련된 병태를 갖는 환자의 추간판에 투여하기 위한 핵 인자-κB(NF-κB) 유도성 프로모터의 제어 하에 인간 IL-1Ra를 코딩하는 핵산 서열을 전달하는 헬퍼 의존적 아데노바이러스(HDAd)이다. 일부 실시양태에서, 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템은 인터루킨-1 수용체 길항제(IL-1Ra) 단백질 이외의 하나 이상의 단백질을 코딩하는 핵산을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 추가 단백질은 DDD 또는 DDD와 관련된 병태를 치료하기 위한 치료 단백질이다.
본원에 기재된 용어 "퇴행성 디스크 질환(DDD) 또는 DDD와 관련된 병태의 치료" 또는 "DDD의 치료"는 본 개시내용을 고려하여 읽을 때 일반적이고 관례적인 의미를 가지며, 이를 앓고 있는 대상체의 하나 이상의 추간판에서 DDD의 발병 또는 발달의 방지는 포괄하지 않지만 이를 앓고 있는 대상체의 하나 이상의 추간판에서 기존 DDD 또는 DDD와 관련된 병태의 진행의 억제 또는 폐지를 포괄한다. 일부 측면에서, "퇴행성 디스크 질환(DDD) 또는 DDD와 관련된 병태의 치료" 또는 "DDD의 치료"는 또한 이를 앓고 있는 대상체의 하나 이상의 추간판에서 DDD 또는 DDD와 관련된 병태의 역전 또는 이로부터의 회복을 포괄한다. 용어 "방지"는 본 개시내용을 고려하여 읽을 때 일반적이고 관례적인 의미를 가지며, 당업계에 공지된 바와 같이 이를 필요로 하는 대상체의 하나 이상의 추간판에서 DDD 또는 DDD와 관련된 것으로 공지된 특징/병태의 발달을 방지 또는 정지하는 것을 포괄하며, 대상체의 하나 이상의 추간판은 아직 DDD 또는 DDD와 관련된 것으로 공지된 특징/병태를 나타내지 않는다.
본 개시내용은 포유동물(예컨대, 인간) 인터루킨-1 수용체 길항제(IL-1Ra) 단백질, 예컨대 FX201을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템(아데노바이러스 기반 벡터)의 추간판 주사(즉, 추간판내 주사)를 위한 조성물을 제공한다. 추간판 주사 후, 아데노바이러스 전달 및 발현 시스템은 추간판 내 세포를 감염시켜 염증에 반응하여 국소적으로 IL-1Ra를 생성한다. 일부 실시양태에서, 아데노바이러스 전달 및 발현 시스템(예컨대, FX201)은 IL-1Ra(예컨대, 인간 IL-1Ra)에 대한 유전자 코딩 서열을 보유하도록 조작된 바이러스 코딩 서열이 없는 비-복제, 비-통합 HDAd 벡터이다. 일부 실시양태에서, 제조에 필요한 아데노바이러스 패키징 신호 및 역위 말단 반복부(ITR)만이 아데노바이러스 게놈에 남아 있다. 일부 실시양태에서, 전사는 염증 환경에 반응하여 IL-1Ra의 발현을 유도하는 염증 민감성 NF-κB 유도성 프로모터에 의해 제어된다. 일부 실시양태에서, 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템은 인터루킨-1 수용체 길항제(IL-1Ra) 단백질 이외의 하나 이상의 단백질을 코딩하는 핵산을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 추가 단백질은 DDD 또는 DDD와 관련된 병태를 치료하기 위한 치료 단백질이다.
일부 실시양태에서, 아데노바이러스 전달 및 발현 시스템은 추간판 주사(추간판내)에 의해 단일 용량으로 투여된다. 예상되는 임상적 이익은 통증 감소, 기능 개선 또는 회복, DDD 환자 또는 DDD와 관련된 병태를 갖는 환자의 기저 질환 과정의 유익한 변형을 포함한 지속적인 증상 완화이다. 유리하게는, 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 아데노바이러스 전달 및 발현 시스템은 추간판에 투여될 때 추간판의 세포에 특이적으로 위치한다. 따라서, 일부 실시양태에서, IL-1Ra 농도는 본 개시내용의 벡터가 주사된 추간판에서 가장 높고, 임의의 다른 기관에서 유의미한 부작용이 존재하지 않는다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 조성물의 아데노바이러스 전달 및 발현 시스템은 PCT 출원 번호: PCT/US2020/051642(공개 번호: WO2021/055860)(이의 전체 내용은 참조로 본원에 포함됨)에 개시된 것과 동일하다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 조성물의 아데노바이러스 전달 및 발현 시스템은 PCT 출원 번호: PCT/IB2013/000198(공개 번호: WO2013/114199)(이의 전체 내용은 참조로 본원에 포함됨)에 개시된 것과 동일하다. 아데노바이러스 전달 및 발현 시스템의 실시양태의 특성은 후술된다.
벡터 백본: 일부 실시양태에서, (예컨대, FX201) 아데노바이러스 전달 및 발현 시스템은 비-복제, 비-통합 HDAd 벡터이다. 게놈 성분은 크기가 대략 29.3 킬로베이스(kb)인 이중 가닥 선형 DNA로 구성된다. 일부 실시양태에서, (예컨대, FX201) 아데노바이러스 전달 및 발현 시스템 게놈은 제조를 가능하게 하기 위해 증폭 및 패키징에 필요한 최소 아데노바이러스 요소: 좌측 및 우측 역위 말단 반복부(이하 각각 "L ITR" 및 "R ITR"로 지칭됨) 및 패키징 신호(Ψ)를 함유한다. 일부 실시양태에서, 아데노바이러스 전달 및 발현 시스템(예컨대, FX201) 게놈의 대략 1.1 kb는 게놈의 우측 끝에 역방향으로(우측에서 좌측으로) 삽입된 인간 IL-1Ra를 코딩하는 핵산 서열 및 R ITR 바로 앞에 위치된 프로모터로 구성된다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 전염증성 시토카인에 반응하는 인간 ELAM 유전자의 근위 프로모터 영역에 융합된 5종의 보존된 NF-κB 결합 모티프 반복부이다(Schindler 1994). 일부 실시양태에서, 아데노바이러스 전달 및 발현 시스템(예컨대, FX201) 게놈의 대략 27 kb는 인간 히포잔틴 포스포리보실트랜스퍼라제(HPRT) 및 인간 코스미드 삽입물로 구성된 비-코딩 스터퍼 서열로 이루어지며, 이는 벡터 게놈을 각각의 바이러스 입자로 효율적으로 패키징하는 것을 가능하게 하는 크기로 게놈을 확대하기 위해 삽입된다. 아데노바이러스 전달 및 발현 시스템인 FX201의 실시양태에 대한 게놈 맵은 도 1에 제시된다.
관심 유전자: 일부 실시양태에서, (예컨대, FX201) 아데노바이러스 전달 및 발현 시스템 게놈은 인간 IL-1Ra의 534개 염기쌍(bp) 서열을 함유하고, 이는 NF-κB 유도성 프로모터의 262 bp 서열에 의해 조절된다.
FX201의 유전자 맵 및 본 개시내용의 HDAd 벡터의 실시양태가 본원에 개시된다(도 2). 본 개시내용의 HdAd 벡터는 서열번호 1 또는 4 중 어느 하나에 따른 IL-1Ra cDNA 상류의 염증 민감성 NF-κB5-ELAM 프로모터 뿐만 아니라 ITR 및 아데노바이러스 패키징 신호를 함유할 수 있다. HDAd-mIL-1Ra, GQ-201, 및 HDAd-인간 IL-1Ra의 전체 벡터 서열은 각각 서열번호 2, 3 및 7에 표시된다. 3가지 벡터 간의 유일한 차이는 GQ-201이 IL-1Ra의 말 변이체를 보유하고, HDAd-mIL-Ra가 뮤린 IL-1Ra 변이체를 갖고, HDAd-huIL-1Ra가 인간 IL-1Ra를 보유한다는 것이다. 예로서, 서열번호 3에 따른 핵산 서열의 HDAd-mIL-Ra는 서열번호 1에 따른 뮤린 IL-1Ra를 코딩하는 핵산을 포함할 수 있다. 예로서, 서열번호 7에 따른 핵산 서열의 HDAd-인간 IL-Ra는 서열번호 4에 따른 인간 IL-1Ra를 코딩하는 핵산을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템은 인터루킨-1 수용체 길항제(IL-1Ra) 단백질 이외의 하나 이상의 단백질을 코딩하는 핵산을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 추가 단백질은 DDD 또는 DDD와 관련된 병태를 치료하기 위한 치료 단백질이다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 벡터는 하기 전략에 따라 표준 분해/리게이션 반응에 의해 클로닝된다. NF-κB5-ELAM 프로모터에 의해 유도되는 루시퍼라제 cDNA를 포함하는 플라스미드인 pNifty-luc 내의 루시퍼라제 cDNA를 Ncol 및 Nhel로 잘라내고 말, 뮤린 또는 인간 IL-1Ra에 대한 cDNA를 이 위치에 리게이션하였다. NF-κB5-ELAM 프로모터 - 뮤린 IL-1Ra 또는 NF-κB5-ELAM 프로모터 - 말 IL-1Ra 또는 NF-κB5-ELAM 프로모터 - 인간 IL-1Ra 카세트를 Notl 및 Pad 또는 EcoRI 및 Pad로 잘라내고, 평활말단화하고, Sail로 선형화되고 평활말단화된 pLPBL 셔틀 플라스미드에 삽입하였다. 이어서, NF-κB5-ELAM 프로모터 - 뮤린 IL-1Ra 또는 NF-κB5-ELAM 프로모터 - 말 IL-1Ra 또는 NF-κB5-ELAM 프로모터 - 인간 IL-1Ra 카세트를 다중 클로닝 부위의 양측 옆에 배치된 Ascl로 잘라내고, Ascl 선형화된 ρ△28 플라스미드에 리게이션하여(Toietta, G., Pastore, L, Cerullo, V., Finegold, M., Beaudet, A.L., and Lee, B. (2002). Generation of helper-dependent adenoviral-based vectors by homologous recombination. Mol Ther 5, 204-210.) 게놈 플라스미드 pA28-mll-1Ra, pA28-eqll-1Ra and pA28- hull-1Ra를 산출하였다. 벡터를 선형화하고, 역위 말단 반복부를 유리시키고, 세균 내성 유전자를 잘라내기 위해 이러한 플라스미드를 Pmel로 분해하였다. 헬퍼 바이러스 AdNG163R-2 및 116 세포 팩토리를 사용하기 전에 기재된 바와 같이 벡터를 구조하고 증폭시켰다(Palmer, D., and Ng, P. (2003). Improved system for helper-dependent adenoviral vector production. Mol Ther 8, 846-852 ;Suzuki, M., Cela, R., Clarke, C, Bertin, T.K., Mourino, S., and Lee, B. (2010). Large-scale production of high-quality helper-dependent adenoviral-based vectors using adherent cells in cell factories. Hum Gene Ther 21, 120-126.)
본 개시내용의 조성물
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 조성물은 아데노바이러스 기반 벡터에 기반한 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템을 포함할 수 있으며, 아데노바이러스 기반 벡터는 인간 또는 포유동물 인터루킨-1 수용체 길항제(IL-1Ra)를 코딩하는 핵산 서열, L ITR, R ITR, 아데노바이러스 패키징 신호 및 비-바이러스, 비-코딩 스터퍼 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, IL-1Ra를 코딩하는 핵산 서열은 뮤린 Il-1Ra, 말 1-1Ra, 개 Il-1Ra, 고양이 Il-1Ra, 토끼 Il-1Ra, 햄스터 Il-1Ra, 소 Il-1Ra, 낙타 Il-1Ra 및 다른 포유동물 종의 상동체로 이루어진 군으로부터 선택되는 Il-1Ra의 cDNA 서열을 함유한다. 일부 실시양태에서, 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템은 인터루킨-1 수용체 길항제(IL-1Ra) 단백질 이외의 하나 이상의 단백질을 코딩하는 핵산을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 추가 단백질은 DDD 또는 DDD와 관련된 병태를 치료하기 위한 치료 단백질이다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 아데노바이러스 기반 벡터는 숙주에서 면역 반응을 최소화하고 DDD에 의해 영향을 받는 추간판을 포함한 추간판에서 인간 또는 포유동물 IL-1Ra의 장기간 유전자 발현을 부여할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 아데노바이러스 기반 벡터는 헬퍼 의존적 아데노바이러스 기반 벡터(HDAd)이다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 조성물에서 인간 또는 포유동물 인터루킨-1 수용체 길항제(IL-1Ra)를 코딩하는 서열은 염증 민감성 프로모터에 의해 제어된다. 이론에 구애됨이 없이, 본 개시내용의 조성물에서 염증 민감성 프로모터의 사용은 DDD 또는 DDD와 관련된 병태를 앓고 있는 추간판의 조직 및 세포에서 IL-1Ra 유전자 발현의 특정 제어를 제공하며, 이는 질환 또는 질환과 관련된 병태에 의해 영향을 받는 세포만이 IL-1Ra 유전자 생성물을 발현 및 분비할 것인 반면, 영향을 받지 않는 세포는 IL-1Ra를 발현 및 분비하지 않을 것이기 때문이다. 일부 측면에서, 프로모터 서열은 인간 또는 포유동물 IL-1Ra를 코딩하는 서열의 판독 프레임의 상류에 위치된다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 조성물에 사용되는 염증 민감성 프로모터는 면역 자극 물질 및/또는 시토카인을 포함하는 증가된 수준의 인자에 의해 특이적으로 활성화된다. 이론에 구애됨이 없이, DDD 또는 DDD와 관련된 병태 동안 다양한 면역 자극 물질 및 시토카인이 방출되어 높은 수준의 프로모터 활성화 물질이 생성된다. 비제한적인 예에서, 면역 자극 물질은 IL-1이며, 이는 DDD의 발달 및 발병 및 추간판 기질 분해 유도에 중추적인 역할을 하는 것으로 공지되어 있다. 방출된 면역 자극 물질 및/또는 시토카인은 NF-κB 프로모터를 조절하는 NF-κB와 같은 전사 인자를 활성화시킬 수 있다. 따라서, 이러한 DDD 또는 DDD 관련된 병태 특이적 면역 자극 물질 및/또는 시토카인의 방출은 DDD 및 DDD와 관련된 병태를 앓고 있는 인간 또는 포유동물의 추간판에서 유전자 발현의 제어를 가능하게 할 수 있다. 일부 실시양태에서, 이러한 DDD 또는 DDD 관련된 병태 특이적 면역 자극 물질 및/또는 시토카인의 방출은 DDD 및 DDD 관련된 병태를 치료 또는 방지하기 위해 인간 또는 포유동물의 추간판에서 유전자 발현의 제어를 가능하게 할 수 있다.
일부 실시양태에서, 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템으로 감염된 퇴행성 디스크의 세포만이 IL-1Ra를 생성한다. 일부 실시양태에서, 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템으로 감염된 퇴행성 디스크의 세포에 의해 생성된 IL-1Ra는 자가분비 방식으로 추간판 세포의 IL-1 수용체에 작용한다. 일부 실시양태에서, 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템으로 감염된 퇴행성 디스크의 세포에 의해 생성된 IL-1Ra는 추간판 세포 및/또는 추간판 주변 조직의 세포의 IL-1 수용체에 측분비 방식으로 작용한다. 본원에 기재된 용어 "자가분비"는 본 개시내용을 고려하여 읽을 때 일반적이고 관례적인 의미를 가지며, 세포에 의해 생성된 분자가 인자 자체를 생성하는 세포에 작용하는 경우이다. 본원에 기재된 용어 "측분비"는 본 개시내용을 고려하여 읽을 때 일반적이고 관례적인 의미를 가지며, 세포에 의해 생성된 분자가 주변 조직에서 그 자체가 아닌 세포에 작용하는 경우이다. 일부 실시양태에서, 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템으로 감염된 퇴행성 디스크의 세포에 의해 생성된 IL-1Ra는 동일한 퇴행성 추간판의 세포의 IL-1 수용체에 작용한다. 일부 실시양태에서, 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템으로 감염된 퇴행성 디스크의 세포에 의해 생성된 IL-1Ra는 주변의 다른 퇴행된 추간판의 세포의 IL-1 수용체에 작용한다. 일부 실시양태에서, 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템으로 감염된 퇴행성 디스크의 세포에 의해 생성된 IL-1Ra는 주변의 다른 비-퇴행성 추간판의 세포의 IL-1 수용체에 작용한다. 일부 실시양태에서, 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템으로 감염된 퇴행성 디스크의 세포에 의해 생성된 IL-1Ra는 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템으로 감염된 퇴행성 디스크 주변 조직의 세포에 직접적으로 또는 간접적으로 작용한다. 일부 실시양태에서, 퇴행성 디스크 주변 조직은 혈관, 신경 조직, 근육, 인대, 힘줄, 골격 조직(예컨대, 척추골) 또는 척수 조직 또는 이들의 조합이다. 혈관은 척주 또는 이의 임의의 가지로 또는 이로부터 혈액을 운반하는 혈관일 수 있다. 신경 조직은 척주 또는 이의 임의의 가지를 자극하는 신경일 수 있다.
본 개시내용과 관련하여 임의의 염증 민감성 프로모터가 사용될 수 있는 것으로 고려된다. 일부 실시양태에서, 염증 민감성 프로모터는 DDD 또는 DDD와 관련된 병태를 갖는 추간판의 세포 및 조직에서 IL-1Ra 유전자 생성물의 특이적 발현을 초래하는 것으로 고려된다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용에 사용하기 위한 염증 민감성 프로모터는 NF-κB, 인터루킨 6(II-6), 인터루킨-1(IL-1), 종양 괴사 인자( TNF), 사이클로옥시게나제 2(COX-2), 보체 인자 3(C3), 혈청 아밀로이드 A3(SAA3), 대식세포 염증성 단백질-1a(MIP-1a), 또는 상기의 하이브리드 구조물, 또는 달리 본원에 개시된 것에 의해 유도 가능한 프로모터를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
일부 실시양태에서, 염증 민감성 프로모터는 NF-κ B5-ELAM 프로모터이다. 인간 내피 백혈구 부착 분자(ELAM) 유전자의 근위 프로모터 영역에 융합된 5종의 보존된 NF-κB 결합 모티프 반복부로 구성된 NF-κB 유도성 프로모터는 여러 가지 이유로 IL-1Ra의 발현을 유도하기 위해 선택되었다. 첫째, 전사 인자로서의 NF-κB는 신체의 모든 세포에서 보편적으로 발현되며, 임의의 형질도입된 세포는 염증 신호로 자극될 때 원칙적으로 IL-1Ra 트랜스진을 발현할 수 있다. 따라서, IL-1Ra 발현을 유도하기 위한 세포 특이성 요건은 없다. 또한, NF-κB는 인터루킨-1(IL-1) 및 종양 괴사 인자-α와 같은 전염증성 시토카인의 수용체 및 많은 전염증성 입력에 대한 세포 반응을 개시하는 역할을 하는 톨 유사 수용체와 같은 다른 면역 세포 수용체에 대한 말단 신호전달 분자이다. 따라서, IL-1Ra 생성의 활성화는 다양한 염증 신호에 의해 추간판에서 자극되도록 설계되었다. 일부 실시양태에서, 염증 민감성 프로모터는 NF-κB 유도성 프로모터와 이러한 특색 중 하나 이상을 공유한다.
