JP6335281B2 - 抗体コンジュゲートダブルエマルジョンナノカプセルおよびその調製方法 - Google Patents

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Description

関連出願の相互参照
本願は、その全開示が参照により本明細書に組み込まれる、２０１３年５月３１日に出願された台湾特許出願第１０２１１９３７０号、２０１３年１１月５日に出願された台湾特許出願番号第１０２１４０１２７号および２０１４年４月２４日に出願された米国特許出願第１４／２６０，７２６号の優先権利益を主張する。
本開示は、抗体コンジュゲートナノ構造に関する。より詳しくは、本開示は、抗体コンジュゲートダブルエマルジョンナノカプセルに関する。
現在、ナノカプセルを有するいくつかのナノカプセルが、薬物を保持するための薬物担体である有機材料から調製されている。これらのナノカプセルは、脂質二重層から構成されるリポソームおよび両性ポリマーから構成されるミセルを含む。
しかし、これらのナノカプセルの構造は、不安定であり、またこれらのナノカプセルの調製は、複雑であるため、制御することが困難である。
一態様では、抗体コンジュゲートダブルエマルジョンナノカプセルが提供される。約５０ｎｍ〜約４００ｎｍの直径を有する抗体コンジュゲートダブルエマルジョンナノカプセルは、水性コア、水性コアを包み込む油性シェルおよび少なくとも１種の抗体を含む。油性シェルの組成物は、ポリマーおよび複数の疎水性磁性ナノ粒子を含むが、その他の界面活性剤を含まない。ポリマーは、連結ポリビニルアルコールまたはポリビニルアルコール（ＰＶＡ）および連結ポリマーの組合せであり、上記の連結ポリビニルアルコールおよび連結ポリマーは、連結基を有する。抗体は、カップリング剤によって連結基と化学的に結合される。
いくつかの実施形態によれば、連結基は、カルボン酸基、チオール基、アルデヒド基、アミン基またはヒドロキシル基であり得る。
いくつかのその他の実施形態によれば、連結ポリビニルアルコールは、カルボキシメチル化ポリビニルアルコール（ＣＭＰＶＡ）、チオール化ポリビニルアルコール（ＴＰＶＡ）またはＰＶＡ−ＴＰＭＡＡの共重合体である。
いくつかのその他の実施形態によれば、連結ポリマーは、ポリアクリル酸（ＰＡＡ）、ポリメタクリル酸（ＰＭＡＡ）、カルボキシメチル化ポリビニルアルコール（ＣＭＰＶＡ）、チオール化ポリビニルアルコール（ＴＰＶＡ）、チオール化ポリメタクリル酸（ＴＰＭＡＡ）またはＰＶＡ−ＴＰＭＡＡの共重合体である。
いくつかのその他の実施形態によれば、疎水性磁性ナノ粒子は、疎水性官能基によって修飾された表面を有するナノ粒子であり、Ｆｅ２Ｏ３、Ｆｅ３Ｏ４、ＣｏＦｅ２Ｏ４またはＭｎＦｅ２Ｏ４でできている。
いくつかのその他の実施形態によれば、抗体は、トラスツズマブの乳癌抗体、セツキシマブの結腸直腸癌抗体、パニツムマブの上皮成長因子受容体抗体またはベバシズマブの血管新生阻害剤抗体を含む。
いくつかのその他の実施形態によれば、カップリング剤は、４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＳＭＣＣ）、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ−エチルカルボジイミドヒドロクロリド（ＥＤＣ）、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドナトリウム塩（スルホ−ＮＨＳ）または３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＳＰＤＰ）である。
いくつかのその他の実施形態によれば、油性シェルは、疎水性薬物をさらに含む。
いくつかのその他の実施形態によれば、水性コアは、親水性薬物をさらに含む。
別の態様では、上記の抗体コンジュゲートダブルエマルジョンナノカプセルを調製するシングルエマルジョン法が提供される。第１に、連結基を有する連結ポリビニルアルコールを含むが、その他のポリマーまたはその他の界面活性剤を含まない水溶液を調製する。疎水性磁性ナノ粒子を含む有機溶液も調製する。水溶液および有機溶液を混合して、ダブルエマルジョンナノカプセルを含むエマルジョン溶液を形成する。有機溶液によって使用された有機溶媒をその後除去して、ダブルエマルジョンナノカプセルを得る。ダブルエマルジョンナノカプセルを含む第１の分散溶液およびカップリング剤と結合している抗体を含む第２の分散溶液を、それぞれ調製する。第１の分散溶液および第２の分散溶液を混合して、連結基とカップリング剤を化学反応させて、抗体コンジュゲートダブルエマルジョンナノカプセルを得る。
いくつかの実施形態によれば、親水性薬物は、水溶液中に添加され得る。
いくつかのその他の実施形態によれば、疎水性薬物は、有機溶液中に添加され得る。
別の態様では、上記の抗体コンジュゲートダブルエマルジョンナノカプセルを調製するダブル乳化法が提供される。ポリビニルアルコールを含むがその他のポリマーまたはその他の界面活性剤を含まない第１の水溶液、および疎水性磁性ナノ粒子を含む有機溶液を、それぞれ調製する。第１の水溶液および有機溶液を混合して、第１のエマルジョン溶液を形成し、第１のエマルジョン溶液は、油中水エマルジョン溶液である。次いで、連結基を有する連結ポリマーを含むが、その他のポリマーまたはその他の界面活性剤を含まない第２の水溶液を調製する。第１のエマルジョン溶液および第２の水溶液を混合して、ダブルエマルジョンナノカプセルを含む第２のエマルジョン溶液を形成する。有機溶液によって使用された有機溶媒を除去して、ダブルエマルジョンナノカプセルを得る。ダブルエマルジョンナノカプセルを含む第１の分散溶液およびカップリング剤と結合している抗体を含む第２の分散溶液を、それぞれ調製する。第１の分散溶液および第２の分散溶液を混合して、連結基とカップリング剤を化学反応させて、抗体コンジュゲートダブルエマルジョンナノカプセルを得る。
いくつかの実施形態によれば、親水性薬物は、第１の水溶液中に添加され得る。
いくつかのその他の実施形態によれば、疎水性薬物は、有機溶液中に添加され得る。
前記の全般的な説明および以下の詳細な説明は、例としてであって、特許請求される本発明のさらなる説明を提供するよう意図されることは理解されるべきである。
前記は、読者に基本的な理解を提供するために本開示の簡略化された要約を示す。この要約は、本開示の広範囲な概要ではなく、本発明の重要な／決定的な要素を同定せず、または本発明の範囲を詳しく説明しない。その唯一の目的は、本明細書において開示されるいくつかの概念を、後に示されるより詳細な説明の前置として簡略化された形態で示すことである。結果として伴う特徴の多くは、添付の図面に関連して考慮される以下の詳細な説明を参照することによってより良好に理解されるようになるので、より容易に認識されよう。
本開示のいくつかの実施形態に従う抗体コンジュゲートダブルエマルジョンナノカプセルの横断図を示す図である。 本開示のいくつかの他の実施形態に従う薬物担体として使用される図１Ａにおけるダブルエマルジョンナノカプセルの横断図を示す図である。 本開示のいくつかの実施形態に従う、連結基を有するダブルエマルジョンナノカプセルを調製するシングル乳化法のフローチャートを示す図である。 本開示のいくつかの他の実施形態に従う、連結基を有するダブルエマルジョンナノカプセルを調製するダブル乳化法のフローチャートを示す図である。 本開示のいくつかの実施形態に従う、抗体カップリング剤コンジュゲートと連結基を有するダブルエマルジョンナノカプセルを反応させる方法のフローチャートを示す図である。 種々の平均分子量を有する種々のＰＶＡを使用する空のＤＥＮＣの走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）像を示す図である。 図４Ａおよび図４Ｂは、トラスツズマブの乳癌抗体を連結する前後の空のＤＥＮＣのＳＥＭ像を示す図である。 ｐＨ４で種々の量のＴＰＭＡＡを含有するＤＥＮＣ中に封入された疎水性ＰＴＸの薬物放出プロファイルを示す図である。 ｐＨ４で種々の量のＴＰＭＡＡを含有するＤＥＮＣ中に封入された親水性Ｄｏｘの薬物放出プロファイルを示す図である。 ｐＨ４およびｐＨ７でＤＥＮＣ中に封入されたＰＴＸおよびＤｏｘ両方の薬物放出プロファイルを示す図である。 図６Ａおよび図６Ｂは、ｐＨ７およびｐＨ４それぞれでＰＶＡ／ＴＰＭＡＡ混合物を含有するトラスツズマブ−ＤＥＮＣの透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）像を示す図である。 種々の量の、トラスツズマブ−Ｄｏｘを封入するＤＥＮＣが添加されたＳｋＢｒ３細胞のフローサイトメトリー分析結果を示す図である。 種々の量の、ＩｇＧ−Ｄｏｘを封入するＤＥＮＣが添加されたＳｋＢｒ３細胞のフローサイトメトリー分析結果を示す図である。 ＳｋＢｒ３細胞、封入されていないＤｏｘ、ＩｇＧ−Ｄｏｘを封入するＤＥＮＣおよびトラスツズマブ−Ｄｏｘを封入するＤＥＮＣの共焦点顕微鏡像を示す図である。 ＳｋＢｒ３細胞が種々のサンプルとともにインキュベートされた後のＳｋＢｒ３細胞の細胞生存性を示す図である。 図１０Ａおよび図１０Ｂは、１日目および３日目のヌードマウス実験のＩＶＩＳ像を示す図である。 種々の時間で変化した固形腫瘍の容積を示す図である。 トラスツズマブ−ＰＶＡおよびＰＡＡの混合物を含有するＤＥＮＣのＳＥＭ像を示す図である。 図１３Ａ〜図１３Ｃは、それぞれ、分子量２５０００、４７０００および７８０００を有するＴＰＶＡを含有するダブルエマルジョンナノカプセルのＳＥＭ像を示す図である。
添付の図面に関連して以下の提供される詳細な説明は、本実施例の説明として意図されるのであって、本実施例が構築または利用され得る唯一の形態を表すよう意図されない。説明は、実施例の機能を、および実施例を構築し、操作するためのステップの順序を示す。しかし、同一または同等の機能および順序は、異なる実施例によって達成され得る。
抗体コンジュゲートダブルエマルジョンナノカプセル
図１Ａは、本開示のいくつかの実施形態に従う抗体コンジュゲートダブルエマルジョンナノカプセルの横断図である。図１Ａでは、抗体コンジュゲートダブルエマルジョンナノカプセル１００は、水性コア１２５を封入する油性シェル１１０から形成される。油性シェル１１０の組成物は、ポリマー１１５および疎水性磁性ナノ粒子１２０を含む。油性シェル１１０の表面は、連結基１３０およびカップリング剤によって連結基１３０と結合している抗体１３５を有する（図１Ａには示されていない）。抗体コンジュゲートダブルエマルジョンナノカプセル１００の直径は、約５０ｎｍ〜約４００ｎｍである。