일부 실시양태에서, 추간판 주사 후, IL-1Ra의 유전자는 중앙 젤라틴성 수핵(NP) 영역(수핵(NP) 세포)을 포함하지만 이에 제한되지 않는 추간판 세포로 전달된다. 일부 실시양태에서, 주사 후, 염증에 의해 영향을 받는 NP 세포는 염증 민감성 프로모터(예컨대, NF-κB 프로모터)의 제어 하에 재조합 IL-1Ra 단백질을 생성하기 시작한다. 일부 실시양태에서, 이후 다량의 IL-1Ra가 추간판 공간으로 분비되며, IL-1Ra는 염증 및 이화 단백질을 억제하고/하거나 NP 세포 및 추간판 영역 및 공간 내에 묻힌 다른 세포의 표면 상의 인터루킨-1 수용체를 차단함으로써 연골 분해를 정지 또는 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 재조합 IL-1Ra의 높은 국소 농도는 어떠한 부작용도 초래하지 않는다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 바와 같이, DDD의 추간판 발병에 관여하는 추간판 분해 및 단백질은 본 개시내용의 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템을 사용하여 효과적으로 억제된다. 일부 실시양태에서, 치료 단백질 IL-1Ra의 높은 국소 농도 및 낮은 전신 농도는 본 개시내용의 조성물의 투여를 통해 달성된다. 일부 실시양태에서, 결과는 부작용이 없거나 최소화된 부작용으로 DDD 치료에서 효능이 높다.
일부 실시양태에서, 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템으로 감염된 이를 필요로 하는 대상체의 하나 이상의 추간판 세포는 적어도 2주, 적어도 1개월, 적어도 3개월, 적어도 6개월 또는 적어도 1년의 기간 동안 IL-1Ra를 발현한다. 결과적으로, 일부 실시양태에서, 단기 치료에 필요한 빈번한 추간판 주사와 관련된 의학적 및 경제적 부담이 상당히 감소된다. 일부 실시양태에서, 퇴행된 디스크 장애 치료와 관련된 잠재적인 합병증이 최소화되고 추간판 건강이 보존되어 치료 대상체(예컨대, 인간)의 지속적인 건강 개선을 초래한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템(아데노바이러스 기반 벡터)의 염증 민감성 IL-1Ra 생성은, 본 개시내용의 아데노바이러스 기반 벡터로 감염된 추간판 내의 세포가 NF-κB5-ELAM 프로모터 또는 임의의 다른 염증 민감성 프로모터를 활성화시킬 수 있는 면역 자극 물질의 부재 하에서는 IL-1Ra 유전자를 발현하지 않는 채로 남아 있으므로, DDD의 발달의 방지를 가능하게 한다. DDD의 발병이 시작되는 경우에만 염증의 결과로 프로모터가 활성화되고 이후 IL-1Ra가 생성되어 분비된다. 따라서, 본 개시내용의 아데노바이러스 전달 및 발현 시스템을 사용함으로써, 이 메커니즘은 초기 단계에서 DDD의 발달의 방지를 가능하게 한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 아데노바이러스 기반 벡터의 염증 민감성 IL-1Ra 생성은 DDD 병태가 해소되거나 사라지면 IL-1Ra가 더 이상 생성되지 않게 된다. 결과적으로, 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 아데노바이러스 기반 벡터의 염증 민감성 IL-1Ra 생성은 대상체에게 투여하기에 더 안전하다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 아데노바이러스 기반 벡터는 L ITR, R ITR 및 아데노바이러스 패키징 신호를 제외하고는 어떠한 바이러스 서열도 보유하지 않는다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용에 사용된 아데노바이러스 기반 벡터는 문헌(Palmer, D., and Ng, P. (2003). Improved system for helper-dependent adenoviral vector production. Mol Ther 8, 846-852.) 및 문헌(Toietta, G., Pastore, L., Cerullo, V., Finegold, M., Beaudet, A.L., and Lee, B. (2002). Generation of helper-dependent adenoviral-based vectors by homologous recombination. Mol Ther 5, 204-210.)에 의해 개발된 헬퍼 바이러스 및 헬퍼 의존적 백본 시스템에 기반한 헬퍼 의존적 아데노바이러스 기반 벡터이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 아데노바이러스 전달 및 발현 시스템은 프로모터, IL-1Ra를 코딩하는 핵산 서열, 좌측 및 우측 역위 말단 반복부, 아데노바이러스 패키징 신호 및 비-바이러스, 비-코딩 스터퍼 핵산 서열을 포함하는 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템의 핵산 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 아데노바이러스 전달 및 발현 시스템은 서열번호 2, 서열번호 3, 또는 서열번호 7에 제시된 핵산 서열, 또는 이의 생물학적 유효 부분을 포함하거나 이로 이루어진다. 서열번호 2의 핵산 서열은 뮤린 헬퍼 의존적 아데노바이러스 기반 벡터를 기재하고, 서열번호 3에 제시된 서열은 말 헬퍼 의존적 아데노바이러스 기반 벡터를 기재하며, 서열번호 7에 제시된 서열은 인간 헬퍼 의존적 아데노바이러스 기반 벡터를 기재하며, 3가지 벡터 모두 각각 뮤린 IL-1Ra 유전자, 말 IL-1Ra 유전자 또는 인간 IL-1Ra 유전자 중 임의의 하나를 보유한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 시스템은 서열번호 2, 서열번호 3, 또는 서열번호 7에 제시된 벡터와 적어도 96%, 97%, 98% 또는 99% 중 어느 하나의 서열 상동성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 아데노바이러스 전달 및 발현 시스템은 서열번호 2, 서열번호 3, 또는 서열번호 7에 제시된 벡터와 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일하거나, 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 아데노바이러스 전달 및 발현 시스템의 일부 실시양태에서, IL-1Ra를 코딩하는 핵산 서열은 서열번호 4의 핵산과 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일하거나, 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 아데노바이러스 전달 및 발현 시스템의 일부 실시양태에서, IL-1Ra를 코딩하는 핵산 서열은 서열번호 6의 아미노산 서열과 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일하거나, 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 IL-1Ra를 코딩하는 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 인간 인터루킨-1 수용체 길항제(IL-1Ra) 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템을 포함하는, DDD 또는 DDD와 관련된 병태를 갖거나 이를 발병할 위험이 있는 것으로 확인된 대상체의 추간판(들) 세포(들), 예컨대 NP 세포의 감염에 대한 약제학적 조성물, 및 이를 사용하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 핵산 서열은 좌측 및 우측 역위 말단 반복부, 아데노바이러스 패키징 신호 및 비-바이러스 및 비-코딩 스터퍼 핵산 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간 IL-1Ra 유전자의 발현은 인간 IL-1Ra 단백질을 코딩하는 핵산 서열의 판독 프레임의 상류에 위치된 NF-κB 유도성 프로모터에 의해 조절된다. 일부 실시양태에서, 인간 IL-1Ra 유전자는 NF-κB 유도성 프로모터 이외의 염증 민감성 프로모터에 의해 조절된다. 일부 실시양태에서, 염증 민감성 프로모터는 NF-κB, 인터루킨 6(II-6), 인터루킨-1(IL-1), 종양 괴사 인자(TNF), 사이클로옥시게나제 2(COX-2), 보체 인자 3(C3), 혈청 아밀로이드 A3(SAA3), 대식세포 염증 단백질-1a(MIP-1a), 또는 상기의 하이브리드 구축물, 또는 달리 본원에 개시된 것에 의해 유도 가능한 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 이를 필요로 하는 대상체에서 DDD 또는 DDD와 관련된 병태를 치료하기 위한 약제학적 조성물의 아데노바이러스 전달 및 발현 시스템은 서열번호 2, 서열번호 3, 또는 서열번호 7에 제시된 벡터와 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일하거나, 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 약제학적 제제는 대상체에서 추간판 염증 및 이화 활성에 대한 IL-1의 효과를 중화시키고/시키거나 대상체에서 DDD 또는 DDD와 관련된 병태의 하나 이상의 조치의 개선을 제공하기 위한 유효량의 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템을 포함한다. 일부 실시양태에서, 추간판(들) 세포(들), 예컨대, NP 세포의 감염은 약제학적 조성물의 추간판으로의 추간판내 주사에 의해 수행된다. 일부 실시양태에서, 주사는 관절내 주사가 아니다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 인간 인터루킨-1 수용체 길항제(IL-1Ra) 단백질을 코딩하는 핵산 서열, 좌측 및 우측 역위 말단 반복부, 아데노바이러스 패키징 신호 및 비-바이러스 및 비-코딩 스터퍼 핵산 서열을 포함하는 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템의 유효량을 포함하는, DDD 또는 DDD와 관련된 병태의 치료를 필요로 하는 대상체에서 이를 치료하기 위한 약제학적 조성물을 제공하며, 인간 IL-1Ra 유전자의 발현은 인간 IL-1Ra 단백질을 코딩하는 핵산 서열의 판독 프레임의 상류에 위치된 NF-κB 유도성 프로모터에 의해 조절되고, 프로모터, IL-1Ra를 코딩하는 핵산 서열, 좌측 및 우측 역위 말단 반복부, 아데노바이러스 패키징 신호 및 비-바이러스, 비-코딩 스터퍼 핵산 서열을 포함하는 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템의 핵산 서열은 서열번호 7의 핵산 서열과 적어도 95% 상동성이다. 일부 실시양태에서, 인간 IL-1Ra 유전자는 NF-κB 유도성 프로모터 이외의 염증 민감성 프로모터에 의해 조절된다. 일부 실시양태에서, 염증 민감성 프로모터는 NF-κB, 인터루킨 6(II-6), 인터루킨-1(IL-1), 종양 괴사 인자(TNF), 사이클로옥시게나제 2(COX-2), 보체 인자 3(C3), 혈청 아밀로이드 A3(SAA3), 대식세포 염증 단백질-1a(MIP-1a), 또는 상기의 하이브리드 구축물, 또는 달리 본원에 개시된 것에 의해 유도 가능한 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 이를 필요로 하는 대상체에서 DDD 또는 DDD와 관련된 병태를 치료하기 위한 약제학적 조성물의 아데노바이러스 전달 및 발현 시스템은 서열번호 2, 서열번호 3, 또는 서열번호 7에 제시된 벡터와 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일하거나, 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 대상체는 후관절 증후군(FJS)을 갖는다. 일부 실시양태에서, 대상체는 후관절 증후군(FJS)을 갖지 않는다.
일부 실시양태에서, 프로모터, IL-1Ra를 코딩하는 핵산 서열, 좌측 및 우측 역위 말단 반복부, 아데노바이러스 패키징 신호 및 비-바이러스, 비-코딩 스터퍼 핵산 서열을 포함하는 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템의 핵산 서열은 서열번호 7의 핵산 서열과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 상동성이거나 동일하다.
일부 실시양태에서, 프로모터, IL-1Ra를 코딩하는 핵산 서열, 좌측 및 우측 역위 말단 반복부, 아데노바이러스 패키징 신호 및 비-바이러스, 비-코딩 스터퍼 핵산 서열을 포함하는 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템의 핵산 서열은 서열번호 7의 핵산 서열과 적어도 99% 상동성이다. 일부 실시양태에서, 프로모터, IL-1Ra를 코딩하는 핵산 서열, 좌측 및 우측 역위 말단 반복부, 아데노바이러스 패키징 신호 및 비-바이러스, 비-코딩 스터퍼 핵산 서열을 포함하는 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템의 핵산 서열은 서열번호 7의 핵산 서열과 동일하다.
"장기 발현"은 본 개시내용을 고려하여 읽을 때 일반적이고 관례적인 의미를 가지며, 본 개시내용의 맥락에서 아데노바이러스 전달 및 발현 시스템의 유전자 생성물(즉, IL-1Ra)이 본 개시내용의 아데노바이러스 기반 벡터(아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템)로 감염된 추간판(들)에서 적어도 3개월, 적어도 6개월 또는 적어도 12개월 동안 발현되는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, IL-1Ra는 본 개시내용의 아데노바이러스 기반 벡터로 감염된 추간판(들)에서 적어도 3개월 동안 발현된다. 일부 실시양태에서, IL-1Ra는 본 개시내용의 아데노바이러스 기반 벡터로 감염된 추간판(들) 세포, 예컨대 NP 세포에서 하기이거나, 약 하기이거나, 적어도 하기이거나, 적어도 약 하기인 기간 동안 발현된다: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 16, 20, 24, 또는 52주, 또는 이전 값 중 임의의 2개에 의해 정의된 범위, 예컨대 1-24, 1-52, 4-12, 4-24, 8-12, 8-24, 12-24, 또는 8-16주.
"생물학적으로 효과적인"은 본 개시내용을 고려하여 읽을 때 일반적이고 관례적인 의미를 가지며, 본 개시내용의 맥락에서 아데노바이러스 전달 및 발현 시스템의 유전자 생성물이 추간판 염증 및 이화 활성에 대한 IL-1의 효과를 중화시키고/시키거나 DDD 또는 DDD와 관련된 병태의 하나 이상의 조치의 개선을 제공하기 위해 추간판내 활성을 갖는 IL-1Ra의 전체 또는 부분 폴리펩티드 서열을 포함하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 아데노바이러스 기반 벡터(아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템)는 염증 민감성 프로모터의 제어 하에 있는 IL-1Ra의 핵산 서열을 포함한다. IL-1Ra가 종 특이적 핵산 서열을 함유하지만, 일부 실시양태에서, 아데노바이러스 기반 벡터는 임의의 포유동물 종 또는 인간으로부터의 인터루킨-1 수용체 길항제(IL-1Ra)를 발현할 수 있다. 일부 실시양태에서, 클로닝에 사용되고 아데노바이러스 기반 벡터에 포함된 포유동물 인터루킨-1 수용체 길항제(IL-1Ra)의 cDNA는 인간 IL-1Ra, 뮤린 IL-1Ra, 말 IL-1Ra, 개 IL-1Ra, 고양이 II-1Ra, 토끼 IL-1Ra, 햄스터 IL-1Ra, 소 IL-1Ra, 낙타 IL-1Ra 또는 다른 포유동물 종의 상동체로 이루어진 군으로부터 선택되는 cDNA이다. 일부 실시양태에서, 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템은 인터루킨-1 수용체 길항제(IL-1Ra) 단백질 이외의 하나 이상의 단백질을 코딩하는 핵산을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 추가 단백질은 DDD 또는 DDD와 관련된 병태를 치료하기 위한 치료 단백질이다.
일부 실시양태에서, 주사된 추간판의 세포에서 게놈 벡터 서열의 존재를 모니터링하기 위해, 본 개시내용에 따른 아데노바이러스 기반 벡터(아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템)는 시각적으로 또는 도구적으로 검출할 수 있는 마커 유전자를 코딩하는 서열을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 마커 유전자는 녹색 형광 단백질(GFP), LacZ 및 루시퍼라제 효소의 군으로부터 선택되지만 이에 제한되지 않는다.
일부 실시양태에서, 예로서, 본 개시내용에 사용된 바와 같은 뮤린 IL-1Ra의 핵산 서열은 서열번호 1에 제시된 서열 목록에 나타나 있다. 상기 언급된 바와 같이 및 달리 본원에 개시된 바와 같이, 임의의 포유동물 또는 인간 종의 생물학적 활성 IL-1Ra 단백질을 초래하는 임의의 핵산 서열이 본 개시내용의 맥락에서 사용될 수 있다. 또한, 동일한 아미노산, 폴리펩티드 또는 단백질을 코딩하는 보존된 핵산 서열은 본 개시내용의 범위에 속한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 아데노바이러스 기반 벡터는 서열번호 1에 나타낸 핵산 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 상동성을 갖는 IL-1Ra의 핵산 서열(예컨대, cDNA)을 함유한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 또한 IL-1Ra의 생물학적 활성 핵산 서열 또는 이의 단편을 포함한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 헬퍼 의존적 아데노바이러스 기반 벡터는 서열번호 1에 제시된 핵산 서열의 생물학적 활성 단편을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 예로서, 본 개시내용에 사용된 인간 IL-1Ra의 핵산 서열은 서열번호 4에 제시된 서열 목록에 나타나 있다. 상기 언급된 바와 같이 및 달리 본원에서, 일부 실시양태에서, 인간의 생물학적 활성 IL-1Ra 단백질을 초래하는 핵산 서열이 본 개시내용의 맥락에서 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 동일한 아미노산, 폴리펩티드 또는 단백질을 코딩하는 보존된 핵산 서열은 본 개시내용의 범위에 속한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 아데노바이러스 기반 벡터는 서열번호 4에 나타낸 핵산 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 상동성을 갖는 IL-1Ra의 핵산 서열(예컨대, cDNA)을 함유한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 또한 IL-1Ra의 생물학적 활성 핵산 서열 또는 이의 단편을 포함한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 아데노바이러스 기반 벡터는 서열번호 4에 제시된 핵산 서열의 생물학적 활성 단편을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 예로서, 본 개시내용에 사용된 인간 IL-1Ra의 핵산 서열은 서열번호 6과 적어도 95% 상동성이거나 동일한 아미노산 서열의 인간 IL-1Ra 단백질을 발현할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용에 사용된 인간 IL-1Ra의 핵산 서열은 서열번호 6과 적어도 96%, 97%, 98% 또는 99% 상동성이거나 동일한 아미노산 서열의 인간 IL-1Ra 단백질을 발현할 수 있다. 서열번호 4에 제시된 본 개시내용에 사용된 인간 IL-1Ra의 핵산 서열은 서열번호 6과 적어도 99% 상동성이거나 동일한 아미노산 서열의 인간 IL-1Ra 단백질을 발현할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용에 사용된 인간 IL-1Ra의 핵산 서열은 서열번호 6에 따른 아미노산 서열의 인간 IL-1Ra 단백질을 발현할 수 있다.
일부 실시양태에서, 인간-IL-1Ra는 야생형 인간 IL-1Ra 단백질의 아미노산 서열과 적어도 95% 내지 99% 상동성이거나 동일한 아미노산 서열을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 인간-IL-1Ra는 서열번호 6에 따른 아미노산 서열의 인간 IL-1Ra 단백질과 95% 내지 99% 상동성이거나 동일한 아미노산 서열을 가질 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 추간판의 세포에서 IL-1Ra의 발현을 위한 및/또는 DDD 또는 DDD 병태를 앓고 있거나 발병할 위험이 있는 것으로 확인된 인간에서 DDD 또는 DDD와 관련된 병태의 치료를 위한 또는 이러한 병태의 방지를 위한 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템을 제공하며, 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템은 인간 인터루킨-1 수용체 길항제(IL-1Ra)를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 아데노바이러스 기반 벡터의 게놈 카피(GC)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 좌측 및 우측 역위 말단 반복부, 아데노바이러스 패키징 신호 및 비-바이러스 및 비-코딩 스터퍼 핵산 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간 IL-1Ra 유전자의 발현은 인간 IL-1Ra를 코딩하는 핵산 서열의 판독 프레임의 상류에 위치된 NF-κB 유도성 프로모터에 의해 조절된다. 일부 실시양태에서, 프로모터, IL-1Ra를 코딩하는 핵산 서열, 좌측 및 우측 역위 말단 반복부, 아데노바이러스 패키징 신호 및 비-바이러스, 비-코딩 스터퍼 핵산 서열을 포함하는 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템의 핵산 서열은 서열번호 2, 서열번호 3, 또는 서열번호 7의 핵산 서열과 적어도 95% 상동성 또는 동일하다. 일부 실시양태에서, 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템은 헬퍼 의존적 아데노바이러스 벡터 및 헬퍼 바이러스로 감염된 숙주 세포로부터 단리되며, 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템은 a) 1.4 x 108 내지 1.4 x 1012 GC의 헬퍼 의존적 아데노바이러스 벡터/밀리리터(GC/ml); b) 15% 미만의 헬퍼 바이러스 입자; c) 10% 미만의 빈 캡시드; d) 100 μg/ml 이하의 숙주 세포 단백질; e) 20 ng/ml 이하의 숙주 세포 핵산; f) 35 EU/ml 이하의 내독소; 및 g) ≤ 300GC/TCID50의 바이러스 입자 대 감염 단위 비율을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템 중 헬퍼 바이러스의 수준은 하기이거나 하기 미만의 헬퍼 바이러스 입자이다: 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1%, 또는 이전 값 중 임의의 2개에 의해 정의된 범위, 예컨대, 1% 내지 2%, 2% 내지 3%, 3% 내지 4%, 4% 내지 5%, 5% 내지 6%, 6% 내지 7%, 7% 내지 8%, 8% 내지 9%, 9% 내지 10%, 10% 내지 11%, 11% 내지 12%, 12% 내지 13%, 13% 내지 14%, 14% 내지 15%, 1% 내지 15%, 또는 1% 내지 5%.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템 중 빈 캡시드의 수준은 하기이거나 하기 미만의 빈 캡시드이다: 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1%, 또는 이전 값 중 임의의 2개에 의해 정의된 범위, 예컨대, 1% 내지 2%, 2% 내지 3%, 3% 내지 4%, 4% 내지 5%, 5% 내지 6%, 6% 내지 7%, 7% 내지 8%, 8% 내지 9%, 9% 내지 10%, 1% 내지 10%, 또는 1% 내지 5%. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템 중 빈 캡시드 및 헬퍼 바이러스의 수준은 동일하다.
본원에 사용된 용어 "빈 캡시드" 및 "빈 입자"는 본 개시내용을 고려하여 읽을 때 일반적이고 관례적인 의미를 가지며, 헬퍼 의존적 아데노바이러스 단백질 쉘은 포함하지만 인간 인터루킨-1 수용체 길항제(IL-1Ra)를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 구축물이 전부 또는 일부 결여된 아데노바이러스 기반 벡터 비리온을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "숙주 세포"는 본 개시내용을 고려하여 읽을 때 일반적이고 관례적인 의미를 가지며, 예컨대 본 개시내용의 헬퍼 의존적 아데노바이러스 벡터 구축물 및 헬퍼 바이러스의 수용자이거나, 수용자이었거나, 수용자로서 사용될 수 있는 미생물, 효모 세포, 곤충 세포 및 포유동물 세포를 의미한다. 이 용어는 형질감염된 원래 세포의 자손을 포함한다. 따라서, 본원에 사용된 "숙주 세포"는 일반적으로 외인성 DNA 서열로 형질감염된 세포를 지칭한다. 단일 모세포의 자손은 자연적, 우발적 또는 고의적 돌연변이로 인해 원래 모세포와 형태 또는 게놈 또는 총 DNA 상보물이 완전히 동일할 필요는 없는 것으로 이해된다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템은 7.0 ± 1.0의 pH를 갖는다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템은 6.0 내지 6.5, 6.5 내지 7.0, 7.0 내지 7.5 또는 7.0 내지 8.0의 pH를 갖는다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템은 ≤600 mOsm/kg의 삼투질 농도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템은 100 mOsm/kg 내지 200 mOsm/kg, 200 mOsm/kg 내지 300 mOsm/kg, 300 mOsm/kg 내지 400 mOsm/kg, 400 mOsm/kg 내지 500 mOsm/kg, 또는 500 mOsm/kg 내지 600 mOsm/kg의 삼투질 농도를 갖는다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템은 a) 1.4 x 109 내지 1.4 x 1012; b) 1.4 x 109 내지 1.4 x 1011; 또는 c) 1.4 x 109 내지 1.4 x 1010 GC/ml의 헬퍼 의존적 아데노바이러스 벡터(HDAd)를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템은 ≥1.4 x 109 GC/ml 내지 < 5.6 x 109 GC/ml, 2.8 x 109 GC/ml, ≥1.4 x 1010 GC/ml 내지 < 5.6 x 1010 GC/ml, 2.8 x 1010 GC/ml, ≥1.4 x 1011 GC/ml 내지 < 5.6 x 1011 GC/ml, 2.8 x 1011 GC/ml, 1.4 x 109 내지 5.6 x 109 GC/ml, 1.4 x 1010 내지 5.6 x 1010 GC/ml, 1.4 x 1011 내지 5.6 x 1011 GC/ml, 2 x 109 내지 5.6 x 109 GC/ml, 2 x 1010 내지 5.6 x 1010 GC/ml, 2 x 1011 내지 5.6 x 1011 GC/ml, 2.8 x 109 내지 5.6 x 109 GC/ml, 2.8 x 1010 내지 5.6 x 1010 GC/ml, 2.8 x 1011 내지 5.6 x 1011 GC/ml, at 2 x 109 내지 2.8 x 109 GC/ml, 2 x 1010 내지 2.8 x 1010 GC/ml, 2 x 1011 내지 2.8 x 1011 GC/ml, 1.4 x 109 내지 2.8 x 1010 GC/ml, 1.4 x 1010 내지 2.8 x 1011 GC/ml, 1.4 x 1011 내지 2.8 x 1011 GC/ml, 2.8 x 109 내지 1.4 x 1012 GC/ml, 2.8 x 1010 내지 1.4 x 1012 GC/ml, 2.8 x 1011 내지 1.4 x 1012 GC/ml, 2.8 x 109 내지 2.8 x 1011 GC/ml, 2.8 x 109 내지 1.4 x 1010 GC/ml, 2.8 x 1010 내지 2.8 x 1011 GC/ml, 1.4 x 109 GC/ml, 1.4 x 1010 GC/ml, 1.4 x 1011 GC/ml, 1.4 x 1012 GC/ml, 2 x 109 GC/ml, 2 x 1010 GC/ml, 2 x 1011 GC/ml, 2.8 x 109 GC/ml, 2.8 x 1010 GC/ml, 2.8 x 1011 GC/ml, 5.6 x 109 GC/ml, 5.6 x 1010 GC/ml, 또는 5.6 x 1011 GC/ml의 농도의 헬퍼 의존적 아데노바이러스 벡터(HDAd)를 포함한다.
일부 실시양태에서, 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템은 1 ml 내지 5 ml, 2 ml 내지 5 ml, 3 ml 내지 5 ml, 4 ml 내지 5 ml, 5 ml, 또는 2 ml의 용량 부피를 포함한다. 일부 실시양태에서, 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템은 1 ml, 3 ml, 또는 4 ml의 용량 부피를 포함한다. 일부 실시양태에서, 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템은 하기이거나, 약 하기이거나, 하기 미만이거나, 약 하기 미만이거나, 하기 초과이거나, 약 하기 초과인 용량 부피를 포함한다: 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 1, 2, 3, 4, 또는 5 ml, 또는 이전 값 중 임의의 2개에 의해 정의된 범위, 예컨대, 0.1 ml 내지 5 ml, 0.5 ml 내지 5 ml, 0.5 ml 내지 2 ml, 1 ml 내지 5 ml, 2 ml 내지 5 ml, 4 ml 내지 5 ml, 또는 3 ml 내지 5 ml.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템은 7 x 109 내지 7 x 1012 GC, 7 x 109 내지 7 x 1011 GC, 7 x 109 내지 7 x 1010 GC, 7 x 109 내지 2.8 x 1010 GC, 7 x 1010 내지 2.8 x 1011 GC, 7 x 1011 내지 2.8 x 1012 GC, 7 x 1010 내지 7 x 1012 GC, 7 x 1010 내지 7 x 1011 GC, 7 x 1011 내지 7 x 1012 GC, 7 x 109 내지 2.8 x 1010 GC, 7 x 1010 내지 2.8 x 1011 GC, 7 x 1011 내지 2.8 x 1012 GC, 1010 내지 2.8 x 1010 GC, 1011 내지 2.8 x 1011 GC, 1012 내지 2.8 x 1012 GC, 2.8 x 109 내지 5.6 x 109 GC, 2.8 x 1010 내지 5.6 x 1010 GC, 2.8 x 1011 내지 5.6 x 1011 GC, 1010 내지 1.4 x 1010 GC, 1011 내지 1.4 x 1011 GC, 1012 내지 1.4 x 1012 GC, 7 x 109 내지 5.6 x 1011 GC, 7 x 1010 내지 5.6 x 1012 GC, 7 x 1011 내지 5.6 x 1012 GC, 1.4 x 1010 내지 7 x 1012 GC, 1.4 x 1011 내지 7 x 1012 GC, 1.4 x 1012 내지 7x 1012 GC, 1.4 x 1010 내지 1.4 x 1012 GC, 1.4 x 1010 내지 1.4 x 1011 GC, 1.4 x 1011 내지 1.4 x 1012 GC, 7 x 109 GC, 7 x 1010 GC, 7 x 1011 GC, 7 x 1012 GC, 1.4 x 1010 GC, 1.4 x 1011 GC, 1.4 x 1012 GC, 2.8 x 1010 GC, 2.8 x 1011 GC, 또는 2.8 x 1012 GC의 총 용량의 헬퍼 의존적 아데노바이러스 벡터(HDAd)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 총 용량은 투여당 단일 디스크에 주사되는 양이다.
약제학적 조성물
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템은 DDD 또는 DDD와 관련된 병태를 앓고 있거나 발병 중인 대상체의 추간판에 투여하기에 적합한 약제학적 조성물에 포함된다. 일부 실시양태에서, 대상체는 DDD 또는 DDD와 관련된 병태를 앓고 있거나 발병 중인 것으로 확인된다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 약제학적 조성물은 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템을 이를 필요로 하는 대상체의 하나 이상의 추간판의 세포로 직접적으로 전달하기 위해 제제화된다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 약제학적 조성물은 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템을 하나 이상의 퇴행성 디스크 또는 비-퇴행성 디스크 또는 둘 다의 세포로 직접적으로 전달하기 위해 제제화된다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 약제학적 조성물은 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템을 하나 이상의 퇴행성 디스크의 세포로 직접적으로 전달하기 위해 제제화된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 DDD는 경추 또는 요추 퇴행성 디스크 질환 중 어느 하나이다. 일부 실시양태에서, DDD는 요추 퇴행성 디스크 질환이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 약제학적 조성물은 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템을 척주 골 쌍: C2-C3, C3-C4, C4-C5, C5-C6, C6-C7, C7-T1, T1-T2, T2-T3, T3-T4, T4-T5, T5-T6, T6-T7, T7-T8, T8-T9, T9-T10, T10-T11, T11-T12, T12-L1, L1-L2, L2-L3, L3-L4, L4-L5 및 L5-S1, 또는 이들의 임의의 조합 사이의 추간판의 세포로 직접적으로 전달하기 위해 제제화된다. 일부 실시양태에서, 대상체는 후관절 증후군(FJS)을 갖는다. 일부 실시양태에서, 대상체는 후관절 증후군(FJS)을 갖지 않는다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 약제학적 조성물은 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템을 하나 이상의 추간판의 연골 종판(CEP), 고도로 조직화된 섬유륜(AF) 및 중앙 젤라틴성 수핵(NP) 영역(수핵(NP) 세포) 또는 이들의 조합의 세포로 전달하기 위해 제제화된다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 약제학적 조성물은 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템을 중앙 젤라틴성 수핵(NP) 영역(수핵(NP) 세포)의 세포로 전달하기 위해 제제화된다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 약제학적 조성물은 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템을 NP 세포인 세포로 전달하기 위해 제제화된다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 조성물은 인간 또는 포유동물 인터루킨-1 수용체 길항제(IL-1Ra)를 코딩하는 핵산 서열, L ITR, R ITR, 패키징 신호 및 비-바이러스, 비-코딩 스터퍼 핵산 서열을 포함하는 아데노바이러스 기반 벡터를 포함하는 약제학적 조성물을 포함하며, 인간 또는 포유동물 인터루킨-1 수용체 길항제(IL-1Ra) 유전자의 발현은 인간 또는 포유동물 IL-1Ra를 코딩하는 핵산 서열의 판독 프레임의 상류에 위치된 염증 민감성 프로모터에 의해 조절된다. 일부 실시양태에서, 약제학적 조성물은 DDD 또는 DDD와 관련된 병태의 치료를 위해 사용된다. 일부 실시양태에서, 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템은 인터루킨-1 수용체 길항제(IL-1Ra) 단백질 이외의 하나 이상의 단백질을 코딩하는 핵산을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 추가 단백질은 DDD 또는 DDD와 관련된 병태를 치료하기 위한 치료 단백질이다.
본 개시내용의 맥락에서 사용되는 염증 민감성 프로모터는, 예컨대 NF-κB, 인터루킨 6(II-6), 인터루킨-1(IL-1), 종양 괴사 인자(TNF), 사이클로옥시게나제 2(COX-2), 보체 인자 3(C3), 혈청 아밀로이드 A3(SAA3), 대식세포 염증 단백질-1a(MIP-1a), 또는 상기의 하이브리드 구축물에 의해 유도 가능한 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 염증 민감성 프로모터는 NF-κB5-ELAM 프로모터이다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 조성물의 아데노바이러스 기반 벡터(아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템)는 헬퍼 의존적 아데노바이러스 기반 벡터(HDAd)이다. 일부 실시양태에서, 이러한 조성물은 본원에 개시된 헬퍼 의존적 아데노바이러스 벡터 바이러스 입자 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 본원에 개시된 양으로 헬퍼 바이러스 및/또는 빈 바이러스 입자를 추가로 포함한다. 본원에 사용된 용어 "약제학적으로 허용되는 담체"는 본 개시내용을 고려하여 읽을 때 일반적이고 관례적인 의미를 가지며, 약제 투여에 적합한 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 항세균제, 항진균제, 등장화제, 흡수 지연제 등을 포함하도록 의도된다. 적합한 담체는 당업계의 표준 참조문인 문헌(Remington's Pharmaceutical Sciences, 전체가 참조로 본원에 포함됨)의 최신판에 기재되어 있다. 이러한 담체 또는 희석제의 비제한적인 예는 물, 식염수, 링거 용액, 덱스트로스 용액, 및 5% 인간 혈청 알부민을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 리포솜 및 고정 오일과 같은 비-수성 비히클도 사용될 수 있다. 약제학적 활성 물질에 대한 이러한 매질 및 작용제의 사용은 당업계에 널리 공지되어 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 작용제가 활성 화합물과 양립할 수 없는 경우를 제외하고, 조성물에서의 이의 사용이 고려된다. 일부 실시양태에서, 보충 활성 화합물도 조성물에 포함된다.
본 개시내용의 약제학적 조성물은 의도된 투여 경로, 추간판으로의 추간판내 주사에 적합하도록 제제화된다. 추간판내 주사에 사용되는 용액 또는 현탁액은 하기 성분을 포함할 수 있다: 멸균 희석제, 예컨대 주사용수, 식염수 용액, 고정 오일, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 다른 합성 용매; 항세균제, 예컨대 벤질알콜 또는 메틸파라벤; 항산화제, 예컨대 아스코르브산 또는 중아황산나트륨; 킬레이트제, 예컨대 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA); 버퍼, 예컨대 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트, 및 장성 조절제, 예컨대 염화나트륨 또는 덱스트로스. pH는 염산 또는 수산화나트륨과 같은 산 또는 염기로 조절될 수 있다. 약제학적 제제는 유리 또는 플라스틱으로 만들어진 앰플, 일회용 주사기 또는 다회 용량 바이알에 담긴다. 일부 실시양태에서, 약제학적 조성물은 추간판에 직접적으로 주사하기 위해 제제화된다(추간판내 주사).