ポリマー１１５は、連結基１３０を有するようポリビニルアルコール（ＰＶＡ）から修飾されている少なくとも１種の連結ポリビニルアルコール、またはポリビニルアルコールおよび連結基１３０を有する連結ポリマーの組合せを含む。さらに、油性シェル１１０の組成物は、任意のその他の界面活性剤またはその他のポリマーを含むことを必要としないことが強調される。
ポリビニルアルコールまたは連結ポリビニルアルコール自体が、油性シェル１１０の内側の水性コア１２５および油性シェル１１０の外側の水溶液に対して親水基を向け得る。したがって、油性シェル１１０の内側の水−油界面および外側の油−水界面は、任意のその他の界面活性剤または任意のその他のポリマーを使用することなく同時に安定化され得る。
上記の連結基１３０は、カルボン酸基、チオール基、アルデヒド基、アミン基またはヒドロキシル基であり得る。例えば、上記の連結ポリビニルアルコールは、カルボキシメチル化ポリビニルアルコール（ＣＭＰＶＡ）、チオール化ポリビニルアルコール（ＴＰＶＡ）またはＰＶＡ−ＴＰＭＡＡの共重合体であり得る。上記の連結ポリマーは、ポリアクリル酸（ＰＡＡ）、ポリメタクリル酸（ＰＭＡＡ）、カルボキシメチル化ポリビニルアルコール（ＣＭＰＶＡ）、チオール化ポリビニルアルコール（ＴＰＶＡ）、チオール化ポリメタクリル酸（ＴＰＭＡＡ）またはＰＶＡ−ＴＰＭＡＡの共重合体であり得る。
ＰＡＡ、ＰＭＡＡ、ＣＭＰＶＡ、ＴＰＶＡおよびＴＰＭＡＡの化学構造は、以下の表１に列挙されている。
表１：連結ＰＶＡをはじめとする、例示される連結ポリマー
抗体１３５は、任意の必要とされる抗体であり得る。抗体の選択は、結合される必要がある抗原に応じて変わる。例えば、カップリング剤−抗体コンジュゲート１３５は、乳癌抗体トラスツズマブ（取引名は、Ｈｅｒｃｉｏｎまたはヘルセプチンである）、結腸直腸癌抗体セツキシマブ、上皮成長因子受容体抗体パニツムマブまたは血管新生阻害剤抗体ベバシズマブであり得る。
疎水性磁性ナノ粒子１２０は、疎水性官能基で修飾された表面を有し、Ｆｅ２Ｏ３、Ｆｅ３Ｏ４、ＣｏＦｅ２Ｏ４またはＭｎＦｅ２Ｏ４でできているナノ粒子であり得る。疎水性官能基は、オレイン酸またはオレイルアミンなどの長鎖アルキル基または長鎖アルケニル基であり得る。疎水性常磁性ナノ粒子１２０は、油性シェル１１０を安定化して、油性シェル１１０が崩壊するのを防ぐことができる。疎水性常磁性ナノ粒子１２０はまた、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）の造影剤であることに加えて、高頻度磁場（ＨＦＭＦ）下での磁性流体温熱療法（ＭＦＨ）によって局所的に加熱し、次いで、油性シェル１１０を破壊するために使用され得る。
ダブルエマルジョンナノカプセル１００は、それぞれ、疎水性薬物および親水性薬物を中に収容するために油性シェル１１０および水性コア１２５を有し、ダブルエマルジョンナノカプセル１００は、疎水性薬物、親水性薬物またはその組合せの薬物担体として使用され得る。さらに、薬物の放出速度は、適用される外部代替磁場の強度およびオン／オフ状態によって制御され得る。
図１Ｂは、本開示のいくつかのその他の実施形態に従う薬物担体として使用される図１Ａにおけるダブルエマルジョンナノカプセルの横断図である。図１Ｂでは、親水性薬物１４５は、ダブルエマルジョンナノカプセル１００の水性コア１２５中に収容される。疎水性薬物１４０は、ダブルエマルジョンナノカプセル１００の油性シェル１１０中に収容される。例えば、親水性薬物１４５は、ドキソルビシン（ＤＯＸＯ）またはシスプラチンであり得、疎水性薬物１４０は、パクリタキセル（ＰＴＸ）、ドセタキセル（Ｄｔｘｌ）、カンプトテシン（ＣＰＴ）またはクルクミンであり得る。
抗体コンジュゲートダブルエマルジョンナノカプセルの調製法
抗体コンジュゲートダブルエマルジョンナノカプセルの調製法は、２つの段階を含む。第１の段階では、連結基を有するダブルエマルジョンナノカプセルを、シングル乳化法またはダブル乳化法によって調製する。第２の段階では、得られたダブルエマルジョンナノカプセルを抗体と反応させて、抗体コンジュゲートダブルエマルジョンナノカプセルを形成する。
図２Ａは、本開示のいくつかの実施形態に従う、連結基を有するダブルエマルジョンナノカプセルを調製するためのシングル乳化法のフローチャートである。図２Ａでは、連結ＰＶＡ（ステップ２０２ａ）を含有する水溶液および疎水性磁性ナノ粒子（ステップ２０２ｂ）を含有する有機溶液を、それぞれ調製する。次いで、水溶液および有機溶液を混合して（ステップ２１２）、エマルジョン溶液を形成する（ステップ２２２）。次いで、エマルジョン溶液中の有機溶媒を除去して（ステップ２３０）、連結基を有するダブルエマルジョンナノカプセルを得る（ステップ２３５）。
上記のステップ２０２ａでは、親水性薬物は、水溶液中にさらに添加され得る。上記のステップ２０２ｂでは、疎水性薬物は、有機溶液中にさらに添加され得る。
有機溶液が、疎水性磁性ナノ粒子のみを含有する場合には、有機溶媒は、水と不混和性で、低沸点であり、疎水性磁性ナノ粒子を効率的に溶解または分散する特性を有することが好ましい。有機溶液が、疎水性薬物をさらに含有する場合には、有機溶媒は、疎水性薬物を効果的に溶解または分散する特性をさらに有することが好ましい。
低沸点を有する有機溶媒を選択する理由は、有機溶媒が、加熱を伴わずに容易に除去され、ダブルエマルジョンナノカプセルの外形が制御不能な副作用によって影響を受けることを防ぎ得るということである。有機溶媒の沸点は、９０℃未満であり得る。有機溶媒は、例えば、クロロホルム、ジクロロメタン、トリクロロエタンまたはアセトニトリルであり得る。
上記のステップ２１２では、混合方法は、例えば、超音波処理であり得る。上記のステップ２３０では、有機溶媒を除去する方法は、室温での揮発または減圧蒸留であり得る。
図２Ｂは、本開示のいくつかのその他の実施形態に従う、連結基を有するダブルエマルジョンナノカプセルを調製するためのダブル乳化法のフローチャートである。図２Ｂでは、ＰＶＡ（ステップ２０５ａ）を含有する第１の水溶液および疎水性磁性ナノ粒子（ステップ２０５ｂ）を含有する有機溶液を、それぞれ調製する。少量の第１の水溶液および多量の有機溶液を混合して（ステップ２１０）、油中水エマルジョン溶液である第１のエマルジョン溶液（ステップ２１５ａ）を形成する。これが、第１の乳化段階である。
上記のステップ２０５ａでは、親水性薬物は、第１の水溶液にさらに添加され得る。上記のステップ２０５ｂでは、疎水性薬物は、有機溶液にさらに添加され得る。ステップ２０５ｂにおける有機溶液のための有機溶媒の選択は、図２Ａにおけるステップ２０２ｂと同一であり、従って、ここでは省略する。
次いで、連結ポリマーを含有する第２の水溶液を調製する（ステップ２１５ｂ）。第１のエマルジョン溶液および第２の水溶液を混合して（ステップ２２０）、第２のエマルジョン溶液（ステップ２２５）を形成する。これが、第２の乳化段階である。
上記のステップ２１０およびステップ２２０の混合法は、例えば、超音波処理であり得る。上記のステップ２３０では、有機溶媒を除去する方法は、室温での揮発または減圧蒸留であり得る。
図２Ｃは、本開示のいくつかの実施形態に従う、抗体−カップリング剤コンジュゲートおよび連結基を有するダブルエマルジョンナノカプセルを反応させる方法のフローチャートである。図２Ｃでは、ダブルエマルジョンナノカプセル（ステップ２４０ａ）を含有する第１の分散溶液および抗体−カップリング剤コンジュゲート（ステップ２４０ｂ）を含有する第２の分散溶液を、それぞれ調製する。第１および第２の分散溶液を混合して（ステップ２４５）、抗体−カップリング剤コンジュゲートをダブルエマルジョンナノカプセル上の連結基と反応させる。次いで、結合していない抗体を遠心分離（ステップ２５０）によって除去して、抗体コンジュゲートダブルエマルジョンナノカプセル（ステップ２５５）を得る。
普通、抗体は、遊離第一級アミン基を使用してカップリング剤と接続して、抗体−カップリング剤コンジュゲートを形成する。いくつかの実施形態に従う、上記の抗体−カップリング剤コンジュゲートを形成するためのいくつかの適したカップリング剤を、以下の表２に列挙する。例えば、上記の連結基がチオール基である場合には、カップリング剤は、ＳＭＣＣまたはＳＰＤＰであり得る。上記のダブル乳化法において使用される連結ポリマーの連結基は、カルボン酸基であり、カップリング剤は、ＥＤＣおよびスルホ−ＮＨＳの組合せであり得る。
表２：いくつかの一般的なカップリング剤
第１の分散溶液（ステップ２４０ａ）および第２の分散溶液（ステップ２４０ｂ）の溶媒の選択は、使用されるカップリング剤に応じて変わる。例えば、ＳＭＣＣがカップリング剤として使用される場合には、０．１Ｍ Ｎａ３ＰＯ４および０．１５Ｍ ＮａＣｌを含有し、ｐＨ値が７．４であるリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液が使用され得る。ＥＤＣおよびスルホ−ＮＨＳがカップリング剤として使用される場合には、０．１Ｍ ２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）および０．５Ｍ ＮａＣｌを含有し、ｐＨ値が６．１であるＭＥＳバッファー溶液が使用され得る。
以下に記載される実施形態では、書くことを簡略にするために、「ダブルエマルジョンナノカプセル」は、「ＤＥＮＣ」と略され、「抗体コンジュゲートダブルエマルジョンナノカプセル」は、「抗体−ＤＥＮＣ」略される。
実施形態１：オレイン酸で覆われたＦｅ３Ｏ４ナノ粒子の調製
この実施形態では、約５ｎｍの直径を有するオレイン酸で覆われたＦｅ３Ｏ４ナノ粒子（ＩＯ−ＯＡナノ粒子と略される）を調製した。ＩＯ−ＯＡナノ粒子の例示された調製法を以下に記載する。さらに、ＩＯ−ＯＡナノ粒子の調製法は、参照により本明細書に組み込まれる、Ｓｕｎ，Ｓ．Ｈ．；Ｚｅｎｇ，Ｈ．；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｄ．Ｂ；Ｒａｏｕｘ，Ｓ．；Ｒｉｃｅ，Ｐ．Ｍ．；Ｗａｎｇ，Ｓ．Ｘ．；Ｌｉ，Ｇ．Ｘ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ、２００４年、第１２６巻、（１）、２７３〜２７９頁を参照し得る。