일부 실시양태에서, 추간판에 직접적으로 주사하기 위한 본 개시내용의 약제학적 조성물은 코르티코스테로이드, 예컨대 메틸프레드니솔론, 베타메타손 또는 트리암시놀론, 및 소량의 국소 마취제, 예컨대 리도카인 또는 부피바카인을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 추간판에 직접적으로 주사하기 위한 본 개시내용의 약제학적 조성물은 코르티코스테로이드를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 코르티코스테로이드는 메틸프레드니솔론, 베타메타손, 트리암시놀론, 또는 이들의 조합이다. 일부 실시양태에서, 코르티코스테로이드, 예컨대 메틸프레드니솔론, 베타메타손, 트리암시놀론, 또는 이들의 조합은 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템과 별도의 투여 형태로 존재하므로, 코르티코스테로이드는 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템 전 또는 후에 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 코르티코스테로이드, 예컨대 메틸프레드니솔론, 베타메타손, 트리암시놀론 또는 이들의 조합은 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템과 동일한 투여 형태(예컨대, 단일 유체)로 존재하므로, 코르티코스테로이드는 아데노바이러스 기반의 생물학적 전달 및 발현 시스템과 동시에 투여된다. 일부 실시양태에서, 추간판에 직접적으로 주사하기 위한 본 개시내용의 약제학적 조성물은 국소 마취제를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 국소 마취제는 리도카인, 부피바카인 또는 이들의 조합이다. 일부 실시양태에서, 국소 마취제, 예컨대 리도카인, 부피바카인 또는 이들의 조합은 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템과 별도의 투여 형태로 존재하므로, 국소 마취제는 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템 전 또는 후에 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 국소 마취제, 예컨대 리도카인, 부피바카인 또는 이들의 조합은 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템과 동일한 투여 형태(예컨대, 단일 유체)로 존재하므로, 국소 마취제는 아데노바이러스 기반의 생물학적 전달 및 발현 시스템과 동시에 투여된다. 일부 실시양태에서, 추간판에 직접적으로 주사하기 위한 본 개시내용의 약제학적 조성물은 적어도 하나의 점도 향상제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 추간판에 직접적으로 주사하기 위한 본 개시내용의 약제학적 조성물은 적어도 하나의 보존제를 포함한다. 점도 향상제는, 예컨대 문헌(Handbook of Pharmaceutical Excipients Ninth edition, Paul J Sheskey, Bruno C Hancock, Gary P Moss, David J Goldfarb; and The United States pharmacopeia: USP 30; The National formulary: NF 25, 전체가 참조로 본원에 포함됨)에 기재된 바와 같은, 당업계에 공지된 임의의 하나 이상의 점도 향상제일 수 있다.
주사용으로 적합한 약제학적 조성물은 멸균 수용액(수용성인 경우) 또는 분산액 및 멸균 주사용 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 모든 경우에서, 조성물은 멸균되어야 하고 주사하기 쉬운 정도로 유동성이어야 한다. 이는 제조 및 저장 조건 하에서 안정적이어야 하며, 세균 및 곰팡이와 같은 미생물의 오염 작용에 대항하여 보존되어야 한다. 일부 실시양태에서, 담체는 예컨대 물, 에탄올, 폴리올(예컨대, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 이들의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질이다. 적절한 유동성은, 예컨대 레시틴과 같은 코팅의 사용, 분산액의 경우 필요한 입자 크기의 유지 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물 작용의 방지는 다양한 항세균제 및 항진균제, 예컨대 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로살 등에 의해 달성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 등장화제, 예컨대 슈가, 폴리알콜, 예컨대, 만니톨, 소르비톨, 염화나트륨을 조성물에 포함시키는 것이 바람직할 것이다. 주사 가능한 조성물의 연장된 흡수는 흡수를 지연시키는 작용제, 예컨대 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 조성물에 포함시킴으로써 초래될 수 있다.
멸균 주사용 용액은 필요에 따라 상기에 열거된 성분 중 하나 또는 조합과 함께 적절한 용매에 필요한 양의 활성 화합물을 혼입한 후 여과 멸균하여 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 기본 분산 매질 및 상기에 열거된 것 중 필요한 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클에 활성 화합물을 혼입시켜 제조된다. 멸균 주사용 용액 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 제조 방법은 이전에 멸균 여과된 용액으로부터 활성 성분 및 임의의 추가의 원하는 성분의 분말을 생성하는 진공 건조 및 동결 건조이다.
본 개시내용의 아데노바이러스 발현 및 전달 시스템의 화학적 특성
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템(예컨대, FX201/PCRX-201)의 캡시드는 외피가 없으며, 29.3 kb 이중 가닥 DNA로 구성된다. 캡시드의 이론적 분자량은 103.9 메가달톤(MDa)이고, 게놈은 18.1 MDa이다. FX201의 캡시드는 대략 100 nm의 직경을 가질 수 있다.
제제: 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템(예컨대, FX201/PCRX-201)은 약 1-20 mM, TRIS, 약 50-100 mM NaCl, 0.01-1% 중량/부피(w/v) 폴리소르베이트 80, 1-10% (w/v) 수크로스, 0.1-10 mM MgCl2, 50-500 μM EDTA, 1-5% 부피/부피(v/v) 에탄올, 및 5-50 mM L-히스티딘으로 구성된 버퍼에서 제제화된다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템(예컨대, FX201)은 10 mM TRIS, 75 mM NaCl, 0.02% 중량/부피(w/v) 폴리소르베이트 80, 5% (w/v) 수크로스, 1.0 mM MgCl2, 100 μM EDTA, 0.5% (부피/부피(v/v) 에탄올), 및 10 mM L-히스티딘으로 구성된 버퍼에서 제제화된다. 일부 실시양태에서, 생성물은 눈에 보이는 미립자가 없는 투명 내지 약간 유백색의 무색 현탁액이다.
저장 조건 및 안정성: 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템(예컨대, FX201/PCRX-201)은 ≤-65℃에서 냉동 액체로 저장된다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템(예컨대, FX201)은 ≤-65℃에서 저장 시 적어도 3개월, 적어도 6개월 또는 적어도 12개월 동안 안정하다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템(예컨대, FX201)은 ≤-65℃에서 저장 시 적어도 24개월 동안 안정하다. 일부 실시양태에서, 일단 해동되면 생성물은 2-8℃에서 저장되어야 하며 7일 이내에 사용되어야 한다. 일부 실시양태에서, 일단 해동되면 생성물은 2-8℃에서 저장되어야 하며 14일 이내에 사용되어야 한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템(예컨대, FX201)은 얼마간의 기간 동안 실온(RT)에서 유지될 수 있다. 일부 실시양태에서, 바이알이 사용 준비가 되면, 바이알 내에서 7시간 이하 동안 실온에서 유지된다(일부 실시양태에서, RT에서 유지된 바이알은 나중에 사용하기 위해 냉장 보관될 수 없다). 일부 실시양태에서, 바이알이 사용 준비가 되면, 바이알 내에서 12시간 이하 동안 RT에서 유지된다(일부 실시양태에서, 실온에서 유지된 바이알은 나중에 사용하기 위해 냉장 상태로 되돌려질 수 없다). 일부 실시양태에서, 용량은 주사기에 제조되면 RT에서 유지되어야 하며 4시간 이내에 사용되어야 한다. 일부 실시양태에서, 용량이 주사기에 제조되면 RT에서 유지되어야 하며 8시간 이내에 사용되어야 한다.
일부 실시양태에서, 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템(아데노바이러스 기반 벡터)을 포함하는 본 개시내용의 약제학적 조성물은 퇴행된 디스크 질환 또는 DDD와 관련된 병태의 치료에 사용되며, 아데노바이러스는 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템은 인간 인터루킨-1 수용체 길항제(IL-1Ra)를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 아데노바이러스 기반 벡터의 게놈 카피(GC)를 포함하고; 좌측 및 우측 역위 말단 반복부, 아데노바이러스 패키징 신호 및 비-바이러스성 및 비-암호화 스터퍼 핵산 서열을 추가로 포함하며, 임의적으로 인간 IL-1Ra 유전자의 발현은 인간 IL-1Ra를 코딩하는 핵산 서열의 판독 프레임의 상류에 위치된 염증 민감성 프로모터에 의해 조절된다. 일부 실시양태에서, 프로모터, IL-1Ra를 코딩하는 핵산 서열, 좌측 및 우측 역위 말단 반복부, 아데노바이러스 패키징 신호 및 비-바이러스, 비-코딩 스터퍼 핵산 서열을 포함하는 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템의 핵산 서열은 서열번호 2, 서열번호 3, 또는 서열번호 7의 핵산 서열과 적어도 95% 상동성 또는 동일하다. 일부 실시양태에서, 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템은 1.4 x 108 내지 1.4 x 1012 GC의 아데노바이러스 기반 벡터/밀리리터(ml)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 염증 민감성 프로모터는 NF-κB, 인터루킨 6(II-6), 인터루킨-1(IL-1), 종양 괴사 인자(TNF), 사이클로옥시게나제 2(COX-2), 보체 인자 3(C3), 혈청 아밀로이드 A3(SAA3), 대식세포 염증 단백질-1a(MIP-1a), 또는 상기의 하이브리드 구축물 중 어느 하나에 의해 유도 가능한 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 염증 민감성 프로모터는 NF-κB 유도성 프로모터이다. 일부 실시양태에서, NF-κB 유도성 프로모터는 NF-κB5-ELAM 프로모터이다.
일부 실시양태에서, 프로모터, IL-1Ra를 코딩하는 핵산 서열, 좌측 및 우측 역위 말단 반복부, 아데노바이러스 패키징 신호 및 비-바이러스, 비-코딩 스터퍼 핵산 서열을 포함하는 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템의 핵산 서열은 서열번호 2, 서열번호 3, 또는 서열번호 7의 핵산 서열과 적어도 96%, 97%, 98% 또는 99% 상동성 또는 동일하다. 일부 실시양태에서, 프로모터, IL-1Ra를 코딩하는 핵산 서열, 좌측 및 우측 역위 말단 반복부, 아데노바이러스 패키징 신호 및 비-바이러스, 비-코딩 스터퍼 핵산 서열을 포함하는 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템의 핵산 서열 - 바이러스성 비-코딩 스터퍼 핵산 서열은 서열번호 2, 서열번호 3, 또는 서열번호 7의 핵산 서열과 적어도 99% 상동성 또는 동일하다. 일부 실시양태에서, 프로모터, IL-1Ra를 코딩하는 핵산 서열, 좌측 및 우측 역위 말단 반복부, 아데노바이러스 패키징 신호 및 비-바이러스, 비-코딩 스터퍼 핵산 서열을 포함하는 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템의 핵산 서열은 서열번호 2, 서열번호 3, 또는 서열번호 7이다.
일부 실시양태에서, 프로모터, IL-1Ra를 코딩하는 핵산 서열, 좌측 및 우측 역위 말단 반복부, 아데노바이러스 패키징 신호 및 비-바이러스, 비-코딩 스터퍼 핵산 서열을 포함하는 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템의 핵산 서열은 서열번호 7의 핵산 서열과 적어도 95% 상동성 또는 동일하다. 일부 실시양태에서, 프로모터, IL-1Ra를 코딩하는 핵산 서열, 좌측 및 우측 역위 말단 반복부, 아데노바이러스 패키징 신호 및 비-바이러스, 비-코딩 스터퍼 핵산 서열을 포함하는 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템의 핵산 서열은 서열번호 7의 핵산 서열과 적어도 96%, 97%, 98% 또는 99% 상동성 또는 동일하다.
일부 실시양태에서, IL-1Ra를 코딩하는 핵산 서열은 서열번호 1의 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, IL-1Ra를 코딩하는 핵산 서열은 서열번호 4의 핵산을 포함한다. 서열번호 4는 인간 IL-1Ra의 원래 코딩 서열(서열번호 5)의 코돈 최적화된 버전이고, 서열번호 4에 따른 코돈 최적화된 서열은 a) 야생형 인간 IL-1Ra 단백질에서 0.78의 코돈 적응 지수(CAI)와 비교하여 0.96의 CAI, b) 야생형 인간 IL-1Ra 단백질에서 56%의 최고 사용 빈도와 비교하여 최고 사용 빈도 내에 85%의 코돈, c) 야생형 인간 IL-1Ra 단백질에서 51.98의 평균 GC 함량과 비교하여 60.4의 평균 GC 함량, 및 d) 야생형 인간 IL-1Ra 단백질과 비교하여 스플라이스 부위(GGTAAG), 스플라이스 부위(GGTGAT), 폴리A(AATAAA), 폴리A(ATTAAA), 불안정화(ATTTA), 폴리T(TTTTTT) 및 폴리A(AAAAAAA)를 포함하는 네가티브 시스 작용 요소 없음을 갖는다.
일부 실시양태에서, 인간 IL-1Ra의 아미노산 서열은 서열번호 6에 따른다. 일부 실시양태에서, 프로모터, IL-1Ra를 코딩하는 핵산 서열, 좌측 및 우측 역위 말단 반복부, 아데노바이러스 패키징 신호 및 비-바이러스, 비-코딩 스터퍼 핵산 서열을 포함하는 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템의 핵산 서열은 서열번호 2, 서열번호 3, 또는 서열번호 7의 핵산 서열을 포함하거나, 필수적으로 이로 이루어지거나, 이로 이루어진다.
일부 실시양태에서, 아데노바이러스 기반 벡터는 감염된 세포에서 벡터 서열의 존재를 모니터링하기 위해 시각적으로 또는 도구적으로 검출 가능한 단백질 생성물을 코딩하는 마커 유전자를 추가로 포함한다. 마커 유전자는 형광 단백질, 효소 또는 검출 가능한 세포 표면 단백질 중 어느 하나를 코딩하는 유전자일 수 있다. 일부 실시양태에서, 마커 유전자는 녹색 형광 단백질 LacZ, 또는 루시퍼라제 효소 중 어느 하나를 코딩하는 유전자이다. 일부 실시양태에서, 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템은 인터루킨-1 수용체 길항제(IL-1Ra) 단백질 이외의 하나 이상의 단백질을 코딩하는 핵산을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 추가 단백질은 DDD 또는 DDD와 관련된 병태를 치료하기 위한 치료 단백질이다.
일부 실시양태에서, 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템을 포함하는 본 개시내용의 약제학적 조성물은 약제학적 조성물 1 ml당 a) 1.4 x 109 내지 1.4 x 1012; b) 1.4 x 109 내지 1.4 x 1011; 또는 c) 1.4 x 109 내지 1.4 x 1010 게놈 카피(GC)의 아데노바이러스 기반 벡터를 포함한다.
일부 실시양태에서, 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템을 포함하는 본 개시내용의 약제학적 조성물은 약제학적 조성물 1 ml당 1.0 x 1010 내지 1.0 x 1012, 1.0 x 1010 내지 1.0 x 1011, 1.0 x 1011 내지 1.0 x 1012, 9 x 1010 내지 9 x 1011, 1.4 x 1010 내지 1.4 x 1012, 1.4 x 1010 내지 1.4 x 1011, 1.4 x 1011 내지 1.4 x 1012, 1.4 x 109 내지 5.6 x 109, 1.4 x 1010 내지 5.6 x 1010, 1.4 x 1011 내지 5.6 x 1011, 2 x 109 내지 5.6 x 109, 2 x 1010 내지 5.6 x 1010, 2 x 1011 내지 5.6 x 1011, 2.8 x 109 내지 5.6 x 109, 2.8 x 1010 내지 5.6 x 1010, 2.8 x 1011 내지 5.6 x 1011, 2 x 109 내지 2.8 x 109, 2 x 1010 내지 2.8 x 1010, 2 x 1011 내지 2.8 x 1011, 1.4 x 109 내지 2.8 x 1010, 1.4 x 1010 내지 2.8 x 1011, 1.4 x 1011 내지 2.8 x 1011, 2.8 x 109 내지 1.4 x 1012, 2.8 x 1010 내지 1.4 x 1012, 2.8 x 1011 내지 1.4 x 1012, 2.8 x 109 내지 2.8 x 1011, 2.8 x 109 내지 1.4 x 1010, 2.8 x 1010 내지 2.8 x 1011, 1.4 x 109, 1.4 x 1010, 1.4 x 1011, 1.4 x 1012, 2 x 109, 2 x 1010, 2 x 1011, 2.8 x 109, 2.8 x 1010, 2.8 x 1011, 5.6 x 109, 5.6 x 1010, 또는 5.6 x 1011 게놈 카피(GC)의 아데노바이러스 기반 벡터를 포함한다. 일부 실시양태에서, 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템을 포함하는 본 개시내용의 약제학적 조성물은 약제학적 조성물 ml당 1 x 108 GC, 1 x 109 GC, 1 x 1010 GC, 1 x 1011 GC, 2 x 108 GC, 2 x 109 GC, 2 x 1010 GC, 2 x 1011 GC, 3 x 108 GC, 3 x 109 GC, 3 x 1010 GC, 또는 3 x 1011 GC의 아데노바이러스 기반 벡터, 또는 이전 값 중 임의의 2개에 의해 정의된 범위, 예컨대 약제학적 조성물 ml당 1 x 108 GC 내지 3 x 1011 GC, 1 x 108 GC 내지 3 x 109 GC, 또는 1 x 109 GC 내지 3 x 109 GC의 아데노바이러스 기반 벡터를 포함한다.
일부 실시양태에서, 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템을 포함하는 본 개시내용의 약제학적 조성물은 1 ml 내지 5 ml, 2 ml 내지 5 ml, 4 ml 내지 5 ml, 3 ml 내지 5 ml, 또는 최대 5 ml의 용량 부피를 포함한다. 일부 실시양태에서, 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템을 포함하는 본 개시내용의 약제학적 조성물은 하기이거나, 약 하기이거나, 하기 미만이거나, 약 하기 미만이거나, 하기 초과이거나, 약 하기 초과인 용량 부피를 포함한다: 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 1, 2, 3, 4, 또는 5 ml, 또는 이전 값 중 임의의 2개에 의해 정의된 범위, 예컨대, 0.1 ml 내지 5 ml, 0.5 ml 내지 5 ml, 0.5 ml 내지 2 ml, 1 ml 내지 5 ml, 2 ml 내지 5 ml, 4 ml 내지 5 ml, 또는 3 ml 내지 5 ml.