０．７０８ｇのＦｅ（ａｃａｃ）３、２．５８ｇの１，２−ヘキサデカンジオール、０．５６５ｇのオレイン酸、０．５３５ｇのオレイルアミン、２０ｍＬのベンジルエーテルを、三つ口フラスコに添加した。上記の混合物を、窒素雰囲気下で冷却水を循環させ、それぞれ、１００℃で３０分、２００℃で６０分および２８５℃で３０分加熱して、ＩＯ−ＯＡナノ粒子を形成した。次いで、得られたＩＯ−ＯＡナノ粒子をエタノール中に分散させ、次いで、６０００ｒｐｍで遠心分離して、上部溶液を除去した。数回反復した後、得られたＩＯ−ＯＡナノ粒子をエタノール中に保存した。
実施形態２：チオール化ポリメタクリル酸の調製
この実施形態では、チオール化ポリメタクリル酸（ＴＰＭＡＡ）を調製した。例示された調製法を、以下に記載し、同時に合成スキームＩも参照する。
３０質量％のＰＭＡＡを含有する２５０ｍｇの水溶液に、５ｍＬのｐＨ８ ＰＢＳ溶液、７５ｍｇの触媒ＥＤＣおよび４０ｍｇの触媒スルホ−ＮＨＳを逐次添加した。１５分間混合および撹拌した後、次いで、５ｍｇのシステアミンを添加した。翌日まで混合物を撹拌して、システアミンの第一級アミン基をＰＭＡＡのカルボン酸基と反応させて、アミド結合を形成し、ＴＰＭＡＡを得た。透析を使用して、触媒ＥＤＣおよびスルホ−ＮＨＳを除去し、次いで、凍結乾燥によって水を除去して、ＴＰＭＡＡ結晶を得た。
実施形態３：ＰＶＡ−ＴＰＭＡＡ共重合体の調製
この実施形態では、ＰＶＡ−ＴＰＭＡＡ共重合体を調製した。例示された調製法を以下に記載する。
上記で得られたＰＶＡおよびＴＰＭＡＡを混合した。次いで、濃硫酸を添加して、ＰＶＡ−ＴＰＭＡＡ共重合体および水の副生成物を形成した。次いで、飽和炭酸ナトリウムを使用して、ＰＶＡ−ＴＰＭＡＡ共重合体とＴＰＭＡＡおよびＰＶＡの反応物を分離して、ＰＶＡ−ＴＰＭＡＡ共重合体の生成物を得た。
実施形態４：チオール化ポリビニルアルコールの調製
この実施形態では、チオール化ポリビニルアルコール（ＴＰＶＡ）を調製した。例示された調製法を以下に記載し、同時に以下の合成スキームＩＩが参照される。ＴＰＶＡの調製についての参考文献は、Ｇｕｐｔａ Ｂ、Ａｎｊｕｍ ＳおよびＩｋｒａｍ Ｓ． Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｉｏｌａｔｅｄ ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ． ２０１３年；第１２９巻：８１５〜２１頁である。
ＰＶＡを脱イオン水に溶解して、２質量％のＰＶＡ水溶液を形成した。ＰＶＡ水溶液中に、２０〜９９％（ｖ／ｖ）のチオグリコール酸および０．１〜１質量％の硫酸水溶液をゆっくりと添加した。混合物を油浴中で加熱して、エステル化反応を実施した。次いで、ＰＶＡエステル化溶液中に、メタノールをゆっくりと注ぎ入れて沈殿物を形成した。沈殿物を回収し、メタノールによって数回精製して、粉末を得た。次いで、粉末を凍結乾燥して、ＴＰＶＡ白色結晶粉末を得た。
実施形態５：カルボキシメチル化ポリビニルアルコールの調製
この実施形態では、カルボキシメチル化ポリビニルアルコール（ＣＭＰＶＡ）を調製し、例示された方法を以下に記載した。同時に合成スキームＩＩＩが参照される。ＣＭＰＶＡの調製の参考文献は、Ｙｕ Ｃ．およびＬｉ Ｂ． Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ−ｇｒａｐｈｉｔｅ ｎａｎｏｓｈｅｅｔ ｃｏｍｐｏｓｉｔｅｓ．Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅｓ． ２００８年；第２９巻：９９８〜１００５頁である。
第１に、２質量％のＰＶＡ水溶液中にＮａＯＨを添加して、ＰＶＡの−ＯＨ基を活性化した。クロロ酢酸（ＣｌＣＨ２ＣＯＯＨ）を、エタノール中に溶解し、ＮａＯＨによって中和して、クロロ酢酸ナトリウム（ＣｌＣＨ２ＣＯＯＮａ）のエタノール溶液を形成した。上記の２種の溶液を混合して、ＣＭＰＶＡのナトリウム塩を形成した。５時間後、適当な量のＨＣｌを添加して、ｐＨ値を６に調整した。続いて、過剰量のアルコールを添加して、ＣＭＰＶＡを精製した。エタノール精製ステップを数回反復した。
実施形態６：抗体−ＰＶＡ／ＴＰＭＡＡ混合物を含有するＤＥＮＣの調製
この実施形態では、図２Ｂにおけるダブル乳化法を使用することによって、ＰＶＡ／ＴＰＭＡＡ混合物を含有するＤＥＮＣを調製した。使用された薬物は、親水性のドキソルビシン（Ｄｏｘ）およびシスプラチンと、疎水性のパクリタキセル（ＰＴＸ）およびカンプトテシン（ＣＰＴ）を含んでいた。次いで、図２Ｃの方法を使用することによって、抗体をＰＶＡ／ＴＰＭＡＡ混合物を含有するＤＥＮＣと結合させた。
親水性薬物およびＰＶＡの第１の水溶液、疎水性薬物およびＩＯ−ＯＡナノ粒子のＣＨＣｌ３溶液ならびにＰＶＡおよびＴＰＭＡＡの第２の水溶液をそれぞれ調製した。親水性薬物およびＰＶＡの第１の水溶液では、ＰＶＡの濃度は、２０ｍｇ／ｍＬとし、親水性薬物（ドキソルビシンまたはシスプラチン）の濃度は、８ｍｇ／ｍＬとした。疎水性薬物およびＩＯ−ＯＡナノ粒子のＣＨＣｌ３溶液では、ＩＯ−ＯＡナノ粒子の濃度は、２０ｍｇ／ｍＬとし、ならびに疎水性薬物がパクリタキセルの場合には、パクリタキセルの濃度は３０ｍｇ／ｍＬとし、疎水性薬物がカンプトテシンである場合には、カンプトテシンの濃度は、５ｍｇ／ｍＬとした。ＰＶＡおよびＴＰＭＡＡの第２の水溶液では、ＰＶＡの濃度は、２０ｍｇ／ｍＬとし、ＴＰＭＡＡの濃度は、２ｍｇ／ｍＬとした。使用されたＰＶＡの平均分子量は、それぞれ、１６，０００、２５，０００、３１，０００および４７，０００とした。ＴＰＭＡＡでは、カルボン酸基の約３７％が、チオール基を有するよう修飾された。
０．２ｍＬの、親水性薬物およびＰＶＡを含有する第１の水溶液ならびに０．５ｍＬの、ＩＯ−ＯＡナノ粒子および疎水性薬物を含有するＣＨＣｌ３溶液を混合し、２０ｋＨｚの周波数での超音波処理によって乳化した。乳化した後、１．５ｍＬの、ＰＶＡおよびＴＰＭＡＡを含有する第２の水溶液を添加し、混合物を２０ｋＨｚでの超音波処理によって再度乳化して、ＰＶＡ／ＴＰＭＡＡ混合物を含有するＤＥＮＣを得た。最後に得られたエマルジョン溶液を開放空間に置くことによって揮発性物質ＣＨＣｌ３を除去して、ＣＨＣｌ３を蒸発させた。ＣＨＣｌ３を蒸発させる温度は、ＤＥＮＣの形態を変更し得る。次いで、ＰＶＡ／ＴＰＭＡＡ混合物を含有するＤＥＮＣを、３ｍＬの、０．１Ｍのリン酸ナトリウムおよび０．１５ＭのＮａＣｌを含有するＰＢＳ溶液に分散させた。
１種の薬物のみが、上記のＤＥＮＣによって封入される場合には、ＤＥＮＣの封入効率および直径が以下の表３に列挙される。表３から、通常、疎水性薬物の封入効率が、親水性薬物の封入効率よりも高いことがわかる。したがって、疎水性薬物を封入するＤＥＮＣの直径の方が通常大きい。さらに、親水性薬物の封入効率は７５％以上であり、親水性薬物を封入するＤＥＮＣを調製するためのダブル乳化法を使用するのに極めて良好である。
表３：単一の親水性薬物または単一の疎水性薬物の封入効率
図３は、種々の平均分子量を有する種々のＰＶＡを使用する空のＤＥＮＣの走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）像である。図３では、空のＤＥＮＣ中に含有されるＰＶＡの平均分子量は、それぞれ、１６０００、２５０００、３１０００および４７０００であった。空のＤＥＮＣは、薬物を封入しなかった。図３から、ＰＶＡの平均分子量が大きいほど、空のＤＥＮＣの直径は小さかった。
次いで、１ｍｇの乳癌抗体トラスツズマブおよび４．８ｍｇのカップリング剤ＳＭＣＣをそれぞれ、２ｍＬおよび５ｍＬの、０．１Ｍのリン酸ナトリウムおよび０．１５ＭのＮａＣｌを含有するＰＢＳ溶液に溶解し、一緒に混合した。混合物を４℃で２時間反応させて、トラスツズマブ−ＳＭＣＣコンジュゲートを得、次いで、８０００ｒｐｍで遠心分離して、未反応のＳＭＣＣを除去した。次いで、トラスツズマブ−ＳＭＣＣコンジュゲートを、１ｍＬの、０．１Ｍのリン酸ナトリウムおよび０．１５ＭのＮａＣｌを含有するＰＢＳ溶液中に再分散させた。
ＤＥＮＣおよびトラスツズマブ−ＳＭＣＣコンジュゲートの分散溶液を混合し、４℃で２時間反応させた。遠心分離後、未反応のトラスツズマブ−ＳＭＣＣコンジュゲートを除去し、トラスツズマブ−ＤＥＮＣの生成物を、４ｍＬの脱イオン水に再分散させた。
カップリング剤ＳＭＣＣは、ＴＰＭＡＡの−ＳＨ連結基を、トラスツズマブの乳癌抗体の−ＮＨ２基と連結するための架橋となった。したがって、ＳＭＣＣおよびＴＰＭＡＡのチオール基によって、トラスツズマブが、ＤＥＮＣの油性シェルの外表面上に結合された。
図４Ａおよび４Ｂは、トラスツズマブの乳癌抗体を連結する前後の空のＤＥＮＣのＳＥＭ像である。使用されたＰＶＡは、１６０００の平均分子量を有していた。図４Ａでは、ＴＰＭＡＡ／ＰＶＡ混合物を含有する空のＤＥＮＣを、脱イオン水によって洗浄し、脱イオン水に再分散させ、次いで、凍結乾燥させた。空のＤＥＮＣは、依然として、中空球形構造を維持していた。図４Ｂでは、図４Ａにおける空のＤＥＮＣは、トラスツズマブ−ＳＭＣＣコンジュゲートと結合された。空のＤＥＮＣの表面は、トラスツズマブ−ＳＭＣＣコンジュゲートによって修飾されたので、トラスツズマブ−ＤＥＮＣの形態が変化した。
実施形態７：ＰＶＡ／ＴＰＭＡＡ混合物を含有するＤＥＮＣ中に封入された薬物の放出に対する溶液のｐＨ値の効果
この実施形態では、ＰＶＡ／ＴＰＭＡＡ混合物を含有する抗体ＤＥＮＣ中に封入された薬物の放出に対する溶液のｐＨ値の効果を試験した。油性シェルは、１６０００の分子量を有するＰＶＡおよびＴＰＭＡＡから構成されていた。使用された薬物は、親水性のドキソルビシン（Ｄｏｘ）および疎水性のパクリタキセル（ＰＴＸ）を含んでいた。
ＴＰＭＡＡは、チオール官能基を有する修飾されたＰＭＡＡポリマーであり、ＰＭＡＡは、ｐＨ感受性ポリマーである。ＰＭＡＡの側鎖上のカルボン酸基およびメチル基は、種々のｐＨ値を有する種々の環境において、異なる外観を示すようＰＭＡＡに影響を及ぼす主な因子である。中性環境では、ＰＭＡＡは、無作為にコイル状であり、親水性である。酸性環境では、ＰＭＡＡは、小球様構造に変形され、縮まり、疎水性になる。ＰＭＡＡのｐＨ感受性特性は、トラスツズマブの乳癌抗体を連結するためのチオール基によって修飾された後にも維持され得ると期待された。したがって、二重の薬物を封入するＤＥＮＣをそれぞれ、中性環境（ｐＨ７）および酸性環境（ｐＨ４）に置いて、薬物の放出量を観察した。