일부 실시양태에서, 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템을 포함하는 본 개시내용의 약제학적 조성물은 총 용량: 7 x 109 내지 7 x 1012 GC, 7 x 109 내지 7 x 1011 GC, 7 x 109 내지 7 x 1010 GC, 7 x 1010 내지 7 x 1012 GC, 7 x 1010 내지 7 x 1011 GC, 7 x 1011 내지 7 x 1012 GC, 7 x 109 내지 2.8 x 1010 GC, 7 x 1010 내지 2.8 x 1011 GC, 7 x 1011 내지 2.8 x 1012 GC, 7 x 109 내지 2.8 x 1011 GC, 7 x 109 내지 2.8 x 1012 GC, 7 x 1010 내지 2.8 x 1012 GC, 1 x 1010 내지 2.8 x 1010 GC, 1 x 1011 내지 2.8 x 1011 GC, 1 x 1012 내지 2.8 x 1012 GC,,f 2.8 x 109 내지 5.6 x 109 GC, 2.8 x 1010 내지 5.6 x 1010 GC, 2.8 x 1011 내지 5.6 x 1011 GC, 1 x 1010 내지 1.4 x 1010 GC, 1 x 1011 내지 1.4 x 1011 GC, 1 x 1012 내지 1.4 x 1012 GC, 7 x 109 내지 5.6 x 1011 GC, 7 x 1010 내지 5.6 x 1012 GC, 7 x 1011 내지 5.6 x 1012 GC, of 1.4 x 1010 내지 7 x 1012 GC, 1.4 x 1011 내지 7 x 1012 GC, 1.4 x 1012 내지 7x 1012 GC, 1.4 x 1010 내지 1.4 x 1012 GC, 1.4 x 1010 내지 1.4 x 1011 GC, 1.4 x 1011 내지 1.4 x 1012 GC, 7 x 109 GC, 7 x 1010 GC, 7 x 1011 GC, 7 x 1012 GC, 1.4 x 1010 GC, 1.4 x 1011 GC, 1.4 x 1012 GC, 2.8 x 1010 GC, 2.8 x 1011 GC, 또는 2.8 x 1012 GC의 아데노바이러스 기반 벡터를 포함한다. 일부 실시양태에서, 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템을 포함하는 본 개시내용의 약제학적 조성물은 총 용량: 1 x 108 GC, 1 x 109 GC, 1 x 1010 GC, 1 x 1011 GC, 2 x 108 GC, 2 x 109 GC, 2 x 1010 GC, 2 x 1011 GC, 3 x 108 GC, 3 x 109 GC, 3 x 1010 GC, 또는 3 x 1011 GC, 또는 이전 값 중 임의의 2개에 의해 정의된 범위, 예컨대 1 x 108 GC 내지 3 x 1011 GC, 1 x 108 GC 내지 3 x 109 GC, 또는 1 x 109 GC 내지 3 x 109 GC를 포함한다. 본 개시내용의 약제학적 조성물의 일부 실시양태에서, 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템의 아데노바이러스 기반 벡터는 헬퍼 의존적 아데노바이러스 벡터(HDAd)이다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 약제학적 조성물은 인간 추간판으로 추간판내 주사를 위해 제제화된다. 일부 실시양태에서, 조성물은 관절내로 주사되지 않는다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 약제학적 조성물은 대상체의 추간판으로 추간판내 주사를 위해 제제화된다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 약제학적 조성물은 추간판의 수핵으로 추간판내 주사를 위해 제제화된다. 일부 실시양태에서, 대상체는 후관절 증후군(FJS)을 갖는다. 일부 실시양태에서, 대상체는 후관절 증후군(FJS)을 갖지 않는다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템을 포함하는 약제학적 조성물은 밀리리터(ml)당 아데노바이러스 기반 벡터의 게놈 카피(GC) 또는 밀리리터(ml)당 아데노바이러스 기반 벡터의 바이러스 입자(VP)로서 정량화된 헬퍼 의존적 아데노바이러스 벡터의 바이러스 입자를 포함하며, 1 VP/ml은 1.4 GC/ml에 상응한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 약제학적 조성물은 밀리리터(ml)당 1.4 x 108 내지 1.4 x 1012 게놈 카피의 아데노바이러스 기반 벡터(GC)를 포함하는 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템을 포함한다. 일부 실시양태에서, 약제학적 조성물은 또한 추간판 내 유체의 밀리리터(ml)당 또는 추간판 부피의 ml당 108 내지 1012개의 바이러스 입자(VP)의 본 개시내용의 헬퍼 의존적 아데노바이러스 벡터를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템을 포함하는 약제학적 조성물은 추간판 내 유체 ml당, 또는 추간판의 부피 ml당 109 내지 1012; 109 내지 1011; 또는 109 내지 1010 VP의 아데노바이러스 기반 벡터를 포함한다. 일부 실시양태에서, 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템을 포함하는 약제학적 조성물은 추간판 내 유체 ml당, 또는 추간판의 부피 ml당 109 내지 1011 VP의 아데노바이러스 기반 벡터를 포함한다.
일부 실시양태에서, 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템을 포함하는 약제학적 조성물은 추간판 내 유체 ml당, 또는 추간판의 부피 ml당 2.8 x 109 내지 2.8 x 1011, 2.8 x 109 내지 2.8 x 1010, 2.8 x 1010 내지 2.8 x 1011, 2 x 109 내지 2 x 1011, 2 x 109 내지 2 x 1010, 또는 2 x 1010 내지 2 x 1011 VP의 아데노바이러스 기반 벡터를 포함한다. 일부 실시양태에서, 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템을 포함하는 약제학적 조성물은 추간판 내 유체 ml당, 또는 추간판의 부피 ml당 1 x 108 VP, 1 x 109 VP, 1 x 1010 VP, 1 x 1011 VP, 2 x 108 VP, 2 x 109 VP, 2 x 1010 VP, 2 x 1011 VP, 3 x 108 VP, 3 x 109 VP, 3 x 1010 VP, 또는 3 x 1011 VP, 또는 이전 값 중 임의의 2개에 의해 정의된 범위, 예컨대 1 x 108 VP 내지 3 x 1011 VP, 1 x 108 VP 내지 3 x 109 VP, 또는 1 x 109 VP 내지 3 x 109 VP의 아데노바이러스 기반 벡터를 포함한다.
일부 실시양태에서, 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템을 포함하는 약제학적 조성물은 추간판 내 유체 ml당, 또는 추간판의 부피 ml당 2.8 x 109, 2.8 x 1010, 2.8 x 1011, 또는 2.8 x 1011 VP의 아데노바이러스 기반 벡터를 포함한다.
일부 실시양태에서, 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템을 포함하는 약제학적 조성물은 추간판 내 유체 ml당, 또는 추간판의 부피 ml당 109 내지 1012; 109 내지 1011; 또는 109 내지 1010 VP의 아데노바이러스 기반 벡터를 포함한다. 일부 실시양태에서, 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템을 포함하는 약제학적 조성물은 추간판 내 유체 ml당, 또는 추간판의 부피 ml당 109 내지 1011 VP의 아데노바이러스 기반 벡터를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템으로 DDD 또는 DDD와 관련된 병태를 앓고 있는 인간의 하나 이상의 추간판의 세포를 감염시키는 방법은 이를 필요로 하는 인간의 하나 이상의 추간판을 추간판 내 유체 밀리리터(ml)당, 또는 추간판의 부피 ml당 108 내지 1012 바이러스 입자(VP)의 본 개시내용의 아데노바이러스 기반 벡터로 감염시키는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템을 포함하는 약제학적 조성물은 추간판 내 유체 ml당, 또는 추간판의 부피 ml당 109 내지 1012; 109 내지 1011; 또는 109 내지 1010 VP의 아데노바이러스 기반 벡터를 포함한다. 일부 실시양태에서, 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템을 포함하는 약제학적 조성물은 추간판 내 유체 ml당, 또는 추간판의 부피 ml당 109 내지 1011 VP의 아데노바이러스 기반 벡터를 포함한다.
일부 실시양태에서, 추간판은 약 0.5 ml 내지 약 20 ml, 0.5 ml 내지 10 ml, 0.5 ml 내지 5 ml, 5 ml 내지 10 ml, 10 ml 내지 15 ml, 15 ml 내지 17 ml, 또는 17 ml 내지 20 ml의 유체 또는 추간판의 부피의 ml을 함유한다.
본 개시내용의 방법
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 퇴행성 디스크 질환(DDD)을 앓고 있거나 앓고 있는 것으로 확인된 대상체의 하나 이상의 추간판의 세포를 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템으로 감염시키는 방법을 제공하며, 방법은 a) 대상체 또는 이를 필요로 하는 대상체의 하나 이상의 추간판의 세포를 소정량의, 임의적으로 유효량의, 본 개시내용의 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템을 포함하는 약제학적 조성물로 감염시키는 단계; 및 b) 하나 이상의 추간판의 세포에서 IL-1Ra를 발현시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템은 인터루킨-1 수용체 길항제(IL-1Ra) 단백질 이외의 하나 이상의 단백질을 코딩하는 핵산을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 추가 단백질은 DDD 또는 DDD와 관련된 병태를 치료하기 위한 치료 단백질이다. 일부 실시양태에서, 방법은 하나 이상의 추간판의 세포에서 추가의 단백질을 발현시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 대상체는 후관절 증후군(FJS)을 갖는다. 일부 실시양태에서, 대상체는 후관절 증후군(FJS)을 갖지 않는다.
일부 실시양태에서, 방법은 코르티코스테로이드, 예컨대 메틸프레드니솔론, 베타메타손, 트리암시놀론, 또는 이들의 조합을 대상체의 추간판에 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 코르티코스테로이드는 코르티코스테로이드가 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템과 동시에 투여되도록 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템과 함께 단일 약제학적 조성물로 제제화된다. 일부 실시양태에서, 코르티코스테로이드는 코르티코스테로이드가 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템을 대상체의 추간판에 투여하기 전 또는 후에 투여될 수 있도록 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템과 별도의 투여 형태로 존재한다. 일부 실시양태에서, 방법은 국소 마취제, 예컨대 리도카인, 부피바카인 또는 이들의 조합을 대상체의 추간판에 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 국소 마취제는 국소 마취제가 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템과 동시에 투여되도록 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템과 함께 단일 약제학적 조성물로 제제화된다. 일부 실시양태에서, 국소 마취제는 국소 마취제가 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템을 대상체의 추간판에 투여하기 전 또는 후에 투여될 수 있도록 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템과 별도의 투여 형태로 존재한다. 일부 실시양태에서, 방법은 코르티코스테로이드 및 국소 마취제 둘 다를 대상체의 추간판에 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 코르티코스테로이드 및 국소 마취제 중 하나 또는 둘 다는 코르티코스테로이드 및/또는 국소 마취제가 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템과 동시에 투여되도록 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템과 함께 단일 약제학적 조성물로 제제화된다. 일부 실시양태에서, 코르티코스테로이드 및 국소 마취제 중 하나 또는 둘 다는 코르티코스테로이드 및/또는 국소 마취제가 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템을 대상체의 추간판에 투여하기 전 또는 후에 투여될 수 있도록 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템과 별도의 투여 형태(들)로 존재한다.
일부 실시양태에서, 방법은 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템 투여 후 유체를 대상체의 추간판에 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 유체는 식염수 용액, 예컨대 0.9% 식염수 용액이다. 일부 실시양태에서, 유체는 완충 용액, 예컨대 PBS이다. 일부 실시양태에서, 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템 투여 후 대상체의 추간판에 투여되는 유체의 부피는 하기이거나, 약 하기이거나, 하기 미만이거나, 약 하기 미만이거나, 하기 초과이거나, 약 하기 초과이다: 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 μl, 또는 이전 값 중 임의의 2개에 의해 정의된 범위, 예컨대 25-1000, 25-500, 25-200, 50-150, 500-1000, 200-800, 200-600, 400-800, 또는 600-800 μl. 일부 실시양태에서, 유체의 투여는 유체의 추간판내 주사 또는 주입을 포함한다. 일부 실시양태에서, 유체의 투여는 디스크의 NP에서 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템의 분포를 증가시킨다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 추간판의 세포는 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템으로 1회 감염된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 추간판의 세포는 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템으로 2회 이상 감염된다. 일부 실시양태에서, 세포는 약제학적 조성물의 추간판내 주사에 의해 감염된다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 추간판의 세포가 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템으로 2회 이상 감염되는 경우, 각각의 감염은 상이한 수의 게놈 카피의 아데노바이러스 기반 벡터를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 추간판이 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템으로 적어도 2회 감염되는 경우, 제1 감염은 제2 감염 또는 임의의 후속 감염의 ml당 GC 수보다 적은 ml당 GC 수를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 추간판이 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템으로 적어도 2회 감염되는 경우, 제1 감염은 제2 감염 또는 후속 감염의 ml당 GC 수보다 더 많은 ml당 GC 수를 포함한다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 추간판의 세포가 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템으로 2회 이상 감염되는 경우, 각각의 감염은 상이한 수의 게놈 카피의 아데노바이러스 기반 벡터를 포함하고, 제1 감염은 1.4 x 109 GC/ml 내지 1.4 x 1010 GC/ml를 포함하고 제2 또는 후속 감염은 1.4 x 1011 내지 1.4 x 1012 GC/ml를 포함하거나, 제1 감염은 1.4 x 1010 내지 1.4 x 1011 GC/ml를 포함하고 제2 또는 후속 감염은 1.4 x 1011 내지 1.4 x 1012 GC/ml를 포함하거나, 제1 감염은 1.4 x 109 내지 1.4 x 1010 GC/ml를 포함하고 제2 또는 후속 감염은 1.4 x 1010 내지 1.4 x 1011 GC/ml를 포함하거나, 제1 감염은 1.4 x 109 GC/ml 내지 5.6 x 109 GC/ml를 포함하고 제2 또는 후속 감염은 1.4 x 1010 내지 5.6 x 1010 GC/ml를 포함하거나, 제1 감염은 1.4 x 1010 내지 5.6 x 1010 GC/ml를 포함하고 제2 또는 후속 감염은 1.4 x 1011 내지 5.6 x 1011 GC/ml를 포함하거나, 제1 감염은 1.4 x 109 내지 5.6 x 109 GC/ml를 포함하고 제2 또는 후속 감염은 1.4 x 1011 내지 5.6 x 1011 GC/ml를 포함하거나, 제1 감염은 2.8 x 109 GC/ml를 포함하고 제2 또는 후속 감염은 2.8 x 1010 GC/ml를 포함하거나, 제1 감염은 2.8 x 1010 GC/ml를 포함하고 제2 또는 후속 감염은 2.8 x 1011 GC/ml를 포함하거나, 제1 감염은 2.8 x 109 GC/ml를 포함하고 제2 또는 후속 감염은 2.8 x 1011 GC/ml를 포함하거나, 제1 감염은 제2 또는 후속 감염의 GC/ml의 수보다 큰 GC/ml의 수를 포함하거나, 제1 감염은 1.4 x 1011 내지 1.4 x 1012 GC/ml를 포함하고 제2 또는 후속 감염은 1.4 x 109 GC/ml 내지 1.4 x 1010 GC/ml를 포함하거나, 제1 감염은 1.4 x 1011 내지 1.4 x 1012 GC/ml를 포함하고 제2 또는 후속 감염은 1.4 x 1010 내지 1.4 x 1011 GC/ml를 포함하거나, 제1 감염은 1.4 x 1010 내지 1.4 x 1011 GC/ml를 포함하고 제2 또는 후속 감염은 1.4 x 109 내지 1.4 x 1010 GC/ml를 포함하거나, 제1 감염은 1.4 x 1010 내지 5.6 x 1010 GC/ml를 포함하고 제2 또는 후속 감염은 1.4 x 109 GC/ml 내지 5.6 x 109 GC/ml를 포함하거나, 제1 감염은 1.4 x 1011 내지 5.6 x 1011 GC/ml를 포함하고 제2 또는 후속 감염은 1.4 x 1010 내지 5.6 x 1010 GC/ml를 포함하거나, 제1 감염은 1.4 x 1011 내지 5.6 x 1011 GC/ml를 포함하고 제2 또는 후속 감염은 1.4 x 109 내지 5.6 x 109 GC/ml를 포함하거나, 제1 감염은 2.8 x 1010 GC/m를 포함하고 제2 또는 후속 감염은 2.8 x 109 GC/ml를 포함하거나, 제1 감염은 2.8 x 1011 GC/m를 포함하고 제2 또는 후속 감염은 2.8 x 1010 GC/ml를 포함하거나, 제1 감염은 2.8 x 1011 GC/m를 포함하고 제2 또는 후속 감염은 2.8 x 109 GC/ml를 포함한다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 추간판의 세포가 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템으로 2회 이상 감염되는 경우, 각각의 감염은 동일한 수의 게놈 카피의 아데노바이러스 기반 벡터를 포함한다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 추간판의 세포가 아데노바이러스 기반의 생물학적 전달 및 발현 시스템으로 2회 이상 감염되는 경우, 각각의 감염은 1.4 x 109 내지 5.6 x 109, 1.4 x 1010 내지 5.6 x 1010, 1.4 x 1011 내지 5.6 x 1011, 2.8 x 109, 2.8 x 1010, 또는 2.8 x 1011 GC/ml를 포함한다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 추간판의 세포가 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템으로 2회 이상 감염되는 경우, 각각의 감염은 대상체의 동일한 추간판에서 수행된다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 추간판의 세포가 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템으로 2회 이상 감염되는 경우, 모든 제2 및 후속 감염은 이전 감염이 수행된 추간판과 상이한 대상체의 추간판에서 수행된다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 추간판의 감염은 본 개시내용의 약제학적 조성물의 추간판내 주사를 포함한다. 본원에 기재된 "하나 이상의 추간판의 감염"은 본 개시내용을 고려하여 읽을 때 일반적이고 관례적인 의미를 가지며, 본 개시내용의 약제학적 조성물을 DDD 또는 DDD와 관련된 병태에 의해 영향을 받은 하나 이상의 추간판에 투여하는 것을 포함하며, 투여는 DDD 또는 DDD와 관련된 병태에 의해 영향을 받은 하나 이상의 추간판에 약제학적 조성물을 주사하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, DDD 또는 DDD와 관련된 병태에 의해 영향을 받은 추간판에 본 개시내용의 약제학적 조성물을 투여하는 것은 DDD 또는 DDD와 관련된 병태에 의해 영향을 받은 하나 이상의 추간판에 약제학적 조성물을 추간판내 주사함으로써 수행된다. 일부 실시양태에서, DDD 또는 DDD와 관련된 병태에 의해 영향을 받은 추간판에 본 개시내용의 약제학적 조성물을 투여하는 것은 DDD 또는 DDD와 관련된 병태에 의해 영향을 받은 하나 이상의 추간판에 약제학적 조성물을 관절내가 아닌 방법으로 주사함으로써 수행된다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 추간판의 세포를 감염시키는 것은 본 개시내용의 약제학적 조성물을 하나 이상의 추간판의 연골 종판(CEP) 영역, 고도로 조직화된 섬유륜(AF) 영역 또는 중앙 젤라틴성 수핵(NP) 영역(수핵(NP) 세포) 또는 이들의 조합에 주사하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 추간판 세포를 감염시키는 것은 약제학적 조성물을 하나 이상의 추간판의 수핵(NP) 영역에 주사하는 것을 포함한다.
치료 모니터링
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 c) 소정량의, 임의적으로 유효량의, 본 개시내용의 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템을 포함하는 약제학적 조성물로 감염된 이를 필요로 하는 대상체의 하나 이상의 추간판의 세포에서 IL-1Ra의 발현 후 대상체의 퇴행된 추간판에서 DDD의 치료 또는 진행을 모니터링하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 대상체는 포유동물이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 인간이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 후관절 증후군(FJS)을 갖는다. 일부 실시양태에서, 대상체는 후관절 증후군(FJS)을 갖지 않는다.