図５Ａは、ｐＨ４での種々の量のＴＰＭＡＡを含有するＤＥＮＣ中に封入された疎水性ＰＴＸの薬物放出プロファイルを示す。図５Ｂは、ｐＨ４での種々の量のＴＰＭＡＡを含有するＤＥＮＣ中に封入された親水性のＤｏｘの薬物放出プロファイルを示す。図５Ａおよび５Ｂでは、ＴＰＭＡＡの修飾パーセンテージは、３７％であった。図５Ａおよび５Ｂから、ｐＨ４の酸性環境では、調製プロセスの間のＴＰＭＡＡの添加量の増大に伴い、ＰＴＸおよびＤｏｘ両方の放出量が増大したことがわかる。この結果は、ＴＰＭＡＡは、酸性環境においてＤＥＮＣからの薬物の放出速度を増大し得ることを示す。
図５Ｃは、ｐＨ４およびｐＨ７でのＤＥＮＣ中に封入されたＰＴＸおよびＤｏｘ両方の薬物放出プロファイルを示す。図５Ｃでは、ＴＰＭＡＡの修飾パーセンテージは、３７％であった。ＴＰＭＡＡの添加量は、１質量％であった。図５Ｃから、ｐＨ４での薬物の放出量は、ｐＨ７での薬物の放出量よりもかなり多いことがわかる。ｐＨ４の酸性環境では、疎水性ＰＴＸの放出量は、親水性のＤｏｘの放出量よりも多かった。
図６Ａおよび６Ｂは、それぞれ、ｐＨ７およびｐＨ４でのＰＶＡ／ＴＰＭＡＡ混合物を含有するトラスツズマブ−ＤＥＮＣの透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）像である。ＴＰＭＡＡの添加量は、１質量％とし、ＴＰＭＡＡの修飾パーセンテージは、３７％であった。図６Ａは、トラスツズマブ−ＤＥＮＣが、中性環境では、球形シェルを有していたことを示す。図６Ｂは、酸性環境では、トラスツズマブ−ＤＥＮＣのシェルが、縮まり、変形されたことを示す。
上記の薬物放出挙動は、ＴＰＭＡＡが酸性環境において縮まり、疎水性であるよう変形されることと一致した。環境中に、多くの水素イオンが存在する場合には、シェル中のＴＰＭＡＡは、縮まり始め、従って、シェルは変形され、押し出される。したがって、油性シェル中に局在する疎水性薬物は、水性コア中に局在する親水性薬物よりも多く放出され得る。
実施形態８：ＨＥＲ−２過剰発現細胞に対するトラスツズマブコンジュゲート担体の認識
この実施形態では、トラスツズマブ−ＤＥＮＣが、ＨＥＲ−２過剰発現細胞を標的とし得るか否かが検証された。選択されたＨＥＲ−２過剰発現細胞クローンは、ＳｋＢｒ３（ヒト乳房腺癌）細胞であった。試験されたトラスツズマブ−ＤＥＮＣのシェルは、１６０００の分子量を有するＰＶＡおよびＴＰＭＡＡの混合物から構成されていた。ＴＰＭＡＡの添加量は、１質量％とし、ＴＰＭＡＡの修飾パーセンテージは３７％であった。
第１に、親水性のＤｏｘを封入するＤＥＮＣを、乳癌抗体トラスツズマブおよびＳｋＢｒ３細胞に特異的ではない抗体ｌｇＧとそれぞれコンジュゲートした。次いで、親水性ドキソルビシン（Ｄｏｘ）を封入する抗体−ＤＥＮＣおよびＳｋＢｒ３細胞を、３７℃で３０分間一緒にインキュベートした。Ｄｏｘは、蛍光（４８８ｎｍの波長で励起され、５８０ｎｍの波長で発光する）を発光し得るので、抗体−抗原の相互作用によってＳｋＢｒ３細胞の細胞表面上に結合されたＤｏｘの蛍光強度を検出するために、フローサイトメータが使用され得る。
図７Ａは、種々の量のトラスツズマブ−Ｄｏｘを封入するＤＥＮＣを添加されたＳｋＢｒ３細胞のフローサイトメトリー分析結果を示す。図７Ａでは、トラスツズマブ−Ｄｏｘを封入するＤＥＮＣは、Ｔと示され、対照として示された曲線のトラスツズマブ−Ｄｏｘを封入するＤＥＮＣの添加量は、ゼロであった。ＳｋＢｒ３細胞は、トラスツズマブ−Ｄｏｘを封入するＤＥＮＣの添加量が増えるほど、より多くのＳｋＢｒ３細胞がより強力な蛍光を有していたことがわかる。この結果は、トラスツズマブ−Ｄｏｘを封入するＤＥＮＣは、ＳｋＢｒ３細胞を認識し、ＳｋＢｒ３細胞の表面上に結合し得ることを示した。
図７Ｂは、種々の量のＩｇＧ−Ｄｏｘを封入するＤＥＮＣを添加されたＳｋＢｒ３細胞のフローサイトメトリー分析結果を示す。図７Ｂでは、「ＩｇＧ−Ｄｏｘを封入するＤＥＮＣ」は、ＩｇＧと示され、対照として示される曲線のＩｇＧ−Ｄｏｘを封入するＤＥＮＣの添加量は、ゼロとした。ＩｇＧ−Ｄｏｘを封入するＤＥＮＣの添加量を問わず、蛍光強度分布は、ほとんど同一であったということがわかる。この結果は、ＩｇＧ−Ｄｏｘを封入するＤＥＮＣは、ＳｋＢｒ３細胞に対して特異性を全く示さないことを示した。
上記の結果をさらに確認するために、トラスツズマブ−Ｄｏｘを封入するＤＥＮＣおよびＳｋＢｒ３細胞ならびにＩｇＧ−Ｄｏｘを封入するＤＥＮＣおよびＳｋＢｒ３細胞をそれぞれインキュベートした後に、ＳｋＢｒ３細胞の核を、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）の色素によって染色した。蛍光Ｄｏｘおよび核の分布を、共焦点顕微鏡によって観察した。さらに、純粋なＳｋＢｒ３細胞および遊離Ｄｏｘも共焦点顕微鏡によって観察した。得られた結果は、図８に示された。
図８は、ＳｋＢｒ３細胞、遊離Ｄｏｘ、ＩｇＧ−Ｄｏｘを封入するＤＥＮＣおよびトラスツズマブ−Ｄｏｘを封入するＤＥＮＣの共焦点顕微鏡像を示す。図８では、「細胞」、「Ｄｏｘ」、「ＩｇＧ−Ｄｏｘ」および「Ｔ−Ｄｏｘ」と各々示された列は、ＳｋＢｒ３細胞、遊離Ｄｏｘ、ＩｇＧ−Ｄｏｘを封入するＤＥＮＣおよびトラスツズマブ−Ｄｏｘを封入するＤＥＮＣのサンプルをそれぞれ表す。「核」、「Ｄｏｘ」および「像混合」によって各々示された行は、核、Ｄｏｘの位置ならびに核およびＤｏｘの位置の重なった像を表す。
図８は、トラスツズマブ−Ｄｏｘを封入するＤＥＮＣおよびＳｋＢｒ３細胞の核の位置が、多数の重複を有していたことを示す。これは、トラスツズマブ−Ｄｏｘを封入するＤＥＮＣが、ＳｋＢｒ３細胞を間違いなく認識し得たことを意味する。しかし、その他のサンプルでは、ほとんど核のみが観察され得、ほとんどのＤｏｘは、核像を重ねると観察されなかった。これは、その他のサンプルはＳｋＢｒ３細胞上にほとんど付着していなかった、すなわち、その他のサンプルはＳｋＢｒ３細胞を認識できなかったことを意味する。
実施形態９：ＨＥＲ−２過剰発現細胞に対する種々のＤＥＮＣの細胞毒性効果
この実施形態では、ＨＥＲ−２過剰発現細胞に対する種々のＤＥＮＣの細胞毒性を研究した。ＤＥＮＣのシェルは、１６０００の分子量を有するＰＶＡおよびＴＰＭＡＡの混合物とした。ＴＰＭＡＡの添加量は、１質量％とし、ＴＰＭＡＡの修飾パーセンテージは、３７％であった。
非コンジュゲート空のＤＥＮＣ（対照群）、ＰＴＸを封入するＤＥＮＣ（ＰＴＸ群）、Ｄｏｘを封入するＤＥＮＣ（Ｄｏｘ群）、トラスツズマブ−ＤＥＮＣ（Ｔ群）、トラスツズマブ−ＰＴＸを封入するＤＥＮＣ（Ｔ−ＰＴＸ群）、ＰＴＸおよびＤｏｘを封入するＤＥＮＣ（ＰＴＸ−Ｄｏｘ）、トラスツズマブ−ＰＴＸおよびＤｏｘを封入するＤＥＮＣ（Ｔ−ＰＴＸ−Ｄｏｘ）をそれぞれ、ＳｋＢｒ３細胞培養物中に添加し、次いで、それぞれ、３７℃で２４時間同時培養した。次いで、ＭＴＴアッセイを使用して、各サンプルの細胞生存性を評価した。得られた結果は、以下の表４に列挙され、図９に示されている。
表４：ＳｋＢｒ３細胞に対する種々のＤＥＮＣの細胞毒性効果
表４および図９に示される結果から、空のＤＥＮＣは、ＳｋＢｒ３細胞に対して細胞毒性効果を有さなかった、したがって、ＳｋＢｒ３細胞に対して非毒性であったということがわかる。しかし、空のＤＥＮＣがトラスツズマブとコンジュゲートした後には、細胞生存性は、約７５％に低下した。トラスツズマブとコンジュゲートした前後のＰＴＸを封入するＤＥＮＣの細胞生存性を比較すると、細胞生存性は、約５６％から約２７％に低下し、これは、トラスツズマブとコンジュゲートする前のＰＴＸを封入するＤＥＮＣのわずか約４８％である。トラスツズマブとコンジュゲートした前後のＤｏｘを封入するＤＥＮＣの細胞生存性を比較すると、細胞生存性は、約３５％から約２９％に低下し、これは、トラスツズマブとコンジュゲートする前のＤｏｘを封入するＤＥＮＣの約８４％である。トラスツズマブとコンジュゲートした前後のＰＩＸおよびＤｏｘを封入するＤＥＮＣの細胞生存性を比較すると、細胞生存性は、約２４％から約１４％に低下し、これは、トラスツズマブとコンジュゲートする前のＰＩＸおよびＤｏｘを封入するＤＥＮＣの約５９％である。
上記の比較から、トラスツズマブとコンジュゲートした後、すべての種類のＤＥＮＣが、ＳｋＢｒ３細胞に対してより良好な細胞毒性効果を有していたことがわかる。
実施形態１０；ｉｎ ｖｉｖｏ動物実験
この実施形態では、ＳｋＢｒ３固形腫瘍を有するヌードマウスを使用して、ｉｎ ｖｉｖｏ動物実験を実施した。ＤＥＮＣのシェルは、１６０００の分子量を有するＰＶＡおよびＴＰＭＡＡの混合物から構成されていた。ＴＰＭＡＡの添加量は、１質量％とし、ＴＰＭＡＡの修飾パーセンテージは、３７％であった。シェルは、色素シアニン５．５（Ｃｙ５．５）と連結されていた。
第１に、非浸潤ｉｎ ｖｉｖｏイメージングシステム（ＩＶＩＳ）を使用することによってヌードマウス中のＤＥＮＣの分布を観察した。３７００Ｇの磁石をヌードマウスの左側の腫瘍に取り付け、ヌードマウスの右側の腫瘍には磁石を取り付けなかった。ＩＶＩＳ下でのＤＥＮＣをヌードマウスに注入した後１日目および３日目の観察結果を、図１０Ａおよび１０Ｂに示した。
図１０Ａに示される１日目の像では、多量のＤＥＮＣが、左側の腫瘍１１０ａおよび右側の腫瘍１２０ａの両側に蓄積した。しかし、図１０Ｂに示される３日目の像では、左側腫瘍１１０ｂでのＤＥＮＣの蓄積量は、右側腫瘍１２０ｂでのＤＥＮＣの蓄積量よりもかなり多く、左腫瘍１１０ｂの蓄積量は、右側腫瘍１２０ｂの蓄積量の約２倍であった。したがって、外部から適用された磁場は、実際に、ヌードマウスでの磁性感受性ＤＥＮＣの分布に影響を及ぼし得る。
次に、ヌードマウス異種移植片腫瘍モデルを使用して、種々のＤＥＮＣの治療効果を分析した。実験では、腫瘍を治療するために、試験された種々のＤＥＮＣを、それぞれ、１日目、５日目、９日目および１３日目にヌードマウスの尾静脈に注入した。次いで、ＩＶＩＳを使用して、１〜３０日目の間の腫瘍の大きさを観察した。得られた結果は、図１１に示した。
図１１に示される実験群は、生理食塩水、空のＤＥＮＣ、ＰＴＸを封入するＤＥＮＣ（ＰＴＸ）、Ｄｏｘを封入するＤＥＮＣ（Ｄｏｘ）、トラスツズマブ−ＰＴＸを封入するＤＥＮＣ（Ｔ−ＰＴＸ）、ＰＴＸおよびＤｏｘを封入するＤＥＮＣ（ＰＴＸ−Ｄｏｘ）、トラスツズマブ−ＰＴＸおよびＤｏｘを封入するＤＥＮＣを含むが、磁場は適用せず（Ｔ−ＰＴＸ−ＤＯＸ Ｎｏ ＭＴ）およびトラスツズマブ−ＰＴＸおよびＤｏｘを封入するＤＥＮＣ（Ｔ−ＰＴＸ−ＤＯＸ）を含んでいた。各実験群は、腫瘍部位に取り付けた２０００Ｇの磁石を有していが、Ｔ−ＰＴＸ−ＤＯＸ Ｎｏ ＭＴの群のみが腫瘍部位に取り付けられた磁石を有していなかった。
図１１に示される結果から、Ｔ−ＰＴＸ−ＤＯＸ群の治療効果が最良であり、３０日後に腫瘍の大きさが、元の腫瘍の大きさの１．９６倍にしか増大しなかったことがわかる。しかし、生理食塩水群については、３０日後に腫瘍の大きさが、元の腫瘍の大きさの１７．６倍に増大した。
実施形態１１：抗体−ＰＶＡおよびＰＶＡ−ＴＰＭＡＡ共重合体の混合物を含有するＤＥＮＣ
この実施形態では、ＰＶＡおよびＰＶＡ−ＴＰＭＡＡ共重合体の混合物を含有するＤＥＮＣを、図２Ｂにおけるダブル乳化法によって調製した。封入された薬物は、例として、親水性のドキソルビシン（Ｄｏｘ）および疎水性のパクリタキセル（ＰＴＸ）を有していた。これらの２種の薬物は、癌治療のための一般的な化学療法薬である。次いで、ＰＶＡおよびＰＶＡ−ＴＰＭＡＡ共重合体の混合物を含有するＤＥＮＣを、シェル上で抗体とコンジュゲートした。
ＰＶＡおよびＰＶＡ−ＴＰＭＡＡ共重合体の混合物を含有するＤＥＮＣの調製法は、実施形態６におけるＰＶＡおよびＴＰＭＡＡの混合物を含有するＤＥＮＣと同様であった。唯一の相違は、ＰＶＡおよびＴＰＭＡＡの第２の水溶液が２質量％のＰＶＡ−ＴＰＭＡＡ共重合体水溶液によって置き換わり、ＰＶＡ−ＴＰＭＡＡ共重合体中のＴＰＭＡＡの修飾パーセンテージが３７％であったということである。最後に、得られたトラスツズマブ−ＰＶＡおよびＰＶＡ−ＴＰＭＡＡ共重合体の混合物を含有するＤＥＮＣを、脱イオン水中に分散させた。
最初に、抗体コンジュゲーションパーセンテージ、ＤＥＮＣの直径および封入効率に対する効果を確認するために、ＰＶＡ−ＴＰＭＡＡ共重合体中のＴＰＭＡＡの含量を調べた。得られた結果は、以下の表５に列挙されている。表５から、抗体が、ＤＥＮＣと連結するのにＴＰＭＡＡのチオール基を必要としたので、抗体コンジュゲーションパーセンテージは、ＴＰＭＡＡ含量が多い場合に高かったということがわかる。さらに、抗体コンジュゲーションパーセンテージが高いほど、ＤＥＮＣの直径は大きかった。薬物の封入効率は、ＴＰＭＡＡ含量によってあまり影響を受けず、したがって、抗体コンジュゲーションパーセンテージによって影響を受けなかった。抗体がＤＥＮＣとコンジュゲートされる前に、薬物がＤＥＮＣ中に封入されたということがあり得る。
表５：抗体コンジュゲーションパーセンテージ、ＤＥＮＣの直径および薬物封入効率に対するＰＶＡ−ＴＰＭＡＡ共重合体中のＴＰＭＡＡ含量の効果
次いで、調製における有機溶媒クロロホルムの揮発温度および揮発時間を調べて、ＤＥＮＣの直径および薬物封入効率に対する効果を確認した。ＰＶＡ−ＴＰＭＡＡ共重合体のＰＶＡ対ＴＰＭＡＡのモル比は、４：１とした。得られた結果は、以下の表６に列挙されている。表６では、クロロホルムの揮発温度および揮発時間は、５５℃未満ではＤＥＮＣの直径および薬物封入効率に対して明白な効果を有していなかった。
表６：ＤＥＮＣの直径および薬物封入効率に対する有機溶媒クロロホルムの揮発温度および揮発時間の効果
ＤＥＮＣの直径および薬物封入効率に対する乳化時間の効果を、続いて調べた。ＰＶＡ−ＴＰＭＡＡ共重合体中のＰＶＡ対ＴＰＭＡＡのモル比は、４：１とした。得られた結果は、以下の表７に列挙した。表７では、第１および第２の乳化時間の長さは、ＤＥＮＣの直径および薬物封入効率に対して明白な効果を有していなかった。
表７：ＤＥＮＣの直径および薬物封入効率に対する乳化時間の効果
生成物形態に対するＰＶＡ−ＴＰＭＡＡ共重合体のＰＶＡ分子量およびＴＰＭＡＡ含量の効果を調べた。得られた結果は、以下の表８に列挙した。表８では、ＰＶＡの分子量が、２５０００〜６１０００である場合に、ＴＰＭＡＡ含量が増大するにつれ、ＤＥＮＣの直径は増大した。ＰＶＡが、４７０００の分子量を有する場合には、ナノ構造の約半数が、コア−シェル構造を有していた。ＰＶＡが６１０００の分子量を有する場合には、わずかな数のナノ構造のみが、コア−シェル構造を有していた。ＰＶＡが７８０００の分子量を有する場合には、ナノカプセルは形成されなかった。この結果は、ＰＶＡの分子量があまりにも大きい場合には、ナノカプセルは形成されないことを示す。
表８：生成物形態に対するＰＶＡ−ＴＰＭＡＡ共重合体のＰＶＡ分子量およびＴＰＭＡＡ含量の効果
実施形態１２：ＰＶＡ／ＴＰＶＡ混合物を含有する抗体コンジュゲート担体
この実施形態では、ＰＶＡおよびＴＰＶＡの混合物を含有するダブルエマルジョンナノカプセル（すなわち、ＤＥＮＣ）を、図２Ｂにおけるダブル乳化法によって調製した。使用された例示的薬物は、親水性のドキソルビシン（Ｄｏｘ）および疎水性のパクリタキセル（ＰＴＸ）であった。これら２種の薬物は、癌治療のための一般的な化学療法薬である。次いで、ＰＶＡおよびＴＰＶＡの混合物を含有するＤＥＮＣを、図２Ｃの方法によってシェルの表面上で抗体とコンジュゲートした。
ＰＶＡおよびＴＰＶＡの混合物を含有するＤＥＮＣの調製方法は、実施形態６におけるＰＶＡおよびＴＰＭＡＡの混合物を含有するＤＥＮＣと同様であった。唯一の相違は、ＰＶＡおよびＴＰＭＡＡの第２の水溶液が、２質量％のＴＰＶＡ水溶液によって置き換わり、ＴＰＶＡの修飾パーセンテージが３０％であるということであった。最後に、得られたトラスツズマブ−ＰＶＡおよびＴＰＶＡの混合物を含有するＤＥＮＣを、脱イオン水中に分散させた。
最初に、抗体コンジュゲーションパーセンテージ、ＤＥＮＣの直径および封入効率に対する効果を確認するために、ＴＰＶＡ含量を調べた。得られた結果を以下の表９に列挙した。表９では、抗体が、ＤＥＮＣと連結するのにＴＰＶＡのチオール基を必要としたので、抗体コンジュゲーションパーセンテージは、ＴＰＶＡ含量が多い場合に高かった。さらに、抗体コンジュゲーションパーセンテージが高いほど、ＤＥＮＣの直径は大きかった。薬物の封入効率は、ＴＰＶＡ含量によってあまり影響を受けず、したがって、抗体コンジュゲーションパーセンテージによって影響を受けなかった。抗体がＤＥＮＣとコンジュゲートされる前に、薬物がＤＥＮＣ中に封入されたということがあり得る。
表９：抗体コンジュゲーションパーセンテージ、ＤＥＮＣの直径および薬物封入効率に対するＴＰＶＡ含量の効果
ＤＥＮＣの直径および薬物封入効率に対する乳化時間の効果を、続いて調べた。ＴＶＰＡ含量は３０ｍｏｌ％であり、ＰＶＡの分子量は、１６０００であった。得られた結果は、以下の表１０に列挙した。表１０では、第１および第２の乳化時間の長さは、ＤＥＮＣの直径および薬物封入効率に対して明白な効果を有していない。
表１０：ＤＥＮＣの直径および薬物封入効率に対する乳化時間の効果
生成物形態に対するＰＶＡ分子量およびＴＰＶＡ含量の効果を調べた。得られた結果は、以下の表１１に列挙した。表１１では、ＰＶＡの分子量が、２５０００〜６１０００である場合に、ＴＰＶＡ含量が増大するにつれ、ＤＥＮＣの直径は増大した。ＰＶＡが、４７０００の分子量を有する場合には、ナノ構造の約半数が、コア−シェル構造を有していた。ＰＶＡが６１０００の分子量を有する場合には、わずかな数のナノ構造のみが、コア−シェル構造を有していた。ＰＶＡが７８０００の分子量を有する場合には、ナノカプセルは形成されなかった。この結果は、ＰＶＡの分子量があまりにも大きい場合には、ナノカプセルは形成されないことを示す。
表１１：生成物形態に対するＰＶＡ−ＴＰＭＡＡ共重合体のＰＶＡ分子量およびＴＰＶＡ含量の効果
実施形態１３：抗体−ＰＶＡ／ＰＡＡ混合物を含有するＤＥＮＣ
この実施形態では、ＰＶＡおよびＰＡＡの混合物を含有するダブルエマルジョンナノカプセル（すなわち、ＤＥＮＣ）を、図２Ｂにおけるダブル乳化法によって調製した。使用された例示的薬物は、親水性のドキソルビシン（Ｄｏｘ）および疎水性のパクリタキセル（ＰＴＸ）であった。これら２種の薬物は、癌治療のための一般的な化学療法薬である。次いで、ＰＶＡおよびＰＡＡの混合物を含有するＤＥＮＣを、図２Ｃの方法によってシェルの表面上の抗体とコンジュゲートした。
ＰＶＡおよびＰＡＡの混合物を含有するＤＥＮＣの調製方法は、実施形態６におけるＰＶＡおよびＴＰＭＡＡの混合物を含有するＤＥＮＣと同様であった。第１の相違は、ＰＶＡおよびＴＰＭＡＡの第２の水溶液が、ＰＶＡおよびＰＡＡ水溶液によって置き換わったことであった。ＰＶＡおよびＰＡＡの水溶液では、ＰＶＡの濃度は、２０ｍｇ／ｍＬであり、ＰＡＡの濃度は、２ｍｇ／ｍＬであった。第２の相違は、乳癌抗体トラスツズマブの第一級アミン基をＰＡＡのカルボン酸基と連結するためのＳＭＣＣのカップリング剤が、ＥＤＣおよびスルホ−ＮＨＳの組合せによって置き換わったことであった。ＰＶＡの分子量は、１６０００であった。
乳癌抗体トラスツズマブおよびカップリング剤の反応では、０．１ＭのＭＥＳおよび０．５ＭのＮａＣｌを含有し、６．０のｐＨ値を有する、０．１ＭのＭＥＳバッファー溶液をまず調製した。次いで、３ｍＬのＭＥＳバッファー溶液中に、ＤＥＮＣ、５０μｇのＥＤＣおよび６０μｇのスルホ−ＮＨＳを続いて添加した。混合物を、１５分間撹拌し、反応させた。次いで、上記のＭＥＳバッファー溶液中に、１μＬの２−メルカプトエタノールを添加して、ＥＤＣの活性化反応を停止した。次いで、ＭＥＳバッファー溶液中に高濃度のＰＢＳ溶液を添加して、ｐＨ値を７超に高めた。続いて、５００μｇの乳癌抗体トラスツズマブを添加し、室温で２時間反応させて、トラスツズマブ−ＤＥＮＣを得た。
得られたトラスツズマブ−ＤＥＮＣを、脱イオン水に分散させ、分散溶液を７０００ｒｐｍで遠心分離した後に未反応の薬剤を除去した。分散および遠心分離のステップを数回反復して、トラスツズマブ−ＤＥＮＣを精製した。精製されたトラスツズマブ−ＤＥＮＣを生理食塩水などの溶媒中に分散させた。
図１２は、トラスツズマブ−ＰＶＡおよびＰＡＡの混合物を含有するＤＥＮＣのＳＥＭ画像であった。図１２では、非コンジュゲートＤＥＮＣの球状形態が、トラスツズマブ−ＤＥＮＣの不規則な形態に変化したことが観察され得る。これは、ＤＥＮＣを乳癌抗体トラスツズマブとコンジュゲートすることによって引き起こされ得る。しかし、ＳＥＭ像の黒色および白色コントラストから、トラスツズマブ−ＤＥＮＣが、中空構造を依然として有することが確認され得る。さらに、得られたトラスツズマブ−ＰＶＡ／ＰＡＡ混合物を含有するＤＥＮＣは、沈殿を形成することなく溶液中に均一に分散され得る。したがって、トラスツズマブ−ＰＶＡ／ＰＡＡ混合物を含有するＤＥＮＣは、実施形態６におけるトラスツズマブ−ＰＶＡ／ＴＰＭＡＡ混合物を含有するＤＥＮＣと同様であった。
実施形態１４：抗体−ＰＶＡ／ＰＭＡＡ混合物を含有するＤＥＮＣ
この実施形態では、ＰＶＡおよびＰＭＡＡの混合物を含有するダブルエマルジョンナノカプセル（すなわち、ＤＥＮＣ）を、図２Ｂにおけるダブル乳化法によって調製した。使用された例示的薬物は、親水性のドキソルビシン（Ｄｏｘ）および疎水性パクリタキセル（ＰＴＸ）であった。これら２種の薬物は、癌治療のための一般的な化学療法薬である。次いで、ＰＶＡおよびＰＭＡＡの混合物を含有するＤＥＮＣを、図２Ｃの方法によってシェルの表面上で抗体とコンジュゲートした。