일부 실시양태에서, DDD의 치료 또는 진행을 모니터링하는 것은 소정량의, 임의적으로 유효량의, 본 개시내용의 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템을 포함하는 약제학적 조성물로 감염된 이를 필요로 하는 대상체의 하나 이상의 추간판의 세포에서 NGF, NT-3, VEGF, 물질 P, 시토카인: IL-1β, IL-6, IL-8, TNF α, MMP 3, MMP 13, ADAMTS 4, 아그레칸 또는 콜라겐 유형 II 또는 이들의 조합의 수준을 결정하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 소정량의, 임의적으로 유효량의, 본 개시내용의 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템을 포함하는 약제학적 조성물로 감염된 이를 필요로 하는 대상체의 하나 이상의 추간판에서 DDD 또는 DDD와 관련된 병태의 치료 또는 진행을 모니터링하는 것은 이를 필요로 하는 대상체의 통증, 신체 기능, 환자 종합 평가, 및 추간판 이미징을 결합하거나; 환자 보고된 통증 및/또는 기능 측정으로부터의 점수를 사용하여 퇴행된 디스크 질환의 진행을 평가하거나; 대상체의 시각적 아날로그 척도(VAS) 점수를 결정함으로써 DDD 관련된 통증을 평가하는 것을 포함하고, 임의적으로 VAS는 하기와 같은 설문지 기반 채점 포인트 척도 시스템이다: 0(통증 없음); 1-3(경미한 통증); 4-6(중간 내지 심한 통증); 7-9(매우 심한 통증); 10(최악의 가능한 통증). 일부 실시양태에서, DDD 또는 DDD와 관련된 병태의 치료 또는 진행의 모니터링에서, 대상체의 VAS 점수가 본 개시내용의 약제학적 조성물을 주사한 후 더 높거나 변화되지 않은 경우, 대상체의 추간판에서 퇴행성 디스크 질환은 관리되지 않거나 치료되지 않은 것으로 간주된다. 일부 실시양태에서, DDD 또는 DDD와 관련된 병태의 치료 또는 진행을 모니터링는 경우, 대상체의 VAS 점수가 본 개시내용의 약제학적 조성물을 주사한 후 더 낮은 경우, 대상체의 추간판에서 퇴행성 디스크 질환은 관리되거나 치료된 것으로 간주된다.
일부 실시양태에서, 이를 필요로 하는 대상체의 하나 이상의 추간판에서 퇴행된 디스크 질환(DDD) 또는 DDD와 관련된 병태의 치료 또는 진행을 모니터링하는 것은 하기와 같이 오스웨스트리 장애 지수(ODI)에 의해 기능 상실 또는 획득을 평가하는 것을 포함한다: 0% 내지 20%(최소 장애); 21%-40%(중간 장애); 41%-60%(심한 장애); 61%-80%(지체부자유): 81%-100%(침대에 눕거나 악화된 증상). 일부 실시양태에서, DDD 또는 DDD와 관련된 병태의 치료 또는 진행의 모니터링에서, 대상체의 ODI 점수가 본 개시내용의 약제학적 조성물을 주사한 후 더 높거나 변하지 않은 경우, 대상체의 추간판에서 퇴행성 디스크 질환은 관리되지 않거나 치료되지 않은 것으로 간주된다. 일부 실시양태에서, DDD 또는 DDD와 관련된 병태의 치료 또는 진행의 모니터링에서, 대상체의 ODI 점수가 본 개시내용의 약제학적 조성물을 주사한 후 더 낮은 경우, 대상체의 추간판에서 퇴행성 디스크 질환은 관리되거나 치료된 것으로 간주된다.
일부 실시양태에서, 이를 필요로 하는 대상체의 하나 이상의 하나 이상의 추간판에서 DDD 또는 DDD와 관련된 병태의 치료 또는 진행을 모니터링하는 것은 이를 필요로 하는 대상체를 목 또는 허리의 통증 또는 압통, 척추의 유연성 및 운동 범위, 운동(앉기 및 걷기 포함)에 영향을 미치는 통증 및 경직, 팔 또는 다리의 따끔거림, 무감각 또는 약화 중 임의의 하나 또는 전부에 대해 신체적으로 검사하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이를 필요로 하는 대상체의 하나 이상의 추간판에서 DDD 또는 DDD와 관련된 병태의 치료 또는 진행을 모니터링하는 것은 이를 필요로 하는 인간을 우울증, 수면 박탈, 통각과민, 중추 민감화, 파국화 또는 이들의 조합에 대해에 대해 신체적으로 검사하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 이를 필요로 하는 대상체의 추간판에서 DDD 또는 DDD와 관련된 병태의 치료 또는 진행을 모니터링하는 것은 방사선 사진 이미징을 사용하여 (a) 추간판의 높이의 변화를 나타내는 척추체 사이의 공간; 및 (b) 골극 형성 및 인접한 척추체 종판이 경화되고 불규칙한지의 여부를 결정하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이를 필요로 하는 대상체의 추간판에서 DDD 또는 DDD와 관련된 병태의 치료 또는 진행을 모니터링하는 것은 자기 공명 이미징(MRI), 초음파(US), 및 광 간섭 단층촬영(OCT) 중 어느 하나 또는 조합을 사용하여 이를 필요로 하는 대상체의 추간판을 이미징하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 이를 필요로 하는 대상체의 추간판에서 DDD 또는 DDD와 관련된 병태의 치료 또는 진행을 모니터링하는 것은 추간판에서 인터루킨-1 수용체 길항제(IL-1Ra) 및 인터루킨-1 베타(IL-1β) 단백질 농도를 측정하는 것; 본 개시내용의 아데노바이러스 기반 벡터에 대한 면역학적 반응을 평가하는 것; 항-캡시드 및 항-IL-1Ra 항체의 존재에 대해 본 개시내용의 약제학적 조성물 또는 방법으로 치료된 인간의 혈액 샘플을 시험하는 것; 및/또는 본 개시내용의 약제학적 조성물 또는 방법으로 치료된 인간의 추간판 조직 및 유체 샘플에서 IL-1Ra 및 IL-1β 단백질 농도를 시험하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 이를 필요로 하는 대상체의 추간판에서 DDD 또는 DDD와 관련된 병태의 치료 또는 진행을 모니터링하는 것은 본 개시내용의 약제학적 조성물 또는 방법으로 치료된 인간의 추간판 조직 및 유체 샘플에서 NGF, NT-3, VEGF, 물질 P, 시토카인: IL-1β, IL-6, IL-8, TNF α, MMP 3, MMP 13, 및 ADAMTS 4, 아그레칸 또는 콜라겐 유형 II 또는 이들의 조합의 수준을 결정하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, DDD 또는 DDD와 관련된 병태의 치료 또는 진행의 모니터링에서, NGF, NT-3, VEGF, 물질 P, 시토카인: IL-1β, IL-6, IL-8, TNF α, MMP 3, MMP 13 및 ADAMTS 4 중 임의의 하나 이상의 수준이 본 개시내용의 약제학적 조성물을 주사한 후 더 높거나 변화되지 않은 경우, 대상체의 추간판에서 퇴행성 디스크 질환은 관리되지 않거나 치료되지 않은 것으로 간주된다. 일부 실시양태에서, DDD 또는 DDD와 관련된 병태의 치료 또는 진행의 모니터링에서, 아그레칸 또는 콜라겐 유형 II 중 임의의 하나 이상의 수준이 본 개시내용의 약제학적 조성물을 주사한 후 더 낮은 경우, 대상체의 추간판에서 퇴행성 디스크 질환은 관리되지 않거나 치료되지 않은 것으로 간주된다. 일부 실시양태에서, DDD 또는 DDD와 관련된 병태의 치료 또는 진행의 모니터링에서, 약제학적 조성물을 주사한 후 하나 이상의 추간판에서 (a) NGF, NT-3, VEGF, 물질 P, IL-1β, IL-6, IL-8, TNF α, MMP 3, MMP 13 또는 ADAMTS 4 또는 이들의 조합의 수준의 증가, 또는 (b) 아그레칸 또는 콜라겐 유형 II 또는 이들의 조합의 수준의 감소 또는 변화 없음, 또는 (c) 둘 모두는 대상체의 추간판에서 퇴행성 디스크 질환이 관리되지 않거나 치료되지 않음을 나타낸다. 일부 실시양태에서, DDD 또는 DDD와 관련된 병태의 치료 또는 진행의 모니터링에서, NGF, NT-3, VEGF, 물질 P, 시토카인: IL-1β, IL-6, IL-8, TNF α, MMP 3, MMP 13 및 ADAMTS 4 중 임의의 하나 이상의 수준이 본 개시내용의 약제학적 조성물을 주사한 후 더 낮은 경우, 대상체의 추간판에서 퇴행성 디스크 질환은 관리되거나 치료된 것으로 간주된다. 일부 실시양태에서, DDD 또는 DDD와 관련된 병태의 치료 또는 진행의 모니터링에서, 아그레칸 또는 콜라겐 유형 II 중 임의의 하나 이상의 수준이 본 개시내용의 약제학적 조성물을 주사한 후 더 높은 경우, 대상체의 추간판에서 퇴행성 디스크 질환은 관리되거나 치료된 것으로 간주된다. 일부 실시양태에서, DDD의 치료 또는 진행의 모니터링에서, 약제학적 조성물을 주사한 후 하나 이상의 추간판에서 (a) NGF, NT-3, VEGF, 물질 P, IL-1β, IL-6, IL-8, TNF α, MMP 3, MMP 13 또는 ADAMTS 4 또는 이들의 조합의 수준의 감소 또는 변화 없음, 또는 (b) 아그레칸 또는 콜라겐 유형 II 또는 이들의 조합의 수준의 증가, 또는 (c) 둘 모두는 대상체의 추간판에서 퇴행성 디스크 질환이 관리되거나 치료됨을 나타낸다.
일부 실시양태에서, DDD의 치료 또는 진행을 모니터링하는 것은 약제학적 조성물을 주사한 후 하나 이상의 추간판에 대한 인간 추간판 퇴행에 대한 조직병리학적 채점 시스템을 기초로 점수의 변화를 결정함으로써 수행된다. 일부 실시양태에서, 인간 추간판 퇴행에 대한 조직병리학적 채점 시스템은 당업계에 공지된 채점 시스템 중 어느 하나, 예컨대 문헌(Christine L. Le Maitre et al., JOR Spine, Vol. 4, Issue 2, June 2021)에 기재된 등급 방법(등급 0-3), 나쳄슨(Nachemson) 분류 시스템(등급 1-4), 톰슨(Thompson) 분류 시스템(등급 1-5), 그리스(Gries) 분류 시스템(등급 1-4), 부스(Boos) 분류 시스템(등급 0-22), 시브(Sive) 분류 시스템(등급 0-12) 및 루테스(Rutges) 분류 시스템(등급 0-12)이다. 일부 실시양태에서, DDD의 치료 또는 진행의 모니터링에서, 약제학적 조성물을 주사한 후 하나 이상의 추간판에 대한 인간 추간판 퇴행에 대한 조직병리학적 채점 시스템에 기초한 점수의 증가 또는 변화 없음은 대상체의 추간판에서 퇴행성 디스크 질환이 관리되지 않거나 치료되지 않음을 타나낸다. 일부 실시양태에서, DDD의 치료 또는 진행의 모니터링에서, 약제학적 조성물을 주사한 후 하나 이상의 추간판에 대한 인간 추간판 퇴행에 대한 조직병리학적 채점 시스템에 기초한 점수의 감소는 대상체의 추간판에서 퇴행성 디스크 질환이 관리되거나 치료됨을 나타낸다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 (d) (c)의 모니터링이 대상체의 추간판에서 퇴행성 디스크 질환이 관리되지 않거나 치료되지 않음을 나타내는 경우, (a)의 하나 이상의 추간판의 세포에 동일한 유효량의 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템을 계속해서 투여하는 단계; 또는 (e) (c)의 모니터링이 대상체의 추간판에서 퇴행성 디스크 질환이 진행됨을 나타내는 경우, (a)의 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템의 양을 추가로 조정하고 하나 이상의 추간판의 세포에 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
DDD, DDD와 관련된 병태 및 이를 앓고 있는 대상체
허리 통증(LBP)은 전 세계적으로 이환율의 가장 큰 원인이며, 일생의 일부 시점에서 인구의 80%에 영향을 미친다(Hoy DG et al., Ann Rheum Dis. 2014; Hoy D et al., Ann Rheum Dis. 2014). 디스크 퇴행 자체가 항상 LBP와 관련되는 것은 아니지만(Brinjikji W et al., AJNR Am J Neuroradiol. 2015), LBP 사례의 40%는 퇴행성 디스크 질환(DDD)으로 공지된 퇴행성 과정에서 추간판(IVD)의 부전에 기인한다(Luoma K, et al., Spine. 2000). IVD 퇴행(IDD) 또는 DDD로 인해 보존적 치료(예컨대, 통증 완화 약물 및 물리치료)를 소진시키고 만성 LBP를 앓고 있는 환자는 침습적이고 비용이 많이 드는 외과적 개입 외에 남은 옵션이 없다. 수백만 명의 삶의 질을 저하시키는 DDD의 심각한 사회 경제적 부담 및 영향에도 불구하고 현재까지 DDD를 중단하거나 되돌릴 수 있는 치료법이 없다.
정상 IVD는 3개의 형태학적으로 구별되는 영역: 연골 종판(CEP), 고도로 조직화된 섬유륜(AF) 및 중앙 젤라틴성 수핵(NP)으로 구성되며, 이들은 집합적으로 작동하여 하중을 전달하고 척추 전체에 에너지를 고르게 분산시킨다. 이 세 조직 간의 상호작용은 IVD를 건강하게 유지하는 데 필요한 국소적 생물물리학적 현상도 제어한다. CEP는 IVD의 무혈관 내부 구조에 영양분 및 산소의 확산을 촉진하는 유리질 연골의 얇은 층이다(Benneker LM et al., Spine. 2005; Bibby SR et al., Eur Spine J. 2004). AF는 라멜라로 배향된 다량의 섬유질의 콜라겐 유형 I을 함유한다. 이는 척추의 굽힘 및 비틀림으로 인한 인장력(Shankar H et al., Techniques in Regional Anesthesia and Pain Management. 2009) 및 압축 하중의 영향을 받는 고도로 수화된 NP의 측면 확장에 대한 저항을 제공한다. NP 세포외 기질(ECM)은 조직 팽윤이 콜라겐 네트워크의 섬유를 늘리는 동안 디스크 팽윤 능력 및 압축에 대한 저항을 제공하는 프로테오글리칸(주로 아그레칸)(Mwale F et al., Eur.Cell Mater. 2004)이 풍부한 기질에 무작위로 배열된 콜라겐 유형 II 섬유로 주로 구성된다(Dolan P et al., Clin.Biomech.(Bristol., Avon.). 2001). 디스크의 세포는 기계에 민감하며 기계적 부하의 이러한 내부 기능 분포는 디스크 조직의 적절한 생물학적 유지에 중요한 생물물리학적 신호를 국소적으로 생성한다.
DDD는 변경된 세포 대사, 기질 합성 및 정상 기질 성분의 분해 증가로 인한 ECM의 점진적인 변화 및 기질 조성의 변화를 특징으로 한다(Le Maitre CL et al., Biochem Soc Trans. 2007; Inkinen RI et al., J Rheumatol. 1998). 동시에 기질 분해는 MMP(기질 메탈로프로테이나제) 및 ADAMTS(트롬보스폰딘 모티프(들)를 갖는 디스인테그린 및 메탈로프로테이나제)의 상향 조절에 의해 가속화된다(Pockert AJ et al., Arthritis Rheum. 2009; Le Maitre CL et al., J Pathol. 2004). IVD 퇴행 동안 기질의 조성 변화는 또한 감소된 조직 세포충실성(Vo NV et al., Orthop Res. 2016)과 함께 증가된 아폽토시스(Gruber HE et al., Spine. 1998, Zhao CQ et al., Apoptosis. 2006) 및 노화(Heathfield SK et al., Arthritis Res.Ther. 2008; Gruber HE et al., Spine. 2007; Le Maitre CL et al., Arthritis Res Ther. 2007; Roberts S et al., Eur Spine J. 2006)를 동반한다. IVD의 세포는 과다한 이화 시토카인 및 케모카인을 생성하고(Vo NV et al., Orthop Res. 2016; Phillips KL et al., Osteoarthritis Cartilage. 2015; Phillips KL et al., Arthritis Res Ther. 2013; Shamji MF et al., Arthritis Rheum. 2010), NP 및 내부 AF에서 가장 높은 발현이 나타났다(Phillips KL et al., Osteoarthritis Cartilage. 2015; Le Maitre CL et al., Arthritis Res Ther. 2005). IL-1 및 IL-1Ra(IL-1 수용체 길항제)는 DDD 발병에서 중추적인 역할을 한다(Hoyland JA et al., Rheumatology (Oxford). 2008; Phillips KL et al., Ann Rheum Dis. 2013; Karppinen J et al., Eur Spine J. 2009; Solovieva S et al., Eur Spine J. 2005; Solovieva S et al., Epidemiology. 2004; Solovieva S, et al., Pain. 2004; Eskola PJ et al., Int J Mol Epidemiol Genet. 2012; Kim DH et al., Spine (Phila Pa 1976). 2010; Paz Aparicio J et al., Eur Spine J. 2011; Le Maitre CL et al., nt J Exp Pathol. 2006).
본 개시내용의 방법의 일부 실시양태에서, DDD 또는 DDD와 관련된 병태를 앓고 있거나 앓고 있는 것으로 확인된 대상체는 포유동물이다. 일부 실시양태에서, DDD 또는 DDD와 관련된 병태를 앓고 있거나 앓고 있는 것으로 확인된 대상체는 인간이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 후관절 증후군(FJS)을 갖는다. 일부 실시양태에서, 대상체는 후관절 증후군(FJS)을 갖지 않는다.
일부 실시양태에서, DDD 또는 DDD와 관련된 병태를 앓고 있거나 앓고 있는 것으로 확인된 인간은 20세 초과 내지 80세 초과, 40-50세, 또는 50세 초과이다. 일부 실시양태에서, DDD 또는 DDD와 관련된 병태를 앓고 있거나 앓고 있는 것으로 확인된 인간은 경추 디스크 질환: 척추의 목 영역에서 발생하는 디스크의 퇴행, 흉부 디스크 질환: 척추의 중간에서 발생하는 디스크의 퇴행, 또는 요추 디스크 질환: 척추의 아래 등에서 발생하는 디스크의 퇴행을 앓고 있다. 일부 실시양태에서, DDD는 추간판의 건조, 추간판 또는 추간 슬립 디스크의 균열 또는 추간판 탈출을 포함하지만 이에 제한되지 않는 퇴행 과정에 의해 야기된다. 일부 실시양태에서, 퇴행 과정은 손상 또는 노화로 인한 것이다.
일부 실시양태에서, DDD와 관련된 병태는 허리 통증, 감소된 등 근육 긴장, 등의 감소된 유연성 또는 혈전 또는 이들의 조합이다. 일부 실시양태에서, DDD와 관련된 병태는 특발성 허리 통증, 요추 신경근병증, 골수병증, 요추 협착증, 척추 협착증, 척추 골관절염, 척추증, 척추전방전위증, 척추측만증, 관절돌기사이 관절 퇴행 또는 이들의 조합이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 후관절 증후군(FJS)을 갖는다. 일부 실시양태에서, 대상체는 후관절 증후군(FJS)을 갖지 않는다.
일부 실시양태에서, DDD는 후술되는 바와 같이 피르만(Pfirrmann) 분류에 따라 등급 2, 3, 4 및 5 중 어느 하나이다: 등급 2, 수평 띠를 갖는 비균질한 모양, 핵과 고리 사이가 약간 흐릿함; 등급 3, 핵과 고리 사이가 흐릿한 비균질한 모양, 고리 모양은 여전히 인식 가능함; 등급 4, 저강도의 비균질한 모양, 고리 모양이 온전하지 않고 핵과 고리 사이의 구별이 불가능함, 디스크 높이가 일반적으로 감소됨; 등급 5, 등급 4와 동일하지만 접힌 디스크 공간을 가짐.
일부 실시양태에서, DDD는 후술되는 바와 같이 등급 1, 2, 3 및 4 중 어느 하나의 섬유륜을 동반한다: 등급 1: 조영제가 찢김을 통해 연골 종판으로 전달됨; 등급 2: 조영제가 골 종판으로 흘러 들어감; 등급 3: 조영제가 종판 아래 척추 해면골에 들어감; 등급 4: 조영제가 해면골 내에 완전히 누출됨. 일부 실시양태에서, DDD의 상이한 단계 또는 등급은 CT 스캔, MRI, x선 또는 이들의 조합을 사용하여 진단된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 DDD는 경추 또는 요추 퇴행성 디스크 질환 중 어느 하나이다. 일부 실시양태에서, DDD는 요추 퇴행성 디스크 질환이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 DDD는 척주 골 쌍: C2-C3, C3-C4, C4-C5, C5-C6, C6-C7, C7-T1, T1-T2, T2-T3, T3-T4, T4-T5, T5-T6, T6-T7, T7-T8, T8-T9, T9-T10, T10-T11, T11-T12, T12-L1, L1-L2, L2-L3, L3-L4, L4-L5 및 L5-S1, 또는 이들의 임의의 조합 사이의 추간판의 DDD이다. 일부 실시양태에서, DDD는 척주 골 쌍: L4-L5 또는 L5-S1 또는 이들의 조합 사이의 추간판의 DDD이다.
일부 실시양태에서, 인간은 DDD 또는 노화, 유전적 소인, 비만, 대사 질환, 관절 손상, 척주에 대한 반복된 스트레스, 스포츠 부상 또는 골 기형 또는 이들의 조합으로 인해 유발되는 DDD 또는 DDD와 관련된 병태를 앓고 있거나 앓고 있는 것으로 확인된다. 일부 실시양태에서, 대상체는 후관절 증후군(FJS)을 갖는다. 일부 실시양태에서, 대상체는 후관절 증후군(FJS)을 갖지 않는다.
일부 실시양태에서, 인간은 하기 단계 중 어느 하나의 DDD 또는 DDD와 관련된 병태를 앓고 있거나 앓고 있는 것으로 확인된다: 단계 1: 척추가, 결국 자세에 영향을 미치는 척추 만곡에 대한 손상 가능성과 함께, 정상적인 균형을 상실함. 관절 및 신경이 스트레스를 받고 더 빨리 노화되기 시작함. 통증 또는 불편함이 거의 없이 전반적인 에너지가 감소하고 심지어 약간의 키 감소도 있을 수 있음; 단계 2: 디스크가 더 좁아지고 골 변형(골돌기)이 나타나기 때문에 디스크 쇠태의 정도가 더 큼. 자세의 변화가 더욱 뚜렷해지고 척추관이 좁아지기 시작할 수도 있음. 통증 및 불편함이 더욱 뚜렷해지고 키가 계속해서 감소할 수 있음. 더 많은 전반적인 탈진 뿐만 아니라 스트레스 대처 능력도 저하됨; 단계 3: 자세가 현저하게 영향을 받음. 디스크가 훨씬 더 얇아지고 중간 내지 심한 신경 손상 및 반흔 조직 형성이 발생할 수도 있음. 더 진행된 경우에는 추가 골 변형이 발생함. 환자의 전반적인 신체적 및/또는 정신적 상태의 악화 및 심각한 에너지 손실; 및 단계 4: 척추에 심한 손상이 발생. 디스크 얇아짐이 최대이거나 더 심하면 완전히 사라짐. 자세 불균형이 심각하고 움직임 및 유연성이 극도로 제한됨. 환자는 종종 심한 신경 손상을 겪고, 영구적인 반흔 조직이 형성되고, 골이 융합되기 시작할 수도 있음. 심한 통증 및 더욱 진전된 정도의 신체적 및/또는 정신적 악화를 경험함. 또한, 키 및 에너지 수준의 지속적인 손실이 있음. 단계 4 DDD는 일반적으로 되돌릴 수 없는 것으로 간주된다.
본 개시내용은 제한하는 것으로 해석되어서는 안되는 하기 실시예에 의해 추가로 예시된다.
실시예
실시예 1: PCRX-201 감염은 NP 세포의 생존력에 영향을 미치지 않는다(레자주린 환원 검정)
인간 수핵(NP) 세포를 외과 샘플로부터 콜라게나제 분해를 통해 단리하였다. 각각의 외과 샘플로부터의 조직을 또한 NP 영역만을 0-9의 척도(0-3은 비-퇴행이고, 4-6은 중간 퇴행이고, 7-9는 심한 퇴행임)로 등급화하는 인간 IVD 퇴행에 대한 합의 등급화 시스템을 활용하는 조직학적 등급화를 위해 파라핀 왁스에 묻었다. 비-퇴행성 및 퇴행성 디스크로부터 유래된 NP 세포를 단층 배양에서 최대 계대 2까지 확장하였으며, PCRX-201(FX201로도 공지됨)로 0, 100, 500, 1000, 2000 및 300 감염 다중도(MOI)로 감염시키고, (생존력의 대리 측정으로) 대사 활성을 24시간, 48시간, 72시간 및 1주에 레자주린 환원 검정을 이용하여 조사하였다. MOI 2000 및 3000으로 1주 감염 후 대사 활성의 약간의 감소가 관찰되었지만, PCRX-201 감염 후 최대 MOI 3000에서도 최대 72시간까지 대사 활성의 상실이 관찰되지 않았다(P<0.05)(도 3).
실시예 2: PCRX-201 감염은 NP 세포의 생존력에 영향을 미치지 않는다(DNA 함량)
퇴행성 인간 IVD(n=6: 등급: 4, 5, 5, 6, 7 및 8)로부터 유래된 NP 세포를 MOI 0, 750 및 3000으로 PCRX-201로 48시간 동안 단층으로 감염시키고, 이어서 생체내 표현형을 모방하고 재분화 및 증식 속도를 유도하기 위해 알기네이트 비드 배양으로 옮겼다. 알기네이트 비드는 배양의 마지막 7일 동안 생리학적으로 관련된 농도의 IL-1β(100 pg/ml)로의 자극과 함께/없이 최대 21일 동안 생체내 환경을 모방하기 위해 5% O2의 낮은 글루코스 배지에서 유지되었다. IL-1Ra 생성을 ELISA를 이용하여 결정하고, 생존력을 4명의 환자(등급 5, 5, 7, 8)로부터 유래된 NP 세포에서 피코 그린 정량화를 이용하여 DNA 함량을 통해 평가하였다. PCRX-201 감염 후 알기네이트 배양 21일 후에도 DNA 함량의 감소는 관찰되지 않았으며(도 4), 이는 세포 생존력에 대한 부작용이 없음을 시사한다.
실시예 3: PCRX-201은 비-퇴행성 디스크 및 퇴행성 디스크로부터 유래된 인간 IVD 세포에서 IL-1Ra 유전자 및 단백질 발현을 유도할 수 있다
PCRX-201이 퇴행성 디스크로부터 유래된 NP 세포에서 IL-1Ra 단백질을 유도할 수 있는지 조사하기 위해, 7명의 환자 샘플(등급: 4, 4, 5, 5, 8, 9 및 9)을 단독으로 또는 추가적인 10 ng/ml IL-1β 자극과 함께 48시간 동안 MOI 3000으로 계대 2에서 단층 배양에서 PCRX-201로 감염시켰다. IL-1β 자극과 함께 및 없이 감염 후 48시간 및 120시간에 조건화된 배지를 수집하고 ELISA를 이용하여 IL-1Ra 생성을 결정하였다. 단층 배양에서 비-감염된 인간 NP 세포의 IL-1β로의 자극은 48시간 및 120시간 후 NP 세포에 의한 IL-1Ra 생성의 상당한 증가를 유도하였다(P<0.05)(도 5a 및 5b). 단층 배양에서 PCRX-201로의 감염은 감염 후 48시간 및 120시간 후 배양 배지로의 IL-1Ra 단백질 분비를 크게 ~ 100배 증가를 유도하였으며(P<0.05)(도 5a 및 5b), IL-1β 자극 후 생성이 더욱 향상되었다. 여기에 기재된 연구 결과는 PCRX-201이 시험관내에서 단층 및 3D 조건에서 퇴행성 인간 NP 세포를 감염시키고 IL-1Ra의 생성을 증가시키는 능력을 가지고 있음을 입증하였다.
실시예 4: 생체내 환경을 모방하고 IL-1Ra의 방출 프로파일을 결정하는 조건에서 연장된 배양 기간에 걸친 PCRX-201의 유지
퇴행성 인간 IVD(n=6: 등급: 4, 5, 5, 6, 7 및 8)로부터 유래된 NP 세포를 MOI 0, 750 및 3000으로 PCRX-201로 48시간 동안 단층으로 감염시키고, 이어서 생체내 표현형을 모방하고 재분화 및 증식 속도를 유도하기 위해 알기네이트 비드 배양으로 옮겼다. 알기네이트 비드는 배양의 마지막 7일 동안 생리학적으로 관련된 농도의 IL-1β(100 pg/ml)로의 자극과 함께/없이 최대 21일 동안 생체내 환경을 모방하기 위해 5% O2의 낮은 글루코스 배지에서 유지되었다. IL-1Ra 생성을 ELISA를 이용하여 결정하였다. PCRX-201로 감염된 NP 세포에 의한 IL-1Ra 단백질 분비는 알기네이트 배양에서 시간이 지남에 따라 연장된 IL-1Ra 생성을 유지하면서 알기네이트 배양에서 2, 7, 14 및 21일 후 MOI 용량 의존적 증가를 나타내었으며, IL-Ra 생성의 ~2000배 증가가 MOI 750으로의 배양에서 21일 후 유도되었으며 ~3000배의 증가가 MOI 300 후 유도되었다(P<0.05)(도 6a-6d). 생리학적 농도(100 pg/ml)의 IL-1로의 자극은 IL-1Ra 방출에 유의미한 증가를 유도하지 않았다(도 6a-6d).
실시예 5: PCRX-201로 감염된 퇴행성 NP 세포로부터 IL-1Ra 생성의 장기간 유지
PCRX-201로 감염된 퇴행성 NP 세포로부터 IL-1Ra 생성의 유지를 조사하기 위해, 상술된 배양물을 최대 10주 동안 생리학적 조건을 모방하기 위해 5% O2의 낮은 글루코스 DMEM 배지에서 유지하였다. 배양 배지로의 IL-1Ra 방출을 감염 후 1, 2, 3, 4, 6, 8 및 10주 후에 정량화하였다. 배양 8주 후 알기네이트 배양 무결성은, 조건화된 배지 내 더 낮은 IL-1Ra 함량과 일치하는, 알기네이트 배양으로부터 세포의 손실로 인해 감소되었지만, PCRX-201로 감염된 세포로부터의 IL-1 Ra 생성은 배양 10주 후에도 상당히 향상되었다(P<0.05)(도 7). 이러한 결과는 인간 퇴행성 디스크로부터 단리된 NP 세포에서 PCRX-201의 감염에 의해 유도된 IL-1Ra 단백질의 생성이 적어도 10주 동안 낮은 글루코스 및 5% O2의 천연 생리학적 조건을 모방하는 3D 배양 환경에서 높은 수준으로 유지된다는 것을 입증한다.
실시예 6: 인간 IVD 세포에서 PCRX-201에 의한 IL-1Ra 유도의 디스크 퇴행의 이화 특색 및 통증 유발 인자 방출에 대한 효능
퇴행성 인간 NP 조직(n=6; 등급: 4, 5, 5, 6, 7 및 8)으로부터 유래된 NP 세포를 MOI 0, 750 및 3000으로 단층으로 감염시키고, 알기네이트 비드 배양으로 옮겼다. 배양물을 추가 1주 동안 100 pg/ml IL-1β와 함께/없이 자극하기 전 14일 동안 생체내 환경을 모방하기 위해 5% O2의 낮은 글루코스 배지에서 유지하였다. 혈관신생 및 신경영양 인자: NGF, VEGF, 시토카인: IL-1, IL-6 및 IL-8; 및 기질 분해 효소: MMP 3 및 ADAMTS 4의 발현을 억제하는 PCRX-201의 능력을 결정하기 위해 조건화된 배지로의 단백질 방출을 조사하여 결정되었다. NGF의 유전자 발현도 조사되었다.
NGF 단백질 발현은 1명의 환자 샘플 내에서만 낮은 수준으로 검출되었으며 다른 환자는 ELISA의 검출 가능한 한계 미만이었으므로, NGF 생성에 대한 PCRX-201의 잠재적 영향을 조사하기 위해 유전자 발현 분석이 활용되었다. NGF mRNA 발현은 100 pg/ml IL-1β 자극에 의해 약간 증가된 반면, PCRX-201로의 감염은 NGF mRNA 발현의 용량 의존적 감소를 유도하였다(도 8).
VEGF 생성은 배양 7, 14 및 21일 후 PCRX-201로 감염된 세포에서 상당히 감소된 반면, 100 pg/ml IL-1β는 VEGF의 증가를 유도하지 않았다(도 9s-9d).
IL-1β 단백질 방출은 PCRX-201 감염 후 배양 2, 7, 14 및 21일에 용량 의존적 방식으로 상당히 감소되었다(P<0.05)(도 10a-10d). IL-6 및 IL-8 단백질은 배양 2일 후 배양 상등액에서 많은 환자 샘플에서 검출되지 않았다. IL-6은 PCRX-201 감염 후 배양 7, 14 및 21일에 용량 의존적 방식으로 상당히 감소되었으며, IL-1β로의 자극은 모든 처리 그룹에서 IL-6 생성을 증가시켰다(P<0.05)(도 11a-11c). 대조적으로, IL-8 생성은 IL-1β 자극 또는 PCRX-201로의 감염에 의해 영향을 받지 않았다(도 12a-12c).
기질 분해 효소 MMP 3 및 ADAMTS 4의 생성은 MOI 750 및 3000으로 PCRX-201로 감염된 퇴행성 디스크로부터 유래된 NP 세포에서 조사되었으며, 추가 1주 동안 100 pg/ml IL-1β로 자극하기 전에 재분화를 가능하게 하기 위해 알기네이트에서 14일 동안 배양되었다. MMP 3 및 ADAMTS 4는 750 및 3000 MOI 둘 다로의 PCRX-201 이후 상당히 하향 조절된 반면(P<0.05), IL-1β 자극은 비-감염된 세포에서만 MMP 3 및 ADAMTS 4 생성의 작지만 유의미하지 않은 증가를 유도하였다(도 12a 및 12b).
이들 결과는 PCRX-201로의 퇴행성 디스크로부터 유래된 NP 세포의 감염이 PCRX-201로 감염된 세포에서 주요 이화, 혈관신생 및 신경영양 인자의 생성을 감소시킨다는 것을 입증한다.
PCRX-201 감염된 NP 세포로부터 방출된 IL-1Ra가 측분비 방식으로도 작용하여 잠재적으로 PCRX-201로 직접적으로 감염된 세포 너머의 디스크에 추가로 다른 효과를 전달할 수 있는지의 여부를 확인하기 위해, 조건화된 배지를 PCXR-201로 감염된 환자 매칭된 인간 NP 세포로부터 수집하고 5% O2의 낮은 글루코스 배지에서 72시간의 기간 동안 비-감염된 대조군 세포를 처리하는 데 활용하였다. 비처리된 비-감염된 대조군 세포 및 PCRX-201 환자 매칭된 세포로부터의 조건화된 배지로 자극된 세포에 의한 IL-1Ra(도 13a), IL-1β(도 13b), IL-6(도 13c), MMP 3(도 13d) 및 ADAMTS 4(도 13e)의 단백질 생성을 ELISA를 이용하여 결정하였다. PCRX-201 세포로부터의 조건화된 배지는 비-감염된 세포에서 측분비 방식으로 IL-6, MMP 3 및 ADAMTs 4의 단백질 생성을 상당히 감소시켰지만(P<0.05), IL-1β의 적은 증가가 관찰되었으며 IL-1Ra의 증가된 농도와 비교하여 매우 낮은 수준으로 나타났다.
이러한 결과는 PCRX-201로 퇴행성 디스크로부터 유래된 NP 세포의 감염이 PCRX-201로 감염된 세포 및 국소 세포에서 측분비 방식으로 주요 이화, 혈관신생 및 신경영양 인자의 생성을 감소시킨다는 것을 입증한다.
실시예 7: 외식편 모델을 사용하여 직접 주사 후 인간 IVD 조직에서 IL-1Ra 생성을 유도하는 PCRX-201의 능력
생체외 유전자 전달과 반대로 PCRX-201이 IVD 내에 직접적으로 IL-1Ra를 전달하는 데 활용될 수 있는지의 여부를 결정하기 위해, PCRX-201을 NP 조직 무결성 및 표현형을 유지하는 반구속형 배양 시스템 내에서 배양된 인간 IVD 조직 외식편에 직접적으로 주사하였다(도 14). 이 연구에는 5명의 환자 샘플(조직학적 등급: 4, 5, 6, 7 및 8)이 활용되었다. 조직 외식편을 비-주사된 대조군, PCRX-201 주사(외식편당 50 μl)의 3가지 처리 그룹으로 나누었다. 감염률은 MOI 3000을 생성하도록 4x106개 세포/mm3의 디스크 조직의 세포 밀도 및 98.2 mm3(5 mm 직경 코어, 5 mm 높이)의 조직 외식편 면적을 기준으로 계산되었다. 모든 처리는 낮은 글루코스, 5% O2 배양으로 최대 2주 동안 3회 수행되었다. ELISA를 통해 배지로의 IL-1Ra의 방출을 조사하기 위해 세포 배양 상등액을 수거하고, 또한 조직 외식편을 왁스로 처리하고 조직 외식편에서 IL-1Ra의 발현을 조사하기 위해 면역조직화학을 활용하였다. 조직 외식편으로부터의 IL-1Ra 단백질 방출 및 IL-1Ra에 대해 면역양성인 NP 조직 내 세포의 수 둘 다의 상당한 증가가 PCRX-201을 NP 조직 외식편에 주사한 후 2주에 나타났다(도 15a-15b).