ＰＶＡおよびＰＭＡＡの混合物を含有するＤＥＮＣの調製方法は、実施形態６におけるＰＶＡおよびＴＰＭＡＡの混合物を含有するＤＥＮＣと同様であった。唯一の相違は、ＰＶＡおよびＴＰＭＡＡの第２の水溶液が、ＰＶＡおよびＰＭＡＡの混合物を含有する水溶液によって置き換わったことであり、ＰＶＡの分子量は、１６０００であった。
得られたトラスツズマブ−ＰＶＡおよびＰＭＡＡの混合物を含有するＤＥＮＣもまた、ＳＥＭ下で観察された不規則な形態を有していたが、依然として中空構造は維持していた。さらに、トラスツズマブ−ＰＶＡおよびＰＭＡＡの混合物を含有するＤＥＮＣはまた、沈殿を形成することなく溶液中に均一に分散され得る。したがって、トラスツズマブ−ＰＶＡ／ＰＭＡＡ混合物を含有するＤＥＮＣは、実施形態６におけるトラスツズマブ−ＰＶＡ／ＴＰＭＡＡ混合物を含有するＤＥＮＣと同様であった。
実施形態１５：抗体−ＰＶＡ／ＣＭＰＶＡ混合物を含有するＤＥＮＣ
この実施形態では、ＰＶＡおよびＣＭＰＶＡの混合物を含有するダブルエマルジョンナノカプセル（すなわち、ＤＥＮＣ）を、図２Ｂにおけるダブル乳化法によって調製した。使用された例示的薬物は、親水性のドキソルビシン（Ｄｏｘ）および疎水性のパクリタキセル（ＰＴＸ）であった。これら２種の薬物は、癌治療のための一般的な化学療法薬である。次いで、ＰＶＡおよびＣＭＰＶＡの混合物を含有するＤＥＮＣを、図２Ｃの方法によってシェルの表面上で抗体とコンジュゲートした。
ＰＶＡおよびＣＭＰＶＡの混合物を含有するＤＥＮＣの調製方法は、実施形態１３におけるＰＶＡおよびＰＡＡの混合物を含有するＤＥＮＣと同様であった。唯一の相違は、ＰＶＡおよびＰＡＡの第２の水溶液が、ＰＶＡおよびＣＭＰＶＡの混合物を含有する水溶液によって置き換わったことであった。ＰＶＡの分子量は１６０００であり、ＣＭＰＶＡの修飾パーセンテージは、３０％であった。
最初に、抗体コンジュゲーションパーセンテージ、ＤＥＮＣの直径および封入効率に対する効果を確認するために、ＣＭＰＶＡ含量を調べた。得られた結果は、以下の表１２に列挙した。表１２では、抗体が、ＤＥＮＣと連結するのにＣＭＰＶＡのカルボン酸基を必要としたので、抗体コンジュゲーションパーセンテージは、ＣＭＰＶＡ含量が多い場合に高かった。さらに、抗体コンジュゲーションパーセンテージが高いほど、ＤＥＮＣの直径が大きかった。
薬物の封入効率は、ＣＭＰＶＡ含量によってあまり影響を受けず、したがって、抗体コンジュゲーションパーセンテージによって影響を受けなかった。抗体がＤＥＮＣとコンジュゲートされる前に、薬物がＤＥＮＣ中に封入されたということがあり得る。しかし、ＰＶＡおよびＣＭＰＶＡの混合物を含有するＤＥＮＣ（表１２）と、ＰＶＡおよびＴＰＶＡの混合物を含有するＤＥＮＣ（表９）と比較すると、プロトンが、ＣＭＰＶＡのカルボン酸基から容易に解離されるので、ＰＶＡおよびＣＭＰＶＡの混合物を含有するＤＥＮＣによるＤｏｘの封入効率は、５〜１０％増大した。
表１２：抗体コンジュゲーションパーセンテージ、ＤＥＮＣの直径および薬物封入効率に対するＣＭＰＶＡ含量の効果
次いで、ＤＥＮＣの直径および薬物封入効率に対する乳化時間の効果を、続いて調べた。ＣＭＰＶＡ含量は３０ｍｏｌ％であり、ＰＶＡの分子量は、１６０００であった。得られた結果は、以下の表１３に列挙した。表１３では、第１および第２の乳化時間の長さは、ＤＥＮＣの直径および薬物封入効率に対して明白な効果を有していなかった。
表１３：ＤＥＮＣの直径および薬物封入効率に対する乳化時間の効果
次いで、生成物形態に対するＰＶＡ分子量およびＣＭＰＶＡ含量の効果を調べた。得られた結果を、以下の表１４に列挙した。表１４では、ＰＶＡの分子量が、２５０００〜６１０００である場合に、ＣＭＰＶＡ含量が増大するにつれ、ＤＥＮＣの直径は増大した。ＰＶＡが６１０００の分子量を有する場合には、わずかな数のナノ構造のみが、コア−シェル構造を有していた。ＰＶＡが７８０００の分子量を有する場合には、ナノカプセルは形成されなかった。この結果は、ＰＶＡの分子量があまりにも大きい場合には、ナノカプセルは形成されないことを示す。
表１４：生成物形態学に対するＰＶＡ−ＴＰＭＡＡ共重合体のＰＶＡ分子量およびＣＭＰＶＡ含量の効果
実施形態１６：ＰＶＡ−ＴＰＭＡＡ共重合体の混合物を含有する抗体コンジュゲート担体
この実施形態では、ＰＶＡ−ＴＰＭＡＡ共重合体を含有するダブルエマルジョンナノカプセル（すなわち、ＤＥＮＣ）を、図２Ａにおけるシングル乳化法によって調製した。使用された例示的薬物は、親水性のドキソルビシン（Ｄｏｘ）および疎水性のパクリタキセル（ＰＴＸ）であった。これら２種の薬物は、癌治療のための一般的な化学療法薬である。次いで、ＰＶＡ−ＴＰＭＡＡ共重合体を含有するＤＥＮＣを、図２Ｃの方法によってシェルの表面上で抗体とコンジュゲートした。
ＰＶＡ−ＴＰＭＡＡ共重合体およびＤｏｘの水溶液ならびにＩＯ−ＯＡナノ粒子およびＰＴＸのクロロホルム溶液をそれぞれ調製した。ＰＶＡ−ＴＰＭＡＡ共重合体およびＤｏｘの水溶液では、ＰＶＡ−ＴＰＭＡＡ共重合体の濃度は、２０ｍｇ／ｍＬであり、Ｄｏｘの濃度は、８ｍｇ／ｍＬとした。ＩＯ−ＯＡナノ粒子およびＰＴＸのクロロホルム溶液では、ＩＯ−ＯＡナノ粒子の濃度は、２０ｍｇ／ｍＬであり、Ｄｏｘの濃度は、３０ｍｇ／ｍＬとした。
２．５ｍＬの、ＰＶＡ−ＴＰＭＡＡ共重合体およびＤｏｘを含有する第１の水溶液ならびに１ｍＬの、ＩＯ−ＯＡナノ粒子およびＰＴＸを含有するＣＨＣｌ３溶液を混合し、２０ｋＨｚの周波数での超音波処理によって乳化して、ＰＶＡ−ＴＰＭＡＡ共重合体を含有するＤＥＮＣを得た。ＰＶＡと共重合体化されたＴＰＭＡＡの修飾パーセンテージは、３７％であった。最後に得られたエマルジョン溶液を開放空間に置くことによって揮発性物質エマルジョン溶液のＣＨＣ１３を除去して、ＣＨＣｌ３を蒸発させた。ＣＨＣ１３を蒸発させる温度は、ＤＥＮＣの形態を変更し得る。次いで、ＰＶＡ−ＴＰＭＡＡ共重合体を含有するＤＥＮＣを、３ｍＬの、０．１Ｍのリン酸ナトリウムおよび０．１５ＭのＮａＣｌを含有するＰＢＳ溶液に分散させた。
次いで、乳癌抗体トラスツズマブを、得られたＰＶＡ−ＴＰＭＡＡ共重合体を含有するＤＥＮＣとコンジュゲートさせた。コンジュゲーション法の詳細は、実施形態６のコンジュゲーション法と同一であり、従って、ここでは省略した。
最初に、抗体コンジュゲーションパーセンテージ、ＤＥＮＣの直径および封入効率に対する効果を確認するために、ＰＶＡ−ＴＰＭＡＡ共重合体中のＴＰＭＡＡ含量を調べた。得られた結果は、以下の表１５に列挙した。表１５では、抗体が、ＤＥＮＣと連結するのにＴＰＭＡＡのチオール基を必要としたので、抗体コンジュゲーションパーセンテージは、ＴＰＭＡＡ含量が多い場合に高かった。さらに、抗体コンジュゲーションパーセンテージが高いほど、ＤＥＮＣの直径は大きかった。ＤｏｘおよびＰＴＸの封入効率は、ＴＰＭＡＡ含量によってあまり影響を受けず、したがって、抗体コンジュゲーションパーセンテージによって影響を受けなかった。抗体がＤＥＮＣとコンジュゲートされる前に、薬物がＤＥＮＣ中に封入されたということがあり得る。
表１５：抗体コンジュゲーションパーセンテージ、ＤＥＮＣの直径および薬物封入効率に対するＴＰＭＡＡ含量の効果
実施形態１７：ＴＰＶＡを含有する抗体コンジュゲート担体
この実施形態では、ＴＰＶＡを含有するダブルエマルジョンナノカプセル（すなわち、ＤＥＮＣ）を、図２Ａにおけるシングル乳化法によって調製した。使用された例示的薬物は、親水性のドキソルビシン（Ｄｏｘ）および疎水性のパクリタキセル（ＰＴＸ）であった。これら２種の薬物は、癌治療のための一般的な化学療法薬である。次いで、ＴＰＶＡを含有するＤＥＮＣを、図２Ｃの方法によってシェルの表面上で抗体とコンジュゲートした。
ＴＰＶＡを含有するＤＥＮＣの調製方法は、実施形態１６におけるＰＶＡ−ＴＰＭＡＡ共重合体を含有するＤＥＮＣと同様であった。唯一の相違は、ＰＶＡ−ＴＰＭＡＡ共重合体およびＤｏｘの水溶液が、ＴＰＶＡおよびＤｏｘを含有する水溶液によって置き換わったということであった。ＴＰＶＡおよびＤｏｘの水溶液では、ＴＰＶＡの濃度は、２０ｍｇ／ｍＬであり、Ｄｏｘの濃度は、８ｍｇ／ｍＬであった。使用されたＰＶＡは、１６０００の分子量を有していた。
図１３Ａ〜１３Ｃは、それぞれ、２５０００、４７０００および７８０００の分子量を有するＴＰＶＡを含有するダブルエマルジョンナノカプセルのＳＥＭ像である。図１３Ａ〜１３Ｃは、ＴＰＶＡの分子量が増大するにつれ、ＤＥＮＣの凝集が増大したことを示す。理由は、ＴＰＶＡの分子量が増大するにつれ、ＤＥＮＣの疎水性が増大したということであり得る。特に、大きすぎて、コア−シェル構造を有するナノ構造を形成できなかった、ＴＰＶＡの分子量が、７８０００であった場合。
最初に、ＰＶＡをチオグリコール酸を用いて修飾することによってＴＰＶＡが得られたので、抗体コンジュゲーションパーセンテージ、ＤＥＮＣの直径および封入効率に対する効果を確認するためにＴＰＶＡの修飾パーセンテージを調べた。ＴＰＶＡは、１６０００の分子量を有するＰＶＡから得られ、得られた結果を以下の表１６に列挙した。表１６では、抗体が、ＤＥＮＣと連結するためにＴＰＶＡのチオール基を必要としたので、抗体コンジュゲーションパーセンテージは、ＴＰＶＡの修飾パーセンテージが高い場合に高かった。さらに、抗体コンジュゲーションパーセンテージが高いほど、ＤＥＮＣの直径は大きかった。薬物の封入効率は、ＰＶＡの修飾パーセンテージによってあまり影響を受けず、従って、抗体コンジュゲーションパーセンテージによって影響を受けなかった。抗体がＤＥＮＣとコンジュゲートされる前に、薬物がＤＥＮＣ中に封入されたということがあり得る。
表１６：抗体コンジュゲーションパーセンテージ、ＤＥＮＣの直径および薬物封入効率に対するＴＰＶＡ修飾パーセンテージの効果
実施形態１８：ＣＭＰＶＡを含有する抗体コンジュゲート担体
この実施形態では、ＣＭＰＶＡを含有するダブルエマルジョンナノカプセル（すなわち、ＤＥＮＣ）を、図２Ａにおけるシングル乳化法によって調製した。使用された例示的薬物は、親水性のドキソルビシン（Ｄｏｘ）および疎水性のパクリタキセル（ＰＴＸ）であった。これら２種の薬物は、癌治療のための一般的な化学療法薬である。次いで、ＣＭＰＶＡを含有するＤＥＮＣを、図２Ｃの方法によってシェルの表面上で抗体とコンジュゲートした。