또한, 천연 NP 조직에 PCRX-201의 직접 주사가 퇴행성 디스크에서 동화작용을 촉진하고 이화 과정을 억제할 수 있는지의 여부를 조사하기 위해 이러한 디스크 외식편을 활용하였다. 세포 배양 상등액을 VEGF, IL-1β, IL-6, MMP 3, ADAMTs 4, 콜라겐 유형 II 및 아그레칸에 대해 ELISA를 이용하여 분석하였으며, 파라핀에 묻힌 조직 외식편에 대해 면역조직화학을 수행하여 각각의 외식편 내에서 VEGF, NGF, IL-1β, MMP 3, ADAMTs 4, 콜라겐 유형 II 및 아그레칸에 대해 면역양성인 세포의 백분율을 결정하였다. 퇴행성 디스크로부터 유래된 인간 NP 조직 외식편에 PCRX-201의 주사로 VEGF(도 16a) 및 MMP3(도 16d)의 농도가 상당히 감소되었고, IL-1β(도 16b) 및 IL-6(도 16c)의 감소도 관찰되었으나 유의성에는 도달하지 못하였다. 배양 배지로 방출된 ADAMTs 4 단백질 농도는 주사 후 2주에 변경되지 않았다(도 16e). 매우 제한된 콜라겐 유형 II가 조건화된 배지에서 관찰된 반면(도 16f), 아그레칸은 배지로 방출되었으며 이는 잠재적으로 감소된 분해로 인해 PCRX-201이 주사된 조직 외식편에서 상당히 감소되었다(도 16g). 면역조직화학적 분석은 VEGF(도 17a), IL-1β(도 17c) 및 MMP 3(도 17d)에 대한 면역양성 세포의 수의 상당한 감소와 함께 이러한 결과를 확인시켜 주었다. 면역양성 세포 백분율의 작지만 유의미하지 않은 감소가 ADAMTS 4에 대해서도 나타난 반면(도 17e). NGF(도 17b) 및 콜라겐 유형 II(도 17f)에 대한 면역양성 세포의 수는 주사 후 2주에 영향을 받지 않았다.
이러한 데이터는 PCRX-201이 직접 주사를 통해 천연 조직 내에서 증가된 IL-1Ra 생성을 유도할 수 있고 이는 감소된 이화작용 및 감소된 아그레칸 분해를 유도한다는 증거를 제공한다.
결론:
종합하면, 외과적으로 제거된 인간 IVD 조직으로부터 단리된 세포 및 조직을 사용하여 수행된 이러한 데이터는 PCRX-201이 퇴행성 디스크로부터 유래된 NP 세포에 의한 활성 IL-1Ra 단백질 생성을 성공적으로 증가시킬 수 있음을 입증하였다. 감염된 세포에 의한 IL-1Ra 단백질의 발현은 글루코스, O2, 세포 표현형 및 증식 능력 측면에서 IVD 환경을 모방하는 3D 배양 시스템에서 장기간(최대 10주 조사) 유지될 수 있었다. 유도된 IL-1Ra는 조건화된 배지로의 처리를 통해 감염된 세포 및 측분비 방식 세포에서 주요 이화 인자(분해 효소 및 이화 및 염증 시토카인), 혈관신생 및 신경영양 인자(VEGF 및 NGF)의 하향 조절을 초래하였다. 또한, 생체외 배양 시스템에서 천연 디스크 조직에 PCRX-201의 직접 주사로 주사된 디스크에서 IL-1Ra 생성 및 발현은 증가하였고 이화작용은 일치하게 감소하였다.
Claims (61)
- 인터루킨-1 수용체 길항제(IL-1Ra) 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템을 포함하는, 퇴행성 디스크 질환(DDD) 또는 DDD와 관련된 병태의 치료를 필요로 하는 대상체에서 DDD 또는 DDD와 관련된 병태를 치료하기 위한 약제학적 조성물.
- 제1항에 있어서, 핵산이 좌측 및 우측 역위 말단 반복부, 아데노바이러스 패키징 신호 및 비-바이러스 및 비-코딩 스터퍼 핵산 서열을 추가로 포함하는 것인 약제학적 조성물.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 핵산이 IL-1Ra 단백질을 코딩하는 핵산 서열의 판독 프레임의 상류에 위치된 염증 민감성 프로모터를 추가로 포함하여, IL-1Ra 유전자의 발현이 염증 민감성 프로모터에 의해 조절되며, 임의적으로 염증 민감성 프로모터는 NF-κB, 인터루킨 6(II-6), 인터루킨-1(IL-1), 종양 괴사 인자(TNF), 사이클로옥시게나제 2(COX-2), 보체 인자 3(C3), 혈청 아밀로이드 A3(SAA3), 및 대식세포 염증 단백질-1a(MIP-1a), 또는 이의 하이브리드 구축물에 의해 유도 가능한 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 약제학적 조성물.
- 제1항 또는 제3항에 있어서, 핵산이 IL-1Ra 단백질을 코딩하는 핵산 서열의 판독 프레임의 상류에 위치된 NF-κB 유도성 프로모터를 추가로 포함하여, IL-1Ra 유전자의 발현이 NF-κB 유도성 프로모터에 의해 조절되는 것인 약제학적 조성물.
- 제1항 또는 제4항에 있어서, 핵산이, 서열번호 7의 핵산 서열과 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일하거나, 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 것인 약제학적 조성물.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, DDD와 관련된 병태가 허리 통증, 감소된 등 근육 긴장, 등의 감소된 유연성, 혈전 또는 이들의 조합인 약제학적 조성물.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, IL-1Ra를 코딩하는 핵산의 서열이, 서열번호 4의 핵산 서열과 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일하거나, 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 것인 약제학적 조성물.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, IL-1Ra를 코딩하는 핵산의 서열이, 서열번호 6의 아미노산 서열과 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일하거나, 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 IL-1Ra 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 것인 약제학적 조성물.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, IL-1Ra 단백질이 인간 IL-1Ra인 약제학적 조성물.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템이 인터루킨-1 수용체 길항제(IL-1Ra) 단백질 이외의 단백질을 코딩하는 핵산을 추가로 포함하고, 임의적으로 추가 단백질은 치료 단백질인 약제학적 조성물.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 약제학적 조성물이 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템을 이를 필요로 하는 대상체의 하나 이상의 추간판의 세포에 직접적으로 전달하기 위해 제제화되는 것인 약제학적 조성물.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체의 하나 이상의 추간판이 퇴행성 디스크 또는 비-퇴행성 디스크 또는 둘 다인 약제학적 조성물.
- 제12항에 있어서, 상기 대상체의 하나 이상의 추간판이 퇴행성 디스크인 약제학적 조성물.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 약제학적 조성물이 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템을 하나 이상의 추간판의 연골 종판(CEP), 고도로 조직화된 섬유륜(AF) 및 중앙 젤라틴성 수핵(NP) 영역(수핵(NP) 세포) 또는 이들의 조합의 세포로 전달하기 위해 제제화되는 것인 약제학적 조성물.
- 제14항에 있어서, 약제학적 조성물이 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템을 수핵(NP) 세포로 전달하기 위해 제제화되는 것인 약제학적 조성물.
- 제14항에 있어서, 세포가 수핵(NP) 세포인 약제학적 조성물.
- 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템으로 감염된 퇴행성 디스크의 세포만이 IL-1Ra를 생성하는 것인 약제학적 조성물.
- 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체의 하나 이상의 추간판의 세포가 적어도 2주, 적어도 1개월, 적어도 3개월, 적어도 6개월 또는 적어도 1년의 기간 동안 IL-1Ra를 발현하는 것인 약제학적 조성물.
- 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 약제학적 조성물이, 대상체에게 투여 시, 대상체에서 퇴행성 디스크 질환(DDD) 및/또는 DDD와 관련된 병태를 치료하기에 효과적인 양의 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템을 포함하는 것인 약제학적 조성물.
- 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 후관절 증후군(FJS)을 갖지 않는 것인 약제학적 조성물.
- 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 후관절 증후군(FJS)을 갖는 것인 약제학적 조성물.
- 퇴행성 디스크 질환(DDD) 또는 DDD와 관련된 병태를 앓고 있는 대상체의 하나 이상의 추간판의 세포에서 IL-IRA를 발현시키는 방법으로서,
a) 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항의 약제학적 조성물로, 이를 필요로 하는 대상체의 하나 이상의 추간판의 세포를 감염시키는 단계; 및
b) 하나 이상의 추간판의 세포에서 IL-1Ra를 발현시키는 단계
를 포함하는 상기 대상체의 하나 이상의 추간판의 세포에서 IL-IRA를 발현시키는 방법. - 제22항에 있어서, 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템이 인터루킨-1 수용체 길항제(IL-1Ra) 단백질 이외의 단백질을 코딩하는 핵산을 추가로 포함하고, 임의적으로 추가 단백질은 치료 단백질이고, 방법이 하나 이상의 추간판의 세포에서 추가 단백질을 발현시키는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
- 제22항 또는 제23항에 있어서, 하나 이상의 추간판의 세포가 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템으로 1회 감염되는 것인 방법.
- 제22항 또는 제23항에 있어서, 하나 이상의 추간판의 세포가 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템으로 2회 이상 감염되는 것인 방법.
- 제25항에 있어서, 하나 이상의 추간판의 세포가 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템으로 2회 이상 감염되는 경우, 각각의 감염이 상이한 수의 게놈 카피의 아데노바이러스 기반 벡터를 포함하는 것인 방법.
- 제25항에 있어서, 하나 이상의 추간판의 세포가 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템으로 2회 이상 감염되는 경우, 각각의 감염이 동일한 수의 게놈 카피의 아데노바이러스 기반 벡터를 포함하는 것인 방법.
- 제25항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 추간판의 세포가 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템으로 2회 이상 감염되는 경우, 각각의 감염이 대상체의 동일한 추간판에서 수행되는 것인 방법.
- 제25항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 추간판의 세포가 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템으로 2회 이상 감염되는 경우, 모든 제2 및 후속 감염이 이전 감염이 수행된 추간판과 상이한 대상체의 추간판에서 수행되는 것인 방법.
- 제22항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 추간판의 세포를 감염시키는 것이 약제학적 조성물을 하나 이상의 추간판의 연골 종판(CEP) 영역, 고도로 조직화된 섬유륜(AF) 영역 또는 중앙 젤라틴성 수핵(NP) 영역(수핵(NP) 세포) 또는 이들의 조합에 주사하는 것을 포함하는 것인 방법.
- 제30항에 있어서, 하나 이상의 추간판의 세포를 감염시키는 것이 약제학적 조성물을 하나 이상의 추간판의 수핵(NP) 영역에 주사하는 것을 포함하는 것인 방법.
- 제22항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 방법이 대상체에서 퇴행성 디스크 질환(DDD) 및/또는 DDD와 관련된 병태를 치료하는 것인 방법.
- 제22항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서,
c) (b)에서 IL-1Ra의 발현 후 대상체의 퇴행된 추간판에서 DDD 또는 DDD와 관련된 병태의 치료 또는 진행을 모니터링하는 단계
를 추가로 포함하는 방법. - 제33항에 있어서, DDD 또는 DDD와 관련된 병태의 치료 또는 진행을 모니터링하는 것이 환자 보고된 통증 및/또는 기능 측정으로부터 점수를 결정함으로써 수행되는 것인 방법.
- 제34항에 있어서, 환자 보고된 통증으로부터 점수를 결정하는 것이 시각적 아날로그 척도(VAS)를 사용하여 수행되는 것인 방법.
- 제22항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체의 VAS 점수가 약제학적 조성물로 대상체의 하나 이상의 추간판의 세포를 감염시킨 후 더 낮은 것인 방법.
- 제34항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 환자 기능 측정으로부터 점수를 결정하는 것이 오스웨스트리 장애 지수(ODI)를 사용하여 수행되는 것인 방법.
- 제22항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체의 VAS 점수가 약제학적 조성물로 대상체의 하나 이상의 추간판의 세포를 감염시킨 후 더 낮은 것인 방법.
- 제33항에 있어서, DDD 또는 DDD와 관련된 병태의 치료 또는 진행을 모니터링하는 것이 NGF, NT-3, VEGF, 물질 P, 시토카인, 아그레칸, 콜라겐 유형 II, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 대상체의 마커의 수준을 결정하는 것을 포함하는 것인 방법.
- 제39항에 있어서, 시토카인이 IL-1β, IL-6, IL-8, TNF α, MMP 3, MMP 13, ADAMTS 4, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
- 제22항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 약제학적 조성물로 대상체의 하나 이상의 추간판의 세포를 감염시킨 후 하나 이상의 추간판에서 다음 중 하나 이상이 발생하는 것인 방법:
(a) NGF, NT-3, VEGF, 물질 P, IL-1β, IL-6, IL-8, TNF α, MMP 3, MMP 13, 또는 ADAMTS 4, 또는 이들의 조합 중 하나 이상의 수준이 감소 또는 변화하지 않음;
(b) 아그레칸 또는 콜라겐 유형 II 또는 이들의 조합의 수준이 증가함; 또는
(c) 둘 모두. - 제22항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 약제학적 조성물로 대상체의 하나 이상의 추간판의 세포를 감염시킨 후 하나 이상의 추간판에서 아그레칸의 수준이 증가하는 것인 방법.
- 제33항에 있어서, DDD 또는 DDD와 관련된 병태의 치료 또는 진행을 모니터링하는 것이, 약제학적 조성물로 대상체의 하나 이상의 추간판의 세포를 감염시킨 후 하나 이상의 추간판에 대해 인간 추간판 퇴행에 대한 조직병리학적 채점 시스템에 기초한 점수의 변화를 결정함으로써 수행되는 것인 방법.
- 제22항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 추간판에 대해 인간 추간판 퇴행에 대한 조직병리학적 채점 시스템에 기초한 점수의 감소가 약제학적 조성물로 대상체의 하나 이상의 추간판의 세포를 감염시킨 후 발생하는 것인 방법.
- 제33항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서,
(d) (c)의 모니터링이 대상체의 추간판의 퇴행성 디스크 질환이 관리 또는 치료되지 않음을 나타내는 경우, (a)의 하나 이상의 추간판의 세포에 동일한 양의 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템을 계속 투여하는 단계; 또는
(e) (c)의 모니터링이 대상체의 추간판의 퇴행성 디스크 질환이 진행됨을 나타내는 경우, (a)의, 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템의 양을 추가로 조정하고 이를 필요로 하는 대상체의 하나 이상의 추간판의 세포에 투여하는 단계
를 추가로 포함하는 방법. - 제22항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 방법이 대상체의 추간판에 코르티코스테로이드 및/또는 국소 마취제의 투여를 추가로 포함하는 것인 방법.
- 제46항에 있어서, 코르티코스테로이드 및/또는 국소 마취제가 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템과 동시에 투여되도록, 코르티코스테로이드 및/또는 국소 마취제가 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템과 단일 약제학적 제제에 있는 것인 방법.
- 제46항에 있어서, 코르티코스테로이드 및/또는 국소 마취제가 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템 전 및/또는 후에 투여되도록, 코르티코스테로이드 및/또는 국소 마취제가 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템과 단일 약제학적 제제에 있지 않는 것인 방법.
- 제22항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 방법이 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템 후에 대상체의 추간판에 유체의 투여를 추가로 포함하고, 임의적으로 유체의 양은 하기이거나, 약 하기이거나, 하기 미만이거나, 약 하기 미만이거나, 하기 초과이거나, 약 하기 초과인 방법: 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 μl, 또는 이전 값 중 임의의 2개에 의해 정의된 범위, 임의적으로 25-1000, 25-500, 25-200, 50-150, 500-1000, 200-800, 200-600, 400-800, 또는 600-800 μl.
- 제49항에 있어서, 유체가 식염수인 방법.
- 제46항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 추가 투여가 코르티코스테로이드 및/또는 국소 마취제 및/또는 유체의 추간판내 주사를 포함하는 것인 방법.
- 제22항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 후관절 증후군(FJS)을 갖지 않는 것인 방법.
- 제22항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 후관절 증후군(FJS)을 갖는 것인 방법.
- 제22항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 방법이 약제학적 조성물의 추간판내 주사를 포함하는 것인 방법.
- 제51항 또는 제54항에 있어서, 추간판내 주사가 중앙 젤라틴성 수핵(NP) 영역에 대한 것인 방법.
- 제22항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 방법이 약제학적 조성물의 힘줄내, 근육내, 관절내, 또는 견봉하 주사를 포함하지 않는 것인 방법.
- 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 약제학적 제제 중 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템의 농도가 하기이거나, 약 하기인 조성물 또는 방법: 1 x 108 내지 5 x 1011 VP/ml, 2 x 108 내지 2 x 1011 VP/ml, 2 x 109 내지 2 x 1011 VP/ml, 1 x 108 내지 2 x 109 VP/ml, 또는 1 x 109 VP/ml 미만.
- 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 약제학적 제제 중 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템의 농도가 하기이거나, 약 하기인 조성물 또는 방법: 1 x 108 내지 5 x 1011 GC/ml, 2 x 108 내지 2 x 1011 GC/ml, 2 x 109 내지 2 x 1011 GC/ml, 1 x 108 내지 2 x 109 GC/ml, 또는 1 x 109 GC/ml 미만.
- 제1항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 척추내 디스크에 투여되는 약제학적 조성물의 단일 용량이 하기이거나, 약 하기이거나, 하기 미만인 양인 조성물 또는 방법: 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 1, 2, 3, 4, 또는 5 ml, 또는 이전 값 중 임의의 2개에 의해 정의된 범위, 임의적으로 0.1 ml 내지 5 ml, 0.5 ml 내지 5 ml, 0.5 ml 내지 2 ml, 1 ml 내지 5 ml, 2 ml 내지 5 ml, 4 ml 내지 5 ml, 또는 3 ml 내지 5 ml.
- 제17항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 감염된 세포가 NP 세포를 포함하는 것인 조성물 또는 방법.
- 제1항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 아데노바이러스 기반 생물학적 전달 및 발현 시스템이 FX201/PCRX-201을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어지는 것인 조성물 또는 방법.
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