ＣＭＰＶＡを含有するＤＥＮＣの調製方法は、実施形態１６におけるＰＶＡ−ＴＰＭＡＡ共重合体を含有するＤＥＮＣと同様であった。唯一の相違は、ＰＶＡ−ＴＰＭＡＡ共重合体およびＤｏｘの水溶液が、ＣＭＰＶＡおよびＤｏｘを含有する水溶液と置き換わったことであった。ＣＭＰＶＡおよびＤｏｘの水溶液では、ＣＭＰＶＡの濃度は２０ｍｇ／ｍＬとし、Ｄｏｘの濃度は８ｍｇ／ｍＬとした。使用されたＰＶＡは、１６０００の分子量を有していた。
抗体をコンジュゲートする方法は、実施形態１３におけるＰＶＡおよびＰＡＡの混合物を含有するＤＥＮＣと同様であった。ＣＭＰＶＡのカルボン酸基を、乳癌抗体トラスツズマブの第一級アミン基と連結するためのカップリング剤は、ＥＤＣおよびスルホ−ＮＨＳの組合せであった。
ＰＶＡを修飾することによって、ＣＭＰＶＡが得られたので、抗体コンジュゲーションパーセンテージ、ＤＥＮＣの直径および封入効率に対する効果を確認するためにＣＭＰＶＡの修飾パーセンテージを調べた。得られたＣＭＰＶＡは、１６０００の分子量を有するＰＶＡから得られ、得られた結果を、以下の表１７に列挙した。表１７では、抗体が、ＤＥＮＣと連結するためにＰＶＡのチオール基を必要としたので、抗体コンジュゲーションパーセンテージは、ＰＶＡの修飾パーセンテージが高い場合に高かった。さらに、抗体コンジュゲーションパーセンテージが高いほど、ＤＥＮＣの直径が大きかった。
薬物の封入効率は、ＰＶＡの修飾パーセンテージによってあまり影響を受けず、従って、抗体コンジュゲーションパーセンテージによって影響を受けなかった。抗体がＤＥＮＣとコンジュゲートされる前に、薬物がＤＥＮＣ中に封入されたということがあり得る。しかし、ＣＭＰＶＡ（表１７）を含有するＤＥＮＣと、ＰＶＡおよびＣＭＰＶＡの混合物（表１２）を含有するＤＥＮＣとを比較すると、シングル乳化法においてＣＭＰＶＡのみが使用されたので、カルボン酸基が、ＤＥＮＣのシェルの内表面および外表面上に分布し得る。さらに、プロトンが、ＣＭＰＶＡのカルボン酸基から容易に解離されるので、ＰＶＡおよびＣＭＰＶＡの混合物を含有するＤＥＮＣによるＤｏｘの封入効率は、１〜５％増大した。
表１７：抗体コンジュゲーションパーセンテージ、ＤＥＮＣの直径および薬物封入効率に対するＰＶＡ修飾パーセンテージの効果
前記を考慮すると、ダブルエマルジョンナノカプセルの内表面および外表面の両方に連結基を提示するよう、連結ＰＶＡにダブルエマルジョンナノカプセルを形成させるためにシングル乳化法が使用され得る。ダブル乳化法はまた、ダブルエマルジョンナノカプセルの外表面に連結基を提示するよう、ＰＶＡおよび連結ポリマーの混合物にダブルエマルジョンナノカプセルを形成させるために使用され得る。連結基は、必要とされる抗体と結合するよう使用され得、従って、抗体はダブルエマルジョンナノカプセルの外表面上に結合され得る。したがって、薬物を封入するダブルエマルジョンナノカプセルは、標的治療を実施するためにいくつかの特定の細胞を標的とできる。さらに、薬物の蓄積量を増大するために、外部適用磁場がさらに使用され得、治療効果がさらに増大され得る。
本明細書（あらゆる添付の特許請求の範囲、要約および図面を含む）において開示されたすべての特徴は、別に明確に記載されない限り、同一、同等または同様の目的を果たす代替特徴によって置き換えられ得る。したがって、開示される各特徴は、同等または同様の特徴の一般的な一連のもののうちの単なる一例である。

Claims (13)

  1. 水性コア；
    水性コアを包み込む油性シェルであって、油性シェルの組成物は、ＰＶＡ−ＴＰＭＡＡの共重合体、またはポリビニルアルコール（ＰＶＡ）および連結基を有する連結ポリマーの組合せであるポリマーと複数の疎水性磁性ナノ粒子を含有するが、その他のポリマーおよび界面活性剤を含有しないものであり、連結ポリマーが、チオール化ポリビニルアルコール（ＴＰＶＡ）またはカルボキシメチル化ポリビニルアルコール（ＣＭＰＶＡ）を含有し、ポリビニルアルコールの分子量が２５０００〜６１０００であって、ＴＰＭＡＡ含量が１０〜３０ｍｏｌ％、ＴＰＶＡ含量が１０〜３０ｍｏｌ％又はＣＭＰＶＡ含量が１０〜５０ｍｏｌ％である油性シェル；
    少なくとも１種のカップリング剤によって前記チオール基又は前記連結基と化学的に結合した抗体
    を含有し、直径が約５０ｎｍ〜約４００ｎｍである抗体コンジュゲートダブルエマルジョンナノカプセル。
  2. 疎水性磁性ナノ粒子が、疎水性官能基によって修飾された表面を有するナノ粒子であり、Ｆｅ２Ｏ３、Ｆｅ３Ｏ４、ＣｏＦｅ２Ｏ４またはＭｎＦｅ２Ｏ４で構成されるものである請求項１記載の抗体コンジュゲートダブルエマルジョンナノカプセル。
  3. 抗体が、トラスツズマブの乳癌抗体、セツキシマブの結腸直腸癌抗体、パニツムマブの上皮成長因子受容体抗体またはベバシズマブの血管新生阻害剤抗体を含む請求項１記載の抗体コンジュゲートダブルエマルジョンナノカプセル。
  4. カップリング剤が、４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＳＭＣＣ）、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ−エチルカルボジイミドヒドロクロリド（ＥＤＣ）、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドナトリウム塩（スルホ−ＮＨＳ）または３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＳＰＤＰ）である請求項１記載の抗体コンジュゲートダブルエマルジョンナノカプセル。
  5. 油性シェルが、疎水性薬物をさらに含むものである請求項１記載の抗体コンジュゲートダブルエマルジョンナノカプセル。
  6. 水性コアが、親水性薬物をさらに含むものである請求項１記載の抗体コンジュゲートダブルエマルジョンナノカプセル。
  7. 下記を含む抗体コンジュゲートダブルエマルジョンナノカプセルを調製するダブルエマルジョン法：
    ポリビニルアルコールを含むが、その他のポリマーおよびその他の界面活性剤を含まない第１の水溶液を調製する；
    複数の疎水性磁性ナノ粒子を含む有機溶液を調製する；
    第１の水溶液および有機溶液を混合して、油中水エマルジョン溶液である、第１のエマルジョン溶液を形成する；
    連結基を有する連結ポリマーおよびポリビニルアルコールを含む組み合わせであるが、その他のポリマーまたは界面活性剤を含まないものであり、前記連結ポリマーが、カルボキシメチル化ポリビニルアルコール（ＣＭＰＶＡ）、チオール化ポリビニルアルコール（ＴＰＶＡ）またはＰＶＡ−ＴＰＭＡＡの共重合体であって、ポリビニルアルコールの分子量が２５０００〜６１０００である第２の水溶液を調製する；
    第１のエマルジョン溶液および第２の水溶液を混合して、ダブルエマルジョンナノカプセルを含む第２のエマルジョン溶液を形成する；
    有機溶液において使用された有機溶媒を除去して、ＴＰＭＡＡ含量が１０〜３０ｍｏｌ％、ＴＰＶＡ含量が１０〜３０ｍｏｌ％又はＣＭＰＶＡ含量が１０〜５０ｍｏｌ％であるダブルエマルジョンナノカプセルを得る；
    ダブルエマルジョンナノカプセルを含む第１の分散溶液を調製する；
    カップリング剤と結合している抗体を含む第２の分散溶液を調製する；
    第１の分散溶液および第２の分散溶液を混合して、連結基とカップリング剤を化学反応させて、複数の抗体コンジュゲートダブルエマルジョンナノカプセルを得る。
  8. 連結基が、カルボン酸基、チオール基またはヒドロキシル基である請求項７記載のダブルエマルジョン法。
  9. 疎水性磁性ナノ粒子が、疎水性官能基によって修飾された表面を有するナノ粒子であり、Ｆｅ２Ｏ３、Ｆｅ３Ｏ４、ＣｏＦｅ２Ｏ４またはＭｎＦｅ２Ｏ４で構成されるものである請求項７記載のダブルエマルジョン法。
  10. 抗体が、トラスツズマブの乳癌抗体、セツキシマブの結腸直腸癌抗体、パニツムマブの上皮成長因子受容体抗体またはベバシズマブの血管新生阻害剤抗体を含む請求項７記載のダブルエマルジョン法。
  11. カップリング剤が、４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＳＭＣＣ）、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ−エチルカルボジイミドヒドロクロリド（ＥＤＣ）、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドナトリウム塩（スルホ−ＮＨＳ）または３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＳＰＤＰ）である請求項７記載のダブルエマルジョン法。
  12. 油性シェルが、疎水性薬物をさらに含むものである請求項７記載のダブルエマルジョン法。
  13. 水性コアが、親水性薬物をさらに含むものである請求項７記載のダブルエマルジョン法。
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Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105832702B (zh) * 2015-01-13 2019-02-22 胡尚秀 用于药物传递的蛋白质纳米磁性壳核胶囊及其应用
EP3432868B1 (en) * 2016-03-23 2020-12-16 Academia Sinica Thin-shell polymeric nanoparticles and uses thereof
CN108685872B (zh) * 2017-04-12 2020-11-20 刘东飞 一种序列沉淀络合凝聚法制备超高载药纳米粒子的方法
US10736964B2 (en) * 2017-05-01 2020-08-11 China Medical University Immunomagnetic nanocapsule and kit for treating cancer
CN108785668B (zh) * 2017-05-01 2022-03-18 洪明奇 免疫磁性组成物及其制备方法、用途和治疗癌症的试剂盒
KR102176034B1 (ko) * 2018-06-22 2020-11-06 서울대학교산학협력단 혈액 클렌징 시스템
EP3836900A1 (en) * 2018-08-17 2021-06-23 Smela, Krzysztof Pawel Multicompartment system of nanocapsule-in-nanocapsule type, for encapsulation of a lipophilic and hydrophilic compound, and the related production method

Family Cites Families (36)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4496689A (en) * 1983-12-27 1985-01-29 Miles Laboratories, Inc. Covalently attached complex of alpha-1-proteinase inhibitor with a water soluble polymer
US5296228A (en) * 1992-03-13 1994-03-22 Allergan, Inc. Compositions for controlled delivery of pharmaceutical compounds
ATE243882T1 (de) 1998-05-26 2003-07-15 Univ Bar Ilan Keimbildung und wachstum von metalloxid- nanopartikeln und verwendung
JP2000203810A (ja) 1999-01-14 2000-07-25 Toyota Central Res & Dev Lab Inc 中空状酸化物粉末粒子
CA2361249C (en) * 1999-02-12 2011-05-10 Stem Cells,Inc. Enriched central nervous system stem cell and progenitor cell populations, and methods for identifying, isolating and enriching for such populations
WO2002034871A2 (en) 2000-10-27 2002-05-02 Genencor International, Inc. Particle with substituted polyvinyl alcohol coating
WO2004083902A2 (en) 2002-10-25 2004-09-30 Georgia Tech Research Corporation Multifunctional magnetic nanoparticle probes for intracellular molecular imaging and monitoring
EP1610752B1 (en) 2003-01-31 2013-01-02 Boston Scientific Limited Localized drug delivery using drug-loaded nanocapsules and implantable device coated with the same
WO2005044224A2 (en) 2003-05-02 2005-05-19 Case Western Reserve University Drug delivery system based on polymer nanoshells
WO2005019509A1 (en) 2003-08-22 2005-03-03 Hyosung Corporation High tenacity polyethylene-2,6-naphthalate fibers
CN1279554C (zh) 2003-12-23 2006-10-11 中国科学院理化技术研究所 具有介孔结构的磁性氧化铁中空微球颗粒及其制法和用途
US20080286350A1 (en) 2004-10-06 2008-11-20 Bc Cancer Agency Formulation of Multivalent Antibody Constructs and Use of Same for Cancer Therapy
WO2007002690A2 (en) 2005-06-24 2007-01-04 William Marsh Rice University Nano-encapsulated triggered-release viscosity breakers
CN103110948A (zh) 2005-11-04 2013-05-22 惠氏公司 mTOR抑制剂、赫赛汀和/或HKI-272的抗肿瘤组合
US20070258889A1 (en) 2005-11-09 2007-11-08 Montana State University Novel nanoparticles and use thereof
US20090324494A1 (en) 2006-02-24 2009-12-31 Atgen Co., Ltd Magnetic nano-composite for contrast agent, intelligent contrast agent, drug delivery agent for simultaneous diagnosis and treatment, and separation agent for target substance
WO2007137236A2 (en) 2006-05-19 2007-11-29 Drexel University Drug loaded contrast agents: combining diagnosis and therapy
WO2008115854A2 (en) * 2007-03-19 2008-09-25 Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Multifunctional nanoparticles and compositions and methods of use thereof
FR2918755B1 (fr) * 2007-07-09 2009-10-30 Commissariat Energie Atomique Procede de detection et de quantification d'analytes sur support solide avec des molecules fluorescentes encapsulees dans des immunoliposomes.
EP2039352A1 (en) 2007-09-18 2009-03-25 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Aqueous-core lipid nanocapsules for encapsulating hydrophilic and/or lipophilic molecules
CN201207042Y (zh) 2008-04-21 2009-03-11 上海骏维实业有限公司 一种新型复合式pH电极
BRPI0812682A2 (pt) 2008-06-16 2010-06-22 Genentech Inc tratamento de cáncer de mama metastático
CN101318710B (zh) 2008-06-30 2011-12-14 中国科学院上海硅酸盐研究所 一种铁氧化物多级空心核壳材料及其制备方法
WO2010002418A2 (en) * 2008-07-01 2010-01-07 The Johns Hopkins University Quick-dissolving oral thin film for targeted delivery of therapeutic agents
CN101475222B (zh) 2009-01-22 2011-10-05 中国科学院上海硅酸盐研究所 铁氧化物空心微球及其制备方法
CN101536982B (zh) 2009-04-27 2011-11-09 中国人民解放军第二军医大学 Trastuzumab修饰的包裹毒素蛋白的PEG化免疫脂质体及其制备与应用
US20120108563A1 (en) 2009-05-19 2012-05-03 Infinity Pharmaceuticals, Inc. Methods Of Treating Liposarcoma
US20120027865A1 (en) 2009-05-21 2012-02-02 Institute Of Life Sciences Water Dispersible Glyceryl Monooleate Magnetic Nanoparticle Formulation
WO2011001276A1 (en) 2009-06-30 2011-01-06 Philogen S.P.A. Immunocytokines in combination with anti-erbb antibodies for the treatment of cancer
TW201129380A (en) 2009-12-04 2011-09-01 Genentech Inc Methods of treating metastatic breast cancer with trastuzumab-MCC-DM1
US9308582B2 (en) * 2009-12-24 2016-04-12 Yi Sun Solution stable and chemically reactive metallic nanoparticles
CN102128864A (zh) 2010-01-12 2011-07-20 上海葛宝水处理设备有限公司 微型复合电极
CA2818669A1 (en) 2010-12-09 2012-06-14 Barbara Klencke Treatment of her2-positive cancer with paclitaxel and trastuzumab-mcc-dm1
TWI462753B (zh) * 2011-11-29 2014-12-01 Univ Nat Chiao Tung 雙乳化核殼奈米結構及其製備方法
CN102580106B (zh) 2012-03-21 2013-07-10 浙江大学 一种pH敏感型聚电解质微囊给药载体的制备方法
CN102746474B (zh) 2012-08-27 2014-07-16 同济大学 一种温度和pH敏感性的壳交联聚合物胶束的制备方法

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